CN114480454A

CN114480454A - 用于治疗粘多糖贮积症ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用

Info

Publication number: CN114480454A
Application number: CN202011161014.3A
Authority: CN
Inventors: 吴侠; 闫梦迪; 肖啸
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-10-27
Also published as: CN114480454B

Abstract

本发明公开了优化的人IDS序列(ohIDS序列)、包含该ohIDS序列的腺相关病毒载体以及包含该腺相关病毒载体的药物。本发明还涉及上述腺相关病毒载体在制备用于治疗粘多糖贮积症II型的药物中的应用以及上述腺相关病毒载体在制备用于改善中枢神经系统(CNS)损伤的药物中的应用。

Description

用于治疗粘多糖贮积症Ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域。特别地，本发明涉及用于治疗粘多糖贮积症Ⅱ型的腺相关病毒载体、包含该腺相关病毒载体的药物及其应用。

背景技术

粘多糖贮积症Ⅱ型(Mucopolysaccharidosis II，MPS II)，又称亨特综合征，是一种罕见的X连锁隐性遗传的代谢疾病，发病原因是编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(Iduronate-2-sulfatase，IDS)的基因发生突变，导致IDS活性的降低或缺失，从而造成细胞中未降解或部分降解的糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)的积累，引发溶酶体功能障碍和细胞凋亡，从而导致多器官系统损伤和寿命缩短。亨特综合征在全球的发病率约0.30–0.71例/100,000婴儿，是亚洲最常见的粘多糖贮积症亚型。

MPS II是一种可变的、进行性的遗传疾病，有着非常广泛的临床表征。临床上，根据病症出现的年龄、是否存在中枢神经系统障碍以及存活时间将其分为两种主要类型——严重型和轻微型。严重型患者在人群中最为常见。患儿通常在18个月-4岁之间开始发病，表现出非常显著的中枢神经系统障碍，最先表现出来的是认知能力逐渐衰弱，同时会表现出典型的舌头扩大、额头突出等面部粗糙特征，并在发育过程中颈部变短、身材变得矮小而粗壮，心血管、皮肤、胃肠道、口腔和呼吸系统都会受到影响。严重型患儿最终在青少年时期就因神经系统退化和心肺功能衰竭而死亡，平均寿命约为12岁，远远低于正常人。

目前，MPS II的临床治疗手段有酶替代疗法(Enzyme replacement therapy，ERT)(参考文献1-2)和造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)(参考文献3-4)。这两种方法虽被证实可用于治疗MSP II患者，但ERT需要长期注射且无法穿过血脑屏障来改善中枢神经系统(Central nervous system，CNS)损伤。HSCT无法显著改善骨骼畸形及先前存在的认知和智力障碍，而且手术死亡率高。

腺相关病毒(AAV，adeno-associated virus)是一种小型无包膜病毒，其包装线性单链DNA基因组。本发明人在实践研究中发现，重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因递送方法在治疗MPS II患者方面有着巨大的潜力，AAV载体具有可长期稳定表达、免疫原性低、插入率和突变率低等优点，并可为MPS II患者提供长期稳定的正常酶来源。

因此，本领域需要用于治疗MPS II的AAV载体。尤其期望获得既可满足躯体治疗需求又可改善CNS病变，特别是可以治疗严重型的MPS II患者的CNS损伤的AAV载体。

参考文献：

1.Activities of daily living in patients with Hunter syndrome:impactof enzyme replacement therapy and hematopoietic stem celltransplantation.DOI:10.1016/j.ymgme.2014.11.002.

2.Impact of Enzyme Replacement Therapy and Hematopoietic Stem CellTherapy on Growth in Patients with Hunter Syndrome.DOI:10.1016/j.ymgmr.2014.04.001.

3.Ultrastructural findings of cutaneous nerves in patients withHunter's syndrome following hematopoietic stem cell transplant.DOI:10.1007/s00795-005-0284-5.

4.Activities of daily living in patients with Hunter syndrome:impactof enzyme replacement therapy and hematopoietic stem celltransplantation.DOI:10.1016/j.ymgme.2014.11.002.

发明内容

为了解决上述问题，本发明人根据人IDS序列，进行优化设计，获得了表达效率更高的优化的人IDS(optimized human Iduronate-2-sulfatase，ohIDS)序列。本发明的ohIDS序列比原始hIDS序列具有更高水平的表达。

在第一方面，本发明提供一种优化的人IDS序列(ohIDS序列)，所述ohIDS序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。

在一个优选实施方式中，ohIDS序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列。在一个更优选实施方式中，ohIDS序列如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示。

在第二方面，本发明提供一种腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含上述ohIDS序列。

本发明的腺相关病毒载体可以从多种腺相关病毒产生。腺相关病毒可以选自任何AAV血清型。AAV血清型的实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10。在一个优选实施方式中，腺相关病毒为AAV9。腺相关病毒AAV9血清型具有穿过新生儿和成年动物血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的能力。

在一个优选实施方式中，上述腺相关病毒载体还包含：启动子和猿猴病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)内含子。

在一个优选实施方式中，所述猿猴病毒40内含子为与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在一个更优选实施方式中，猿猴病毒40内含子包含SEQ ID NO：2所示的序列。在一个最优选实施方式中，猿猴病毒40内含子的序列如SEQ IDNO：2所示。

在一个优选实施方式中，启动子为非特异性启动子，优选为由鸡β肌动蛋白(Chickenβ-actin，CBA)启动子和人巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子组成的CB启动子。CB启动子为非特异性的强启动子，可以实现基因的高水平表达，降低载体剂量。

在一个优选实施方式中，所述CB启动子为与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。在一个更优选实施方式中，所述CB启动子包含SEQ IDNO：3所示的序列。在一个最优选实施方式中，所述CB启动子的序列如SEQ ID NO：3所示。

在一个实施方式中，腺相关病毒载体还包含：AAV2的反向末端重复序列(invertedterminal repeat，ITR)和/或牛生长激素基因多聚腺苷酸(bovine Growth HormonePolyA，bGH polyA)序列。

在一个实施方式中，AAV2的ITR序列如SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5所示。

在一个实施方式中，牛生长激素基因多聚腺苷酸(bGH polyA)序列如SEQ ID NO：6所示。

在第三方面，本发明提供上述腺相关病毒载体在制备用于治疗粘多糖贮积症II型的药物中的应用。

在第四方面，本发明提供上述腺相关病毒载体在制备用于改善中枢神经系统(CNS)损伤的药物中的应用。

在第五方面，本发明提供一种用于治疗粘多糖贮积症II型的药物，其包含上述腺相关病毒载体和可选的药学上可接受的载体。所述药物可以在体内纠正IDS活性水平，从而治疗MPS II疾病。

在一个实施方式中，药学上可接受的载体包括任何临床上有用的溶剂、分散介质、低温保护剂、等渗剂和吸收延迟剂等。

在第六方面，本发明提供一种治疗粘多糖贮积症II型的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上述药物。

在一个实施方式中，所述施用包括静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内、病灶内或鼻内施用。在一个优选实施方式中，所述施用为尾静脉注射。尾静脉注射具有通过微创实现载体全身转导的优势，适用于治疗MPS II此类既有躯体病症同时又伴有CNS损伤的疾病。

在一个实施方式中，粘多糖贮积症II型选自轻微型和严重型。在一个优选实施方式中，粘多糖贮积症II型为严重型。

附图说明

图1A为表达原始人IDS(hIDS)和优化后的人IDS(ohIDS)载体结构示意图，载体名称分别为pCB-hIDS和pCB-ohIDS。除原始人IDS基因和优化的人IDS基因之外，载体结构还包括ITR、CB启动子(CMV增强子+CBA启动子)、SV40内含子以及bGH poly A。

图1B为pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体转染HEK293细胞后，hIDS mRNA实时定量PCR结果图。分别用5μg的载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞，通过实时定量PCR确定hIDS基因在mRNA水平的表达情况。空白为转染对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图1C为pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体转染HEK293细胞后，细胞内hIDS蛋白质印迹结果图。分别用5μg的载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞，利用蛋白质印迹法分析hIDS蛋白在HEK293细胞中的表达情况。空白为未转染对照组。

图1D为pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体转染HEK293细胞后，上清液中hIDS的ELISA定量分析结果图。分别用5μg的载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞上清液，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)定量分析分泌到细胞上清液里的hIDS含量。空白为未转染对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图1E为pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体转染HEK293细胞后，细胞内GAG总含量分析结果图。分别用5μg载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞，利用二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法测定细胞中GAG含量的变化。空白为未转染对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2A为用包装好的AAV9-CB-hIDS和AAV9-CB-ohIDS注射野生型小鼠7天后，检测小鼠血液内hIDS酶活结果图。病毒通过小鼠尾静脉注射，注射量为1×10¹³vg/kg。Ctrl为未注射对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2B为用包装好的AAV9-CB-hIDS和AAV9-CB-ohIDS注射野生型小鼠1个月后，检测小鼠血液内hIDS酶活结果图。病毒通过小鼠尾静脉注射，注射量为1×10¹³vg/kg。Ctrl为未注射对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2C为用包装好的AAV9-CB-hIDS和AAV9-CB-ohIDS注射野生型小鼠1个月后，检测小鼠脑组织内hIDS酶活结果图。病毒通过小鼠尾静脉注射，注射量为1×10¹³vg/kg。Ctrl为未注射对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2D为用包装好的AAV9-CB-hIDS和AAV9-CB-ohIDS注射野生型小鼠1个月后，检测小鼠肝组织内hIDS酶活结果图。病毒通过小鼠尾静脉注射，注射量为1×10¹³vg/kg。Ctrl为未注射对照组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3A-3E为MPSII疾病模型小鼠尾静脉注射AAV9-CB-ohIDS后，血浆中hIDS酶活性检测结果图。通过尾静脉注射的方式向2月龄的MPSII雄性小鼠递送AAV9-CB-ohIDS，两个治疗组分别为AAV9-CB-ohIDS(1E13 vg/kg，n＝3)、AAV9-CB-ohIDS(1E14 vg/kg，n＝5)。未治疗的同窝MPS II模型鼠(n＝6)和WT小鼠(n＝6)作为对照。在药物注射后7天、1个月、2个月、3个月、4个月分别采集小鼠血样进行hIDS酶活性分析。图3A为载体给药7天后小鼠血浆中的hIDS酶活性。图3B为载体给药1个月后小鼠血浆中的hIDS酶活性。图3C为载体给药2个月后小鼠血浆中hIDS酶活性。图3D为载体给药3个月后小鼠血浆中hIDS酶活性。图3E为载体给药4个月后小鼠血浆中hIDS酶活性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4A-4G为小鼠组织中hIDS酶活性检测结果。

图5为小鼠组织hIDS免疫组化的结果图。标尺＝100μm。

图6A-6C为小鼠组织中GAG水平及尿液样本中的HS含量结果图。图6A为小鼠肝脏、肾脏、肺脏和脾脏中的GAG含量。图6B为小鼠心脏、大脑和肌肉中的GAG含量。图6C为小鼠尿液中的HS含量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7为小鼠组织甲苯胺蓝染色结果图。甲苯胺蓝染色结果通常与组织GAG水平相关。标尺＝50μm。

图8为小鼠头骨X射线照相检测结果图。箭头所示为小鼠的颧骨弓。

图9为AAV9-CB-ohIDS载体治疗后，MPS II小鼠脑中星形胶质细胞增多情况改善的结果图。CTX为大脑皮层，HP为海马。标尺＝100μm。

图10为AAV9-CB-ohIDS载体治疗后MPS II小鼠脑中神经小胶质细胞增多情况改善的结果图。标尺＝50μm。

图11A-11E为AAV9-CB-ohIDS载体治疗后MPS II小鼠认知及行为表现改善结果图。通过Morris水迷宫试验评估载体治疗后MPS II小鼠(6个月龄)运动能力和空间学习记忆能力的变化。图11A为小鼠寻找隐藏平台的潜伏期。图11B为小鼠的游泳速度。图11C为小鼠在目标象限停留的时间。图11D为60秒内小鼠的游泳距离。图11E为小鼠的运动轨迹。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图12A-12E为AAV9-CB-ohIDS载体治疗后MPS II小鼠血浆中ALT、AST含量变化及肝脏HE病理学切片。图12A为载体给药7天后小鼠血浆中的ALT含量。图12B为载体给药7天后小鼠血浆中的AST含量。图12C为载体给药3个月后小鼠血浆中的ALT含量。图12D为载体给药3个月后小鼠血浆中的AST含量。图12E为小鼠肝脏HE染色。*p<0.05。

图13为构建的其他优化的人IDS载体(即pCB-ohIDS-1、pCB-ohIDS-2、pCB-ohIDS-3、pCB-ohIDS-4)转染HEK293细胞后，细胞内hIDS蛋白质印迹结果图。分别用5μg的载体转染HEK293细胞，48小时后收集细胞，利用蛋白质印迹法分析hIDS蛋白在HEK293细胞中的表达情况。空白为转染对照组。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

“反向末端重复序列”或“ITR”序列是本领域众所周知的术语，并且是指在以相反方向存在于病毒基因组的末端处的相对短的序列。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是人。

术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。对被治疗受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对于患者或者医师来说是可察觉的。

术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗粘多糖贮积症II型的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与粘多糖贮积症II型相关的一种或多种症状的量。

术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。

短语“药学上可接受的”指此类成分当施用于哺乳动物(例如人)时是生理上可耐受的并且通常不产生不良反应。

除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1：质粒载体的构建

本实施例以本实验室自有的pAAV2.1单链重组AAV载体(其序列如SEQ ID NO：12所示)为载体骨架构建。通过将原有骨架上的真核表达元件替换为CB启动子(其序列如SEQ IDNO：3所示)、SV40内含子(其序列如SEQ ID NO：2所示)、Kozak序列(5’-GCCACC-3’)、原始的人IDS(hIDS)(其序列如SEQ ID NO：7所示)或优化的人IDS(ohIDS)，以及bGH poly A(其序列如SEQ ID NO：6所示)。关于ohIDS序列，本发明人自主设计得到优化后的hIDS的编码序列即ohIDS序列(其序列如SEQ ID NO：1所示)，并通过RNAfold对优化后的序列进行了分析。

分别将合成的hIDS和SEQ ID NO：1所示的ohIDS序列通过FseI和BstBI限制性核酸内切酶(New England Biolabs)酶切连入pAAV2.1质粒骨架，构建成为pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体(图1A)。

实施例2：pCB-hIDS和pCB-ohIDS载体在细胞中表达及功能分析

将生长良好的HEK293细胞均匀铺于六孔板中，每孔1×10⁶个细胞接种，培养液体积约为2mL。待细胞的生长汇合度达到80-90％时，用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI，HEDE Biotech)进行转染，DNA与PEI试剂的比例为1：2。设置3个孔分别为：5μg pCB-hIDS质粒+10μL PEI；5μg pCB-ohIDS质粒+10μL PEI；未转染空白对照。转染48小时后，收集细胞和上清液，以确定pCB-hIDS载体和pCB-ohIDS载体在细胞水平hIDS基因的具体表达情况。

(1)实时定量PCR分析hIDS的mRNA的表达：

通过实时定量PCR确定细胞内hIDS基因在mRNA水平的具体表达情况，结果显示pCB-ohIDS转染后，ohIDS mRNA表达量高显著高于pCB-hIDS组(图1B，***p<0.001)。

(2)蛋白质印迹法分析hIDS蛋白的表达：

转染后收集细胞进行裂解，提取蛋白进行蛋白质印迹法检测。结果表明，hIDS在蛋白电泳上表现出两个条带，即成熟形式55KDa，前体形式75KDa，pCB-ohIDS转染组蛋白表达水平显著高于pCB-hIDS转染组(图1C)。

(3)ELISA分析细胞上清液中hIDS蛋白的含量：

本实施例使用Human IDS DuoSet ELISA试剂盒(R&D systems)，定量检测分泌到细胞培养上清液中的hIDS酶含量。结果显示，转染了pCB-ohIDS载体的细胞上清液中hIDS含量显著高于pCB-hIDS转染组(图1D，***p<0.001)。

(4)DMMB比色法定量检测细胞GAG总含量：

定量分析IDS底物的变化显示，转染hIDS显著降低了细胞中GAG的水平，pCB-ohIDS转染组细胞中GAG水平显著低于pCB-hIDS组(图1E，***p<0.001)。

以上结果表明，经过优化的pCB-ohIDS载体在体外表现出较高的表达效率，能够高效地将表达产物分泌到胞外，能够发挥高效降解细胞GAG的功能。

实施例3：AAV9-ohIDS和AAV9-hIDS的制备和体内功能分析

本实施例通过尾静脉注射向2个月龄野生型(WT)雄性小鼠递送1E13 vg/kg AAV9-CB-ohIDS和AAV9-CB-hIDS(n＝4)。在注射后1周和1月分别取血两次，并在1月时进行小鼠脑和肝组织酶活的分析。结果显示，在病毒注射后7天即可检测到hIDS活性，并且AAV9-CB-ohIDS组显著高于AAV9-hIDS组(图2A)。在注射后1个月小鼠的血液内，注射组hIDS的活性较注射后7天有显著提高，且AAV9-CB-ohIDS组显著高于AAV9-CB-hIDS组(图2B)。分析注射后1个月小鼠脑组织中酶活显示，AAV9-CB-hIDS酶活较对照组有所提高但是无统计学差异；AAV9-CB-ohIDS组酶活较对照组明显提高，同时也显著高于AAV9-CB-hIDS注射组(图2C)。在肝组织中，AAV9-CB-ohIDS组酶活也显著高于AAV9-CB-hIDS和对照组(图2D)。

以上结果显示，表达ohIDS的病毒载体，在体内也表现出良好的活性。综合在体外和体内的研究证实，本研究所优化获得的ohIDS是可以在人细胞中高效表达、具有高水平酶活和底物降解能力的蛋白。

在下面的研究中显示了主要利用该优化序列(ohIDS)进行的药效研究。

实施例4：AAV9-CB-ohIDS的体内表达验证

MPSII基因敲除小鼠(B6N.Cg-IDStm1Muen/J)购自美国Jackson Laboratory。该小鼠雌性杂合子可正常生长发育和生育。半合子雄性从3个月龄时表现出骨骼和神经疾病，在60-70周时由于继发性中枢神经系统疾病而死亡。在IDS KO小鼠6周龄时，尿液中GAG水平是正常小鼠的4倍。GAG在肝脏、肾脏、肺、脾脏、骨骼肌和心脏也有明显累积。脑干和脊髓的神经元也出现明显坏死。小鼠组织空泡化广泛存在于多个组织中，包括心脏瓣膜、睾丸和小脑神经元。IDS KO小鼠表现出骨骼异常和脱发，并且在开放场测试中表现不佳。

将实施例3中制备的AAV9-CB-ohIDS病毒，以1E13 vg/kg、1E14 vg/kg剂量，通过尾静脉注射2个月龄雄性MPS II小鼠。年龄和性别相同的MPS II和WT同窝仔鼠注射相同体积的PBS作为对照。在治疗4个月时对血液、组织的酶活和底物水平进行分析。

(1)hIDS酶活性分析：

在药物注射后7天、1个月、2个月、3个月、4个月分别采集小鼠血样进行hIDS酶活性分析。结果显示，在未治疗的MPS II小鼠血浆中hIDS活性非常低，而在载体治疗7天后两个治疗组小鼠血液循环中即可检测到hIDS酶活性的显著增加，两个治疗组小鼠体内hIDS活性分别达到MPS II小鼠的1260倍(1E14 vg/kg)和405倍(1E13 vg/kg)，呈现剂量依赖性(图3A,***p<0.001)。载体治疗1个月后，两个载体治疗组hIDS活性分别达到MPS II小鼠的9000倍(1E14 vg/kg)和5500倍(1E13 vg/kg)(图3B,*p<0.05,***p<0.001)。2个月后，治疗组hIDS活性分别达到MPS II小鼠的17000倍(1E14 vg/kg)和11480倍(1E13vg/kg)，hIDS酶活性水平持续升高(图3C,**p<0.01,***p<0.001)。3个月后，两个载体治疗组hIDS活性分别达到MPS II小鼠的5800倍(AAV9-CB-hIDS，1E14 vg/kg)和5570倍(AAV9-CB-hIDS，1E13 vg/kg)，其中，低剂量组hIDS活性水平与高剂量AAV9组接近(图3D,***p<0.001)。4个月后，两个载体治疗组hIDS活性分别达到MPS II小鼠的4370倍(AAV9-CB-hIDS，1E14 vg/kg)和3330倍(AAV9-CB-hIDS，1E13 vg/kg)，两组小鼠循环中仍可检测到高水平的hIDS酶活性(图3E,***p<0.001)。以上研究结果证实，利用AAV转导人IDS基因至MPS II小鼠可迅速且持续恢复循环中hIDS酶的活性。

本实施例在药物注射4个月后，检测各组织hIDS酶活性水平。结果显示，在未治疗的MPS II小鼠大脑、肝脏、脾脏等多个组织中hIDS活性非常低，而两剂量治疗组小鼠大脑和外周组织器官中hIDS酶活性显著提高，接近或超过WT水平。两个治疗组大脑中hIDS活性分别达到MPS II小鼠的17.5倍(1E14 vg/kg)和6.5倍(1E13 vg/kg)。脑中hIDS酶活分别达到WT小鼠的92％(1E14 vg/kg)和34％(1E13 vg/kg)，证实AAV9-CB-ohIDS可以恢复CNS内hIDS酶活性，其中高剂量组可使其恢复至接近WT水平(图4A,**p<0.01)。两个治疗组外周组织器官中hIDS活性都得到了超生理水平的恢复，超过WT水平，与未治疗组存在显著性差异(图4B-G,*p<0.05**p<0.01,***p<0.001)。

(2)hIDS酶免疫组化分析：

本实施例在药物注射4个月后，利用人IDS蛋白抗体检测小鼠心脏、脾脏、肾脏、肺、脑、肝脏和肌肉组织中hIDS的表达及分布。免疫组化的结果与组织hIDS活性相关。结果显示，未经载体治疗的MPS II小鼠的脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺和肌肉组织中均不表达hIDS，而在低剂量和高剂量载体治疗组小鼠的外周组织器官和大脑中都检测到不同水平的hIDS表达(图4)。在脑组织中，低剂量治疗组小鼠仅观察到微弱的hIDS表达，而高剂量治疗组小鼠脑中hIDS的表达水平较高。肝脏组织中，高剂量治疗组染色最强；脾脏和肺脏中，两个AAV载体治疗组均检测到高水平的hIDS阳性信号；肾脏和肌肉组织中，高剂量治疗组hIDS表达较强，低剂量治疗组表达较弱(图5)。

以上数据显示，不同剂量AAV9-CB-ohIDS可以在小鼠的CNS和外周组织器官中广泛表达hIDS蛋白，且高剂量AAV9-CB-hIDS(1E14 vg/kg)能够在组织中表达相对高水平的hIDS。

(3)组织中GAG以及尿液中HS含量测定：

为了评估AAV9-CB-ohIDS递送在MPS II小鼠中的治疗效果，本实施例分析注射后4个月MPS II小鼠组织中GAG的水平及尿液样本中的HS含量。结果显示，接受病毒载体治疗的MPS II小鼠，其肝脏、肾脏、肺和脾脏组织中GAG含量均显著降低，与未接受治疗的MPS II小鼠组织的GAG水平均具有显著性差异(图6)。病毒载体治疗后小鼠肝脏中GAG含量降低至未治疗组的5％-8％，肾脏中GAG含量降低至未治疗组的4％-10％，肺中GAG含量降低至未治疗组的5％-15％，脾脏中GAG水平降低至未治疗组的25％-40％。其中，1E14 vg/kg治疗组小鼠体内GAG水平得到最大程度的降低，治疗效果最为显著(图6A,**p<0.01,***p<0.001)。两组接受病毒载体治疗的MPS II小鼠心脏组织中GAG含量降低至未治疗组小鼠的40％，两组之间没有显著性差异(图6B,*p<0.05)。AAV9-CB-ohIDS载体处理后MPS II小鼠肌肉组织中GAG含量与未治疗组相比没有显著性差异(图6B,*p<0.05)。1E14 vg/kg治疗组小鼠脑中GAG水平降低至未治疗水平的25.7％，1E13 vg/kg治疗组小鼠脑中GAG水平降低至未治疗组的64.0％。上述实验结果证实，高剂量和低剂量的AAV9-CB-ohIDS递送都可有效降低小鼠脑内GAG含量(图6B,***p<0.001)。

此外，收集小鼠尿液样本并通过LC-MS/MS检测HS含量。结果显示，与未治疗组小鼠相比，载体治疗组的小鼠尿液中HS含量降低至未治疗组的12％-14％，其中1E14 vg/kg治疗组小鼠尿液中HS含量比低剂量治疗组更低，而WT组小鼠的尿液样本的HS水平为未治疗组的10％左右，表明经载体处理后MPS II小鼠尿液中HS含量与WT水平接近，与组织中测得的GAG水平一致(图6C,*p<0.05,***p<0.001)。

(4)组织甲苯胺蓝染色：

为了进一步观察溶酶体中GAG贮积的变化，本实施例对载体治疗4个月后的小鼠组织进行甲苯胺蓝染色。组织的甲苯胺蓝染色程度通常与组织GAG水平相关。

结果显示，在未治疗的MPS II小鼠脑中观察到大量的溶酶体储存病变的细胞，而经过载体处理溶酶体储存病变的细胞数量明显减少，1E14 vg/kg组细胞中溶酶体贮积GAG明显减少。这进一步证明AAV9-CB-ohIDS能有效校正CNS的溶酶体储存病理学。心脏中，1E14vg/kg组细胞中溶酶体贮积GAG明显减少；肝脏中，与未治疗组相比，AAV载体治疗后细胞溶酶体中GAG贮积明显下降；肌肉组织中，AAV载体治疗后细胞溶酶体中GAG的贮积显著降低，表明AAV9-CB-ohIDS可以纠正外周组织器官的溶酶体储存病理学(图7)。

实施例6：治疗后模型小鼠骨骼异常检测

MPS II小鼠随着年龄的增长，逐渐出现颅面畸形和手指增粗等骨骼异常。在本实施例中使用X射线照相检测6个月龄小鼠的颅面畸形情况。

结果显示，未接受载体治疗的MPS II小鼠的颧骨弓出现明显的增厚。然而，当对小鼠进行AAV载体治疗后，所有治疗组小鼠颧骨弓增厚的现象都有明显缓解，与WT相似(图8)。以上X射线结果说明，载体治疗后抑制了MPS II小鼠骨骼畸形化。

实施例7：治疗后模型小鼠神经炎症改善分析

脑中星形胶质细胞的增多与CNS炎症相关。本实施例中主要进行脑组织的胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)、小胶质细胞特异性抗体(ionizedcalcium binding adapter molecule 1,Iba-1)免疫荧光研究。比较分析了AAV载体治疗后对于CNS炎症的影响。结果显示，相较于WT组的小鼠，未治疗组MPS II小鼠脑内大脑皮层和海马区域GFAP阳性细胞数明显增多，证实6个月龄的未治疗MPS II小鼠脑中星形细胞增多且存在神经炎症。接受载体治疗后，1E14 vg/kg组小鼠大脑皮层GFAP阳性信号明显减少，减轻了GAG积累而引起的神经炎症，1E13 vg/kg治疗组小鼠大脑皮层和海马区域GFAP阳性信号虽然较WT和未治疗组低，但是与1E14 vg/kg组相比对炎症的减轻程度较低(图9)。

同时，小胶质细胞作为CNS的免疫细胞，在CNS发生病变或者损伤时能够快速地感知并检测到神经障碍并被活化。活化的小胶质细胞在数量与形态上会发生显著的变化，因此本实施例检查MPS II神经功能障碍是否与小胶质细胞介导的炎症反应有关，通过对载体治疗4个月后小鼠脑组织的小胶质细胞标记物Iba-1进行免疫荧光染色来反映炎症反应。结果显示，与WT对照组相比，6个月龄未经治疗的MPS II小鼠脑中Iba-1阳性小胶质细胞的总细胞数明显增多，且小胶质细胞的形态特征发生变化(细胞体增大)，表明MPS II小鼠的CNS损伤与小胶质细胞介导的炎症反应相关。在接受载体治疗后，小鼠脑中小胶质细胞活化水平明显降低，其中1E14 vg/kg治疗组Iba-1阳性细胞数最少，细胞体面积最小，表明载体治疗有效降低了MPS II小鼠脑内的炎症反应(图10)。

实施例8：治疗后模型小鼠认知功能检测

本实施例使用Morris水迷宫试验评估载体治疗后MPS II小鼠(6个月龄)的运动能力和空间学习记忆能力的变化。

结果显示，在训练阶段，未治疗MPS II小鼠发现隐藏平台的潜伏期较长，表明学习能力显著下降；而接受AAV9-CB-ohIDS治疗的MPS II小鼠找到隐藏平台的时间与WT水平接近，表明治疗后明显改善小鼠的学习能力，达到与WT小鼠类似的水平(图11A)；与未治疗MPSII小鼠相比，载体治疗组小鼠的游泳速度有所提高，且接近WT水平，表明运动能力得到显著改善(图11B,*p<0.05,**p<0.01)。

进一步统计60秒内小鼠在目标象限的停留时间及游泳距离显示，与未治疗组相比，1E14 vg/kg治疗组小鼠在目标象限的驻留时间显著延长，但1E13 vg/kg治疗组小鼠的停留时间略低于高剂量组(图11C)。未治疗组小鼠的游泳距离较短，表明MPS II小鼠运动能力受到严重损伤，而接受载体治疗的两组MPS II小鼠游泳距离显著延长至WT水平，表明运动能力恢复正常化(图11C-D,*p<0.05,**p<0.01)。从小鼠的运动轨迹图中可观察到载体治疗后小鼠在目标1号象限的停留时间延长，穿越目标平台的次数增多，与WT运动轨迹相似(图11E)。

以上数据表明，治疗后小鼠的认知学习和运动能力都有明显改善。并且，1E14 vg/kg治疗组较1E13 vg/kg组对于MPS II小鼠行为学方面的改善更加明显。

实施例9：治疗后模型小鼠肝脏损伤检测

为了探究AAV病毒颗粒在短期和长期内是否会对小鼠肝脏造成损伤以及损伤程度，本实施例选定谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartateaminotransferase，AST)作为检测指标，分别于AAV载体尾静脉注射后7天和3个月对小鼠血浆中ALT和AST含量进行检测。

结果表明，载体治疗7天后，相较未治疗组和WT对照组，1E13 vg/kg和1E14 vg/kg两个治疗组ALT、AST水平无明显升高，说明高滴度的AAV病毒颗粒在短期内没有引起小鼠肝脏的ALT、AST指标异常升高，进一步说明本发明设计的药物载体在高剂量情况下没有引起肝急性毒性，能保持较好的安全性(图12A、B)。治疗3个月后，1E13 vg/kg、1E14vg/kg治疗组小鼠血浆中ALT含量与未治疗组、WT对照组相比均无显著性差异。两药物治疗组的小鼠血浆中AST水平与未治疗组、WT对照组相比均无显著性差异，说明接受载体治疗4个月后小鼠体肝功能仍维持正常(图12C-D)。

同时本实施例通过小鼠肝脏HE染色对治疗后肝脏的结构进行了分析。结果显示，6个月龄未经治疗的MPS II模型小鼠肝脏切片中可观察到胞浆中出现大量空泡，有明显的多糖类物质累积。经过载体治疗后三组小鼠肝脏胞浆丰富，核质对比明显，没有明显的多糖类物质累积，且没有观察到肝坏死、肝硬化或肝癌等肝脏病变损伤(图12E)。

实施例10.治疗后MPS II小鼠血清内AAV9和hIDS抗体分析

为了探究载体处理后MPS II小鼠血液中AAV9中和抗体的产生情况，我们使用纯化的AAV9-CB-ohIDS载体作为抗原，利用人肝癌细胞系huh7进行中和抗体检测。在AAV9-CB-ohIDS载体注射后4个月眼眶取血。结果如表1所示，AAV9-CB-ohIDS载体注射4个月后，所有治疗组小鼠AAV中和抗体滴度都达到了最大值1:32，显示AAV中和抗体阳性。进一步，我们使用全长hIDS蛋白作为抗原，通过ELISA测定血液样品抗hIDS的抗体。结果显示，载体处理4个月后，治疗组小鼠没有产生抗hIDS的抗体。

以上结果说明，本研究的AAV9-CB-ohIDS具有明显的安全性。

表1 MPS II小鼠抗AAV和hIDS抗体分析

实施例11.其他优化的人IDS载体

1)质粒载体的构建

本发明人还设计得到了以下优化的人IDS序列：ohIDS-1(其序列如SEQ ID NO：8所示)、ohIDS-2(其序列如SEQ ID NO：9所示)、ohIDS-3(其序列如SEQ ID NO：10所示)和ohIDS-4序列(其序列如SEQ ID NO：11所示)，并通过RNAfold对优化后的序列进行了分析。

以本实验室自有的pAAV2.1单链重组AAV载体(其序列如SEQ ID NO：12所示)为载体骨架构建载体。将原有骨架上的真核表达元件替换为CB启动子(其序列如SEQ ID NO：3所示)、SV40内含子(其序列如SEQ ID NO：2所示)、Kozak序列(5’-GCCACC-3’)、原始的人IDS(hIDS)(其序列如SEQ ID NO：7所示)或优化的人IDS(ohIDS-1、ohIDS-2、ohIDS-3和ohIDS-4)，以及bGH poly A(其序列如SEQ ID NO：6所示)。

分别将合成的hIDS、ohIDS-1、ohIDS-2、ohIDS-3和ohIDS-4序列通过FseI和BstBI限制性核酸内切酶(New England Biolabs)酶切连入pAAV2.1质粒骨架，构建成为pCB-hIDS、pCB-ohIDS-1、pCB-ohIDS-2、pCB-ohIDS-3、pCB-ohIDS-4载体。

2)hIDS蛋白的表达

将生长良好的HEK293细胞均匀铺于六孔板中，待细胞的生长汇合度达到80-90％时，用聚乙烯亚胺(PEI，HEDE Biotech)进行转染。6个孔分别为：pCB-ohIDS-1质粒+PEI；pCB-ohIDS-2质粒+PEI；pCB-ohIDS-3质粒+PEI；pCB-ohIDS-4质粒+PEI；pCB-hIDS质粒+PEI；未转染空白对照。转染48小时后，收集细胞进行裂解，提取蛋白进行蛋白质印迹法检测，以确定hIDS蛋白的表达情况。

图13显示，pCB-ohIDS-1、pCB-ohIDS-2和pCB-ohIDS-4转染组的蛋白表达水平均显著高于pCB-hIDS转染组。结果表明，ohIDS-1、ohIDS-2和ohIDS-4序列比原始hIDS序列具有更高水平的表达，因此可用于制备治疗粘多糖贮积症II型的药物。

综上，本发明获得了表达效率更高的优化的人IDS序列。包含本发明ohIDS序列的载体和药物可以补充MPS II外周和中枢神经系统中IDS的缺失，通过使细胞重新高效持续地表达IDS，水解过多积累的GAG，达到高效治疗MPS II的目的。本发明的载体和药物预期可以治疗甚至逆转严重型MPS II患者的CNS损伤，显示出巨大的治愈MPS II疾病的潜力。

虽然通过参照本发明的某些优选实施方式，已经对本发明进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本发明的精神和范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 用于治疗粘多糖贮积症Ⅱ型的腺相关病毒载体、药物及其应用

<130> 209967

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的人密码子优化基因的DNA序列（ohIDS）

<400> 1

gccaccatgc ctccacctag aactggaaga ggcctgctgt ggctgggcct tgtgctctct 60

tctgtgtgtg tggccctggg ctctgagaca caggccaact ctacaacaga tgccctgaat 120

gtgctgctga tcattgtgga tgacctgagg cctagcctgg gctgctatgg ggacaaactt 180

gtcagaagcc ccaacattga ccagctggcc tctcacagcc tgctgttcca gaatgccttt 240

gctcagcaag ctgtgtgtgc ccctagcaga gtgtccttcc tgacaggcag aaggcctgac 300

accaccagac tgtatgactt caacagctat tggagagtgc atgctggcaa cttcagcaca 360

atccctcagt acttcaaaga aaatggctat gtgaccatgt ctgtgggcaa agtgtttcac 420

cctggcatca gctccaacca cacagatgac agcccctaca gctggtcctt tccaccttat 480

caccccagct ctgagaagta tgagaacacc aagacctgca gaggccctga tggggaactg 540

catgccaatc tgctgtgccc tgtggatgtg ctggatgtcc ctgagggcac cctgcctgat 600

aagcagtcta cagagcaggc catccagctg ctggaaaaga tgaagacctc tgctagcccc 660

ttcttcctgg ctgtgggcta ccacaagcct cacatccctt tcagataccc caaagagttc 720

cagaagctgt accctctgga aaacatcaca ctggcccctg atcctgaggt gccagatgga 780

cttcctcctg tggcctacaa tccctggatg gacatcagac agagggaaga tgtgcaggcc 840

ctgaatatct ctgtgcctta tggccccatt cctgtggact tccagagaaa gatcaggcag 900

agctactttg cctctgtgtc ctacctggac acccaagtgg gcagactgct gagtgccctg 960

gatgatctgc agctggccaa cagcaccatc attgccttca cctctgacca tggatgggcc 1020

ctgggagagc atggagagtg ggccaagtac agcaactttg atgtggccac tcatgtgccc 1080

ctcatcttct atgtgcctgg cagaacagcc agcctgcctg aggctgggga gaagctgttc 1140

ccatatctgg acccctttga ctctgcctct cagctgatgg aacctggcag acagtccatg 1200

gatctggtgg aactggtgtc tctgttcccc acactggctg gcctggctgg acttcaggtt 1260

ccaccaagat gtcctgtgcc tagcttccat gtggaactgt gcagagaggg caagaacctg 1320

ctgaagcact tcagattcag agatcttgaa gaggacccct acctgcctgg caaccccaga 1380

gagctgattg cctactctca gtaccccagg ccatctgaca tcccacagtg gaactctgac 1440

aagcccagcc tgaaggacat caagatcatg ggctacagca tcaggaccat tgactacaga 1500

tacacagtgt gggttggatt caaccctgat gagttcctgg ccaacttctc tgatatccat 1560

gctggggagc tgtactttgt ggactctgac ccactgcagg accacaacat gtacaatgac 1620

agccaaggtg gagatctgtt tcagctgctg atgccttgaa ccgtcgac 1722

<210> 2

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 猿猴病毒40内含子DNA序列

<400> 2

gtaagttaag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 99

<210> 3

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CB启动子DNA序列（CBA启动子+CMV增强子）

<400> 3

tggtcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gaccccgccc 60

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 120

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 180

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 240

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc 300

ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 360

ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg 420

cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg aaaggtgcgg cggcagccaa tcaaagcggc 480

gcgctccgaa agtttccttt tatggcaagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcaa 540

accgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc accgcggtgg cggcctaaag tcgacgagga 600

actgaaaaac cagaaagtta actg 644

<210> 4

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 左AAV2 ITR

<400> 4

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggcca 111

<210> 5

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 右AAV2 ITR

<400> 5

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ccttaattaa cctaa 149

<210> 6

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 牛生长激素基因多聚腺苷酸化元件的DNA序列

<400> 6

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 214

<210> 7

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIDS

<400> 7

atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60

tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120

ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180

tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300

cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420

atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480

tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540

aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600

agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660

ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720

ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780

cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840

atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900

tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960

cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020

gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080

ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140

ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200

gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260

cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320

cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380

attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440

agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500

gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560

gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620

ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1707

<210> 8

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的人密码子优化基因的DNA序列（ohIDS-1）

<400> 8

gccaccatgc ctccacctag aactggaaga ggcctgctgt ggctgggcct tgtgctctct 60

tctgtgtgtg tggccctggg ctctgagaca caggccaact ctacaacaga tgccctgaat 120

gtgctgctga tcattgtgga tgacctgagg cctagcctgg gctgctatgg ggacaaactt 180

gtcagaagcc ccaacattga ccagctggcc tctcacagcc tgctgttcca gaatgccttt 240

gctcagcaag ctgtgtgtgc ccctagcaga gtgtccttcc tgacaggcag aaggcctgac 300

accaccagac tgtatgactt caacagctat tggagagtgc atgctggcaa cttcagcaca 360

atccctcagt acttcaaaga aaatggctat gtgaccatgt ctgtgggcaa agtgtttcac 420

cctggcatca gctccaacca cacagatgac agcccctaca gctggtcctt tccaccttat 480

caccccagct ctgagaagta tgagaacacc aagacctgca gaggccctga tggggaactg 540

catgccaatc tgctgtgccc tgtggatgtg ctggatgtcc ctgagggcac cctgcctgat 600

aagcagtcta cagagcaggc catccagctg ctggaaaaga tgaagacctc tgctagcccc 660

ttcttcctgg ctgtgggcta ccacaagcct cacatccctt tcagataccc caaagagttc 720

cagaagctgt accctctgga aaacatcaca ctggcccctg atcctgaggt gccagatgga 780

cttcctcctg tggcctacaa tccctggatg gacatcagac agagggaaga tgtgcaggcc 840

ctgaatatct ctgtgcctta tggccccatt cctgtggact tccagagaaa gatcaggcag 900

agctactttg cctctgtgtc ctacctggac acccaagtgg gcagactgct gagtgccctg 960

gatgatctgc agctggccaa cagcaccatc attgccttca cctctgacca tggatgggcc 1020

ctgggagagc atggagagtg ggccaagtac agcaactttg atgtggccac tcatgtgccc 1080

ctcatcttct atgtgcctgg cagaacagcc agcctgcctg aggctgggga gaagctgttc 1140

ccatatctgg acccctttga ctctgcctct cagctgatgg aacctggcag acagtccatg 1200

gatctggtgg aactggtgtc tctgttcccc acactggctg gcctggctgg acttcaggtt 1260

ccaccaagat gtcctgtgcc tagcttccat gtggaactgt gcagagaggg caagaacctg 1320

ctgaagcact tcagattcag agatcttgaa gaggacccct acctgcctgg caaccccaga 1380

gagctgattg cctactctca gtaccccagg ccatctgaca tcccacagtg gaactctgac 1440

aagcccagcc tgaaggacat caagatcatg ggctacagca tcaggaccat tgactacaga 1500

tacacagtgt gggttggatt caaccctgat gagttcctgg ccaacttctc tgatatccat 1560

gctggggagc tgtactttgt ggactctgac ccactgcagg accacaacat gtacaatgac 1620

agccaaggtg gagatctgtt tcagctgctg atgccttga 1713

<210> 9

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的人密码子优化基因的DNA序列（ohIDS-2）

<400> 9

gccaccatgc ctccacctag aactggaaga ggcctgctgt ggctgggcct tgtgctctct 60

tctgtgtgtg tggccctggg ctctgagaca caggccaact ctacaacaga tgccctgaat 120

gtgctgctga tcattgtgga tgacctgagg cctagcctgg gctgctatgg ggataagctt 180

gtcagaagcc ccaacattga ccagctggcc tctcacagcc tgctgttcca gaatgccttt 240

gctcagcaag ctgtgtgtgc ccctagcaga gtgtccttcc tgacaggcag aaggcctgac 300

accaccagac tgtatgactt caacagctat tggagagtgc atgctggcaa cttcagcaca 360

atccctcagt acttcaaaga aaatggctat gtgaccatgt ctgtgggcaa agtgtttcac 420

cctggcatca gctccaacca cacagatgac agcccctaca gctggtcctt tccaccttat 480

caccccagct ctgagaagta tgagaacacc aagacctgca gaggccctga tggggaactg 540

catgccaatc tgctgtgccc tgtggatgtg ctggatgtcc ctgagggcac cctgcctgat 600

aagcagtcta cagagcaggc catccagctg ctggaaaaga tgaagacctc tgctagcccc 660

ttcttcctgg ctgtgggcta ccacaagcct cacatccctt tcagataccc caaagagttc 720

cagaagctgt accctctgga aaacatcaca ctggcccctg atcctgaggt gccagatgga 780

cttcctcctg tggcctacaa tccctggatg gacatcagac agagggaaga tgtgcaggcc 840

ctgaatatct ctgtgcctta tggccccatt cctgtggact tccagagaaa gatcaggcag 900

agctactttg cctctgtgtc ctacctggac acccaagtgg gcagactgct gagtgccctg 960

gatgatctgc agctggccaa cagcaccatc attgccttca cctctgacca tggatgggcc 1020

ctgggagagc atggagagtg ggccaagtac agcaactttg atgtggccac tcatgtgccc 1080

ctcatcttct atgtgcctgg cagaacagcc agcctgcctg aggctgggga gaagctgttc 1140

ccatatctgg acccctttga ctctgcctct cagctgatgg aacctggcag acagtccatg 1200

gatctggtgg aactggtgtc tctgttcccc acactggctg gcctggctgg acttcaggtt 1260

ccaccaagat gtcctgtgcc tagcttccat gtggaactgt gcagagaggg caagaacctg 1320

ctgaagcact tcagattcag agatcttgaa gaggacccct acctgcctgg caaccccaga 1380

gagctgattg cctactctca gtaccccagg ccatctgaca tcccacagtg gaactctgat 1440

aagcccagcc tgaaggacat caagatcatg ggctacagca tcaggaccat tgactacaga 1500

tacacagtgt gggttggatt caaccctgat gagttcctgg ccaacttctc tgatatccat 1560

gctggggagc tgtactttgt ggactctgac ccactgcagg accacaacat gtacaatgac 1620

agccaaggtg gagatctgtt tcagctgctg atgccttga 1713

<210> 10

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的人密码子优化基因的DNA序列（ohIDS-3）

<400> 10

gccaccatgc ctccacctag aactggaaga ggcctgctgt ggctgggcct tgtgctctct 60

tctgtgtgtg tggccctggg ctctgagaca caggccaact ctacaacaga tgccctgaat 120

gtgctgctga tcattgtgga tgacctgagg cctagcctgg gctgctatgg ggataagctt 180

gtcagaagcc ccaacattga ccagctggcc tctcacagcc tgctgttcca gaatgccttt 240

gctcagcaag ctgtgtgtgc ccctagcaga gtgtccttcc tgacaggcag aaggcctgac 300

accaccagac tgtatgactt caacagctat tggagagtgc atgctggcaa cttcagcaca 360

atccctcagt acttcaaaga aaatggctat gtgaccatgt ctgtgggcaa agtgtttcac 420

cctggcatca gctccaacca cacagatgac agcccctaca gctggtcctt tccaccttat 480

caccccagct ctgagaagta tgagaacacc aagacctgca gaggccctga tggggaactg 540

catgccaatc tgctgtgccc tgtggatgtg ctggatgtcc ctgagggcac cctgcctgat 600

aagcagtcta cagagcaggc catccagctg ctggaaaaga tgaagacctc tgctagcccc 660

ttcttcctgg ctgtgggcta ccacaagcct cacatccctt tcagataccc caaagagttc 720

cagaagctgt accctctgga aaacatcaca ctggcccctg atcctgaggt gccagatgga 780

cttcctcctg tggcctacaa tccctggatg gacatcagac agagggaaga tgtgcaggcc 840

ctgaatatct ctgtgcctta tggccccatt cctgtggact tccagagaaa gatcaggcag 900

agctactttg cctctgtgtc ctacctggac acccaagtgg gcagactgct gagtgccctg 960

gatgatctgc agctggccaa cagcaccatc attgccttca cctctgacca tggatgggcc 1020

ctgggagagc atggagagtg ggccaagtac agcaactttg atgtggccac tcatgtgccc 1080

ctcatcttct atgtgcctgg cagaacagcc agcctgcctg aggctgggga gaagctgttc 1140

ccatatctgg acccctttga ctctgcctct cagctgatgg aacctggcag acagtccatg 1200

gatctggtgg aactggtgtc tctgttcccc acactggctg gcctggctgg acttcaggtt 1260

ccaccaagat gtcctgtgcc tagcttccat gtggaactgt gcagagaggg caagaacctg 1320

ctgaagcact tcagattcag agatcttgaa gaggacccct acctgcctgg caaccccaga 1380

gagctgattg cctactctca gtaccccagg ccatctgaca tcccacagtg gaactctgat 1440

aagcccagcc tgaaggacat caagatcatg ggctacagca tcaggaccat tgactacaga 1500

tacacagtgt gggttggatt caaccctgat gagttcctgg ccaacttctc tgatatccat 1560

gctggggagc tgtactttgt ggactctgac ccactgcagg accacaacat gtacaatgac 1620

agccaaggtg gagatctgtt tcagctgctg atgccttga 1713

<210> 11

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的人密码子优化基因的DNA序列（ohIDS-4）

<400> 11

gccaccatgc ctccacctag aactggaaga ggcctgctgt ggctgggcct tgtgctctct 60

tctgtgtgtg tggccctggg ctctgagaca caggccaact ctacaacaga tgccctgaat 120

gtgctgctga tcattgtgga tgacctgagg cctagcctgg gctgctatgg ggataagctt 180

gtcagaagcc ccaacattga ccagctggcc tctcacagcc tgctgttcca gaatgccttt 240

gctcagcaag ctgtgtgtgc ccctagcaga gtgtccttcc tgacaggcag aaggcctgac 300

accaccagac tgtatgactt caacagctat tggagagtgc atgctggcaa cttcagcaca 360

atccctcagt acttcaaaga aaatggctat gtgaccatgt ctgtgggcaa agtgtttcac 420

cctggcatca gctccaacca cacagatgac agcccctaca gctggtcctt tccaccttat 480

caccccagct ctgagaagta tgagaacacc aagacctgca gaggccctga tggggaactg 540

catgccaatc tgctgtgccc tgtggatgtg ctggatgtcc ctgagggcac cctgcctgat 600

aagcagtcta cagagcaggc catccagctg ctggaaaaga tgaagacctc tgctagcccc 660

ttcttcctgg ctgtgggcta ccacaagcct cacatccctt tcagataccc caaagagttc 720

cagaagctgt accctctgga aaacatcaca ctggcccctg atcctgaggt gccagatgga 780

cttcctcctg tggcctacaa tccctggatg gacatcagac agagggaaga tgtgcaggcc 840

ctgaatatct ctgtgcctta tggccccatt cctgtggact tccagagaaa gatcaggcag 900

agctactttg cctctgtgtc ctacctggac acccaagtgg gcagactgct gagtgccctg 960

gatgatctgc agctggccaa cagcaccatc attgccttca cctctgacca tggatgggcc 1020

ctgggagagc atggagagtg ggccaagtac agcaactttg atgtggccac tcatgtgccc 1080

ctcatcttct atgtgcctgg cagaacagcc agcctgcctg aggctgggga gaagctgttc 1140

ccatatctgg acccctttga ctctgcctct cagctgatgg aacctggcag acagtccatg 1200

gatctggtgg aactggtgtc tctgttcccc acactggctg gcctggctgg acttcaggtt 1260

ccaccaagat gtcctgtgcc tagcttccat gtggaactgt gcagagaggg caagaacctg 1320

ctgaagcact tcagattcag agatcttgaa gaggacccct acctgcctgg caaccccaga 1380

gagctgattg cctactctca gtaccccagg ccatctgaca tcccacagtg gaactctgat 1440

aagcccagcc tgaaggacat caagatcatg ggctacagca tcaggaccat tgactacaga 1500

tacacagtgt gggttggatt caaccctgat gagttcctgg ccaacttctc tgatatccat 1560

gctggggagc tgtactttgt ggactctgac ccactgcagg accacaacat gtacaatgac 1620

agccaaggtg gagatctgtt tcagctgctg atgccttga 1713

<210> 12

<211> 4312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pAAV2.1单链重组AAV载体

<400> 12

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180

aggaagatcg gaattctcta gaacgcgtgg tacctctggt cgttacataa cttacggtaa 240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 480

tacttggcag tacatctact cgaggccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 660

aggcggaaag gtgcggcggc agccaatcaa agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 720

gcaaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcaaaccg cgcggcgggc gggagcggga 780

tcagccaccg cggtggcggc ctaaagtcga cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg 840

gtaagttaag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 900

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct 960

gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg ccggccaaac agtagttgac aattaatcat 1020

cggcatagta tatcggcata gtataatacg actcactata ggaggacctg agctagtcga 1080

cgtcccatgg ccattcgaat taaaccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 1140

gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 1200

tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 1260

tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 1320

tgctggggac tcgagtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 1380

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 1440

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 1500

gccttaatta acctaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 1560

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 1620

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 1680

cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 1740

cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 1800

tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 1860

ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 1920

cgccccgata gacggttttt cgccctttga cgctggagtt cacgttcctc aatagtggac 1980

tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 2040

ggatttttcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 2100

cgaattttaa caaaatatta acgtttataa tttcaggtgg catctttcgg ggaaatgtgc 2160

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 2220

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 2280

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 2340

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 2400

aactggatct caatagtggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 2460

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 2520

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 2580

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 2640

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 2700

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 2760

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gtaatggtaa 2820

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 2880

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 2940

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 3000

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 3060

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 3120

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 3180

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 3240

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 3300

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 3360

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 3420

gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 3480

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 3540

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 3600

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 3660

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 3720

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 3780

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 3840

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 3900

cctttttacg gttcctggcc ttttgctgcg gttttgctca catgttcttt cctgcgttat 3960

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 4020

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 4080

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 4140

actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 4200

cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 4260

aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccag atttaattaa gg 4454

Claims

1.一种ohIDS序列，其中，所述ohIDS序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的ohIDS序列，其中，所述ohIDS序列包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示的序列，优选为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11所示的序列。

3.一种腺相关病毒载体，其中，所述腺相关病毒载体包含权利要求1或2所述的ohIDS序列。

4.如权利要求3所述的腺相关病毒载体，其中，所述腺相关病毒载体还包含：启动子和猿猴病毒40内含子。

5.如权利要求4所述的腺相关病毒载体，其中，所述猿猴病毒40内含子为与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的腺相关病毒载体，其中，所述猿猴病毒40内含子包含SEQ ID NO：2所示的序列，优选为SEQ ID NO：2所示的序列。

7.如权利要求3-6中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述启动子为非特异性启动子，优选为由人巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子组成的CB启动子。

8.如权利要求7所述的腺相关病毒载体，其中，所述CB启动子为与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，优选为与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少96％、97％、98％、99％或100％同源性的核苷酸序列，更优选为SEQ ID NO：3所示的序列。

9.如权利要求3至8中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，腺相关病毒载体还包含：AAV2的反向末端重复序列和/或牛生长激素基因多聚腺苷酸序列。

10.如权利要求9所述的腺相关病毒载体，其中，AAV2的反向末端重复序列如SEQ IDNO：4和/或SEQ ID NO：5所示；和/或，牛生长激素基因多聚腺苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

11.如权利要求3至10中任一项所述的腺相关病毒载体，其中，所述腺相关病毒选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10，优选为AAV9。

12.权利要求3至11中任一项所述的腺相关病毒载体在制备用于治疗粘多糖贮积症II型的药物中的应用，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述腺相关病毒载体。

13.如权利要求12所述的应用，其中，所述施用包括静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内、病灶内或鼻内施用，优选为尾静脉注射。

14.权利要求3至11中任一项所述的腺相关病毒载体在制备用于改善中枢神经系统损伤的药物中的应用，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述腺相关病毒载体。

15.一种用于治疗粘多糖贮积症II型的药物，其包含权利要求3至11中任一项所述的腺相关病毒载体和药学上可接受的载体。

16.如权利要求15所述的药物，其中，所述药学上可接受的载体包括临床上有用的溶剂、分散介质、低温保护剂、等渗剂和吸收延迟剂。

17.如权利要求15或16所述的药物，其中，所述粘多糖贮积症II型选自轻微型和严重型，优选为严重型。