JP2777074B2 - ポリペプチドおよびその製造方法 - Google Patents

ポリペプチドおよびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】発明の背景 遺伝子工学の１つの特徴は、真核生物起源に由来する外
来ＤＮＡ配列を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）又はその他の微生物に挿入することにある。遺伝
子工学で得られる別の優れた特徴は、外来ＤＮＡがコー
ドしているポリペプチドの産生をこれら微生物中で誘導
することにある。ポリペプチドの産生は２段階プロセス
で生じ、各段階が多数のサブステップを含むと考えられ
ている。２つの段階は転写段階と翻訳段階である。ポリ
ペプチドを効率的に量産するためにはプロセスの２つの
段階が共に効率的に行なわれる必要がある。転写によっ
て遺伝子（ＤＮＡ）からｍＲＮＡが生成し、翻訳によっ
てｍＲＮＡからポリペプチドが生成する。転写プロセス
の重要なサブステップは開始、即ちプロモーター−オペ
レーター領域へのＲＮＡポリメラーゼの結合である。プ
ロモーター領域を構成するデオキシリボヌクレオチド塩
基の配列を変更し、これによってプロモーターの相対的
効率を加減し得る。この効率はＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーターに対する親和性に左右される。翻訳効率はｍ
ＲＮＡの安定性に影響される。ｍＲＮＡ安定性が増すと
翻訳効率が上がる。ｍＲＮＡ安定性の正確な決定因子は
正確にはわかっていないが、その塩基の配列によって決
定されるｍＲＮＡの二次構造が安定性に寄与することが
判明している。翻訳の最初のサブステップでは、シャイ
ン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列
又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）として知られるｍＲ
ＮＡ上の塩基配列にリボソームが結合する。リボソーム
がｍＲＮＡに沿ってＡＵＧ翻訳開始コドンまで移動する
とポリペプチド合成が開始される。これらのコドンは通
常、シャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ）部位から約１０塩基“下流に”存在する。翻訳効
率を高める要因の１つに、シャイン−ダルガルノ（Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）部位へのリボソームの結合
を増強することが含まれる。シャイン−ダルガルノ（Ｓ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列及びＡＵＧコドンの
領域でのｍＲＮＡの構造とシャイン−ダルガルノ（Ｓｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列からＡＵＧコドンまで
の間隔とは、夫々、翻訳効率の決定に関して重要な役割
を果たすことが判明している。翻訳効率に影響を与える
別の要因は、早期終結（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎ）及び転写減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏ
ｎ）である。減衰部位を除去することによって翻訳効率
を向上させることが可能である。細菌細胞中で真核生物
ポリペプチドを多量に産生する計画の障害となるのは、
多量のｍＲＮＡを生成する細胞が効率良く増殖できない
ことである。このような障害は、抑制というプロセスに
より転写を阻害することによって除去することができ
る。抑制に於いては、オペレーター領域に結合して転写
を阻害するタンパク阻害剤（リプレッサータンパク）の
作用によって遺伝子がスイッチオフされている。微生物
が所望の細胞密度まで増殖した後に、リプレッサーを破
壊するか又はリプレッサーの効果を凌駕し得る誘導物質
として知られる分子を添加することによって抑制されて
いる遺伝子を活性化する。λバクテリオファージ由来の
ＰＬプロモーターを含むプラスミド中での真核生物遺伝
子のクローニングに関しては文献中に多くの報告が見ら
れる［エッチ．ブイ．バーナード（Ｈ．Ｖ．Ｂｅｒｎａ
ｒｄ）らジーン（Ｇｅｎｅ）（１９７９）５，５９；シ
ー．デロム（Ｃ．Ｄｅｒｏｍ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）
（１９８２）１７，４５；ディー．ゲイセン（Ｄ．Ｇｈ
ｅｙｓｅｎ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８２）１
７，５５；ジェー．ヘジペス（Ｊ．Ｈｅｄｇｐｅｔｈ）
ら、モル．ジエン．ジエネット．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．）（１９７８）１６３，１９７；イー．レマ
ート（Ｅ．Ｒｅｍａｕｔ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１
９８１）１５，８１；アール．デリンク（Ｒ．Ｄｅｒｙ
ｎｃｋ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８０）
２８７，１９３）］。更に、１９８１年１２月１６日公
開の欧州特許出願第０４１，７６７号は、λバクテリオ
ファージ由来のＰＬプロモーターを含む発現ベクターを
記載している。しかしながら、これらの文献はいずれも
ＣＩＩリボソーム結合部位の使用については記載してい
ない。λバクテリオファージ由来のＰＬプロモーターと
ＣＩＩリボソーム結合部位とを含むベクターの使用につ
いては、エー．ビー．オッペンハイム（Ａ．Ｂ．Ｏｐｐ
ｅｎｈｅｉｍ）ら、ジェー．モル．バイオロ．（Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（１９８２）１５８，３２７並びに
エッチ．シマタケ（Ｈ．Ｓｈｉｍａｔａｋｅ）及びエ
ム．ローゼンベルグ（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ），ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８１）２９２，１２８に
記載されている。これらの刊行物は、高レベルのＣＩＩ
タンパクの産生について記載しているが、真核生物タン
パクの産生を包含又は記載していない。ＰＬプロモータ
ーとＣＩＩリボソーム結合部位を含む他のベクターも以
下の文献に記載されている。カーンティ・エム等（Ｃｏ
ｕｒｎｔｅｙ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．），ＰＮＡＳ（１９
８４）８１，６６９−６７３；ラウテンベルガー・ジェ
イ・エー等（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．），遺伝子（Ｇｅｎｅ），１９８３，２３，
７５−８４及びラウテンベルガー・ジェイ・エー等，サ
イエンス（１９８３），２２１，８５８−８６０。しか
しながら、これらに記載されたベクターではいずれもＣ
ＩＩプロテインのアミノ末端部分を含む融合タンパク質
が産生する。１９８２年にシャッマン（Ｓｈａｔｚｍａ
ｎ）及びローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）は第１
４回マイアミ．ウインター．シンポジウム（Ｍｉａｍｉ
Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）にポスターを提
出した［エー．アール．シャッマン（Ａ．Ｒ．Ｓｈａｔ
ｚｍａｎ）及びエム．ローゼンバーグ（Ｍ．Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ），第１４回マイアミウインターシンポジウム
（Ｍｉａｍｉ Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）抄
録９８頁［１９８２］］。この抄録には、λバクテリオ
ファージ由来のＰＬとＮｕｔとＣＩＩリボソーム結合部
位とを含むベクターを使用して“真核生物”ポリペプチ
ドを細菌宿主中で細胞タンパクの５％より高い量で合成
することが開示されているが、（ＳＶ４０小Ｔ（ｓｍａ
ｌｌ Ｔ）抗原は実際には真核生物ポリペプチドでなく
ウイルスタンパクであるし）、細菌宿主名が示されてい
ない、使用したオペレーターが定義されていない、複製
起点（開始点）も選択可能な表現型の遺伝子も同定され
ていない等の理由によって上記の開示は実施不能であ
る。このようなベクターを使用するこの系は、このベク
ターを安定に形質転換し得るような或る種の宿主溶原菌
（ｈｏｓｔ ｌｙｓｏｇｅｎ）を含むと記載されてい
る。本出願人は、国立保健協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆＨｅａｌｔｈ），ヘルス及び
ヒューマンサービス部門（Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔ
ｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），米国，
によるエム．ローゼンベルグ（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ）名義で係属中の米国特許出願第４５７，３５２号の
存在を知っている。この出願の一部は国立技術情報サー
ビス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ），米国通常部門
（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ）から入
手できたが、特許請求の範囲はまだ機密であり入手不能
である。本出願人は該出願の入手し得た部分について検
討し、この開示も実施不能であるとの結論を得た。即
ち、この開示によれば宿主が重要であるのに（８頁１７
行）いかなる適当な宿主も同定されていない。更に該出
願はλ突然変異体の使用を基盤とするのにこの突然変異
体が特定されていない（４頁２０行）。更に該出願では
宿主が溶原（ｌｙｓｏｇｅｎ）を含む（８頁１８行）
が、本発明では宿主が溶原菌でない。該出願は真核生物
遺伝子、すなわちサルメタロチオネイン遺伝子のクロー
ニング及び発現に言及しているが（７頁１８行）、これ
らについて詳細に説明していない。該出願ではＣＩＩリ
ボソーム結合領域のいかなるヌクレオチドの配列も位置
も変更していないと述べられている（３頁２７行）。１
９８３年７月１５日出願の、本発明と同様に譲渡されて
いる係属中の米国特許出願第５１４，１８８号中に細菌
中に於けるポリペプチドの発現に有用な新規なベクター
について記載がある。これらのベクターは、ＰＬＯＬ，
抗転写終結因子Ｎタンパクを結合するＮ利用部位（Ｎｕ
ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ），リボソーム結合部
位，ＡＴＧ コドン，所望のポリペプチドをコードして
いる遺伝子を挿入する為の制限酵素部位，複製起点及び
選択可能なマーカーを含んでいる。これらのベクターに
於いて、Ｎ利用部位とリボソーム結合部位間の距離は約
３００塩基対より大きい。更に、それぞれのベクターに
は、容易に置換され得ない特異的リボソーム結合部位が
含まれている。これらのベクターは様々なポリペプチド
の発現にどれも同様に用い得るということはできない。
Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ転写終結配列が、ブロシウス・ジェイ
等（Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）ジェイ・モ
ル・バイオル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１４８，１０
７，（１９８１）に記載されている。このＴ１Ｔ２ｒＲ
ＮＡ終結配列を原核生物遺伝子の３′末端につなぎ、該
遺伝子をプロモーターによるコントロール下で発現させ
ることが記載されている（アマン・イー等（Ａｍａｎ
ｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９８
３，２５，１６７；ザビュー・エム等（Ｚａｂｅａｕ，
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）エムボ・ジャーナル（Ｔｈｅ Ｅ
ＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）１９８２，１，１２１７）。欧
州特許出願第８１３０４５７３．９号で１９８２年４月
１４日に公開された欧州特許公開第０４９，６１９号に
は、安定化因子として熱誘導性リプレッサー（ｔｈｅｒ
ｍｏｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）λｃＩ
８５７の使用が記載されている。このリプレッサーをプ
ラスミド上にクローニングする。リプレッサー合成を欠
陥しているプロファージλｃＩ９０に感染によって導入
する。このプロファージは３２℃より低い温度ではクロ
ーン化リプレッサーによって維持される。前記プラスミ
ドを失った細胞はいずれも溶菌する。温度を３８℃より
も高くすると、該リプレッサーが破壊されあるいは不活
化されて細胞が溶菌する。この安定化システムはλＰＬ
プロモーターを含み３８℃より高温でポリペプチドを発
現する本発明のベクターには用いることはできない。コ
ピー数の多い構成プラスミド（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ
ｅ ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｐｌａｓｍｉ
ｄｓ）に由来する複製起点は公知である。例えば、Ｃｏ
ｌ Ｅ１由来の。ｐＯＰ １Δ６複製起点は、ゲルファ
ンド・デー・エイチ等（Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，ｅ
ｔ ａｌ．）ＰＮＡＳ（１９７８）７５，（１２），５
８６９及びミューシング・エム等（Ｍｕｅｓｉｎｇ，
Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）Ｃｅｌｌ（１９８１）４５，２３
５に記載されている。更に、コピー数の多い脱落性（ｒ
ｕｎ−ａｗａｙ）複製プラスミド（これはコピー数の多
い構成プラスミドとは区別される）も公知である（レマ
ント・イー等（Ｒｅｍａｎｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）遺
伝子（Ｇｅｎｅ）１９８３，２２，１０３）。本発明は
様々なポリペプチドの発現を予期せぬ程高める発現ベク
ターに係わる。本発明のベクター中に異なるリボソーム
結合部位を採用することで、従来のベクターを用いて達
成されるレベルと比較して高い発現レベルの様々なポリ
ペプチドを生産することが可能になる。加えて、従来の
ベクターと全く同じリボソーム結合部位を用いても同じ
ポリペプチドを高い発現レベルで生産することが可能で
ある。更に、Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ終結配列を発現させたい
ポリペプチドがコードされている遺伝子の３′末端に結
げることによって、細菌宿主によって生産される総ポリ
ペプチドに比べてその所望のポリペプチドの量を増やす
ことが可能である。重要なことに、Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ転
写終結配列が存在すると、コピー数の多い構成プラスミ
ド由来の複製起点を、数多くのコピーを構成的（ｃｏｎ
ｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）に複製する能力を失なうことなく
発現ベクター中に組み込むことが可能になる。ｐＢＲ
３２２又はコピー数の多い脱落性（ｒｕｎａｗａｙ）プ
ラスミド以外のコピー数の多い非構成プラスミド（ｎｏ
ｎ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ
ｎｕｍｂｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ）由来の複製起点はこ
れをベクター中に組み込んだとき細胞当りほんの限られ
た数の、代表的には細胞当り４０コピーより少ない数を
生産することができる。コピー数の多い構成プラスミド
由来の複製起点に代えることによって、ポリペプチドの
発現レベルが予期せぬ程高くなることが判明した。本発
明の好適なベクターは細菌宿主内で安定化されており、
ベクター及びポリペプチドをコードした遺伝子を含むプ
ラスミドを含有する細菌が増殖する際にそのプラスミド
は失なわれることがない。こうして、プラスミドの不安
定性に帰因するところの収率低下が克服される。更に、
このような好適ベクターを用いることで選択マーカーと
して抗生物質抵抗性を用いる必要がなく、従ってポリペ
プチドを低コストで生産することが可能になる。本発明
の新規な発現ベクターを用いて生産され得る幾つかのポ
リペプチドのうちのあるものはスーパーオキシドジスム
ターゼ（ＳＯＤ）及びそのアナログ（類似体）である。
本発明は特に、従来のベクターと全く同じリボソーム結
合部位を用いても、また本明細書中に記載されている前
記ＲＢＳと異なるリボソーム結合部位を用いても、スー
パーオキシドジスムターゼ及びそのアナログの予期せぬ
程の高められた発現を催す発現プラスミドに係わる。本
発明はまた、前記プラスミドを利用して細菌内でＳＯＤ
及びそのアナログの高効率に産生する方法に係わる。ス
ーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及び酸素フリー
ラジカル（Ｏ２・−）の現象は１９６８年にマッコード
及びフリードヴィッヒによって発見された（マッコード
・ジェイ・エム（ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．）及びフリー
ドヴィッヒ・アイ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．）ジェイ
・バイオル・ケミ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２４
４，６０４９−６０５５（１９６９））。スーパーオキ
シドラジカル及び他の高反応性酸素種は全ての呼吸細胞
に於いて酸化的代謝の副生成物として産生し、広範囲の
細胞成分及び高分子に多大の損傷を与えることが判った
（フリードヴィッヒ・アイ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，
Ｉ．），アドバンス・イン・イン・オーガニック・バイ
オケミストリー，アイクホーン・ジー・エル（Ｅｉｃｈ
ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｌ．）版及びマルチリ・エル・ジー（Ｍ
ａｒｚｉｌｌｉ，Ｌ．Ｇ．），エルセヴィア／北オラン
ダ，ニューヨーク，６７−９０頁（１９７０）並びにフ
リーマン・ビー・エー（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｂ．Ａ．）及
びクラポ・ジェイ・デー（Ｃｒａｐｏ，Ｊ，Ｄ，）ラボ
ラトリー・インベスティゲーション，４７，４１２−４
２６（１９８２）参照）。スーパーオキシドジスムター
ゼとして知られる金属プロテイン類は酸化−還元反応２
Ｏ２ −＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２を触媒し、酸素毒性に
対する防御機構を形成する。タンパク分子中に異なる金
属を含有する３種類のＳＯＤが知られている。即ち、
鉄，マンガン及び銅と亜鉛の両者を含有するものであ
る。これらの酵素は全て同じ反応を究極的な効率で触媒
し、金属が活性部位の触媒因子であるような類似の機構
で作用する。これらの酵素は幾つかの進化論上の群に分
類される。Ｍｎ−ＳＯＤ及びＦｅ−ＳＯＤは主に原核細
胞中に見られ、一方ＣｕＺｎ−ＳＯＤは事実上全ての真
核生物中に認められる（シュタインマン・エイチ・エム
（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｍ）スーパーオキシドジスム
ターゼ，オバーレイ・エル・エム（Ｏｂｅｒｌｅｙ，
Ｌ．Ｍ．）版，シーアールシープレス，フロリダ，１１
−６８頁（１９８２））。ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ−１
は同一の非共有結合サブユニットからなる金属−蛋白質
二量体であり、各サブユニットは銅１原子と亜鉛１原子
とを含有し、１６０００ダルトンの分子量を持つ（ハー
ツ，ジェー，ダブリュ（Ｈａｒｔｚ，Ｊ．Ｗ．）及びド
イッチェ，エイチ．エフ．（Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｈ．
Ｆ．）、ジェー．バイオール．ケム．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．）２４７，７０４３−７０５０（１９７
２））。各サブユニットは配列が確定された１５３個の
アミノ酸からなる（ジャブッシュ，ジェー．アール．
（Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．）、ファーブ，ディー．エ
ル．（Ｆａｒｂ，Ｄ．Ｌ．）、ケルシェンスタイナー，
ディー．エー．（Ｋｅｒｓｃｈｅｎｓｔｅｉｎｅｒ，
Ｄ．Ａ．）及びドイッチェ，エイチ．エフ．（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈ，Ｈ．Ｆ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）１９：２３１０〜２３１６（１９８
０）及びバーラ，ディ．（Ｂａｒｒａ，Ｄ．），マルチ
ニ，エフ．（Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｆ．）、バニスター，ジ
ェー．ブイ．（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，Ｊ．Ｖ．）、シニ
ーナ，エム．ダブリュ．（Ｓｃｈｉｎｉｎａ，Ｍ．
Ｗ．）、ロチリオ，ダブリュー．エイチ．（Ｒｏｔｉｌ
ｉｏ，Ｗ．Ｈ．）、バニスター，ダブリュー．エイチ．
（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，Ｗ．Ｈ．）及びボッサ，エフ．
（Ｂｏｓｓａ，Ｆ）、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ）１２０，５３−５６（１９８０））。更
に、近年、ヒトＳＯＤ−１の全コード領域を含有するｃ
ＤＮＡクローンが単離されその配列が決定された（リー
マン−フルウィッツ，ジェー．（Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕｒ
ｗｉｔｚ，Ｊ．）、ダフニ，エヌ．（Ｄａｆｎｉ，
Ｎ．）、ラヴィエ，ブイ．（Ｌａｖｉｅ，Ｖ．）及びグ
ローナー，ワイ．（Ｇｒｏｎｅｒ，Ｙ．）、プロク．ナ
ットル．アカデ．サイ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７９，２８０８−２８１１
（１９８２）及びシャーマン，エル．（Ｓｈｅｒｍａ
ｎ，Ｌ．），ダフニ，エヌ．（Ｄａｆｎｉ，Ｎ．）、ラ
イマン−フルヴィッツ，ジェー．（Ｌｅｉｍａｎ−Ｈｕ
ｒｗｉｔｚ，Ｊ．）及びグローナー，ワイ．（Ｇｒｏｎ
ｅｒ，Ｙ．）、プロク．ナットル．アカデ．サイ．ＵＳ
Ａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）
８０，５４６５−５４６９（１９８３））。産生したヒ
トＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤアナログはそのアミノ末端アラニ
ンがアセチル化されていない点で天然のヒトＣｕ−Ｚｎ
ＳＯＤと異なる。天然のヒトＳＯＤはアミノ末端アラ
ニンがアセチル化されている（ハーツ，ジェー，ダブリ
ュー．（Ｈａｒｔｚ，Ｊ．Ｗ．）及びドイッチェ，エイ
チ．エフ．（Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｈ．Ｆ．）、ジェー．バ
イオール．ケム．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）（１９
７２）２４７，７０４３−７０５０；ジャブッシュ，ジ
ェー．アール．（Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．）ら、バイ
オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８
０）１９，２３１０−２３１６；バーラ（Ｂａｒｒａ）
ら、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）
（１９８０）１２０，５３及びオバーリー，エル．ダブ
リュ．（Ｏｂｅｒｌｙ，Ｌ．Ｗ．）、スーパーオキシド
ジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａ
ｓｅ）、第１巻、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ）、フロリダ（Ｆｌｏｒｉｄａ）、（１９８２）、
（３２頁−３３頁）。ウシＳＯＤと同様に天然のヒトＳ
ＯＤはグリコシル化されていると思われる（ヒューバ
ー，ダブリュ．（Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．）、米国特許第３，
５７９，４９５号明細書、１９７１年５月１８日発
行）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が
自分で産生した蛋白質をグリコシル化しないように、細
菌が産生したヒトＳＯＤはほとんどグリコシル化されな
い。細菌が産生したＳＯＤアナログのアミノ酸配列は成
熟ヒトＳＯＤと同じであるが、Ｎ−末端にメチオニン残
基を持たない。本発明はヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの酵素
学的に活性なアナログを細菌内で産生し精製する方法を
提供する。スーパーオキシドジスムターゼはその薬理学
的特性から非常に興味深い。ウシ由来の天然にみられる
スーパーオキシドジスムターゼ（オルゴテイン，ｏｒｇ
ｏｔｅｉｎ）は抗炎症作用を持つことが知られており、
欧州、例えば西独で炎症の治療用に最近市販されてい
る。米国を含む多くの国でも炎症治療用特に馬の腱の炎
症の治療用に動物薬として販売されている。又、科学論
文はＳＯＤが広範囲に亘り臨床的に使用できるであろう
ことを示唆している。これには腫瘍形成や腫瘍増大を防
止することや抗癌剤の細胞毒作用や心臓毒作用を軽減す
ること（オバーレイ，エル．ダブリュ．（Ｏｂｅｒｌｅ
ｙ，Ｌ．Ｗ．）及びビューエトナー，ジー．アール．
（Ｂｕｅｔｔｎｅｒ，Ｇ．Ｒ．）、キャンサー リサー
チ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）３９，１１４１
−１１４９（１９７９）；虚血組織の保護（マクコー
ド，ジェー．エム．（ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．）及びロ
イ，アール．エス．（Ｒｏｙ，Ｒ．Ｓ．）、カン．ジェ
ー．フィジオール．ファーム．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．）６０，１３４６−１３５２（１
９８２））；及び精子の保護（アルバーレッツ，ジェ
ー．ジー．（Ａｌｖａｒｅｚ，Ｊ．Ｇ．）及びストーレ
イ，ビー．ティー．（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｂ．Ｔ．）、バイ
オール．リプロダ．（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．）２
８，１１２９−１１３６（１９８３））が包含される。
更に、加令過程に対するＳＯＤの作用の研究も非常に興
味深い（タルマソッフ，ジェー．エム．（Ｔａｌｍａｓ
ｏｆｆ，Ｊ．Ｍ．）、オノ，ディー．（Ｏｎｏ，Ｔ．）
及びカトラー，アール．ジー．（Ｃｕｔｌｅｒ，Ｒ．
Ｇ．）、プロク．ナットル．アカデ．サイ．ＵＳＡ（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）７７，
２７７７−２７８２（１９８０））。本発明は、Ｈ＋の
存在下でのスーパーオキシドラジカルの過酸化水素と分
子状酸素への還元を触媒するために組換えヒトスーパー
オキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）またはそのアナログ
を使用することにも係る。特に、本発明は虚血（ｉｓｃ
ｈｅｍｉａ）に伴う再灌流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）
時の損傷を減少させ、切除した摘出臓器の生存期間（ｓ
ｕｒｖｉｖａｌ ｐｅｒｉｏｄ）を延長するためのｈＳ
ＯＤアナログの使用に関する。本発明は臓器移植に伴う
再灌流時の損傷や脊髄虚血（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ
ｉｓｃｈｅｍｉａ）を減少させるためにｈＳＯＤ又はそ
のアナログを使用することにも係る。発明の要約 本発明は、非耐熱性（ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ）リプ
レッサーＣ１を含有する適切な細菌宿主細胞例えば大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に導入する
と、この宿主細胞が、宿主細胞の温度がリプレッサー不
活化温度まで上昇した際、前記ベクターに挿入されてい
る所望遺伝子を発現し得かつ前記遺伝子がコードしてい
るポリペプチドを産生し得るようになる改良発現ベクタ
ーに係り、このベクターは、５′から３′に向かって、
λバクテリオファージ由来のプロモーター−オペレータ
ーＰＬＯＬを含有するＤＮＡ配列と、抗転写終結因子Ｎ
タンパク質を結合するためのＮ利用部位と、この後に続
くリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配列の置換（ｒ
ｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を可能にする第１の制限酵素部
位と、所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソーム
に結合し得るようにするためのリボソーム結合部位を含
有するＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドン、または所望遺
伝子をベクター内に挿入するとＡＴＧ開始コドンに変換
されるＤＮＡ配列と、ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせ
て（ｉｎ ｐｈａｓｅ）所望遺伝子をベクター内に挿入
するための第２の制限酵素部位と、をこの順に含む二本
鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、さらに、宿主細胞中で自律
複製し得る細菌プラスミド由来複製起点を含有するＤＮ
Ａ配列と、このベクターが宿主細胞中に存在するときに
現れる選択可能または同定可能な表現形質に関連する遺
伝子を含有するＤＮＡ配列ならびにｃＩ４３４という断
片（このような断片はｃＩ４３４リプレッサータンパク
質に対する遺伝子とこれに関連したプロモーター−オペ
レーター配列とを含む）を含有するＤＮＡ配列から成る
群から選択される選択手段と、を含んでおり、ＰＬＯＬ
プロモーターオペレーター配列の３′末端とＮ利用部位
の５′末端との間の距離が約８０塩基対未満であり、Ｎ
利用部位の３′末端とリボソーム結合部位の５′末端と
の間の距離が約３００塩基対未満である。選択手段がｐ
ＪＨ２００及びｐＲＯ２１１の如き表現形質に関連する
遺伝子であるベクターが好ましい。本発明ベクターは第
２の制限酵素部位の３′にＴ１Ｔ２ｒＲＮＡ配列を含有
するＤＮＡを更に含んでいてもよい。Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ
転写終結配列は第２の制限酵素部位の３′末端から約１
００塩基対未満であることが望ましく、約２０塩基対未
満であることがより望ましい。Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ転写終
結配列を含んでいる現状の好ましいベクターはその選択
手段が表現形質に関連する遺伝子であるｐ５７９であ
る。ｃＩ４３４フラグメント（断片）を含有する本発明
ベクター中で、ｃＩ４３４フラグメントはＴ１Ｔ２ｒＲ
ＮＡ終結配列の３′にあることが望ましい。ベクターが
表現形質に関連する遺伝子とｃＩ４３４フラグメントと
の両者を含有していることが望ましい。両方の遺伝子を
含有している現状で好ましいベクターはＣｌａ Ｉ部位
にｃＩ４３４フラグメントをクローニングしたｐ５７９
である。本発明ベクターは、宿主細胞中で自律複製し
得、少なくとも４００個のベクターの構成コピーを生成
し得る細菌のプラスミド由来の複製起点をも含有してい
てもよい。現状で好ましい複製起点はｃｏｌ Ｅ１プラ
スミド由来のｐＯＰ １Δ６である。Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ
終結配列、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なく
とも４００個生成し得る複製起点を含み且つ表現形質遺
伝子とｃＩ４３４フラグメントの遺伝子との両者を含有
しているベクターが好ましい。所望のポリペプチド例え
ばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモンの如き
成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ヒ
トアポリポプロテインＥ又はこれらのアナログをコード
するｃＤＮＡのような遺伝子をベクターの第２の制限酵
素部位に挿入してプラスミドを作ってもよい。このプラ
スミドはその後、遺伝子が発現され所望のポリペプチド
を生成することのできる適切な宿主に導入することがで
きる。現状で好ましいプラスミドは、ｂＧＨ用には、ｐ
ＲＯ １２，ｐＳＡＬ５２００−６，ｐＨＧ４４，ｐＳ
ＡＬ５６００−１，ｐ７２００−２２，ｐＨＧ５０，ｐ
８３００−１０Ａ，ｐＳＡＬ−１７０／１０ ｐＳＡＬ
−２１０／４及びｐ９２００；ヒトスーパーオキシドジ
スムターゼ用には、ｐＳＯＤα２，ｐＳＯＤβ１，ｐＳ
ＯＤβ１Ｔ１１，ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２及びｐＳＯＤβ
１ＴＴ−１；ｐＧＨ用には、ｐ３００８及びｐ３００
９；ｃＧＨ用には、ｐ５００２及びｐ５００３；ｈＧＨ
用には、ｐＴＶ３００；ヒトアポリポプロテインＥ用に
は、ｐＴＶ−１８８，ｐＳＡＬ１６０−５，ｐＴＶ−１
７０，ｐＴＶ−１９０，ｐＴＶ−１９４，ｐＴＶ−２１
４及びｐＴＶＲ２７９−８である。好ましい宿主は大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ１６３７，
Ａ１６４５，Ａ２６０２，Ａ２０９７及びＡ１５６３並
びにプラスミドがｃＩ４３４フラグメントを含有してい
るときには、Ａ１６４５（λｉ４３４ｃＩ−ｍｉｎｉ
Ｔｎ １０）を包含する。好ましい原栄養性宿主（ｐｒ
ｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｏｓｔｓ）は大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）Ａ４２００，Ａ４２５５及びＡ４３４６を包
含する。好ましい溶解性宿主（ｌｙｔｉｃ ｈｏｓｔ
ｓ）は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ａ４０４８を包含す
る。得られた宿主ベクター系はポリペプチドの製造に用
いることができる。プラスミドを含有する宿主細胞をポ
リペプチドを生成しうる適切な条件下で増殖させ、得ら
れたポリペプチドを回収する。宿主ベクター系を用い
て、ヒトアポリポプロテインＥ、ウシ成長ホルモン、ブ
タ成長ホルモン、ニワトリ成長ホルモン、ヒト成長ホル
モン及びヒトスーパーオキシドジスムターゼのアナログ
が製造される。このように得られたＳＯＤアナログはＳ
ＯＤアナログと適当なキャリアー（担体，ｃａｒｒｉｅ
ｒ）とを含有する動物薬及び医薬組成物に配合される。
これらのスーパーオキシドジスムターゼアナログは次の
反応：２Ｏ２ −＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２を触媒するの
に用いられる。より特定的には、このようなアナログは
虚血又は臓器移植に伴う再灌流による損傷を減少させ、
心筋梗塞の大きさを減少させ、切除した摘出臓器の生存
時間（有効保存期間）を増加させるために用いられた。
これらのアナログは脊髄損傷を減少させるために又気管
支肺異形成（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｄｙｓｐｌａｓｉａ）に用いることもできる。酵素学的
に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又は
そのアナログを細菌細胞中で生成する方法も発見され
た。細菌細胞はスーパーオキシドジスムターゼ又はアナ
ログをコードするＤＮＡ配列を含有しており、このＤＮ
Ａ配列を発現させることができる。この方法は、適切な
条件下で、培地中の細胞が利用しうるＣｕ＋＋濃度が約
２ｐｐｍ以上となるような量のＣｕ＋＋を添加した生成
（産生）培地中に細菌細胞を維持することからなる。こ
の方法の好ましい具体例では、細菌細胞はヒトスーパー
オキシドジスムターゼのアナログをコードするＤＮＡ配
列を含有するプラスミドを持つ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。本発明は又、本発明
方法により細菌細胞内で生成された、精製された酵素学
的に活性な真核生物のスーパーオキシドジスムターゼ又
はそのアナログを回収する方法にも係る。この方法は、
成長（増殖）培地から細菌細胞を単離し、ｐＨが約７．
０〜約８．０の適切な溶液中に細菌細胞を懸濁すること
からなる。懸濁した細菌細胞の細胞壁を破砕し、次に、
得られた均質な溶液を適切な条件下で音波処理する。音
波処理した溶液を適切な条件下で遠心する。上清部を移
して、約２時間約６５℃に加熱する。次に、上清部を冷
却し、適切な条件下で遠心して上清部に清澄な蛋白質溶
液を得る。得られた上清部を適切な容量まで濃縮し、ｐ
Ｈ約７．０〜約８．０で平衡化した適切なアニオン交換
体でのイオン交換クロマトグラフィーにかける。スーパ
ーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得られ
た溶液を集めて適切な容量まで濃縮し、ｐＨ約７．０〜
約８．０の緩衝溶液に対して透析する。この濃縮した緩
衝溶液をｐＨ約７．０〜約８．０で平衡化した適切なア
ニオン交換体でのイオン交換クロマトグラフィーにかけ
る。アニオン交換体−蛋白質複合体を適切な塩勾配にか
ける。スーパーオキシドジスムターゼまたはアナログを
含有する画分を集めて濃縮し、蒸留水に対して透析す
る。適当なバッファーでこの溶液のｐＨを約４．０〜約
５．０に調整する。次に、緩衝化した溶液をｐＨ約４．
０〜約５．０で平衡化した適切なカチオン交換体でのイ
オン交換クロマトグラフィーにかける。蛋白質−カチオ
ン交換体複合体を適切な塩勾配にかけ、精製されたスー
パーオキシドジスムターゼ又はアナログを含有する得ら
れた画分を集める。本発明はこれらの方法で生成され
た、精製された酵素学的に活性な組換え体の真核性スー
パーオキシドジスムターゼ又はそのアナログにも係る。図面の説明 第１図乃至第３１図に示した各プラスミドの制限地図は
各プラスミドに存在する全ての制限部位を同定するもの
ではない。制限部位が１つの図には示されているが、も
う１つの図には示されていない場合もある。しかしなが
ら、本発明を完全に理解するために必要な制限部位は全
て示している。第１図：ｐＡＬ ５００の構築 ｂＧＨ ｃＤＮＡを含むプラスミドＤ４（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３１８２６）をＨａｅ ＩＩで消化した。得られた
１６００塩基対の大フラグメントを精製し、Ｓ１エキソ
ヌクレアーゼで３７℃で５分間消化した。得られたフラ
グメントの末端に配列： の合成Ｅｃｏ ＲＩリンカーを連結した。連結混合物を
Ｅｃｏ ＲＩで開裂し、Ｅｃｏ ＲＩで開裂してあるｐ
ＢＲ ３２２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７０１７）中に挿入
した。Ｅｃｏ ＲＩで開裂すると５′端に配列： を有する１２００塩基対フラグメントを遊離するクロー
ンｐＡＬＲＩが得られた。この配列が生成するというこ
とは、ｐＡＬＲＩが天然ｂＧＨの１番目の残基（フェニ
ルアラニン）をコードするＴＴＣコドンを含むＥｃｏ
ＲＩ制限部位を含有することを示している。ｐＡＬＲＩ
をＰｓｔ Ｉで部分開裂した。消化物をＤＮＡポリメラ
ーゼＩの大フラグメント（クレノウ）で処理し、配列： のＨｉｎｄ ＩＩＩリンカーを連結した。連結混合物を
Ｅｃｏ ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩとで開裂した。ｂＧＨ
ｃＤＮＡを含むフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ及び
Ｈｉｎｄ ＩＩＩの制限部位間でｐＢＲ ３２２にサブ
クローニングしてｐＡＬ ５００（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３
９７８２）を得た。第２図：ｐＲＯ ２１１及びｐＲＯ １２の構築 プラスミドｐＪＨ ２００（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８
３）をＮｄｅ Ｉで部分消化し、末端を充填（ｆｉｌｌ
ｉｎ）するためにＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）
で処理した。得られた末端を再び連結させて発現ベクタ
ーｐＲＯ ２１１を形成した。発現ベクターｐＲＯ ２
１１をＮｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。大
フラグメントを単離し、ｐＡＬ ５００（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３９７８２）から単離したＮｄｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ ｂＧＨフラグメントと連結してｐＲＯ １２を
得た。（Ｎｄｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントは
ｐＡＬ５００をＥｃｏ ＲＩで消化し、消化産物の末端
に配列： の合成リンカーを連結させて生成した。連結混合物をＮ
ｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、得られたＮｄｅ
Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｂＧＨフラグメントを単離し
た。）第３図：ｐＳＡＬ５２００−６の構築 ｐＲＯ １２（第２図）をＰｖｕ ＩＩで部分消化し、
次いでＮｄｅ Ｉで消化することにより７２塩基対フラ
グメントを除去した。消化したｐＲＯ １２に真正（ａ
ｕｔｈｅｎｔｉｃ）ｂＧＨのＮ−末端の最初の２４個の
アミノ酸をコードする合成ＤＮＡフラグメントを連結し
た。合成ＤＮＡフラグメントは配列：
【化１】 の２つのリン酸化した合成一本鎖ＤＮＡをアニールして
構築した。アニールしたフラグメントを４つのデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸全ての存在下にＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（クレノウ）で処理して、完全長（ｆｕｌｌ
ｌｅｎｇｔｈ）の二本鎖ＤＮＡを形成した。フラグメン
トをＰｖｕ ＩＩとＮｄｅ Ｉとで消化した後にｐＲＯ
１２と連結させてｐＳＡＬ５２００−６を形成した。第４図：ｐ３００８の構築 ｐ３００８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０４）は、プラス
ミドｐｐＧＨ−ＮｄｅＩ／ＲＩのＮｄｅ Ｉ消化物から
単離したｐＧＨフラグメントとＮｄｅ Ｉで消化したｐ
ＲＯ ２１１（第２図）とを連結して構築した。ｐｐＧ
Ｈ−Ｎｄｅ Ｉ／ＲＩは完全長のｐＧＨ ｃＤＮＡを含
有しており、この両末端には合成リンカーによってＮｄ
ｅ Ｉ部位が付加されている。第５図：ｐ５００２の構築 二量体化した合成リンカーと、プラスミドｐｃＧＨ−Ｎ
ｄｅ Ｉ／ＲＩのＮｄｅ Ｉ及びＢａｎ ＩＩ消化物か
ら単離した２つのｃＧＨフラグメントとを３点連結（ｔ
ｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐ５００
２を構築した。連結混合物をＮｄｅ Ｉで消化し、次い
で、予めＮｄｅ Ｉで制限してある発現ベクターｐＲＯ
２１１（第２図）と連結した。プラスミドｐ５００２
を含むコロニーを単離した。 合成リンカーは配列：
【化２】 を有する２つの一本鎖合成ＤＮＡから構築した。連結前
にリンカーをリン酸化した。このリンカーは真正ｃＧＨ
のＮ−末端の初めの１８個のアミノ酸をコードする。プ
ラスミドｐｃＧＨ−Ｎｄｅ Ｉ／ＲＩは完全長ｃＧＨ
ｃＤＮＡを含有し、その５′端はＥｃｏ ＲＩ制限部位
であり、３′端はＮｄｅ Ｉ制限部位である。これら制
限部位は合成リンカーを用いて付加した。第６図：ｐＨＧ ４４及びｐＨＧ ５０の構築 ｐＲＯ １２（第２図）をＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し
た。アガロースゲルで線状ＤＮＡ（ＩＩＩ型）を精製
し、ｒＲＮＡオペロン転写終結配列Ｔ１Ｔ２を含有する
約１２００塩基対のＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉフラグメントに連結した。Ｔ１Ｔ ２Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
で消化してあるプラスミドｐＰＳ １（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．３９８０７）から単離した。得られたプラスミドｐ
ＨＧ ４４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０６）は組換え体
（ｒｅｃ）ｂＧＨ配列の３′端にＴ１Ｔ２配列を含有し
ている。λｃＩ４３４リプレッサー配列を含有するプラ
スミドｐＳＫ ４３４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８４）
をＨｐａ ＩＩで消化した。λｃＩ ４３４Ｈｐａ ＩＩ
−Ｈｐａ ＩＩフラグメントを単離し、Ｃｌａ Ｉで消
化してあるｐＨＧ ４４と連結した。得られたプラスミ
ドｐＨＧ ５０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０５）はＴ１
Ｔ２転写終結配列とλｃＩ４３４リプレッサー配列とを
含有する。第７図：ｐ８３００−１０Ａの構築 Ｎ−末端にメチオニンを有する天然のフェニルアラニン
型ｂＧＨ（ｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨ）のアナログを発現
するプラスミドｐ８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣＮｏ．３
９７８５）を次のように製造した。プラスミドｐ７２０
０−２２はｐＪＨ２００（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８
３）由来のλＰＬプロモーターとリボソーム結合部位
と、ｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨをコードするＤＮＡと、Ｔ
１Ｔ２ｒＲＮＡ終結配列とを含有している。λＰＬプロ
モーター、ＣＩＩリボソーム結合部位、ｍｅｔ−ｐｈｅ
ｂＧＨ遺伝子及びＴ１Ｔ２転写終結配列を有するＣｌ
ａＩ−Ｃｌａ ＩフラグメントをプラスミドｐＯＰ １
Δ６の唯一（単一）のＣｌａ Ｉ部位に挿入してｐ８３
００−１０Ａを形成した。このプラスミドｐＯＰ１Δ６
は高いコピー数を有する構成プラスミド（ｃｏｎｓｔｉ
ｔｕｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｐ
ｌａｓｍｉｄ）である。第８図：ｐＳＡＬ−１３０／５及びｐＳＡＬ−１７０／
１０の構築 ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ ｂＧＨ蛋白質を発現するプラ
スミドｐＨＧ ４４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０６）を
Ｎｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。得られた
Ｎｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ ｂＧＨフラグメント
を単離し、ｐ８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９
７８５）をＮｄｅ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩの両者で部分
消化して調製したフラグメントに連結した。このような
連結により、ｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨ遺伝子フラグメン
トをｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ ｂＧＨ遺伝子フラグメン
トに置換する。このようにして得たプラスミドｐＳＡＬ
−１３０／５はｒｅｃ ｂＧＨを発現する。ｐＢＲ ３
２２プラスミド（ＡＴＣＣＮｏ．３７０１７）のＴｅｔ
Ｒ遺伝子を含有するＥｃｏ ＲＩ−Ａｖａ Ｉフラグメ
ントをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で処理し、予
めＢａｍ ＨＩで消化しＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノ
ウ）で充填したｐＳＡＬ−１３０／５に挿入することに
よりｐＳＡＬ−１７０／１０を得た。第９図：ｐＳＡＬ−２１０／４の構築 ｐＳＡＬ−１７０／１０をＣｌａ Ｉで部分消化するこ
とにより線状ＤＮＡ（ＩＩＩ型）を調製した。これをア
ガロースゲルで精製し、プラスミドｐＳＫ ４３４（Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．３９７８４）のＨｐａ ＩＩ消化物から
単離したＨｐａＩＩ−Ｈｐａ ＩＩ ｃＩ４３４遺伝子
フラグメントに連結した。第１０図：ｐＳＡＬ５６００−１の構築 ｐＳＡＬ５２００−６（第３図）をＨｉｎｄ ＩＩＩで
消化した。アガロースゲルで線状ＤＮＡ（ＩＩＩ型）を
精製し、ｒＲＮＡオペロン転写終結配列Ｔ１Ｔ２を含有
する約１２００塩基対のＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントに連結した。このＴ１Ｔ ２Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントはＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化してあるプラスミドｐＰＳ １（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９８０７）から単離した。得られたプラスミ
ドｐＳＡＬ５６００−１はｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎｂＧ
Ｈ配列の３′端にＴ１Ｔ２配列を含有する。第１１図：ｐ３００９の構築 プラスミドｐ３００８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０４）
（第５図）からＮｄｅＩ−Ｎｄｅ Ｉ ｐＧＨフラグメ
ントを単離した。予めＮｄｅ Ｉで消化した発現ベクタ
ーｐ５７９（第１９図）の唯一のＮｄｅ Ｉ部位にこの
フラグメントを挿入した。得られたプラスミドｐ３００
９はＮ−末端に付加したメチオニン残基を有する天然の
ブタ成長ホルモン蛋白質のアナログを発現する。第１２図：ｐ５００３の構築 プラスミドｐ５００２からＮｄｅ Ｉ−Ｎｄｅ Ｉ ｃ
ＧＨフラグメントを単離した。予めＮｄｅ Ｉで消化し
た発現ベクターｐ５７９（第１９図）の唯一のＮｄｅ
Ｉ部位にこのフラグメントを挿入した。得られたプラス
ミドｐ５００３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７９２）はＮ−
末端にメチオニン残基を付加した天然のニワトリ成長ホ
ルモン蛋白質のアナログを発現する。第１３図：ｐＳＯＤα２の構築 ｐＪＨ ２００（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８３）発現ベ
クターをＮｄｅ Ｉで消化した。λＰＬプロモーターと
ＣＩＩリボソーム結合部位とを含有する５５０塩基対Ｎ
ｄｅ Ｉフラグメントを単離し、予めＮｄｅ Ｉで消化
したプラスミドｐＳＯＤ ＮＨ−１０の唯一のＮｄｅ
Ｉ部位に挿入した。（プラスミドｐＳＯＤ ＮＨ−１０
はヒトＳＯＤのｃＤＮＡクローン由来のものである［リ
ーマン−フルヴィッツ，ジェー．（Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕ
ｒｗｉｔｚ，Ｊ．）ら、ＰＮＡＳ（１９８２）７９：２
８０８］。得られたプラスミドｐＳＯＤ ＮＨ−５５０
をＡｌｕ Ｉで消化した。（関連Ａｌｕ Ｉ部位のみを
図示する。）λＰＬプロモーター及びＳＯＤ遺伝子を含
有する大Ａｌｕ Ｉフラグメントを単離した。Ｂａｍ
ＨＩリンカーを結合し、得られたフラグメントをＢａｍ
ＨＩで消化した。Ｂａｍ ＨＩで消化産物をｐＢＲＭ
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７２８３）の唯一のＢａｍ ＨＩ
部位に挿入してｐＳＯＤα２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７
８６）を形成した。第１４図：ｐＳＯＤα１３及びｐＳＯＤβ１の構築 プラスミドｐＳＯＤα２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８
６）をＥｃｏ ＲＩで部分消化し、得られた線状ＤＮＡ
をアガロースゲルにより単離した。精製ＤＮＡをＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填し、再び連結した。
得られたクローンｐＳＯＤα１３はリボソーム結合部位
の５′端にＥｃｏ ＲＩ部位を１個有する。Ｅｃｏ Ｒ
Ｉ及びＡｌｅ Ｉで消化してあるプラスミドｐＢＬＡ１
１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７８８）からβ−ラクタマー
ゼプロモーター及びリボソーム結合部位を含有するフラ
グメントを単離した。２００塩基対（ｂｐ）フラグメン
トをｐＳＯＤα１３から単離した大きなフラグメントに
連結した。このｐＳＯＤα１３はＮｄｅ Ｉで消化し、
ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し、次い
でＥｃｏ ＲＩで消化してあった。得られたプラスミド
ｐＳＯＤβ１はβ−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結
合部位とλＰＬプロモーターとを含有している。第１５図：ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の構築 プラスミドｐＢＲ ３２２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７０１
７）をＥｃｏ ＲＩとＡｖａ Ｉで消化した。得られた
ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填し
た。その後、ＴｅｔＲ遺伝子フラグメントを単離し、ｐ
ＳＯＤβ１（第１４図）プラスミドから単離した大フラ
グメントに連結した。このｐＳＯＤβ１プラスミドは予
め、Ｐｓｔ Ｉで消化した後Ｂａｍ ＨＩで部分消化
し、次いでＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）て充填し
ておいた。得られたプラスミドｐＳＯＤβ１Ｔ１１はＴ
ｅｔＲ遣伝子を含有している。第１６図：ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１の構築 Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノウ）で充填してあるプラスミドｐＰＳＩ（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９８０７）からｒＲＮＡＴ１Ｔ２転写終結フ
ラグメントを単離した。このフラグメントを、Ｂａｍ
ＨＩで部分消化しＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で
充填してあるプラスミドｐＳＯＤβ１Ｔ１１（第１５
図）に連結した。第１７図：ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２の構築 天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結合部位の配列に類
似の配列：
【化３】 を有する合成ＤＮＡフラグメントをリン酸化し、Ｎｄｅ
Ｉ及びＥｃｏ ＲＩで消化してあるｐＳＯＤα１３プ
ラスミド（第１４図）の大フラグメントに連結した。第１８図：ｐＴＶ−１８８の構築 プラスミドｐＡｐｏ Ｅ−ＥＸ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３
９７８７）をＮｄｅＩで消化し、次いでフラグメントを
ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填した。得られ
たＡｐｏ Ｅ遺伝子フラグメントを単離し、ｐＳＯＤβ
１Ｔ１１プラスミド（第１５図）の唯一のブラントエン
ド（平滑端）Ｓｔｕ Ｉ部位に挿入した。得られたプラ
スミドｐＴＶ−１８８はＡｐｏ Ｅ融合蛋白質を発現す
る。第１９図：ｐ５７９の構築 Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化してあるプラスミドｐＰＳ １
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０７）からｒＲＮＡオペロン
Ｔ１Ｔ２転写終結フラグメントを単離した。Ｔ１Ｔ２フ
ラグメントを、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化してあるｐＲＯ
２１１（第２図）の唯一のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿
入した。得られた発現ベクターｐ５７９はλＰＬプロモ
ーター、ＣＩＩリボソーム結合部位そしてＴ１Ｔ２転写
終結信号を有している。第２０図：ｐＴＶ−１７０の構築 Ｎｄｅ Ｉ−Ｎｄｅ Ｉ Ａｐｏ Ｅフラグメントをプ
ラスミドｐＡｐｏＥ−ＥＸ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９７
８７）から単離し、Ｎｄｅ Ｉで消化してある発現ベク
ターｐ５７９（第１９図）の唯一のＮｄｅ Ｉ部位に挿
入した。得られたプラスミドｐＴＶ−１７０はＮ末端に
メチオニン残基を付加した天然のヒトＡｐｏ Ｅ蛋白質
のアナログを発現する。第２１図：ｐＴＶ−１９０の構築 プラスミドｐＴＶ−１７０（第２０図）をＮｄｅ Ｉで
部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填
した。単離した線状ＤＮＡを再連結してプラスミドｐＴ
Ｖ−１９０を得た。プラスミドｐＴＶ−１９０を分析し
たところＡｐｏＥ遺伝子の５′端に唯一のＮｄｅ Ｉ部
位を持つことが判った。第２２図：ｐＴＶ−１９４の構築 Ｅｃｏ ＲＩとＡｌｕ Ｉで消化した後プラスミドｐＢ
ＬＡ１１（ＡＴＣＣＮｏ．３９７８８）からβ−ラクタ
マーゼプロモーターとリボソーム結合部位のフラグメン
トを単離した。このフラグメントを、Ｎｄｅ Ｉで消化
し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填した後Ｅ
ｃｏ ＲＩで消化してあるｐＴＶ−１７０（第２０図）
プラスミドの大フラグメトに連結した。第２３図：ｐＳＡＬ１６０−５の構築 Ａｐｏ Ｅ ＤＮＡ配列を有するＡｖａ Ｉ−Ａｖａ
Ｉフラグメントを、Ａｖａ Ｉで消化したｐＴＶ−１７
０（第２１図）から単離した。このフラグメントをＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で充填し、アガロースゲ
ルで単離した。精製Ａｐｏ Ｅフラグメントを、Ｐｓｔ
Ｉで部分消化しＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）で
充填してあるｐＴＶ１０４（２）プラスミド（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９３８４）のＰｓｔ Ｉ部位に挿入した。得
られたプラスミドをｐＳＡＬ１６０−５と表わす。第２４図：ｐＴＶ−２１４の構築 配列：
【化４】 のヒト成長ホルモンの最初の１４個のアミノ酸を含む合
成フラグメントをγ−３２Ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化した。リン酸化したリンカーを、
Ｎｄｅ Ｉで消化してあるｐＴＶ１９０プラスミドの唯
一のＮｄｅ Ｉ部位に挿入した。第２５図：ｐＴＶＲ２７９−８の構築 ｐＴＶＲ２７９−８はｐＴＶ１９０から構築したｐＴＶ
２６４−４５から構築した。Ｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ３アナ
ログの発現を支配するプラスミドｐＴＶ１９０をＡｖａ
Ｉで部分開裂し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメントを用いて「充填」し、再連結した。得られた
プラスミドｐＴＶ２６４−４５には遺伝子の３′端のＡ
ｖａ Ｉ部位がない。プラスミドｐＴＶ２６４−４５を
Ｎｄｅ Ｉで完全に消化し、配列： のリン酸化した合成リンカーに連結した。ｐＴＶＲ２７
９−８と表わされる得られたプラスミドはｍｅｔ−ｌｅ
ｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ３アナログの
発現を支配する。第２６図：ｐ９２００の構築 ｐＨＧ４４からアンピシリン耐性遺伝子のほとんどを除
去しｐＨＧ４４のテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換
えることによりプラスミドｐ９２００を構築した。ｐＨ
Ｇ４４をＧｌａ ＩとＰｓｔ Ｉで開裂し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、ＤＮＡ大
フラグメントを単離した。このフラグメントを、Ｅｃｏ
ＲＩとＡｖａ ＩでｐＢＲ３２２を開裂し、クレノウ
フラグメントで処理した後に単離したｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ小フラグメントに連結した。連結で得たプラスミド
をｐ９２００と表わした。プラスミドｐ９２００はｍｅ
ｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｂＧＨアナログの発現を支配し、
宿主細胞をテトラサイクリン耐性とする。第２７図：ｐＴＶ３００の構築 ｐＴＶ３００はｍｅｔ１４−ｈＧＨアナログの発現を支
配する。ｐＴＶ１８（１）をＮｄｅ Ｉで開裂し、ｍｅ
ｔ１４−ｈＧＨ ＤＮＡを単離し、Ｎｄｅ Ｉで開裂し
たｐ５７９（第１９図）に連結することによりｐＴＶ３
００を構築した。ｐＴＶ１８（１）は１９８５年１月２
３日に公開された欧州特許出願公開第０１３１８４３Ａ
ｌ明細書又は対応の１９８３年７月１５日出願の米国特
許出願番号第５１４，１８８号明細書（援用して本明細
書に包含する）に記載されたようにして得ることができ
る。第２８図：Ａｐｏ Ｅアナログの細胞内蓄積に伴う細胞
毒性 ｐＴＶ１９４を含有するｃ６００細胞（５ｍｌ）又はト
ランスフェクションしていない対照（コントロール）細
胞を培養し、インキュベーション温度を３０℃から４２
℃に上昇させることにより誘導した。図に示した時間
に、培養物の１ｍｌアリコートを取り、氷で急冷し、成
長培地で段階的に希釈し、適当な抗生物質の存在下に寒
天上に置き、３０℃で一晩インキュベートした。コロニ
ー数は２つのプレートの平均から決定した。ｐＴＶ１９
４をトランスフェクトしたｃ６００細胞とトランスフェ
クトしていないｃ６００細胞とを３０℃に維持した対応
培養物（ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）を非誘導
対照とした。第２９図：線維芽細胞のＡｐｏ−Ｂ，Ｅ（ＬＤＬ）レセ
プターへのＡｐｏ ＥＤＭＰＣ複合体の結合 生物工学処理したＡｐｏ Ｅ（ｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ ３
アナログ）と真正Ａｐｏ Ｅのリン脂質複合体は、蛋白
質とＤＭＰＣとを２２℃でインキュベートすることによ
って調製した。（実施例３８の後の参考文献３０に）記
載したように、密度勾配超遠心で非複合物質から複合体
を分離した。左：４℃において、培養した線維芽細胞レ
セプターとの結合について１２５Ｉ標識ヒトＬＤＬと競
合する生物工学処理Ａｐｏ Ｅ及び真正Ａｐｏ Ｅ・Ｄ
ＭＰＣ複合体の能力。右：１２５Ｉ−標識Ａｐｏ Ｅア
ナログ及び真正Ａｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の培養線維
芽細胞と直接結合する能力。第３０図：肝臓の膜のＡｐｏ Ｅレセプターに対する
１２５Ｉ−Ａｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の結合 第２９図に記載の通りにリン脂質（ＤＭＰＣ）複合体を
調製した。コレステロールを与えた成犬の肝臓の膜をＡ
ｐｏ Ｅレセプター源として用い、（実施例３８の後の
参考文献３２に）記載の如く調製した。１２５Ｉ−標識
した生物工学処理した及び真正Ａｐｏ Ｅ ＤＭＰＣ複
合体を、（実施例３８の後の参考文献３２）に記載の如
く４℃で膜に結合させた。第３１図：ウサギ血漿からのヨウ素化Ａｐｏ Ｅのクリ
アランス 生物工学処理した及び真正Ａｐｏ Ｅをウサギ血漿１ｍ
ｌと共に３７℃で３０分間インキュベートした後、この
混合物をウサギの静脈に注射した。図に示す時間に約２
ｍｌの血液をＥＤＴＡを含有するバイアル中に採取し、
計数測定用血漿を調製した。（実施例３８の後の参考文
献３３に）記載されているように、測定値（カウント）
はＴＣＡ可溶分解産物に対して補正する。発明の詳細な説明 遺伝子の発現とポリペプチドの産生を増強しうるベクタ
ーが開発された。このプラスミドは２本鎖ＤＮＡ分子で
ある。このプラスミドを非耐熱性リプレッサーＣＩを含
有する適切な細菌の宿主細胞に導入すると、この細胞
は、宿主細胞の温度がリプレッサー不活性化温度まで上
昇したときに、プラスミドに挿入された所望の遺伝子を
発現して、遺伝子がコードするポリペプチドを産生させ
ることができる。前記ベクターは５′から３′に向って
次のものを順に含んでいる。 ・ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターとオペ
レーターＰＬＯＬを含有するＤＮＡ配列； ・抗転写終結因子Ｎ蛋白質を結合するためのＮ利用部
位； ・その後に続くリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配
列を置換できる第１の制限酵素部位； ・所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームと結
合しうるようにするためのリボソーム結合部位を含有す
るＤＮＡ配列； ・ＡＴＧ開始コドン、又はベクターに所望遺伝子を挿入
するときにＡＴＧ開始コドンに変換されるＤＮＡ配列；
及び ・ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせてベクター内に所望
遺伝子を挿入するための第２の制限酵素部位。 前記ベクターは、又、宿主細胞内で自律複製できる細菌
プラスミド由来の複製起点を含有するＤＮＡ配列と、ベ
クターが宿主細胞中に存在するときに現われる選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有する
ＤＮＡ配列とｃＩ４３４と表わされるフラグメントを含
有するＤＮＡ配列とからなる群から選択される選択手段
とを含んでいる。このようなｃＩ４３４フラグメントは
ｃＩ４３４リプレッサー蛋白質の遺伝子とそれに関連す
るプロモーター及びオペレーター配列とを含んでいる。
ｃＩ４３４はｃＩ４３４−溶原素（ｌｙｓｏｇｅｎ）を
抑制するので、このプラスミドを損失すると細胞融解
（ｌｙｓｉｓ）が起こるであろう。ＰＬＯＬプロモータ
ー及びオペレーター配列の３′末端とＮ利用部位の５′
末端との間の距離は約８０塩基対未満であり、Ｎ利用部
位の３′末端とリボソーム結合部位の５′末端との間の
距離は約３００塩基対未満である。ベクターの適宜付加
成分は第２の制限酵素部位の３′末端に位置するＴ１Ｔ
２ｒＲＮＡ転写終結配列である。Ｔ１Ｔ２ｒＲＮＡ転写
終結配列が第２の制限酵素部位の３′末端から約１００
塩基対未満であると好ましい。より好ましくは、Ｔ１Ｔ
２ｒＲＮＡ転写終結配列が第２の制限酵素部分の３′末
端から約２０塩基対未満である。ベクターは、このベク
ターが宿主細胞内に存在するときに現われる選択可能な
又は同定可能な表現形質に関連している遺伝子を含有し
ているＤＮＡ配列か、λｉｍｍ４３４ｃＩ−溶原素を抑
制するｃＩ４３４リプレッサー遺伝子を含有しているＤ
ＮＡ配列のいずれか、又は両者を含んでいる。選択可能
な又は同定可能な表現形質に関連する適切な遺伝子は温
度感受性又は薬剤耐性例えばアンピシリン、クロラムフ
ェニコール又はテトラサイクリンに対する耐性に関連す
るものを包含する。宿主がｃＩ４３４リプレッサー遺伝
子を含有しているときには、この宿主内でλｉｍｍ４３
４ｃＩ−プロファージが誘発されない。従って、ｃＩ
４３４が存在するときには高価な抗生物質選択用生理食
塩水を使う必要はない。ベクターは、選択可能な又は同
定可能な表現形質に関連する遺伝子を含有しているＤＮ
Ａ配列と、ｃＩ４３４と表わされるフラグメントを含有
するＤＮＡ配列との両方を含んでいるのが好ましい。ｃ
Ｉ４３４遺伝子がベクターに含まれているときにはＴ１
Ｔ２ｒＲＮＡ配列の３′末端の後に位置していることが
望ましい。ベクターは、宿主細胞内で自律複製しうる細
菌プラスミド由来の複製起点をも含んでいる。このよう
な複製起点の適切なものは多くの源、例えばｐＢＲ３２
２又はｐＲＩから得ることができる。好ましくは、ベク
ターは、宿主細胞内でベクターの構成コピーを少なくと
も４００個自律複製しうる高い構成コピー数の細菌プラ
スミド由来の複製起点を有している。より好ましくは、
この複製起点がＣｏｌ Ｅ１である。最も好ましくは、
起点は第７図に示す制限地図を有するプラスミドｐＯＰ
１Δ６である。ベクターのもう１つの成分は、その後
に続くリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配列を置換
させうる第１の制限酵素部位である。多数のこのような
部位が使用できる。Ｅｃｏ ＲＩが適切である。ベクタ
ーのもう１つの成分は、ＡＴＧ開始コドンと位相を合わ
せてプラスミドに所望遺伝子を挿入するための第２の制
限酵素部位である。多数のこのような部位を使用しう
る。適切部位はＮｄｅ Ｉ，Ｃｌａ Ｉ，Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ，Ｓｍａ Ｉ，Ｂｇｌ ＩＩ，Ｘｂａ Ｉ，Ｓａｃ
Ｉ及びＡｌｕ Ｉを包含する。一般的に、第２の制限
酵素部位がリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配列を
置換させうるに必要な第２の制限部位としても機能する
ことが好ましい。第２の制限酵素部位をこの目的にも用
いることができないときには、本発明ベクターはリボソ
ーム結合部位の後且つ第２の制限部位の前に第３の制限
酵素部位をも含んでいなければならない。好ましくは、
ベクターは２つの非反復（ｕｎｉｑｕｅ）制限酵素部位
を含有している。第１の部位はリボソーム結合部位を含
有するＤＮＡ配列を置換させることができる。第２の部
位はＡＴＧ開始コドンと位相を合せてプラスミドに所望
遺伝子を挿入させることができる。本明細書中で用いら
れている「非反復（唯一の，単一の）制限酵素」という
用語はプラスミド中に１つだけある制限酵素部位を意味
している。現状での好ましい具体例においては、Ｅｃｏ
ＲＩが第１の制限酵素部位であり、Ｎｄｅ Ｉが第２
の制限酵素部位である。好ましくは、ベクターは共有結
合で閉じた環状二本鎖の分子である。しかしながら、プ
ラスミドが共有結合で閉じていることは必須ではない。
宿主細胞をＣＩリプレッサー蛋白質の不活化温度まで加
熱した後に、プラスミドの発現レベルが上昇する。この
目的のためには約３８℃以上の温度が有効である。又、
宿主細胞に対する不必要な熱損傷を最小限にすることが
望ましいので、温度は４２℃を数度以上超えないことが
一般的に好ましい。ベクターの１つの重要な成分はリボ
ソーム結合部位である。適切な部位は、 配列：
【化５】 を有するラムダバクテリオファージ由来のＣＩＩ； 配列：
【化６】 を有するラムダバクテリオファージ由来のＣＩＩの変異
体； 配列：
【化７】 を有するバクテリオファージラムダの主要頭部蛋白質遺
伝子；ｐＢＲ３２２由来の天然のβ−ラクタマーゼリボ
ソーム結合部位； 配列：
【化８】 を有する合成オリゴヌクレオチド； 配列：
【化９】 を有する合成オリゴヌクレオチド；及びバシラスツレン
ゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｅｎｇｅｎｓｉ
ｓ）由来の天然のリボソーム結合部位である。以前に記
載されたベクターと比較して、本発明ベクターは所望の
ポリペプチド生成物をコードする広範囲の遺伝子の発現
を増強するために使用することができる。成長ホルモン
例えばウシ、ブタ、ニワトリ又はヒトの成長ホルモン
や、スーパーオキシドジスムターゼやアポリポプロテイ
ンＥ又はそれらいずれかのアナログをコードする遺伝子
が適切な遺伝子に含まれる。アナログ（アナログ、類似
体）とは天然のポリペプチドと同じ活性を有している
が、ポリペプチドのＮ末端で１つ以上の異なるアミノ酸
が付加されているか、欠失しているか又はその両者であ
るポリペプチドを意味している。本発明のプラスミドと
共に用いる好ましい宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）である。現状で好ましい株はＡ１６３
７，Ａ１６４５，Ａ２６０２，Ａ２０９７，Ａ１５６３
及びＡ１６４５（λｉ４３４ｃＩ−ｍｉｎｉ Ｔｎ １
０）である。スーパーオキシドジスムターゼ又はそのア
ナログの発現のために現状で最も好ましい株はＡ１６４
５である。Ａ１６４５及びＡ１６４５（λｉ４３４ｃＩ
−ｍｉｎｉ Ｔｎ １０）が動物の成長ホルモン遺伝子
を発現するための現状でより好ましい株である。 （１）フェニルアラニン型真正ｂＧＨのアミノ末端にア
ミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎがついているｂＧＨ
アナログ、又は （２）フェニルアラニン型天然ｃＧＨのアミノ末端にア
ミノ酸、メチオニンがついているｃＧＨのアナログ を産生する遺伝子の発現のための現状で最も好ましい株
はＡ２０９７である。テトラサイクリン耐性遺伝子を含
有するトランスポゾンをガラクトースオペロン内に挿入
し、ガラクトースオペロンに近い所で発現用のラムダ系
を挿入することによってｃ６００からＡ１６３７を得
た。ｃ６００はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンからＡＴＣＣ受託番号２３７２４号として入手でき
る。Ｇａｌ＋（ガラクトース発酵能）に関して選択し、
テトラサイクリン耐性を失わせることにより、Ａ１６３
７からＡ１６４５を得た。Ａ１６４５はラムダ発現系を
含有しているが選択によってトランスポゾンの一部は取
り除かれている。この表現型はＣ６００ｒ− ｍ＋ ｇ
ａｌ＋ ｔｈｒ− ｌｅｕ− ｌａｃ Ｚ−ｂｌ（λｃ
Ｉ８５７ΔＨＩΔＢａｍ ＨＩ Ｎ＋）である。以下に
より詳細に記載した種々のプラスミドも含み、Ａ１６４
５は米国（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、マリーランド（Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のアメリ
カンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。
Ａ１６４５（λｉ４３４ｃＩ−ｍｉｎｉ Ｔｎ １０）
は３０℃でｉｍｍ４３４ｃＩ３００８ｍｉｎｉ Ｔｎ
１０Δ１６Δ１７をプラスミド含有大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ａ１６４５に感染させるこ
とにより得た。テトラサイクリン耐性コロニーを単離精
製した。プラスミドｐＨＧ５０を含有するこの株はＡＴ
ＣＣ受託番号３９８０５としてアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託してある。Ａ２６０２及びＡ１
５６３はＳＡ５００由来である。これらの表現型は各々
ＳＡ５００ｈｉｓ− ｉｌｅ− ｇａｌ＋ Δ８（λｃ
Ｉ８５７ΔＨＩΔＢａｍＮ＋）及びＳＡ５００ｈｉｓ−
ｉｌｅ− ｇａｌ＋ Δ８ ｌａｃ Ｚ− Ａ２１
（λｃＩ８５７ ｉｎｔ２ ｘｉｓ１ ｎｕｔＬ３ Δ
ＨＩ）である。Ａ２０９７はＡ１６４５由来である。こ
の表現型はＡ１６４５ｌａｃΔｘ Ａ２１ｐｒｃ
Ｃ：：Ｔｎ１０である。最少必須培地中で増殖させたと
きでさえ高いレベルでポリペプチドを発現すことができ
る大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の原栄
養株も又、本発明ベクターの宿主として使用できる。好
ましい原栄養株はＡ４２００とＡ４２５５とを包含す
る。プラスミドｐ９２００を含有する株Ａ４２５５は受
託番号５３２１５号としてＡＴＣＣに寄託してある。プ
ラスミドｐＧＨ４４を含有するＡ４３４６のようなビオ
チン非要求（依存）性原栄養株が更に好ましい。Ａ４３
４６は受託番号５３２１８号としてＡＴＣＣに寄託して
ある。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の
溶原株も本発明のベクターの宿主として使用できる。ポ
リペプチドが産生する温度において、ポリペプチドが産
生する速度よりゆっくりと、例えば細胞を融解させるエ
ンドリシンのような物質を産生する溶原株が適切な溶原
株に含まれる。これにより、産生された溶解物質の量が
細胞融解を起こすレベルに達する前に、細胞が比較的大
量の所望ポリペプチドを産生することができる。適切な
溶原菌の例には、ｐＧＨ４４を含有する株Ａ４０４８の
ようなＰｌｃ Ｉｔｓプラスミドを含有するものが含ま
れる。Ａ４０４８は受託番号５３２１７号でＡＴＣＣに
寄託してある。ｐＢＲ３２２とｐＢＲＭは各々ＡＴＣＣ
受託番号３７０１７号及び３７２８３号としてアメリカ
ンタイプカルチャーコレクションから入手でき、Ｄ４は
米国特許出願と関連してＡＴＣＣ受託番号３１８２６号
として寄託した以外、全ての寄託は微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約に従った。ベクターは本
発明が関連する分野の当業者には公知の方法で形成でき
る。これらの方法については本明細書中に記載した種々
の文献中により詳細に記載されており、従来技術に関す
る完全な情報を提供するために本明細書中に参考として
それらの内容を包含する。現状の好ましいベクターの１
つは第２図に示す制限地図を有するｐＪＨ２００であ
る。Ａ１６４５株を用い、従来の形質転換法により大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）にこのベクタ
ーを導入した。得られた宿主ベクター系はＡＴＣＣ受託
番号第３９７８３号として寄託してある。所望のポリペ
プチド例えばウシ成長ホルモンをコートする遺伝子をｐ
ＪＨ２００に挿入できる。２番目の好ましいベクターｐ
ＲＯ２１１はｐＪＨ２００のＮｄｅ Ｉ部分消化物から
構築した。ｐＲＯ２１１は第２図に示す制限地図を有す
る。このベクターをＮｄｅ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで
消化し、大フラグメントを単離し、これをｐＡＬ５００
（ＡＴＣＣ受託番号３９７８２号）から得たｂＧＨ ｃ
ＤＮＡに連結することによりウシ成長ホルモンｃＤＮＡ
をｐＲＯ２１１に挿入した。得られたプラスミドはｐＲ
Ｏ１２と表わす。これの制限地図も第２図に示す。プラ
スミドｐＲＯ１２をＰｖｕ ＩＩで部分消化し、続いて
Ｎｄｅ Ｉにより消化する。真正ｂＧＨのＮ末端の最初
の２４個のアミノ酸をコードする合成ＤＮＡフラグメン
トを消化したｐＲＯ１２に連結する。得られたプラスミ
ドはｐＳＡＬ５２００−６と称し、その制限地図を第３
図に示す。本発明のベクターはまた、ヒトスーパーオキ
シドジスムターゼ（ＳＯＤ）あるいはその類似物（アナ
ログ）を生産するプラスミドを生成するように工学処理
し得る。λＰＬプロモーター及びＣＩＩリボソーム結合
部位を有するｐＪＨ２００（ＡＴＣＣ受託番号３９７８
３）のフラグメントを、第１３図に示すように、単離し
た後ヒトＳＯＤ遺伝子を含むプラスミドｐＳＯＤ ＮＨ
−１０に挿入して、ｐＳＯＤ ＮＨ−５５０と称するプ
ラスミドを形成した。λＰＬプロモーター及びＳＯＤ遺
伝子を含むフラグメントをｐＳＯＤ ＮＨ−５５０のＡ
ｌｕ Ｉによる消化後単離した。Ｂａｍ ＨＩリンカー
の添加及びその後のＢａｍ ＨＩによる制限の後、フラ
グメントをｐＢＲＭの唯一のＢａｍ ＨＩ部位に挿入し
た。ｐＢＲＭはＡＴＣＣ受託番号３７２８３で寄託され
ている高コピー数プラスミドである。得られたプラスミ
ドをｐＳＯＤα２と称する。その制限地図を第１３図に
示した。このプラスミドは Ｅ．ｃｏｌｉ株Ａ２０９７
中に入れてＡＴＣＣ受託番号３９７８６で寄託されてい
る。プラスミドｐＳＯＤα２（ＡＴＣＣ受託番号３９７
８６）はＣＩＩリボソーム結合部位を含んでいる。この
リボソーム結合部位を、ｐＢＬＡ１１のＥｃｏ ＲＩ−
Ａｌｕ Ｉダイジェスト（消化物）から単離したβ−ラ
クタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガーノ（Ｓ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）リボソーム結合部位を含
有するフラグメントにより置き換える。（プラスミドｐ
ＢＬＡ１１は第１４図に示す制限地図を有するものであ
り、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ａ１６４５中
に入れてＡＴＣＣ受託番号３９７８８により寄託されて
いる。）ＣＩＩリボソーム結合部位を第１４図に示すよ
うにプラスミドｐＳＯＤα２から除去する。ｐＳＯＤα
２をＥｃｏ ＲＩにより部分的に制限しＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し再連結すると、該プラ
スミド中に残る唯一のＥｃｏ ＲＩ部位がＣＩＩＲＢＳ
の５′末端となる。得られたｐＳＯＤα１３と称するプ
ラスミドをＮｄｅ Ｉで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填し、次にＥｃｏ ＲＩにより消
化する。大フラグメントを単離し、ｐＢＬＡ１１より単
離されたβ−ラクタマーゼプロモーター及びリボソーム
結合部位を含むフラグメントに連結してプラスミドｐＳ
ＯＤ β１を構築する。ｐＳＯＤ β１はアンピシリン
抵抗性遺伝子フラグメント（ＡｍｐＲ）の替りにテトラ
サイクリン抵抗性遺伝子フラグメント（ＴｅｔＲ）を含
むように改変し得る。ＡｍｐＲフラグメントをＰｓｔ
Ｉ引き続きＢａｍ ＨＩ（部分的）による消化によりｐ
ＳＯＤβ１から除去した。得られたプラスミドをＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で充填した。別にＴｅ
ｔＲ遺伝子フラグメントをｐＢＲ３２２のＥｃｏ ＲＩ
−Ａｖａ Ｉダイジェストから単離し、充填し、上で充
填したプラスミドに連結した。（プラスミドｐＢＲ３２
２は広く入手可能で、例えばアメリカンタイプカルチュ
アコレクションからＡＴＣＣ受託番号３７０１７として
入手可能である。）得られたプラスミドをｐＳＯＤβ１
Ｔ１１と称する。その制限地図を第１５図に示す。ヒト
スーパーオキシドジスムターゼを生産するのに使用し得
るもう１つのプラスミドをｐＳＯＤβ１−ＢＡ２と称す
る。そのｐＳＯＤα１３からの構築を第１７図に示す。
本発明のベクター、例えばｐＲＯ２１１はまたブタある
いはニワトリ成長ホルモンを生産するように処理するこ
ともできる。即ち第４図に示すように、ブタ成長ホルモ
ンｃＤＮＡをｐｐＧＨ−Ｎｄｅ Ｉ／ＲＩのＮｄｅ Ｉ
ダイジェストから単離した。得られたｐＧＨ遺伝子を含
むフラグメントをｐＲＯ２１１のＮｄｅＩダイジェスト
に連結した。得られたプラスミドはＰ３００８と称し、
Ｅ．Ｃｏｌｉ株Ａ２０９７中に入れてＡＴＣＣ受託番
号３９８０４で寄託されている。本発明の他の実施態様
においては、第５図に示すようにｐｃＧＨ−Ｎｄｅ Ｉ
／ＲＩのＮｄｅ Ｉ−Ｂａｎ ＩＩダイジェストから２
つのニワトリ成長ホルモンフラグメントを単離した。２
つのｃＧＨフラグメントを、真正ｃＧＨのＮ末端の最初
の１８個のアミノ酸をコードするリン酸化合成リンカー
に連結した。リンカーの配列は下記の通りである。
【化１０】 得られたフラグメントを次にｐＲＯ２１１のＮｄｅ Ｉ
ダイジェストに連結し、ｐ５００２と称するプラスミド
を形成した。その制限地図を第５図に示す。本発明のベ
クターはまた、ヒトアポリポプロテインＥを生産するよ
うに工学処理することもできる。ヒトアポリポプロテイ
ンＥ（Ａｐｏ Ｅ）遺伝子はプラスミドｐＡｐｏ Ｅ−
ＥＸ２からＮｄｅ Ｉ消化により単離される。ｐＡｐｏ
Ｅ−ＥＸ２は第１８図に示す制限地図を有し、 Ｅ．
ｃｏｌｉ株Ａ１６４５中に入れてＡＴＣＣ受託番号３９
７８７で寄託されている。Ａｐｏ Ｅ遺伝子（ｃＤＮ
Ａ）は種々のプラスミド中に配置し得る。好ましい具体
例はプラスミドｐＴＶ−１８８であり、その制限地図を
第１８図に示す。ｐＴＶ−１８８は、ｐＡｐｏ Ｅ−Ｅ
Ｘ２から単離されたＡｐｏ Ｅ遺伝子をプラスミドｐＳ
ＯＤβ１Ｔ１１のＳｔｕ Ｉダイジェストに連結するこ
とにより構築した。ｐＴＶ−１８８はＴｅｔＲフラグメ
ント、ＰＬプロモータ配列、β−ラクタマーゼプロモー
ター及びシャイン−ダルガーノ配列を含む。このプラス
ミドはＡｐｏ Ｅ融合プロテインを発現する。Ａｐｏ
Ｅ遺伝子を含むプラスミドのもう１つの好ましい具体例
は第２３図に示した制限地図を有するｐＳＡＬ１６０−
５である。ｐＳＡＬ１６０−５はｐＴＶ１０４（２）
（ＡＴＣＣ受託番号３９３８４）及びプラスミドｐＴＶ
−１７０（第２０図参照）から構築した。Ａｐｏ Ｅ遺
伝子はｐＴＶ−１７０から単離し、ｐＴＶ１０４（２）
のＰｓｔ Ｉ部位のヒト成長ホルモン遺伝子配列内に挿
入した。得られたプラスミドｐＳＡＬ１６０−５はＡｍ
ｐＲフラグメント及びＰＬプロモーター配列を含む。現
状での好ましいベクターの一つは、第１９図に示す制限
地図を有するｐ５７９である。このベクターは適当な
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株、例えばＡ１６３
７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５あるいはＡ２
０９７に、当業者にとっては公知の慣用の形質転換法に
より導入し得る。所望のポリペクチド、例えばブタ成長
ホルモンあるいはニワトリ成長ホルモンをコードした遺
伝子をｐ５７９に挿入し得る。ブタ成長ホルモンｃＤＮ
Ａを、ベクターｐ５７９をＮｄｅ Ｉにより消化し、こ
のオープンストランドをｐ３００８（ＡＴＣＣ受託番号
３９８０４）より得たｐＧＨ ｃＤＮＡに連結すること
によって、ｐ５７９に挿入した。得られたプラスミドを
ｐ３００９と称し、その制限地図を第１１図に示す。ベ
クターｐ５７９をＮｄｅ Ｉで消化し、このオープンス
トランドをｐ５００２から得たｃＧＨ ｃＤＮＡに連結
することによって、ニワトリ成長ホルモンｃＤＮＡをｐ
５７９に挿入した。得られたプラスミドをｐ５００３と
称し、その制限地図を第１２図に示す。ｐ５００３はＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＡ２０９７株中に入れ
てＡＴＣＣ受託番号３９７９２で寄託されている。ヒト
アポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ３）産生遺伝子はお
そらくその最終産物のアミノ末端にアミノ酸メチオニン
が付加しているであろうが、これもｐ５７９に挿入し得
る。得られたｐＴＶ−１７０と称するプラスミドの構築
を第２０図に示す。このプラスミドはｐＪＨ２００（Ａ
ＴＣＣ受託番号３９７８３）由来のＣＩＩリボソーム結
合部位を有する。プラスミドｐＴＶ−１７０はＡｐｏ
Ｅ遺伝子の両端を区切っているＮｄｅＩ部位の一つを除
去することによって改変し得る。得られたプラスミドは
ｐＴＶ−１９０と称し、第２１図に示す。ｐＴＶ−１７
０はまた、ＣＩＩリボソーム結合部位をｐＢＬＡ１１
（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．３９７８８）から単離された
β−ラクタマーゼプロモーター及びシャイン−ダルガー
ノリボソーム結合部位配列と置き替えることにより改変
し得る。得られたプラスミドはｐＴＶ−１９４と称し、
第２２図に示した制限地図を有する。ｐＴＶ−１９０
（第２１図）はまた、ヒトＡｐｏ Ｅ３のアナログを生
産するように改変することもでき、このアナログはその
アミノ末端において、成熟ヒトＡｐｏ Ｅ３の配列に結
合した、ヒト成長ホルモンの１４個のアミノ酸のアミノ
末端配列及びそれに続くメチオニンを有する。このプラ
スミドをｐＴＶ−２１４と称し、第２４図に示した制限
地図を有する。Ａｐｏ Ｅ３遺伝子を含むプラスミドの
もう一つの好ましい具体例は第２５図に示した制限地図
を有するｐＴＶＲ２７９−８である。ｐＴＶＲ２７９−
８はｐＴＶ１９０から構築されたｐＴＶ２６４−４５か
ら構築される。プラスミドｐＴＶ１９０（第２１図）を
Ａｖａ Ｉにより部分的に開裂し、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントを使用して“充填”し、再連
結する。得られたプラスミドはｐＴＶ２６４−４５と称
し、遺伝子の３′末端においＡｖａ Ｉ部位を欠除して
いる。プラスミドｐＴＶ２６４−４５をＮｄｅ Ｉによ
り完全に消化し、下記の配列を有するリン酸化合成リン
カーに連結する。 得られたプラスミドはｐＴＶＲ２７９−８と称しＡＴＣ
Ｃに受託番号５３２１６で寄託されている。本発明のベ
クターはまた、ヒト成長ホルモンを産生することができ
るプラスミドを形成するように工学処理することもでき
る。このようなプラスミドの１つの例はｐＴＶ３００で
あり、第２７図に示した制限地図を有している。ｐＴＶ
３００は、ｐＴＶ１８（１）をＮｄｅ Ｉにより開裂
し、ｍｅｔ１４−ｈＧＨ ＤＮＡを単離し、それをＮｄ
ｅ Ｉで開裂したｐ５７９（第１９図）に連結すること
によって構築した。ｐＴＶ１８（１）は、１９８５年１
月２３日公開のヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．０１３１
８４３Ａ１号あるいは対応する１９８３年７月１５日出
願のアメリカ特許出願５１４，１８８号（援用して本明
細書に包含する）に記載されているようにして得られ
る。本発明のベクターはまた、アミノ末端がアセチル化
されていないという点において天然のヒトＳＯＤと異な
っているヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）のアナログを産生するプラスミドを生成する
ように工学処理することもできる。このようなプラスミ
ドは第１６図に従って構築され、ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１
と称する。本発明のベクターは組換えウシ成長ホルモン
を産生するプラスミドを生成するように処理し得る。１
つの例として、真正ｐＧＨのフェニルアラニン形のアミ
ノ末端に付加されたアミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌ
ｎを有するｂＧＨアナログの生産があり、このアナログ
はｒｅｃ ｂＧＨとも称される。そのようなホルモンを
産生するプラスミドｐＧＨ４４は第６図の図式に従って
構築されるものであり、Ａ２０９７株に入れてＡＴＣＣ
受託番号３９８０６で寄託されている。ｍｅｔ−ａｓｐ
−ｇｌｎウシ成長ホルモンを生産するもう一つのプラス
ミドはｐ９２００である。このプラスミドｐ９２００は
ｐＨＧ４４（第６図）に似ているが、アンピシリン抵抗
性の替りにテトラサイクリン抵抗性を与える。ｐ９２０
０の構築は第２６図に示した。ｐＨＧ４４をＣｌａ Ｉ
及びＰｓｔ Ｉにより開裂し、ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントを使用して“充填”し、次いで大
ＤＮＡフラグメントを単離した。このフラグメントを、
ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ及びＡｖａ Ｉにより開裂し
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用し
て“充填”することにより単離したｐＢＲ３２２のテト
ラサイクリン抵抗性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントに
連結した。得られたプラスミドｐ９２００はＡＴＣＣに
受託番号５３２１５で寄託されている。もう一つの例
は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたアミノ酸メチオニンを有するｂＧＨアナロ
グの生産である。このようなホルモンを産生するプラス
ミドｐＳＡＬ５６００−１は第１０図に示したように構
築した。プラスミドｐ７２００−２２もこのようなホル
モンを産生する。このプラスミドは第７図に示した制限
地図を有する。現状で好ましいベクターの一つは、Ｃｌ
ａ Ｉ部位にクローニングされたｃＩ４３４フラグメン
トを含有するＤＮＡ配列を持ったベクターｐ５７９であ
る。ｐ５７９は第１９図に示した制限地図を有する。天
然のウシ成長ホルモンのフェニルアラニン形のアミノ末
端につけ加えられたｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎのアミノ酸
配列を有するウシ成長ホルモンのアナログ（ｒｅｃ−ウ
シ成長ホルモンとも称する）を発現するプラスミドを構
築した。このようなプラスミドの１つはｐＨＧ５０であ
り、第６図に示した制限地図を有する。このプラスミド
はＡ１６４５株（λｉ４３４ｃＩ−ｍｉｎｉ Ｔｎ １
０）中に入れてＡＴＣＣ受託番号３７８０５でアメリカ
ンタイプカルチュアコレクションに寄託されている。も
う一つのこのようなプラスミドはｐＳＡＬ−２１０／４
であり、第９図に示した制限地図を有する。現状での好
ましいベクターの１つはプラスミドｐ８３００−１０Ａ
からｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨを除去することによって得
られる。このプラスミドｐ８３００−１０Ａは第７図に
示した制限地図を有し、Ａ２０９７株中に入れてＡＴＣ
Ｃ受託番号３９７８５でアメリカンタイプカルチュアコ
レクションに寄託されている。現状でのもう一つの好ま
しいベクターは、プラスミドｐＳＡＬ−１７０／１０か
らｒｅｃ ｂＧＨ遺伝子を除去して得られる。このプラ
スミドｐＳＡＬ−１７０／１０の制限地図を第８図に示
した。現状での好ましい第３のベクターはプラスミドｐ
ＳＡＬ−２１０／４からｒｅｃ ｂＧＨ遺伝子を除去し
て得られる。このプラスミドｐＳＡＬ−２１０／４の制
限地図を第９図に示した。本発明のベクターは、宿主に
導入することによりウシ成長ホルモンのアナログを産生
するプラスミドを生成するようにも工学処理し得る。ｐ
８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ受託番号３９７８５）はこ
のようなプラスミドの１例であるが、第７図に示したよ
うにして構築した。それにより生産されたこのアナログ
は、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のアミノ末端につ
け加えられたメチオニン残基を有する。他のプラスミド
も、天然ｂＧＨのフェニルアラニン形のＮ末端につけ加
えられたｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎのアミノ酸配列を有す
るアナログを産生する。それ等のプラスミドにはｐＳＡ
Ｌ−１３０／４（第８図）、ｐＳＡＬ−１７０／１０
（第８図）及びｐＳＡＬ−２１０／４（第９図）が包含
される。同じ方法により、プラスミドの第２制限酵素部
位において所望のポリペプチドをコードした遺伝子に置
きかえることにより他のプラスミドを調製し得る。種々
の宿主ベクター系としては、 Ｅ．ｃｏｌｉＡ１６３
７，Ａ１６４５，Ａ２６０６，Ａ２０９７あるいはプラ
スミドがｃＩ４３４フラグメントを含んでいない場合は
Ａ１５６３及びプラスミドがｃＩ４３４フラグメントを
含む場合はＡ１６４５株（ｉ４３４ｃＩ−ｍｉｎｉ Ｔ
ｎ １０）が包含される。本発明の宿主ベクター系とし
ては、例えばＡ４２００，Ａ４２５５のような原栄養体
Ｅ．ｃｏｌｉ及び例えばＡ４３４６のようなビオチン
非依存宿主ベクター系が包含される。本発明の溶解性宿
主ベクター系としては宿主がＡ４０４８、特にＡ３１１
１であるものが包含される。本明細書に記載する宿主ベ
クター系及びプラスミドは、例えばウシ，ブタ，ニワト
リ及びヒトの成長ホルモン、ヒトスーパーオキシドジス
ムターゼ及びヒトアポリポプロテインＥのような異なる
ポリペプチドを生産するのに使用できる。そうするため
には宿主ベクター系をポリペプチドを生産し得る適当条
件下で成長させ、次いでポリペプチドを回収する。宿主
ベクター系の至適生育条件は約４２℃に適当な時間を保
つことである。望ましくは、ヒトアポリポプロテインＥ
を生産しようとするもの以外の全ての宿主ベクター系に
対しては４２℃で生育させる時間は約１〜５時間であ
る。ヒトアポリポプロテインＥを生産しようとする宿主
ベクター系の場合の生育時間は望ましくは約１５分であ
る。至適培地は加水分解物を含む。上記の方法により多
数のｂＧＨ，ｐＧＨ，ｃＧＨ，ｈＧＨ，Ａｐｏ Ｅ及び
ＳＯＤアナログを調製した。Ｎ末端における変化以外は
天然Ａｐｏ Ｅのものと同一のアミノ酸配列を有するＡ
ｐｏ Ｅアナログを調製した。例としては下記のものが
ある。 １）天然ヒトアポリポプロテインＥのＮ末端に付け加え
られたアミノ酸メチオニン、 ２）ヒトスーパーオキシドジスムターゼのＮ末端の４２
のアミノ酸配列、次いでメチオニンをＮ末端に付加され
た天然ヒトアポリポプロテインＥ、 ３）Ｎ末端の１１個のアミノ酸を取り除き、成熟ヒト成
長ホルモンのＮ末端の４５個のアミノ酸配列とそれに続
くメチオニンに置き換えた天然ヒトアポリポプロテイ
ン、 ４）ヒト成長ホルモンのＮ末端の１４個のアミノ酸、続
いてメチオニンをＮ末端に結合した天然ヒトアポリポプ
テインＥのアミノ酸配列、及び ５）Ｎ末端にｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔのアミノ
酸配列を結合した天然ヒトアポリポプロテインＥ３。 調製したｐＧＨアナログでは天然ブタ成長ホルモンのＮ
末端にアミノ酸メチオニンが結合していた。天然ニワト
リ成長ホルモンのＮ末端にアミノ酸メチオニンが結合し
たｃＧＨアナログを調製した。天然ヒト成長ホルモンの
最初の１３個のアミノ酸が欠失されているｈＧＨアナロ
グ、即ちｍｅｔ１４ｈＧＨを調製した。Ｎ末端における
変化以外は天然ＳＯＤと同一のアミノ酸配列を有するＳ
ＯＤアナログを調製した。例としては下記のものがあ
る。 １）アセチル化されていない天然ヒトＳＯＤ及び ２）アセチル化及びグリコシル化されていない天然ヒト
ＳＯＤ。 これ等のＳＯＤアナログは陽子（プロトン）の存在下で
超酸化物（スーパーオキシド）アニオンの不均化（ｄｉ
ｓｍｕｔａｔｉｏｎ）あるいは等価（ｕｎｉｖａｌｅｎ
ｔ）還元を触媒して下記式に従い過酸化水素を生成す
る。
【化１１】 ｂＧＨ，ｃＧＨあるいはｐＧＨアナログの一つ以上の有
効量及び適当なキャリアーを含有する獣医学的組成物を
調製し得る。キャリアーは当業者にとって公知のもので
ある。アナログは直接、あるいは組成物の形状で、ミル
クや肉の生産を増加させるためにウシあるいはブタに投
与したり、肉の生産を増加させるためにニワトリに投与
し得る。Ａｐｏ ＥあるいはｈＧＨのアナログの一つ以
上の有効量及び適当なキャリアーを含有する薬剤（医
薬）組成物を調製し得る。キャリアーは当業者にとって
公知のものである。アナログは直接あるいは組成物の形
状で、例えばＡｐｏ Ｅの場合はＡｐｏＥ生産不全ある
いは動脈硬化（ａｔｈｅｒｉｏｓｃｅｌｅｒｏｓｉｓ）
の患者の治療のために、ｈＧＨの場合はｈＧＨ生産不全
の患者の治療のためにヒトに投与し得る。ＳＯＤあるい
は一種以上のＳＯＤアナログの有効量及び適当なキャリ
アーを含有する獣医学的及び薬剤組成物も調製し得る。
キャリアーは当業者にとって公知のものである。ＳＯＤ
あるいはアナログは直接あるいは組成物の形状で、例え
ば炎症羅患々者の治療や、全体的虚血症（ｇｌｏｂｏｌ
ｉｓｃｈｅｍｉａ）あるいは腎移植のような臓器移植
の後の再灌注における酸素−フリーラジカルによる損傷
の軽減のために、動物あるいはヒトに投与できる。ＳＯ
Ｄあるいはアナログはまた、直接あるいは組成物の形状
で、例えば切除の後の灌注におけるフリーラジカル酸素
による単離臓器の損傷を軽減し、角膜のような臓器の生
存時間（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ）を延長するため
に、単離臓器灌注媒体に加えることもできる。さらには
ＳＯＤあるいはアナログは神経学的損傷の軽減にも使用
できる。酵素的活性真核生物スーパーオキシドジスムタ
ーゼ（ＳＯＤ）またはそのアナログを細菌細胞中で産生
する方法を発見した。このバクテリア（細菌）細胞がス
ーパーオキシドジスムターゼあるいはアナログをコード
したＤＮＡ配列を含有しておりかつ発現し得る。該方法
はそのバクテリア細胞を適当な条件下、適当な生産培地
中に生育維持することから成る。生産培地中には、濃度
が約２ｐｐｍ以上となるようなＣｕ＋＋量を添加する。
バクテリア細胞は、組換えＤＮＡ技術により真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼをコードしたＤＮＡ配列を
導入できるものならば何でもよい。該バクテリアはこの
ＤＮＡ配列を発現し、タンパク生成物を生産できなけれ
ばならない。バクテリアの種及び株により、至適条件及
び生産培地は異なる。バクテリア細胞は例えばプラスミ
ドのようなベクターＤＮＡ分子中に、スーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログをコードするＤＮＡ配列
を含有してもよい。ベクターあるいはプラスミドは、組
換えＤＮＡ技術によりＳＯＤをコードする配列を分子内
の適当な位置に取り組み込むように構築される。本発明
の好ましい具体例においてはバクテリア細胞はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞である。 Ｅ．ｃｏｌｉの
好ましい株はＡ１６４５株である。本発明の Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞はＳＯＤあるいはそのアナログをコードするプ
ラスミドを含有する。本発明の好ましい具体例において
はＳＯＤはヒトスーパーオキシドジスムターゼあるいは
そのアナログである。本発明の好ましい具体例は、プラ
スミドｐＳＯＤβ１，ｐＳＯＤα２，ｐＳＯＤβＴ１
１，ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２あるいはｐＳＯＤβ１ＴＴ１
を含有するＥ．ｃｏｌｉ株に関する。これ等のプラスミ
ドの構築方法は前記図面の説明において記載し、プラス
ミド自体は後記実施例３に記載した。これ等のプラスミ
ドは通常の当業者であれば利用可能な出発物質から構築
し得る。真核細胞スーパーオキシドジスムターゼをコー
ドするプラスミドを構築するのに有用な種々のプラスミ
ドを含有するＥ．ｃｏｌｉ株は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従
い、アメリカンタイプカルチュアコレクション（ロック
ビル、メリーランド２０８５２）に寄託してある。これ
等のプラスミドのＡＴＣＣ受託番号は、ｐＢＲＭがＡＴ
ＣＣ３７２８３、ｐＳＯＤα２がＡＴＣＣ３９７８６、
ｐＢＲ３２２がＡＴＣＣ３７０１７、ｐＢＬＡ１１がＡ
ＴＣＣ３９７８８、ｐＪＨ２００がＡＴＣＣ３９７８
３、ｐＰＳＩがＡＴＣＣ３９８０７である。本発明の１
つの特定具体例においては、プラスミドｐＳＯＤα２を
含有するＥ．ｃｏｌｉＡ２０９７株により酵素的活性ヒ
トスーパーオキシドジスムターゼアナログを産生する。
この細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託番号３９７８６で寄託されている。バクテリア細胞
の適当な産生培地は、例えばカゼイン加水分解物あるい
はＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地のような許容可
能成長培地であればどのようなものでもよい。適当な生
育条件はＥ．ｃｏｌｉ株及びそれに含まれるプラスミド
により変化し、例えばプラスミドｐＳＯＤβ１Ｔ１１を
含有するＥ．ｃｏｌｉＡ１６４５は４２℃で誘導し、そ
の温度で約１〜５時間維持する。接種物の生育、生産段
階前での培養の所望密度までの生育及び生産期間中の培
養の維持に対する温度、時間、撹拌及び通気の至適条件
は後記実施例２６に記載した。酵素的活性ＳＯＤの生成
に必要なＣｕ＋＋イオンの培地中の濃度は、使用培地の
タイプにより変化する。カゼイン加水分解物培地の場
合、２００ｐｐｍのＣｕ＋＋イオン濃度が有効であるこ
とが判明した。ＬＢ培地の場合、Ｃｕ＋＋濃度は７５ｐ
ｐｍが有効であることが判明した。全ての複合型の成長
培地においては、培地中のＣｕ＋＋濃度が約５０〜２５
０ｐｐｍであることが好ましい。ほとんどの真核細胞ス
ーパーオキシドジスムターゼはＣｕ／Ｚｎ金属タンパク
質である。本発明の一つの特定具体例においては、培地
中のＺｎ＋＋濃度が約２ｐｐｍ以上となるように添加物
（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）としてＺｎ＋＋を加える。本
発明の好ましい具体例においては、Ｃｕ＋＋及びＺｎ
＋＋の濃度は０．８ｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ及び
１０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えることによ
り補給する。適切な保存、培養、接種及び生産培地の特
定成分は変化し得るが、当業者にとっては公知のもので
ある。至適培地の特定例は実施例２６に記載した。本発
明は、本発明の方法に従って生成したバクテリア細胞中
の生成された酵素的活性真核細胞ＳＯＤあるいはそのア
ナログの回収方法にも係る。培養物を急冷した後、バク
テリア細胞を先ず生産培地から単離する。細胞の単離
は、遠心分離や濾過のように細胞を破壊しない方法であ
れば何によっても行なえる。次に細胞をｐＨ約７．０〜
約８．０の適当な溶液に懸濁する。ｐＨが約７．８の５
０ｍＭリン酸ナトリウム溶液を使用することが好まし
い。ブレンダーあるいは細胞破砕機のような適当な手段
により細胞壁を破棄し、得られた均一懸濁液を至適条件
下で超音波処理する。超音波処理は連続流型セルを用い
て行なう。得られた超音波処理溶液を適当な条件下で遠
心分離し、細胞破片と上清タンパク質溶液を分離する。
次に上清液を約２時間、約６５℃に加熱し、冷却して先
の遠心分離ステップと同じ条件において遠心分離して上
清液として清澄タンパク質溶液を得る。次に上清液を適
当な容量に濃縮する。例えば分子量１０．０００カット
オフの限外濾過装置を用いて１１に濃縮する。次に濃縮
タンパク質溶液を、ｐＨを約７．０〜約８．０に平衡さ
せた適当なアニオン交換物質上のイオン交換クロマトグ
ラフィーにかける。ｐＨ約７．８の１５０ｍＭリン酸ナ
トリウムバッファーにより平衡化したＤＥＡＥ−セファ
セル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラム上でクロマトグラフィ
ーを行なうことが好ましい。得られたスーパーオキシド
ジスムターゼあるいはアナログを含有する通過溶液を収
集し、適当な容量に濃縮してｐＨ約７．０〜約８．０の
バッファー溶液に対して透析する。この操作は限外濾過
装置中でｐＨ約７．８の２０ｍＭトリスーＨＣｌ溶液に
対して行うことができる。この濃縮溶液を次に、ｐＨ約
７．０〜約８．０に平衡化した適当なアニオン交換物質
上のイオン交換クロマトグラフィーにかける。ｐＨ約
７．８の２０ｍＭトリス−ＨＣｌにより平衡化したＱＡ
Ｅ−セファロースカラムが適当である。アニオン交換物
質に結合したタンパク質を、例えばｐＨ７．８の２０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ中の０〜２００ｍＭ ＮａＣｌのよう
な適当な塩勾配にかける。得られたＳＯＤあるいはアナ
ログを含有するフラクション（画分）を回収し、例えば
限外濾過装置により濃縮し、蒸留水に対して透析し、適
当なバッファーによりｐＨを約４．０〜約５．０に調整
する。好ましい具体例においては、対象溶液はｐＨ約
４．８の１Ｍ酢酸ナトリウムを加えて１００ｍＭ酢酸ナ
トリウム溶液とした。この緩衝した溶液を今度はカチオ
ン交換物質のイオン交換クロマトグラフィーにかける。
ｐＨ約４．７の１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーに
より平衡化したＣＭ−セファロースカラムが適当であ
る。カチオン交換物質に結合したタンパク質を、例えば
ｐＨ４．７の１００ｍＭ酢酸ナトリウム中の１００〜５
００ｍＭＮａＣｌのような適当な塩勾配にかけ、得られ
る精製ＳＯＤあるいはアナログを含有するフラクション
を回収する。精製ＳＯＤを含有するフラクションは例え
ば限外濾過によって濃縮しかつ貯蔵のために凍結乾燥を
行なってもよい。本発明はまた、本発明の方法により生
産及び精製された精製酵素的活性真核細胞スーパーオキ
シドジスムターゼあるいはそのアナログにも係る。本発
明の好ましい具体例は、本発明の方法により調製及び精
製された精製酵素的活性ヒトスーパーオキシドジスムタ
ーゼに係る。
【実施例】以下の実施例は本発明の理解を助けるために
提示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図は
なく、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきもので
はない。実施例においては、ベクターの構築、該当ポリ
ペプチドをコードする遺伝子のベクター内挿入、得られ
たプラスミドの細菌宿主内導入等のために使用された従
来方法について詳細に説明していないが、これらの方法
は当業者に公知であり、以下の如き多数の刊行物に記載
されている。Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）、Ｅ．Ｆ．フリッチ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）及
びＪ．サンブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、モレキ
ュラークローニング；アラボラトリーマニュアル（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク（１９８
２）。メソッドインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５巻、“ニューク
レイックアシード（パート１）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ）”、ローレンスグロスマン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ
Ｇｒｏｓｓｍａｎ）及びキビーモルダブ（Ｋｉｖｉｅ
Ｍｏｌｄａｖｅ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８０）。
メソッドインエンザイモロジー、６８巻、“リコンビナ
ントＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）”、レ
イウー（Ｒａｙ Ｗｕ）編、アカデミックプレス、ニュ
ーヨーク（１９８１）。メソッドインエンザイモロジ
ー、１００巻、“リコンビナントＤＮＡ（パート
Ｂ）”、レイウー、ローレンスグロスマン及びキビーモ
ルダブ編、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９８
３）。メソッドインエンザイモロジー、１０１巻、“リ
コンビナントＤＮＡ（パートＣ）”、レイウー、ローレ
ンスグロスマン及びキビーモルダブ編、アカデミックプ
レス、ニューヨーク（１９８３）。プリンシプルズオブ
ジーンマニピュレーション、マンイントロダクションツ
ージェネティックエンジニアリング（Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、Ａ
ｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第２版、Ｒ．Ｗ．オール
ド（Ｒ．Ｗ．Ｏｌｄ）及びＳ．Ｂ．プリムローズ（Ｓ．
Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）編、ユニバーシティーオブカル
フォルニアプレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ）（１９８１）。Ｈ．
Ｖ．バーナード（Ｈ．Ｖ．Ｂｅｒｎａｒｄ）他、ジーン
（Ｇｅｎｅ）（１９７９）５，５９。Ａ．Ｂ．オッペン
ハイム（Ａ．Ｂ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）他、Ｊ．モル．
バイオル（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）（１９８２）１５
８，３２７。Ｅ．ルモー（Ｅ．Ｒｅｍａｕｔ）他、ジー
ン（１９８１）１５，８１。実施例１ 発現ベクター 本明細書中で使用される「発現ベクター」という用語
は、細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で所望の遺伝
子を発現させるのに有用な１群のプラスミドを意味す
る。所望遺伝子を発現ベクター内に挿入してもよく、又
は発現ベクターのプロモーターを切除して所望遺伝子の
手前に入れてもよい。ｐＪＨ２００ 第２図に示したｐＪＨ２００は、マルチコピー プラス
ミドｐＢＲ３２２に挿入されたＤＮＡから成る。λＤＮ
Ａの顕著な特徴は、λＤＮＡがλＰＬプロモーター，左
側のＮ利用部位（ｎｕｔＬ），ＥｃｏＲＩ制限部位，ｔ
ＲＩ終結部位，それに続くＣＩＩリボソーム結合部位お
よびＮｄｅ Ｉ制限部位の一部であるＡＴＧ開始コドン
を含むことである。第２図に示すように、Ｎｄｅ Ｉ制
限部位の下流の１１６塩基対は４個の単一（非反復、ｕ
ｎｉｑｕｅ）制限部位である。これらの制限部位により
所望遺伝子が容易に挿入されうる。ＣＩＩリボソーム結
合部位は天然のリボソーム結合部位とただ１個の点変異
で異なる。ｐＪＨ２００はｐＯＧ１１［エー．オッペン
ハイム（Ａ．ｏｐｐｅｎ ｈｅｉｍ）ら、ジェー．モ
ル．バイオル．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、（１９８
２）１５８；３２７］から構築され、ｐＯＧ１１中に認
められたＣＩＩリボソーム結合部位とλＰＬプロモータ
ーとを含む。しかしながら、λＰＬプロモーターとＣ
ＩＩリボソーム結合部位の間に位置するλＤＮＡの３４
６ｂｐは欠失しており、ＥｃｏＲＩ制限部位がこれら２
つの要素間の接合点に導入されている。また、マルチ制
限部位リンカーをリボソーム結合部位の“下流に（ｄｏ
ｗｎｓｔｒｅａｍ）”挿入した。ｐＪＨ２００はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９７８３で寄託されている。ｐＲＯ２１１ 第２図に示し、前記図面の説明中で詳細に記載したよう
にｐＲＯ２１１は、ｐＪＨ２００から２個のＮｄｅ Ｉ
制限部位の１個を脱離させて誘導された。ｐＪＨ２０
０，ｐＲＯ２１１および真核遺伝子を含有するそれらの
誘導体を適当な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中に維持さ
せてもよい。適当な宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーｃＩ８５７および抗転写終結Ｎ
タンパクを与えることである。［エム．イー．ゴッテス
マン（Ｍ．Ｅ．Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ）ら、ジェー．モ
ル．バイオロ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、（１９８
０）１４０；５７−７５］。ｐＲＯ２１１は従来の発現
ベクターに比して下記する多くの利点を有する。 １．発現レベルが極めて高いこと このベクターは、総細胞タンパクの３５％という高レベ
ルで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に外来タンパクを発現さ
せることができる。 ２．リボソーム結合部位を置換しうること ｐＲＯ２１１は、リボソーム結合部位の“上流に”位置
する非反復Ｅｃｏ ＲＩ部位とリボソーム結合部位の
“下流”に位置する１個のＮｄｅ Ｉ部位とを含む。従
って、リボソーム結合部位の境界は２個の非反復制限部
位である。こうして、プラスミドの他の特徴を変えるこ
となく、現在のリボソーム結合部位（λＣＩＩリボソー
ム結合部位）を簡単に切除して他の天然あるいは合成リ
ボソーム結合部位のほとんどいずれとも置換することが
できる。これは所望のポリペプチドの至適発現を大きく
助長する。 ３．発現を熱感応的に調節し得ること λＰＬプロモーターは、ＣＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち、このリプレッサーは３０℃ではプロ
モーターに結合するが、４２℃で失活する。従って、発
酵温度を４２℃に上げることにより宿主細菌で所望タン
パクの産生が誘発（誘導）される。そのような系は以下
の利点を有する。 （ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に
毒性の外来タンパクを発酵過程の遅くに産生させること
ができるので、早期の細胞死が避けられる。 （ｂ）タンパクの産生亢進（Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ）は、プロテインを安定にしかつタンパク分解を回
避しうる。［チエン，ワイ．イー（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．
Ｅ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８１）１４，１２
１］。従って、λＰＬの如き厳密に調節されたプロモー
ターを使用する“瞬間的”産生亢進は、連続的な低レベ
ル産生より好ましいであろう。 ４．単純化された誘発プロトコール 本願並びに係属中の米国特許出願第５１４，１８８号に
記載されているプラスミドによるタンパク産生は、熱感
受性ｃＩ８５７リプレッサーにより調節される。上記係
属中の出願に記載されているプラスミドで必要とされる
誘発プロトコールは、４２℃における誘発とそれに続く
３８℃における増殖を含んでいた。対照的に、ベクター
ｐＪＨ２００，ｐＲＯ２１１あるいはそれらのプラスミ
ド誘導体を使用するときには、タンパク合成の至適誘発
は４２℃における誘発と同温度（４２℃）における増殖
とを含んでいた。これにより、発酵器を冷却する必要が
なくなる。 ５．コピー数 ｐＪＨ２００およびｐＲＯ２１１中のλＰＬプロモータ
ーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に存在するλ形質導入
ファージベクターよりも高いコピー数をプラスミド上で
示した。これにより発現レベルが高くなる。 ６．リボソーム結合部位と開始コドン この発現ベクターは、強力な原核生物リボソーム結合部
位（ＲＢＳ）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）とを含む。従
って、いずれの真核遺伝子も開始コドンを付加せずにク
ローン化されうる。また、有効なＲＢＳは発現レベルを
増加させる。リボソーム結合部位はλＣＩＩリボソーム
結合部位である。リボソーム結合部位の配列は次の通り
である。
【化１２】 １個の塩基対が野生型λにみられるリボソーム結合部位
と異なる。 ７．適当な制限部位 発現ベクターは唯一のＮｄｅ Ｉ制限部位を有し、前記
部位内にＡＴＧ開始コドンを含む。これにより、所望の
遺伝子を適正に位置付けることができる。唯一のＮｄｅ
Ｉ部位がリボソーム結合部位の直後にみとめられる。 ８．遺伝子挿入のための適当な制限部位 Ｎｄｅ Ｉ制限部位の下流に配置された１１６塩基対
は、次の順番で４個の他の非反復制限部位である。Ｂｇ
ｌ ＩＩ，Ｓｍａ Ｉ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＣｌａ
Ｉ。非反復制限部位が複数個あるため、所望の遺伝子
が容易に挿入されうる。 ９．Ｎｕｔ部位 宿主から与えられるＮタンパクは発現ベクター上のＮｕ
ｔ部位に結合し、それによってｔＲＩ部位での転写終結
あるいはクローン化された遺伝子内での早期転写終結が
阻止される。菌株 所望のベクターおよびプラスミドに対する適切な宿主
は、形質転換に適した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株で
あり、前記菌株はＡ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６
３，Ａ１６４５（ｃ６００ｒ−ｍ＋ ｇａｌ＋ ｔｈｒ
− ｌｅｕ− ｌａｃ−ｂｌ（λｃＩ８５７ΔＨＩΔＢ
ａｍ ＨＩ Ｎ＋））およびＡ２０９７（Ａ１６４５
ｌａｃ Δｘ Ａ２１ ｐｒｏ Ｃ：：Ｔｎ １０）を
含む。実施例２ 動物成長ホルモン Ｉ ｐＲＯ １２ ｐＲＯ１２の構築は、第２図に示されかつ図面の説明に
記載されている。第１図に示した構築手順を有するｐＡ
Ｌ５００からのｂＧＨ ｃＤＮＡをｐＲＯ２１１に挿入
する前に処理して、適切な解読枠とＮｄｅ Ｉ制限部位
を作成した。ｐＲＯ １２を、当業者に公知の方法を用
いる形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）Ａ１６４５株に導入した。この菌株は増殖
および誘発されるとウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のアナ
ログを産生する。前記ｂＧＨアナログは、フェニルアラ
ニン型天然ｂＧＨのＮ−末端に付加されたアミノ酸配列
のｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎを有する。ｐＲＯ １２によ
り産生されるｂＧＨアナログの量は、クーマシーブルー
染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを走査して計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約３０〜３６％
であった（表Ｉ）。 ＩＩ ｐＳＡＬ５２００−６ ｐＳＡＬ５２００−６の構築は第３図に示されかつ図面
の説明に記載されている。ｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨをコ
ードするＤＮＡ配列を、ｐＲＯ １２をＰｖｕＩＩおよ
びＮｄｅ Ｉで制限し、１０塩基対が重複したセグメン
トを有する２個の一重鎖合成オリゴヌクレオチドから形
成された合成ＤＮＡフラグメント（断片）を挿入して得
た。ｐＳＡＬ５２００−６を、公知の方法を使用する形
質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）Ａ１６４５株に導入した。この菌株は、増殖およ
び誘発で、ｐｈｅ ｂＧＨのアミノ末端に付加されたメ
チオニンを有するｂＧＨアナログを産生する。ｐＳＡＬ
５２００−６により産生されるｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨ
アナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルを走査して計算すると、細菌により産生される
総タンパクの約１８−２０％であった。菌株を増殖さ
せ、産生されたｂＧＨを回収しそしてｂＧＨを精製する
ために使用した方法は、ｐＲＯ１２からのｂＧＨ産生の
ための実施例５に後記する方法と同じである。 ＩＩＩ ｐ３００８ ｐ３００８の構築は、第４図に示されかつ図面の説明に
記載されている。ｐ３００８は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０
４で寄託されている。ｍｅｔ−ｐｈｅ ｐＧＨ（豚成長
ホルモン）をコードするＤＮＡ配列を、ｐＧＨ ｃＤＮ
ＡをｐＲＯ２１１に挿入して得た。ｐ３００８を、当業
者に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５株に導入
した。この菌株は増殖および誘発により、ｐｈｅ ｐＧ
Ｈのアミノ末端に付加されたメチオニンを有するｐＧＨ
を産生する。ｐ３００８により産生されるｍｅｔ−ｐｈ
ｅ ｐＧＨアナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルを走査して計算すると、細菌により
産生される総タンパクの約１８−２０％であった。菌株
を増殖させ、産生されたｐＧＨを回収しかつｐＧＨを精
製するために使用した方法は、ｐＲＯ１２からのｂＧＨ
産生のための実施例５に後記する方法と同じであった。 ＩＶ ｐ５００２ ｐ５００２の構築は第５図に示されかつ図面の説明に記
載されている。ｍｅｔ−ｐｈｅ ｃＧＨ（ニワトリ成長
ホルモン）をコードするＤＮＡ配列を、ｃＧＨｃＤＮＡ
をｐＲＯ ２１１に挿入し、次いで遺伝子の５′末端を
合成オリゴヌクレオチドリンカーで完成させることによ
り得た。ｐ５００２を、公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ａ１
６４５株に挿入した。この菌株は増殖および誘発によ
り、ｐｈｅ ｃＧＨのアミノ末端に付加されたメチオニ
ンを有するｃＧＨを産生する。ｐ５００２により産生さ
れたｍｅｔ−ｐｈｅ ｃＧＨの量は、クーマシー染色Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲルを走査して計算すると、細
菌により産生された総タンパクの約１８−２０％であっ
た。菌株を増殖させ、産生されたｃＧＨを回収し、ｃＧ
Ｈを精製するために使用された方法は、ｐＲＯ １２か
らのｂＧＨ産生のための実施例５に後記する方法と同じ
である。
【表１】 １．表は、ｐＲＯ ２１１由来の各種プラスミドのｂＧ
Ｈ発現レベルを示す。プラスミドｐＲｅｃ２／３および
ｐＲＯ １１は、１９８３年７月１５日出願の係属中の
米国特許出願第５１４，１８８号に記載されている。 ２．産生されたｂＧＨの量は総バクテリアプロテインに
対するパーセンテージで表示した。略 号 ＣＨＣＮ＝構成高コピー数（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ
ｈｉｇｈ ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒ） ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ＴｅｔＲ＝テトラサイクリン耐性 Ｔ１Ｔ２＝転写終結配列 ｃＩ４３４＝プラスミド安定化ｃＩ４３４系。実施例３ ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ） Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ ｃＤＮＡ修飾の出発点は、リーマ
ン−ハービッツ，ジェー．（Ｌｉｅｍａｎ−Ｈｕｒｗｉ
ｔｚ，Ｊ．）ら、ＰＮＡＳ（１９８２），７９：２８０
８に記載されているプラスミドｐＳ６１−１０である。
ＳＯＤ ｃＤＮＡは、１９８３年４月２９日に出願され
た係属中の米国特許出願第４８９，７８６号明細書にも
記載されている。ＳＯＤ ｃＤＮＡを修飾すると、遺伝
子の５′末端にＮｄｅ Ｉ制限部位が、遺伝子の３′末
端にＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位が導入された。得られた
プラスミドｐＳＯＤ ＮＨ−１０は両端が非反復制限部
位になっているＳＯＤ ｃＤＮＡを含んでいる。 Ｉ．ｐＳＯＤα２ ｐＳＯＤα２の構築は第１３図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている。ｐＳＯＤα２はアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ．３
９７８６で寄託されている。ｐＳＯＤα２を構築するた
めに、λＰＬプロモーターとＮｕｔＬとＣＩＩリボソー
ム結合部位とを発現ベクターｐＪＨ２００から切り取
り、プラスミドｐＳＯＤ ＮＨ−１０のＳＯＤ遺伝子の
手前に配置した。次いでプロモーターとＲＢＳとＳＯＤ
遺伝子とを含有するフラグメントをベクターｐＢＲＭに
挿入した［ハートマン，ジェー・アール．（Ｈａｒｔｍ
ａｎ，Ｊ．Ｒ．）ら，ＰＮ ＡＳ７９：２３３−２３７
（１９８２）］。ｐＢＲＭはアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ．３７２８３で寄
託されている。ｐＳＯＤα２を、公知の方法を用いる形
質転換で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
Ａ２０９７株に導入した。得られたクローンを増殖およ
び誘発させるとＳＯＤアナログタンパクが産生した。ｐ
ＳＯＤα２により産生されたＳＯＤアナログの量は、ク
ーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査によ
って計算すると、細菌により産生された総タンパクの約
０．１−０．３％であった（表２）。産生されたＳＯＤ
アナログは、下記のｐＳＯＤβ１により産生されたアナ
ログと多分同一であろう。 ＩＩ．ｐＳＯＤβ１ ｐＳＯＤβ１の構築は、第１４図に示しかつ前記図面の
説明中に記載されている。ｐＳＯＤβ１を構築するため
に、ｐＳＯＤα２のＣＩＩＲＢＳを、ｐＢＬＡ１１由来
のＲＢＳおよびβ−ラクタマーゼプロモーター（β−ｌ
ａｃ−ｐｒｏｍ）で置換した。ｐＢＬＡ１１はアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮ
ｏ．３９７８８で寄託されている。ｐＢＬＡ１１はｐＢ
Ｒ３２２中の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）４１５７
と４３５３との間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロ
モーターと、リボソーム結合部位とを含む。ＥｃｏＲＩ
リンカーをプロモーターの上流に付加し、マルチ制限部
位リンカーを開始コドンＡＴＧの直後に付加した。従っ
て、開始コドンで始まるコード鎖の配列はＡＴＧＡＧＣ
ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣである。ｐＳＯＤβ１を、公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させるとＳＯＤアナログ
を産生する。産生されるヒトＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤアナロ
グは、天然ヒトＳＯＤがアミノ末端アラニンでアセチル
化されているのに対して［ハーツ，ジェー．ダブリュ
ー．（Ｈａｒｔｚ，Ｊ．Ｗ．）及びドイッチン，エッ
チ．エフ．（Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｈ．Ｆ．）、ジェー．バ
イオロ．ケム．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）（１９７
２）２３４：７０４３−７０５０；ヤーブッシュ，ジェ
ー．アール．（Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．）らバイロケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８０）
１９：２３１０−２３１６；バラ（Ｂａｒｒａ）ら、Ｆ
ＥＢＳ］レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）（１９８０）１２
０：５３及びオバーレイ，エル．ダブリュ．（Ｏｂｅｒ
ｌｅｙ，Ｌ．Ｗ．）スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ
ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ），ｖｏｌ．
Ｉ，（１９８２），ＣＲＣプレス，フロリダ，ｐｐ．３
２−３３］、アミノ酸配列解析化学量論で示されるよう
にアミノ末端アラニンがアセチル化されていない点で天
然ヒトＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤと異なる。更に、天然ヒトＳ
ＯＤはグリコシル化されている［ヒューバー，ダブリュ
ー．（Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．）、１９７１年５月１８日付発
行ＵＳＰ Ｎｏ．３，５７９，４９５〕のに対して、細
菌産生ヒトＳＯＤはほとんど全くグリコシル化されてい
ない。なぜなら、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）は自身が産生するタンパクをグリコシル化しな
いからである。細菌産生ＳＯＤアナログのアミノ酸配列
は成熟ヒトＳＯＤの配列と同一であり、そのＮ−末端に
メチオニン残基を含まない。ｐＳＯＤβ１により産生さ
れるＳＯＤの量は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れた総タンパクの約３−８％であった（表ＩＩ）。菌株
の増殖、産生されたＳＯＤの回収およびＳＯＤの精製の
ために用いた方法は、ｐＳＯＤβ１Ｔ１１のための後記
実施例７の方法と同じである。 ＩＩＩ．ｐＳＯＤβ１Ｔ１１ ｐＳＯＤβ１Ｔ１１構築は第１５図に示されかつ前記図
面の説明中に記載されている。ｐＳＯＤβ１のβ−ラク
タマーゼ遺伝子を、ｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリ
ン耐性をコードする遺伝子で置換した。ｐＳＯＤβ１Ｔ
１１より産生されるＳＯＤアナログの量は、クーマシー
染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査により計算す
ると、細菌により産生された総タンパクの約８−１３％
であった（表ＩＩ）。産生されたＳＯＤアナログは、ｐ
ＳＯＤβ１により産生されるアナログと同一である。 ＩＶ．ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２ ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２の構築は第１７図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。ｐＳＯＤα１３のＣ
ＩＩリボソーム結合部位を、配列
【化１３】 を有する合成ＤＮＡフラグメントで置換した。前記配列
は天然β−ラクタマーゼＲＢＳの配列と類似している。
ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２を当業者に公知の方法を用いる形
質転換によって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。得られたクローン
を増殖および誘発させると、ヒトＳＯＤアナログを産生
する。ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２により産生されるＳＯＤの
量は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの
走査により計算すると、細菌により産生された総タンパ
クの約２−４％であった（表ＩＩ）。産生されたＳＯＤ
アナログは、ｐＳＯＤβ１により産生されたアナログと
同一である。
【表２】 １．β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター及びリボソ
ーム結合部位 ２．β−ラクタマーゼ遺伝子のリボソーム結合部位に相
当する合成リボソーム結合部位 ３．総細菌性タンパクのパーセンテージとして表示した
産生ＳＯＤアナログの量略 号 ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性 ＴｅｔＲ＝テトラサイクリン耐性 Ｔ１Ｔ２＝転写終結配列。実施例４ ヒトアポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ３） Ａｐｏ Ｅ３ ｃＤＮＡ修飾の出発点は、カリホルニ
ア，サンフランシスコのグラッドストン財団（Ｇｌａｄ
ｓｔｏｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のジョーンテイラ
ー（Ｊｏｈｎ Ｔａｙｌｏｒ）博士により提供されたプ
ラスミドｐＮＢ１７８であった。このプラスミドは、ヒ
トＡｐｏ Ｅ３遺伝子の完全長ｃＤＮＡコピーを含む。
ｐＮＢ１７８中のｃＤＮＡを修飾して、遺伝子の５′末
端の非コード化ＤＮＡを除去しかつ遺伝子の両末端にＮ
ｄｅ Ｉ制限部位を付加した。このＡｐｏ Ｅ３ ｃＤ
ＮＡフラグメントを（１９８３年７月１５日に出願され
た係属中の米国特許出願第５１４，１８８号に記載され
ている）ベクターｐＮＤ５中に挿入した。得られたプラ
スミドｐＡｐｏＥ−Ｅｘ２を第１８図に示す。これはア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３９７８７で寄託されている。 Ｉ．ｐＴＶ−１８８ ｐＴＶ−１８８の構築は第１８図に示されかつ前記図面
の説明に記載されている。プラスミドｐＴＶ−１８８
は、ｐＡｐｏＥ−Ｅｘ２のＮｄｅ Ｉ−ＮｄｅＩフラグ
メントを充填（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）して得たＡｐｏ
Ｅ３フラグメントを（第１４図に示しかつ図面の説明中
に記載されている）ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の唯一のブラン
ト末端Ｓｔｕ Ｉ部位に挿入して得た。ｐＴＶ−１８８
を当業者に公知の方法を用いる形質転換により、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５
に導入した。得られたクローンを増殖及び誘発させる
と、ヒトＡｐｏ Ｅ３のアナログを産生する。前記アナ
ログは、真正ヒトＡｐｏ Ｅ３のＮ−末端に結合したヒ
トスーパーオキシドジスムターゼのＮ−末端配列の４２
個のアミノ酸を有し、かつそのＮ−末端にはメチオニン
を有する。産生されたＡｐｏ Ｅ３アナログは、クーマ
シー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査によって
計算すると、細菌により産生される総タンパクの約１０
％であった。菌株の増殖のために使用した方法は、１
２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンをアンピシリンの代
わりに使用する以外はｐＲＯ １２からのｂＧＨ産生の
ための実施例５に記載の方法と同じである。 ＩＩ．ｐＳＡＬ１６０−５ ｐＳＡＬ１６０−５の構築は第２３図に示されかつ前記
図面の説明中に記載されている。プラスミドｐＳＡＬ１
６０−５を、ｐＴＶ−１７０（第２０図参照）のＡｖａ
Ｉ−Ａｖａ Ｉ Ａｐｏ Ｅ３遺伝子フラグメントに
挿入して得た。ｐＳＡＬ１６０−５を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。得ら
れたクローンを増殖および誘発させると、アミノ末端に
メチオニンと１１個のＮ−末端アミノ酸が欠失している
Ａｐｏ Ｅ３に融合したヒト成長ホルモンのＮ−末端由
来の４５個のアミノ酸とを含むＡｐｏ Ｅ３のアナログ
が産生される。ｐＳＡＬ１６０−５により産生されるＡ
ｐｏ Ｅ３アナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルの走査により計算すると、細菌によ
り産生される総タンパクの約５％であった。菌株の増殖
するために使用した方法は、ｐＲＯ １２からのｂＧＨ
産生のための実施例５に記載されている方法と同じであ
る。実施例５ ｐＲＯ １２の増殖 Ｉ．保存培養物 ｐＲＯ １２の保存培養物（ｓｔｏｃｋ ｃｕｌｔｕｒ
ｅ）をカゼイン培地で増殖し（接種物参照）、次に凍結
培地で２倍に希釈し、−８０℃で保存する。凍結培地は
５００ｍｌあたり以下の物質を含む。 ＩＩ．接種物 接種物を２０ｇ／ｌカゼイン水解物，１０ｇ／ｌ酵母抽
出物および２ｇ／ｌＮａＣｌ中で増殖させた。振盪フラ
スコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、３０℃，約２
００ｒ．ｐ．ｍのシェーカー上で１５時間インキュベー
トした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌通気
した発酵槽で行なった。無菌培地に２−１０％接種物を
接種し、３０℃，ｐＨ７±０．５で撹拌通気して溶存酸
素レベルを空気飽和の２０％より高く維持しながら１５
時間インキュベートした。 ＩＩＩ．産生 産生培地は以下の物質を含む。 培地は１００ｍｇ／ｌのアンピシリンも含む。アンピシ
リンは産生のためには任意成分であるが、通常接種物の
増殖用培地には添加されている。濃縮溶液中のビオチ
ン，チアミン及びアンピシリンを別々にフィルター滅菌
し、接種以前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶
液を最初に１０ｇ／ｌになるように添加した。誘発の過
程ではブドウ糖を更に１０ｇ／ｌ添加した。微量元素溶
液は以下の物質を含む。 培地に０．５−１０％の接種培養物を接種し、３０℃で
インキュベートする。撹拌−通気速度は、空気飽和の２
０％より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。ＮＨ３でｐＨを７±０．２に維持する。細胞濃度
が約３．５ｇ／ｌ（ＯＤ６６０＝１０）に到達したら誘
発を始める。温度を４２℃に上げ、４２℃で１−５時間
維持する。次いで培養物を急冷し、ホルモン精製のため
に遠心分離によって細胞を回収する。ｂＧＨの回収 ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）配合装置を用い、
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）と５０
ｍＭ ＥＤＴＡ と１００ｍＭ ＮａＣｌとを含む５倍
容の溶液に１３ｋｇの細菌細胞（湿潤ケーキ）を再懸濁
させる。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように
調整する。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕装置ＫＤ５
（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，バーゼル）に８
０ｌ／時の速度で連続的に通し、破砕細胞の均質懸濁液
をＣＥＰＡ１０１遠心機で４５ｌ／時の流速で遠心して
清澄化する。遠心ステップで得られた沈殿物を回収し、
５０ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．４）１５．５ｌに再懸濁させる。終濃度
０．０５ｍｇ／ｍｌまでリゾチームを加え、懸濁液を３
７℃で１６時間インキュベートした。トリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）Ｘ−１００を終濃度１％まで加える。次に、懸
濁液を室温で３０分間インキュベートし、連続流式細胞
超音波処理装置（加熱システム）内で１８ｌ／時の速度
で超音波処理し、ＣＥＰＡ１０１遠心機で遠心する。沈
殿物を収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）に再懸濁し、前記同様に超音波処理し、ＣＥＰ
Ａ１０１遠心機で遠心した。細胞を５０ｍＭ ＢＤＴＡ
および１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４）１５．５ｌに再懸濁し、２
回沈殿させ、蒸留水１５．５ｌに再懸濁させる。沈殿物
を遠心によって収集し、−２０℃で保存する。ｂＧＨの精製 沈殿物を３０−４０ｌの蒸留水に再懸濁させ、０．５
ＮのＮａＯＨでｐＨ１１．８に滴定して可溶化する。次
に溶液を連続的に超音波処理し、所要によりＣＥＰＡ１
０１遠心機で遠心して清澄化するか、またはワットマン
Ｎｏ．１濾紙を通して濾過する。清澄化プロテイン溶液
（３２．６１、２９７，０００のＯＤ２８０ｎｍを含
む）を各部分が５０，０００−６０，０００ＯＤを含む
ように分ける（６×５．４ｌ）。各部分を夫々、５ｆｔ
２面積の１００，０００分子量カットオフカセット（タ
イプＰＴＨＫ）を３個備えたミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置を通
して限外濾過する。５．４ ｌ部分を１ｌ保留分（ｒｅ
ｔｅｎｔａｔｅ）容量に濃縮する。限外濾液を収集し保
存する。保留分を再び新鮮な１０ｍＭホウ酸塩緩衝液，
ｐＨ１１．８でもとの容量にまで希釈し、十分に混合す
る。バッチを再び１ｌ保留分容量に濃縮する。限外濾液
を集め、はじめの限外濾液と合わせる。限外濾液中のＯ
Ｄ分の流出総量が限外濾過装置に最初に充填されたＯＤ
分の２０％に等しくなるとき、次の濃縮ステップでの保
留分を１ｌではなく０．５ｌにする。濃縮および１０ｍ
Ｍホウ酸塩緩衝液による希釈のサイクルを、０．５ｌの
保留分からの限外濾液の２８０ｎｍ（１ｃｍセル）での
吸光度が０．１未満になるまで継続する。これは通常９
−１２回の濃縮・希釈サイクルを要する。最終保留分は
捨てる。全ての限外濾液を合せ、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ
９．０に調節した。他の５．４ｌ部分を同様に限外濾過
し、ｐＨ調節した限外濾液を全て一緒にする。典型的な
流出物は０．２６の吸光度を有する限外濾液を総量３８
０ｌ（１００，０００ＯＤに等しい）生じ、完結するに
は２４−４０時間を要する。１００Ｋ限外濾過工程から
の合した限外濾液（２８０ｎｍで１００，０００ＯＤを
含む３８０ｌ）を、２３ｃｍ／時（２５ｌ／時）の線流
速でセファロースＣＬ−６ＢＤＥＡＥイオン交換カラム
に充填する。直径３７ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムをｐ
Ｈ９．０で１０ｍＭホウ酸塩緩衝液の２ベット容量（３
２Ｌ）で洗浄する。充填および洗浄ステップからの溶出
物は捨てる。１０ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリ
ウム，ｐＨ９に溶離液を変えると、カラムからｂＧＨが
排出される。溶離流速は２３ｃｍ／時である。流出の進
行を２８０ｎｍでの溶出物の吸光度を追跡してモニター
する。ｂＧＨピークを４乃至５ベット容量（２８０ｎｍ
で４３，０００ＯＤを含む８４ｌ）で収集し、１０，０
００分子量カットオフカセットを備えたミリポアペリコ
ン限外濾過装置を用いて約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。
次いで、溶液を凍結乾燥する。収量は純ｂＧＨ約７０ｇ
である。実施例６ ｐＲＯ１２により産生されるｂＧＨアナログの活性 １．ｂＧＨアナログと天然ｂＧＨとのラジオイムノアツ
セイ比較 リン酸塩緩衝生理食塩水（１％ＢＳＡ）中に１００ｎｇ
／ｍｌのｂＧＨアナログを含む溶液を調製した。この溶
液を濃度５０，２５，１２．５，６．２５，３．１２，
１．５６及び０．７８ｎｇ／ｌまで順序希釈した。これ
らの溶液について各０．１ｍｌのサンプル群２組を、二
抗体法を用いるＲＩＡにかけた。希釈曲線は天然ｂＧＨ
で得られる曲線と同等であった。 ２．ラジオレセプター結合アッセイ ウサギ肝膜に対するラジオレセプター結合アッセイを、
ツシマティー（ＴｕｓｈｉｍａＴ．）及びフライセンエ
ッチ．ジー．（Ｆｒｅｉｓｅｎ Ｈ．Ｇ．）［ワイ．チ
ン（Ｙ．Ｃｈｉｎ．），エンドクル．メタボ．（Ｅｎｄ
ｏｃｒ，Ｍｅｔａｂ９）（１９７３），３７，３］に記
載の方法で、１２５Ｉ−ｂＧＨをトレーサーとし、真正
ｂＧＨ溶液を校正曲線用に用いて実施した。３組のサン
プルを０．３ｍｌのアッセイバッファ（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，１５ｍＭ ＣａＣｌ２及び５ｍｇ／ｍｌウシ血清
アルブミン，ｐＨ７．６）中、室温で２時間インキュベ
ートした。試験管は、１２５Ｉ−ｂＧＨ（３０−６０μ
Ｃｉ／μｇの調製物２０，０００ｃｐｍと、１５０−２
５０μｇの肝膜タンパクと、天然ｂＧＨ（１−１００ｎ
ｇ）又は細菌ｂＧＨの抽出物のいずれかとを収容してい
た。結果は、ｂＧＨアナログのｂＧＨ活性が天然ｂＧＨ
の同じ活性に匹敵することを示した。 ３．脛骨テスト 実施例５の細菌細胞から回収されたｐＲＯ １２産生ｂ
ＧＨアナログの生物活性を脛骨テストで測定した。［パ
ルロー，エー．エフ．（Ｐａｒｌｏｗ Ａ．Ｆ．）ら、
エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）
（１９６５）７７，１１２６］。生後２８〜３０日のラ
ットを下垂体切除し、次に処理しないで１０−１４日間
維持した。ウシ下垂体又は組換体大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から誘導したウシ成長ホルモンを
０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１Ｍホウ酸塩，ｐＨ１
０．０に溶解した。ラット（１群４−７匹ずつ）を正常
食［プリナラット餌（Ｐｕｒｉｎａ Ｒａｔ−Ｃｈｏ
ｗ）及び任意量の水］で維持し、ｂＧＨ溶液の皮下注射
（０．２ｃｃ中、５−１２５μｇ／日）を５日間毎日続
けた。６日目に動物を殺し、前肢膝骨を取り出して長手
方向に切開し、アセトンで固定して２％ＡｇＮＯ３で染
色した。解剖双眼顕微鏡（ニコン）で観察して骨端プレ
ートの幅を測定した。（ラットあたり４０回の読み取り
を行なった）平均値を用いて長期投与−応答曲線を抽い
た。結果は、ｐＲＯ １２産生ｂＧＨアナログのｂＧＨ
活性が天然ｂＧＨの同じ活性に匹敵することを示した。 実施例７ＳＯＤβ１Ｔ１１の増殖 Ｉ．保存培養物 ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の保存培養物をカゼイン培地で増殖
し（接種物参照）、凍結培地で２倍に希釈し、−８０℃
で保存した。凍結培地は５００ｍｌあたり次の物質を含
む。 ＩＩ．接種物 接種物を２０ｇ／ｌカゼイン水解物，１０ｇ／ｌ酵母抽
出物及び２ｇ／ｌ ＮａＣｌの中で増殖させた。振盪フ
ラスコ中の無菌培地に保存培養物を接種し、３０℃、約
２００ｒ．ｐ．ｍ．のシェーカー上で１５時間インキュ
ベートした。必要に応じ、以後の接種物増殖段階は撹拌
通気した発酵槽で行なった。無菌培地に２〜１０％接種
物を接種し、３０℃，ｐＨ７±０．５で撹拌通気して溶
存酸素レベルを空気飽和の２０％より高く維持しながら
１５時間インキュベートした。 ＩＩＩ．産生 産生培地は次の物質を含む。 培地には、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンも含ま
れる。テトラサイクリンは産生のためには任意成分であ
るが、通常接種物を増殖させるために使用される培地に
は添加されている。濃縮溶液中のビオチン，チアミン及
びテトラサイクリンを別々にフイルター滅菌し、接種以
前に無菌産生培地に加えた。無菌ブドウ糖溶液を最初に
１０ｇ／ｌになるように添加した。誘発の段階で更に１
０ｇ／ｌのブドウ糖を添加した。微量元素溶液は次の物
質を含む。 培地に０．５〜１０％の接種培養物を接種し、３０℃で
インキュベートした。撹拌−通気速度は、空気飽和の２
０％より高い溶存酸素レベルが維持されるように設定さ
れる。ＮＨ３でｐＨを７±０．２に維持する。細胞濃度
が約３．５ｇ／ｌ（ＯＤ６６０＝１０）に達すると誘発
が始まる。温度を４２℃に上げ、４２℃で１〜５時間維
持する。次いで培養物を急冷し、酵素精製のために遠心
分離によって細胞を回収する。ＳＯＤの回収 ポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ）配合装置を用い、
５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）１２ｌ中に
１．５ｋｇの細菌細胞（ウェットケーキ）を懸濁させ
る。配合装置の速度は泡立ちを最小に抑えるように調整
した。均質懸濁液をダイノミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ）細
胞破砕装置ＫＤ５（Ｗｉｌｌｙ，Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅ
ｎ，バーゼル）に連続的に通す。破砕細胞の均質懸濁液
を連続流細胞を用いて超音波処理し、ＣＥＰＡ１０１遠
心機で遠心した。上清を６５℃で２時間加熱し、冷却
し、前記処理と同様にして遠心した、清澄な上清を１
０，０００分子量カットオフカセット（ＰＴＧＣ型）を
備えたミリポアペリコン限外濾過装置で１ｌに濃縮す
る。濃縮されたタンパク溶液を、１５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡したＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラム（２ｋｇＤＥＡＥセファロース）に流
す。流出液を収集し、濃縮し、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．８に対してペリコン限外濾過装置で透析
し、次いで２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡したＱ
ＡＥ−セファロースカラムに通す。２０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液，ｐＨ７．８と塩勾配（０〜２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）でカラムを展開する。ＳＯＤ含有画分を収集
し、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対
して透析し、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４．８を
添加して１００ｍＭ酢酸ナトリウムとする。タンパク溶
液を更に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．７
で平衡したＣＭ−セファロースカラムで分離する。カラ
ムを同じ緩衝液および塩勾配（１００〜５００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ）で展開する。ＳＯＤ含有画分を収集し、ペリコ
ン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾燥する。実施例８ ｐＳＯＤβ１Ｔ１１により産生されるＳＯＤの活性 実施例７で調製したｐＳＯＤβ１Ｔ１１より産生される
ＳＯＤアナログの酵素活性を、マックコード（ＭｃＣｏ
ｒｄ）及びフライドビッチ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ），ジ
ェー・バイオロ・ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）
（１９６９），２４４：６０４９−６０５５に記載され
た如く、フエリシトクロム−ｃの還元抑制をモニターし
てアッセイした。得られた結果は、ｐＳＯＤβ１Ｔ１１
生ＳＯＤアナログの活性は天然ヒトＳＯＤ［シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）］の活性に匹敵し、ウシＳＯＤ［オルゴテイ
ン（Ｏｒｇｏｔｅｉｎ）：グリューネンタールＧＭＢ
Ｈ］の活性にも匹敵していることを示した。実施例９ 発現ベクター Ｉ．ｐ５７９ 第１９図に示し前記図面の説明中で詳細に説明したベク
ターｐ５７９は、ＰＬプロモーターとＮ利用部位（Ｎｕ
ｔＬ）及び非反復ＥＣｏ ＲＩおよびＮｄｅＩ制限部位
で境界付けられるＣＩＩリボソーム結合部位とＡＴＧ開
始コドンと大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）のｒｒｎ ＢリボソームＲＮＡ遺伝子オペロンの末
端に由来するＴ１Ｔ２転写終結シグナルとから成る。こ
れらの要素は、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＢＲ
３２２上でクローンされる。他の特徴は第１９図に示さ
れている。ｐ５７９は、プラスミドｐＰＳ １上に含ま
れるＴ１Ｔ２転写終結シグナルをベクターｐＲＯ ２１
１のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入して調製される。ｐＲ
Ｏ２１１は第２図に示されている。ｐＰＳ １はサルミ
エントス（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ）ら、セル（Ｃｅｌ
ｌ）（１９８３）３２，１３３７−１３４６に記載さ
れ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０７で寄託されている。ｐ５７
９および真核生物遺伝子を含むその誘導体を適当な大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主中に維持
することもできる。宿主の最も重要な特徴は、この宿主
が熱感受性リプレッサーｃＩ８５７と抗転写終結Ｎタン
パクを与えることである。［ゴーテスマン，エム．（Ｇ
ｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．）ら、ジェー．モル．バイオ
ロ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（１９８０）１４０，
５７−７５］。ｐ５７９は、従来の発現ベクターに比較
して以下の如き多くの利点を有する。 １．発現レベルが極めて高いこと このベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の外来タン
パクの発現を総細胞タンパクの４２％という高レベルで
誘発しうる。この発現レベルは、Ｔ１Ｔ２転写終結配列
を欠く他の類似のλＰＬプラスミドの発現レベルよりも
高い。 ２．転写終結シグナル ベクターＰ５７９はλＰＬプロモータとＣＩＩリボソー
ム結合部位の下流に位置するＴ１Ｔ２転写終結シグナル
を含む。このベクターを用いて得られる高発現レベルは
挿入された遺伝子の末端にＴ１Ｔ２転写終結因子が存在
していることに部分的に起因している。すなわち、この
Ｔ１Ｔ２転写終結因子はＮ修飾ＲＮＡポリメラーゼの転
写を集結しうるからである。このように、転写終結因子
はプラスミドの非所望タンパクのλＰＬ制御転写を阻止
し、これにより所望のタンパクの相対収量を高める。 ３．リボソーム結合部位が交換しうること ｐ５７９は、リボソーム結合部位の上流に位置する唯一
のＥｃｏ ＲＩ部位とＡＴＧ開始コドンの所に位置する
唯一のＮｄｅ Ｉ部位とを含む。従って、リボソーム結
合部位の両境界は２個の非反復制限部位である。これに
より、現在のリボソーム結合部位（λＣＩＩリボソーム
結合部位）の切除とプラスミドの他の特徴を変えること
なく他の天然または合成リボソーム結合部位の実質的な
置換を容易に行ない得る。こうして所望ポリペプチドの
至適発現が大いに促進される。 ４．発現を熱誘導的に調節し得ること λＰＬプロモーターは、ＣＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃ１８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち、３０℃ではプロモーターに結合する
が、４２℃で失活する。従って、発酵温度を４２℃に上
げることにより宿主細菌で所望タンパクの産生が誘発さ
れる。そのような系は以下の利点を含む。 （ａ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に
毒性の外来タンパクを発酵プロセスの後期に産生するこ
とができ、これにより早期の細胞死を回避しうる。 （ｂ）タンパクの産生先進がこのタンパクを安定させ、
タンパク分解を阻止する［チエン，ワイ．イー（Ｃｈｅ
ｎｇ，Ｙ．Ｅ．）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８１）
１４，１２１］。従って厳密に調節されたプロモーター
例えばλＰＬを使用する“瞬間的”産生冗進は連続的な
低レベル産生よりも好ましいであろう。 ５．誘発プロトコールを簡略化しうること ｐ５７９由来のプラスミドを約４２℃で誘発し、タンパ
ク合成中４２℃に保持する。係属中の米国特許出願第５
１４，１８８号に記載のｐＭＧ １００およびｐＮＤ５
から誘導したプラスミドの誘発プロトコールでは、４２
℃への温度変化が必要であり、その後の増殖は３８℃で
長時間要する。ｐ５７９の至適誘発プロトコールは３８
℃への冷却ステップが不要であり、簡略化される。 ６．コピー数が多いこと ｐ５７９のλＰＬプロモーターは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中に使用されるλ導入ファー
ジベクターに比較してプラスミド上に多いコピー数を示
す。これにより発現レベルが増加する。 ７．リボソーム結合部位及び開始コドンを有すること この発現ベクターは強力な原核生物リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）とを含む。従っ
て、開始コドンの付加を要せずにいかなる真核生物遺伝
子のクローニングも可能である。さらに効率の良いＲＢ
Ｓによって発現レベルが増大する。リボソーム結合部位
は我々がすでにベクターｐＮＤ５にクローン化したλＣ
ＩＩリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列は次の通りである。
【化１４】 １塩基対が野生型λで認められるリボソーム結合部位と
異なる。 ８．適当な制限部位が存在すること 発現ベクターは、ＡＴＧ開始コドンを含む唯一のＮｄｅ
Ｉ制限部位を有する。これにより、所望の遺伝子を適
正に配置し得る。この唯一のＮｄｅ Ｉ部位がリボソー
ム結合部位の直後にある。 ９．遺伝子挿入のための適当な制限部位が存在すること Ｎｄｅ Ｉ制限部位の下流に位置する１１６塩基対に
は、順次Ｂｇｌ ＩＩ、Ｓｍａ Ｉという非反復制限部
位がある。これら非反復制限部位により、所望遺伝子の
挿入が容易に行ない得る。 １０．Ｎｕｔ 部位を有すること 宿主によって与えられるＮタンパクは発現ベクター上の
Ｎｕｔ部位に結合し、これによりｔＲＩ部位での転写終
結またはクローン化された遺伝子内の早期転写終結が阻
止する。菌株 記載されたベクター及びプラスミドに対する適当な宿主
は、Ａ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５
（ｃ６００ｒ−ｍ＋ｇａｌ＋ｔｈｒ−ｌｅｕ−ｌａｃ−
ｂｌ（λｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａｍＨＩ Ｎ＋））及び
Ａ２０９７（Ａ１６４５ ｌａｃ Δｘ Ａ２１ ｐｒ
ｏＣ：：Ｔｎ１０）を含む形質転換用に適当な大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の菌株である。実施例１０ 動物成長ホルモン Ｉ ｐＨＧ４４ ｐＨＧ４４の構築は、第６図に示されかつ前記図面の説
明中に記載され、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０６で寄託さ
れている。このプラスミドは第２図に示すｐＲＯ １２
プラスミドに、第６図に示されサーミエントス（ｓａｒ
ｍｉｅｎｔｏｓ）ら、セル（ｃｅｌｌ）（１９８３）３
２，３３７−１３４６に記載され、ＡＴＣＣ Ｎｏ．３
９８０７で寄託されているプラスミドｐＰＳ １のＴ１
Ｔ２転写終結配列を挿入して得られた。Ｔ１Ｔ２転写終
結配列の存在により、ｍＲＮＡ転写の長期間継続（ｌｏ
ｎｇ ｒｕｎ−ｏｎ）が阻止され、よってλＰＬプロモ
ーターのコントロール下でのβ−ラクタマーゼ遺伝子と
多分他の非所望タンパクの高レベル発現が阻止される。
プラスミドｐＨＧ ４４を、当業者に公知の方法を用い
る形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）Ａ２０９７株中に導入した。この菌株を増殖
及び誘発すると、フェニルアラニン形真正ウシ成長ホル
モン（ｂＧＨ）のアミノ末端に付加されたアミノ酸配列
ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎを有するｂＧＨのアナログが産
生する。ｐＨＧ ４４により産生されるｂＧＨアナログ
の量は、クーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生される総タ
ンパクの約３７−４２％であった。菌株の増殖、産生さ
れたｂＧＨ アナログの回収及びｂＧＨ アナログの精
製に使用した方法は実施例１３に記載されている。ｂＧ
Ｈ 遺伝子の３′末端にＴ１Ｔ２転写終結配列を導入す
ることによりβ−ラクタマーゼ発現が顕著に抑えられて
いるため、発現レベルはｐＲＯ １２から得られる発現
レベル（表Ｉ）より高い。 ＩＩ ｐＳＡＬ５６００−１ ｐＳＡＬ５６００−１の構築は第１０図に示されかつ前
記図面の説明中に記載されている。プラスミドｐＳＡＬ
５６００−１は（第３図に示されている）ｐＳＡＬ５２
００−６からプラスミドｐＰＳ １（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
３９８０７）のＴ１Ｔ２転写終結配列を挿入して得られ
た。プラスミドｐＳＡＬ５６００−１を、当業者に公知
の方法を用いる形質転換により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。この
菌株を増殖及び誘発すると、フェニルアラニン型天然ｂ
ＧＨのアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有
するｂＧＨのアナログが産生された。ｐＳＡＬ５６００
−１菌株により産生されたｂＧＨ アナログの量は、ク
ーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
２２−２８％であった。菌株の増殖、産生されたｂＧＨ
アナログの回収及びｂＧＨ アナログの精製に使用し
た方法は、実施例１３に記載のｐＨＧ ４４に対する方
法と同じである。ｂＧＨ 遺伝子の３′末端にＴ１Ｔ２
転写終結配列を導入することによりβ−ラクタマーゼ発
現が大きく抑えられているため、発現レベルはｐＳＡＬ
５２００−６菌株から得られるレベルよりも高かった。 ＩＩＩ ｐ３００９ ｐ３００９の構築は、第１１図に示されかつ前記図面の
説明に記載されている。Ｐ５７９発現ベクター（第１９
図）の唯一のＮｄｅ Ｉ部位にＮｄｅ Ｉ−Ｎｄｅ Ｉ
ブタ成長ホルモンｃＤＮＡフラグメントを挿入して、プ
ラスミドｐ３００９を得た。ブタ成長ホルモン（ｐＧ
Ｈ）フラグメントはＮｄｅ Ｉ消化によりｐ３００８
（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８０４）から単離した。プラス
ミドｐ３００９を、当業者に公知の方法を用いる形質転
換により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株は増殖及び誘発す
ると、フェニルアラニン形天然 ｐＧＨのアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するｐＧＨのアナロ
グが産生された。産生されたｐＧＨ アナログの量は、
クーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルの走査
により計算すると、細菌により産生される総タンパクの
約３０−３５％であった。菌株を増殖、産生されたｐＧ
Ｈ アナログの回収及びｐＧＨ アナログの精製に使用
した方法は、実施例１３に記載されているｐＨＧ ４４
に対する方法と同じである。ｐＨＧ 遺伝子の３′末端
にＴ１Ｔ２転写終結配列が導入されてβ−ラクタマーゼ
発現が大きく抑えられているために、ｐ３００９の発現
レベルはｐ３００８菌株から得られるレベルに比して高
かった。 ＩＶ ｐ５００３ ｐ５００３の構築は第１２図に示されかつ前記図面の説
明中に記載されている。ｐ５００３はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ Ｎｏ．３９
７９２で寄託されている。ｐ５７９発現ベクターの非反
復Ｎｄｅ Ｉ部位にＮｄｅ Ｉ−Ｎｄｅ Ｉニワトリ成
長ホルモンｃＤＮＡフラグメントを挿入して、プラスミ
ドｐ５００３を得た。プラスミドｐ５００３を、当業者
に公知の方法を用いる形質転換により大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ２０９７に導入し
た。この菌株は増殖及び誘発すると、フェニルアラニン
形天然ニワトリ成長ホルモン（ｃＧＨ）のアミノ末端に
付加されたアミノ酸メチオニンを有するｃＧＨのアナロ
グが産生された。産生されたｃＧＨアナログの量は、ク
ーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲルの走査に
より計算すると、細菌により産生される総タンパクの約
３０−３５％であった。菌株を増殖、産生されるｃＧＨ
アナログの回収及びｃＧＨ アナログを精製するため
に使用した方法は、実施例１３に記載したｐＨＧ４４に
対する方法と同じである。ある。ｃＧＨ遺伝子の３′末
端にＴ１Ｔ２転写終結配列が導入することによりβ−ラ
クタマーゼの発現が大きく抑えられているため、ｐ５０
０３の発現レベルはｐ５００２菌株から得られるレベル
よりも高かった。実施例１１ ヒトＣｕ−Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ） Ｉ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１構築は第１６図に示されかつ図面
の説明中に記載されている。プラスミドｐＳＯＤβ１Ｔ
Ｔ−１は、ｐＳＯＤβ１Ｔ１１（第１５図）のＳＯＤ遺
伝子の３′末端にＴ１Ｔ２終結配列を挿入した得た。プ
ラスミドｐＳＯＤβ１ＴＴ−１を、当業者に公知の方法
を用いる形質転換で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株を増殖
するとＳＯＤアナログを産生した。産生したＳＯＤ ア
ナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルア
ミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生され
る総タンパクの約１０−１５％であった。菌株の増殖、
産生されるＳＯＤ アナログの回収及びＳＯＤ アナロ
グの精製に使用した方法は実施例１５に記載されてい
る。非所望ＤＮＡ 配列の転写及び翻訳がＴ１Ｔ２誘発
で抑えられているために、ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１の発現
レベルはｐＳＯＤβ１Ｔ１１（表ＩＩ）から得られるレ
ベルより高かった。アミノ酸配列解析化学量論により示
される如くアミノ末端アラニンがアセチル化されていな
い点で、産生されたヒトＣｕ−ＺｎＳＯＤアナログは天
然ヒトＣｕ−ＺｎＳＯＤとは異なる。天然ヒトＳＯＤは
アミノ末端アラニンでアセチル化されている［ハーツ，
ジェー．ダブリュー．（Ｈａｒｔｚ，Ｊ．Ｗ．）及びド
イッチェ，エィチ．エフ．（Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｈ．
Ｆ．）、ジェー．バイオロ．ケム．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ）（１９７２）２４７：７０４３−７０５０、ヤ
ーブッシュ，ジェー．アール．（Ｊａｂｕｓｃｈ，Ｊ．
Ｒ．）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）（１９８０）１９：２３１０−２３１６；バーラ
（Ｂａｒｒａ）ら、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ）（１９８０）１２０，５３及びオバーレイ，エル．
ダブリュ．（Ｏｂｅｒｌｅｙ，Ｌ．Ｗ．），スーパーオ
キシドジスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍ
ｕｔａｓｅ）ＶｏＬ．Ｉ，ＣＲＣプレス，フロリダ，
（１９８２），ｐｐ．３２−３３］。天然ヒトＳＯＤは
グリコシル化されている［ヒューバー，ダブリュ．（Ｈ
ｕｂｅｒ，Ｗ．）、１９７１年５月１８日付発刊米国特
許第３，５７９，４９５号］。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は自身が産生するタンパクをグリ
コシル化しないので、細菌産生ヒトＳＯＤは殆んど全く
グリコシル化されていない。細菌産生ＳＯＤアナログの
アミノ酸配列は成熟ヒトＳＯＤのアミノ酸配列と同一で
あり、Ｎ−末端にメチオニン残基を含まない。実施例１２ ヒトアポリポプロテインＥ３（Ａｐｏ−Ｅ３） Ｉ ｐＴＶ−１７０ ｐＴＶ−１７０の構築は第２０図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ｐＡｐｏＥ−ＥＸ２（ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．３９７８７）由来のＮｄｅ Ｉ−Ｎｄｅ
Ｉ Ａｐｏ−Ｅ３フラグメントを発現ベクターｐ５７９
の非反復ＮｄｅＩ部位に挿入して、プラスミドｐＴＶ−
１７０を得た。ｐＴＶ−１７０を当業者に公知の方法を
使用する形質転換により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。得られたク
ローンを増殖させると、多分天然ヒトＡｐｏ Ｅ３のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニンを有するヒト
Ａｐｏ Ｅ３が産生された。産生されたヒトＡｐｏ Ｅ
３アナログの量は、クーマシー染色ＳＤＳポリアクリル
アミドゲルの走査により計算すると、細菌により産生さ
れる総タンパクの約１％であった。菌株を増殖するのに
使用した方法は実施例１７に記載されている。 ＩＩ ｐＴＶ−１９４ ｐＴＶ−１９４の構築は第２２図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ｐＴＶ−１７０（第２０
図）から、ＣＩＩリボソーム結合部位をｐＢＬＡ１１由
来のβ−ラクタマーゼプロモーターとリボソーム結合部
位で置換すると、ｐＴＶ−１９４が誘導された。ｐＢＬ
Ａ１１は、ｐＢＲ３２２中の座標４１５７と４３５３の
間にあるβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーターとリボ
ソーム結合部位とを含む。Ｅｃｏ ＲＩリンカーをプロ
モーターの上流に付加し、マルチ制限部位リンカーを開
始コドンＡＴＧの直後に付加した。従って、開始コドン
を始めとするコード鎖の配列は、ＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡ
ＧＡＡＴＴＣである。ｐＢＬＡ１１はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ Ｎｏ．３９
７８８として寄託された。ｐＴＶ−１９４を、当業者に
公知の方法を用いる形質転換によって大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入し
た。得られたクローンを増殖すると、多分天然ヒトＡｐ
ｏ Ｅ３のアミノ末端に付加されたアミノ酸メチオニン
を有するヒトＡｐｏ Ｅ３のアナログが産生された。産
生されたヒトＡｐｏ−Ｅアナログの量は、クーマシー染
色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査により計算する
と、細菌により産生される総タンパクの約３％であっ
た。菌株を増殖するのに使用された方法は実施例１７に
記載されているｐＴＶ−１７０に対する方法と同じであ
る。 ＩＩＩ ｐＴＶ−２１４ ｐＴＶ−２１４の構築は第２４図に示されかつ前記図面
の説明中に記載されている。ヒト成長ホルモンの１４個
のアミノ酸アミノ末端配列をコードする合成ＤＮＡフラ
グメントをｐＴＶ−１９０の非反復Ｎｄｅ Ｉ部位に挿
入することにより、（第２１図に示されかつ前記図面の
説明中に記載されている）ｐＴＶ−１９０からｐＴＶ−
２１４を誘導した。ｐＴＶ−２１４を、当業者に公知の
方法を用いる形質転換により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ａ１６４５に導入した。得られ
たクローンを増殖及び誘発すると、ヒトＡｐｏ Ｅ３の
アナログが産生された。前記アナログは、アミノ末端に
ヒト成長ホルモンの１４個のアミノ酸アミノ末端配列と
それに続く成熟ヒトＡｐｏ Ｅ３の配列に付随したメチ
オニンとを有する。産生されたヒトＡｐｏ Ｅアナログ
の量は、クーマシー染色ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲ
ルの走査により計算すると、細菌により産生された総タ
ンパクの約２％であった。菌株を増殖するために使用し
た方法は実施例１７に記載されているｐＴＶ−１７０に
対する方法と同じである。実施例１３ ｐＨＧ ４４の増殖 Ｉ．保存培養株 ｐＨＧ ４４の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参
照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−８
０℃で保存した。凍結培地は５００ｍｌ中の含有成分を
以下に示す。 ＩＩ．接種材料 接種材料を、カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１
０ｇ／ｌ及びＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で増殖させた。振盪フ
ラスコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０
℃及び約２００ｒ．ｐ．ｍで１５時間培養した。必要に
応じ、撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に２−１０％の接種材料培養株を接種
し、空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．５
で１５時間培養した。 ＩＩＩ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用に使用される培地中で常に見出されるもので
ある。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液
をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添
加した。まず１０ｇ／ｌまで滅菌グルコース溶液を添加
した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に０．５−１０％の接種材料培養株を接種し、３０
℃で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。ｐＨはＮＨ
３で７±０．２に維持した。細胞濃度が約３．５ｇ／ｌ
（ＯＤ６６０＝１０）に達してから誘導を開始した。温
度を４２℃まで上昇させ、４２℃を１−５時間維持し
た。次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法
により細胞を回収した。ｂＧＨの回収 ポリトロン（キネマテイカ）（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｋｉ
ｎｅｍａｔｉｃａ））混合機を使用し、発泡を最小化す
るように該混合機の速度を調節しながら、５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ及び１００ｍＭＮａＣｌを含有する溶液５容量中に、
細菌細胞１３ｋｇ（湿潤ケーキ）を再懸濁させた。均質
な懸濁液を８０ｌ／時でダイノミル細胞破砕器ケー．デ
ィー・５（ウイリー・エイ・バシヨフエン、バーゼル）
（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ ｃｅｌｌｄｉｓｒｕｐｔｏｒ Ｋ
Ｄ５（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂａｓｅ
ｌ））に連続的に通し、破砕した細胞の均質懸濁液を、
流量４５ｌ／時でシー・イー・ピー・エイ（ＣＥＰＡ）
１０１遠心機で遠心分離により清澄化させた。遠心分離
段階で分離された沈殿物を収集し、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
を含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４）１５．５ｌ中に再懸濁させた。最終濃度が０．０５
ｍｇ／ｍｌになるまでリゾチームを添加し、懸濁液を３
７℃で１６時間インキュベートした。最終濃度が１％に
なるまでトリトン・エックス（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）−１
００を添加した。次に懸濁液を室温で３０分間インキュ
ベートし、連続フローセル音波処理装置（熱システム）
内で１８ｌ／時で音波処理し、シー・イー・ピー・エイ
・１０１遠心機内で遠心分離した。沈殿物を収集し、５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に再懸
濁させ、前記と同様に音波処理し、シー・イー・ピー・
エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。５０ｍＭＥＤＴ
Ａ及び１００ｍＭＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１５．５ｌ中に細胞を再
懸濁させ、２度沈殿させ、蒸留水１５．５ｌ中に再懸濁
させた。遠心分離により沈殿物を収集し、−２０℃で保
存した。ｂＧＨの精製 沈殿物を蒸留水３０−４０ｌ中に再懸濁させ、０．５Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ１１．８に滴定して可溶化させた。次に
溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー・イー・
ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離により清澄化さ
せ、又はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ．１濾紙で
濾過した。清澄化させた蛋白質溶液（２８０ｎｍ ＯＤ
＝２９７０００の溶液３２．６ｌ）を、それぞれ５００
００−６００００ＯＤの各部分（６×５．４ｌ）に分割
した。各面積５ｆｔ２の３個の１０００００分子量カッ
トオフカセット（ピー・ティー・エイチ・ケーＰＴＨＫ
型）を備えるミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過器で各部分をそれぞれ限
外濾過した。５．４ｌ部分を保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔ
ｅ）容量１ｌまで濃縮した。限外濾過物を収集し、保存
した。保持物をｐＨ１１．８の別の１０ｍＭホウ酸塩緩
衝液で当初の容量まで希釈し、十分混合した。バッチを
保持物容量１ｌまで再び濃縮した。限外濾過物を収集
し、先の限界濾過物と混合した。両者の限外濾過物中の
ＯＤの合計値が、限外濾過器に初期にチャージされたＯ
Ｄの２０％になったら、次の濃縮段階の保持物容量を１
ｌでなく０．５ｌとした。０．５ｌの保持物容量からの
限外濾過物の吸光度が２８０ｎｍ（１ｃｍセル）で０．
１より小さくなるまで、濃縮及び１０ｍＭホウ酸塩緩衝
液による希釈のサイクルを継続した。一般に、濃縮及び
希釈サイクル数は９から１２の範囲とした。最終保持物
を排出した。全限外濾過物を合し、６ＮＨＣｌでｐＨ
９．０に調整した。別の５．４ １部分を同様に限外濾
過し、ｐＨ調整済みの全限外濾過物を合した。代表的な
一工程から、ＯＤ＝１０００００に相当する吸光度０．
２６の限外濾過物総量３８０ｌが産生され、所要時間は
２４から４０時間であった。１００Ｋ限外濾過段階で合
した限外濾過物（２８０ｎｍでＯＤ＝１０００００の濾
過物３８０ｌ）を、線流速２３ｃｍ／時（２５ｌ／時）
でセファロース・シー・エル・６・ビー、ディー・イー
・エー・イー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ＤＥ
ＡＥ）イオン交換カラムに通した。直径３７ｃｍ、高さ
１５ｃｍのカラムを、ｐＨ９．０の１０ｍＭホウ酸塩緩
衝液２床容量（３２Ｌ）で洗浄した。充填及び洗浄段階
からの溶出液を排出した。溶離液を段階的に１０ｍＭホ
ウ酸塩、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９に変化させ、
ｂＧＨをカラムから排出した。溶出流速は２３ｃｍ／時
とした。２８０ｎｍにおける溶出液の吸光度を追跡する
ことにより、工程の進行を監視した。ｂＧＨピークを４
から５床容量（２８０ｎｍでＯＤ＝４３０００の容量８
４１）収集した後、１００００分子量カットオフカセッ
トを有するミリポア・ペリコン限外慮過器を使用して約
１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に溶液を凍結乾燥した。
収量は、純粋ｂＧＨ約７０ｇであった。実施例１４ ｐＨＧ ４４により産生されるｂＧＨアナログの活性 １．天然ｂＧＨに対するｂＧＨ アナログのラジオイム
ノアッセイ比較 リン酸塩でｐＨを調節した食塩水（１％ＢＳＡ）中にｂ
ＧＨ アナログ１００ｎｇ／ｍｌを含有する溶液を調製
した。該溶液を逐次、濃度５０，２５，１２．５，６．
２５，３．１２，１．５６及び０．７８ｎｇ／ｌに希釈
した。これらの溶液の０．１ｍｌ アリコート１対に対
して、二抗体法によりＲＩＡを行った。希釈曲線は、天
然ｂＧＨで得られる場合と同等であった。 ２．ラジオレセプタ結合アッセイ トレーサとして１２５Ｉ−ｂＧＨ及び較正曲線用として
真正ｂＧＨ溶液を使用し、ツシマ・ティーＴｕｓｈｉｍ
ａ，Ｔ及びフレイセン・エイチ・ジーＦｒｅｉｓｅｎ，
Ｈ．Ｇ．（ワイ・チン「内分泌代謝」Ｙ．Ｃｈｉｎ．，
ＥｎｄｏｃｒＭｅｔａｂ．（１９７３），３７，３）に
より記載されているように、ウサギ肝臓膜でラジオレセ
プタ結合アッセイを行った。アッセイ用緩衝液０．３ｍ
ｌ（５０ｍＭトリス、１５ｍＭＣａＣｌ２及びウシ血清
アルブミン５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．６）中で室温で３組
の試料を２時間インキュベートした。管には、１２５Ｉ
−ｂＧＨ（３０−６０μＣｉ／μｇの調製に２００００
ｃｐｍ）、肝臓膜蛋白質１５０−２５０μｇ、及び天然
ｂＧＨ（１−１００ｎｇ）又は細菌ｂＧＨエキスのいず
れかを充填した。その結果、ｂＧＨ アナログのｂＧＨ
活性は天然ｂＧＨのｂＧＨ活性と同等であることが認め
られた。 ３．脛骨試験 実施例１３に従い細菌細胞から回収したｐＲＯ １２か
ら産生したｂＧＨ アナログの生物活性を脛骨試験によ
り評価した。（パーロウ・エイ・エフ他「分泌学」Ｐａ
ｒｌｏｗ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌｏｇｙ（１９６５）７７，１１２６参照。）ラット
の下垂体を２８−３０日齢で切除した後、無処置で１０
−１４日間置いた。ウシ下垂体又は組換体大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から誘導されたウシ成
長ホルモンをｐＨ１０．０の０．０１Ｍホウ酸塩と共に
０．１５ＭＮａＣｌに溶解させた。ラット（１群４−７
匹）に毎日ｂＧＨ溶液（０．２ｃｃ中に５−１２５μｇ
／日）を５日間皮下注射し、この間常用飼料（プリナラ
ットチャウ及び任意に水）を与え続けた。動物を６日目
に殺し、前脚膝骨を取出し、長手方向に切断し、アセト
ンで固定し、２％ＡｇＮＯ３で染色した。解剖双眼鏡
（ニコン）で観察することにより骨端板の幅を測定し
た。平均値（ラット１匹当たりの読み４０回）を使用し
て長い投与−応答曲線を形成した。この結果、ｂＨＧ
４４から産生したｂＧＨ アナログのｂＧＨ 活性が天
然ｂＧＨのｂＧＨ 活性と同等であることが認められ
た。実施例１５ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１の増殖 Ｉ．保存培養株 ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の保存株をカゼイン培地（接種材料
の項参照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈
し、−８０℃で保存した。凍結培地５００ｍｌ中の含有
成分を以下に示す。 ＩＩ．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、３０℃及び約２０
０ｒ．ｐ．ｍで振盪器上で１５時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気
飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を維持するよ
うに撹拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．５で１
５時間培養した。 ＩＩＩ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にテトラサイクリン１２．５ｍｇ／ｌを含有
させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中には常に含有
されている。ビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
の濃度溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生
用培地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／
ｌまで添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコー
スを添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に０．５−１０％の接種材料培養株を接種し、３０
℃で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸
素濃度を維持するように撹拌通気率を設定した。ｐＨを
ＮＨ３で７±０．２に保った。細胞濃度が約３．５ｇ／
ｌ（ＯＤ６６０＝１０）に達してから誘導を開始した。
温度を４２℃まで上昇させ、１−５時間４２℃を保っ
た。次に培養株を冷却し、酵素精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。ＳＯＤの回収 発泡を最小化するように速度を調節しながらポリトロン
（キネマテイカ）混合機内で５０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．８）１２ｌ中に細菌細胞１．５ｋｇ（湿潤ケ
ーキ）を懸濁させた。均質懸濁液をダイノミル細胞破砕
器ケー・ディー・５（ウイリー・エイ・バシヨフエン、
バーゼル）に連続的に通過させた。連続フローセルを使
用して破砕細胞の均質懸濁液を音波処理し、シー・イー
・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。上清を
６５℃で２時間加熱し、冷却して前記と同様に遠心分離
した、１００００分子量カットオフカセット（ピー・テ
ィー・ジー・シー型）を使用するミリポアペリコン限外
濾過装置内で清澄な上清を１ｌまで濃縮した。濃縮され
た蛋白質溶液を、１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．８）で平衡化されたディー・イー・エイ・イ
ー・セファロースカラム（２ｋｇディー・イー・エイ・
イー・セファロース）に通した。溶液中の流れを収集
し、濃縮し、ペリコン限外濾過装置内でｐＨ７．８の２
０ｍＭトリスＨＣｌで透析してから、２０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液で平衡化されたキュー・エイ・イー・セファ
ロースカラム上に置いた。ｐＨ７．８の２０ｍＭトリス
ＨＣｌ緩衝液及び塩勾配（０−２００ｍＭＮａＣｌ）で
カラムを展開させた。ＳＯＤ含有フラクションを収集
し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、蒸留水で透析した
後、ｐＨ４．８の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を添加する
ことにより１００ｍＭ酢酸ナトリウムとした。ｐＨ４．
７の１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化されたシ
ー・エム・セファロースカラム上で蛋白質溶液を更に分
離した。同一緩衝液及び塩勾配（１００−５００ｍＭＮ
ａＣｌ）を使用してカラムを展開させた。ＳＯＤ含有フ
ラクションを収集し、ペリコン限外濾過装置で濃縮し、
凍結乾燥した。実施例１６ ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１により産生されるＳＯＤの活性 マックコード及びフリドヴィチ、生化学誌（ＭｃＣｏｒ
ｄ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ）（１９６９），２４４，６０４９−６０５５に記
載されているようにフエリシトクロム・シーの還元抑制
を監視することにより、実施例１５のｐＳＯＤβ１ＴＴ
−１により産生されたＳＯＤ アナログの酵素活性を分
析した。その結果、ｐＳＯＤβ１ＴＴ−１から産生され
たＳＯＤアナログの活性は、天然のヒトＳＯＤ の活性
及びウシＳＯＤ （オルゴテイン：グルネンタール・ゲ
ー・エム・ベー・ハーｏｒｇｏｔｅｉｎ：Ｇｒｕｎｅｎ
ｔｈａｌ ＧＭＢＨ）の活性と同等であると認められ
た。実施例１７ ｐＴＶ−１７０の増殖 Ｉ．保存培養株 ｐＴＶ−１７０の保存株をカゼイン培地（接種材料の項
参照）上で増殖させ、凍結培地で２倍に希釈し、−８０
℃で保存した。凍結培地５００ｍｌ中の含有成分を以下
に示す。 ＩＩ．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０℃
及び約２００ｒ．ｐ．ｍで１５時間培養した。必要に応
じて、撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階を実
施した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空
気飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保つよう
に撹拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．５で１５
時間培養した。 ＩＩＩ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には更にアンピシリン１００ｍｇ／ｌを含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中には常に見出され
る。ビオチン、チアミン及びアンピシリンの濃度溶液を
それぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加
した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌまで添加し
た。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に０．５−１０％の接種材料培養株を接種し、３０
℃で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。ｐＨをＮＨ
３で７±０．２に維持した。細胞濃度が約３．５ｇ／ｌ
（ＯＤ６６０＝１０）に達してから誘導を開始した。温
度を４２℃まで上昇させ、１５時間４２℃を保った。次
に培養株を冷却し、蛋白質精製用に遠心分離法により細
胞を回収した。実施例１８ ウシ成長ホルモン ｐＨＧ ５０ ｐＨＧ ５０の構築は第６図に示され図面の説明中に説
明してある。ｐＨＧ４４（エイ・ティー・シー・シー・
ＡＴＣＣ番号３９８０６）の単一Ｃｌａ Ｉ部位にｐＳ
Ｋ ４３４（ＡＴＣＣ番号３９７８４）のＨｐａ ＩＩ
−Ｈｐａ ＩＩλｃＩ４３４フラグメントを挿入するこ
とによりプラスミドｐＨＧ ５０を得た。同様にしてプ
ラスミドｐＨＧ ５１を構築した。しかし乍ら、プラス
ミドｐＨＧ ５０と比較してλｉｍｍ４３４ｃＩ＋フラ
グメントはプラスミド内で逆配向（ｏｐｐｏｓｉｔｅ
ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に見出された。λｉｍｍ４３
４をＢａｍ ＨＩで消化し、Ｂａｍ ＨＩで消化された
ｐＢＲ３２２に混合物を連結させることによりｐＳＫ
４３４（ＡＴＣＣ番号３９７８４）を構築した。連結さ
れた混合物で大腸菌Ａ２０９７を形質転換し、λｉｍｍ
４３４ｃＩ３００３ファージに免疫性のコロニーを単離
した。これらのコロニーの１個から単離したプラスミド
ｐＳＫ ４３４は６ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメントを
含んでおり、該フラグメントはλｃＩ４３４遺伝子を含
んでおりかつＮ遺伝子外からＰ遺伝子外に伸びていた。
ｐＳＫ４３４は第６図の制限地図を有する。当業者に公
知の方法を使用する形質転換により、ｐＨＧ ５０及び
ｐＨＧ ５１を大腸菌菌株Ａ１６４５に導入した。得ら
れたクローン、それぞれＡ３１０８及びＡ３１１２は、
増殖及び誘導後、フェニルアラニン形天然ｂＧＨ のア
ミノ末端に付加されたアミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇ
ｌｎ を有するｂＧＨ アナログを産生した。産生され
たｂＧＨアナログの量を、クーマシーで染色したエス・
ディー・エス・ポリアクリルアミドゲルを走査すること
により計算した処、細菌により産生される総蛋白質量の
３７−４２％の範囲であった（第１表）。プロファージ導入 λｃＩ４３４選択系を使用するためには、ｐＨＧ ５０
を含有する細胞がプロファージλｉｍｍ４３４ｃＩ−を
も含有していなければならない。本発明者はプロファー
ジとしてλｉｍｍ４３４ｃＩ３００３ｍｉｎｉ Ｔｎ
１０Δ１６Δ１７を使用した。まれに起こる安定的なプ
ロファージ挿入現象の単離を容易にするために、ｍｉｎ
ｉ Ｔｎ １０Δ１６Δ１７テトラサイクリン耐性マー
カ（フォスター他、細胞（Ｆｏｓｔｅｒ，ｅｔ ａ
ｌ．，ｃｅｌｌ）（１９８１）２３，２０１−２１３）
をファージ中に導入した。他方、この結果、テトラサイ
クリン耐性を監視することにより、プロファージの存在
を簡単に試験することも可能になった。アンピシリンの
存在下で増殖したプラスミドｐＨＧ ５０を含有する大
腸菌菌株Ａ１６４５に、３０℃で低感染多重度でλｉｍ
ｍ４３４ｃＩ３００３ｍｉｎｉＴｎ １０Δ１６Δ１７
を感染させた。テトラサイクリン耐性コロニーを単離
し、精製した。前記菌株はアメリカ菌寄託センター（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃ
ｅｎｔｅｒ）にＡＴＣＣ番号３９８０５で寄託されてい
る。別の方法として、大腸菌１６４５をｐＨＧ ５０及
びλｉｍｍ４３４ｃＩ３００３ｍｉｎｉ Ｔｎ １０Δ
１６Δ１７で同時に形質転換し、アンピシリン及びテト
ラサイクリンの双方に耐性のコロニーを選択することに
より、プロファージを導入した。ベクター及びプラスミ
ドに好適な宿主は、Ａ１６３７，Ａ２６０２，Ａ１５６
３，Ａ１６４５（Ｃ６００ΔＨΔＢａｍ ＨＩｒ−ｍ＋
ｇａｌ＋ｔｈｒ−ｌｅｕ−Ｂｌ）又はＡ２０９７（Ａ１
６４５ ｌａｃΔｘ Ａ２１，ｐｒｏＣ：：Ｔｎ１０）
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。上記
と同様にして所望のプロファージを全菌株に導入するこ
とができる。ｐＨＧ 及びｂＧＨ 遺伝子の切除により
該ｐＨＧ から誘導され得るベクターは、従来開示され
ている発現ベクターに対して、以下の点を含む多くの利
点を有する。 １．プラスミド安定性の改良 プラスミドは、λｉｍｍ４３４ｃＩ−溶原素を抑制する
ｃＩ４３４リプレッサ遺伝子を含んでいる。プラスミド
が損失すると、λｉｍｍ４３４ｃＩ−プロファージ誘導
により細菌細胞溶菌が生じる。従って、高価な抗生物質
選択系を使用しなくてもプラスミドは安定的に保たれ
る。第ＩＩＩ表は、ｃＩ４３４安定化系を有するプラス
ミドの高安定性を示している。λＰＬプロモーターの不
耐熱性リプレッサーがＣＩであるにも拘らず、ｃＩ
４３４プラスミド安定化系は、熱誘導性λＰＬプロモー
タ発現系と同時に利用することができる。λｉｍｍ４３
４ｃＩ−プロファージはいずれもλｉｍｍ４３４ｃＩ３
００３プロファージと置換できることに留意すべきであ
る。又、任意の抗生物質耐性マーカを先にｍｉｎｉ Ｔ
ｎ １０Δ１６Δ１７に導入したテトラサイクリン耐性
マーカと置換することができる。λｉｍｍ２１及びλｉ
ｍｍ２２のリプレッサーマイナス突然変異体が入手でき
るので、λ４３４系の代わりにファージ２１又はファー
ジ２２の同等の系を使用することができる。 ２．非常に高い発現レベル このプラスミドは、総細胞蛋白質の４２％という高レベ
ルで大腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能であ
る。この発現レベルは、Ｔ１Ｔ２転写終結配列を含まな
い他の同様のλＰＬプラスミドについて記載されている
発現レベルよりも高い。 ３．転写終結暗号 プラスミドは、λＰＬプロモーター及びＣＩＩリボソー
ム結合部位の「下流」に配置されたＴ１Ｔ２転写終結暗
号を含んでいる。Ｔ１Ｔ２転写ターミネータはＮ修飾Ｒ
ＮＡポリメラーゼの転写を終結させ得るので、このプラ
スミドを使用する場合に得られる高発現レベルは部分的
に、挿入遺伝子の端部にあるＴ１Ｔ２転写ターミネータ
の存在に起因し得る。従って、この転写ターミネータは
好ましくないプラスミド蛋白質のλＰＬ制御転写を阻止
し、その結果、所望の蛋白質の相対収量を向上させる。 ４．置換可能なリボソーム結合部位 ｐＨＧ ５０は、リボソーム結合部位の「上流」に位置
する１個のＥｃｏ ＲＩ部位と、ＡＴＧ開始コドンに位
置するＮｄｅ Ｉ部位１個とを含んでいる。従って、リ
ボソーム結合部位は２個の別々の制限部位によりその両
端が定められている。このため、プラスミドの他の特徴
を変えることなく、容易に現在のリボソーム結合部位
（λＣＩＩリボソーム結合部位）を切除して別のほとん
どあらゆる天然又は合成リボソーム結合部位に置換する
ことができる。こうして、所望のポリペチドの最適発現
が著しく容易になる。 ５．発現の熱誘導調節 λＰＬプロモーターは、ＣＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは３０℃ではプロモー
ターに結合するが、４２℃では不活性化する。従って、
発酵温度を４２℃に上昇させることにより、宿主細菌は
所望の蛋白質を産生するように誘導される。このような
系の利点を以下に述べる。 （ａ）大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が後期に産生さ
れ得るので、発酵プロセス中における初期細胞死が避け
られる。 （ｂ）蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化し、蛋白
質分解が阻止され得る。（チエン、ワイ・イー他、遺伝
子（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ）
（１９８１）１４，１２１）。従って、λＰＬのような
厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」過
剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適である。 ６．誘導プロトコールの単純化 ｐＨＧ ５０は約４２℃で誘導され、蛋白質合成期間を
通して４２℃に保たれる。本願出願人名義の米国特許出
願第５１４１８８号に記載されているｐＭＧ１００及び
ｐＮＤ ５から誘導されたプラスミドの誘導プロトコー
ルは、４２℃で誘導後、３８℃の増殖期間を設けること
を定めている。ｐＨＧ ５０の最適誘導プロトコールは
３８℃まで冷却する段階を必要としないので単純であ
る。 ７．高コピー数 プラスミド上に見出されるｐＨＧ ５０中のλＰＬプロ
モーターは、大腸菌中のλ形質導入ファージベクターよ
りもコピー数が多い。従って、発現レベルが向上する。 ８．リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）及び翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含んでい
る。従って、開始コドンを添加することなくあらゆる真
核性遺伝子がクローン化され得る。更に、高効率のＲＢ
Ｓ は発現レベルを向上させる。リボソーム結合部位は
λＣＩＩリボソーム結合部位である。リボソーム結合部
位の配列を以下に示す。
【化１５】 １個の塩基対が、野性型λに見出されるリボソーム結合
部位と異なっている。 ９．好適な制限部位 プラスミドから誘導される発現ベクターは、部位内にＡ
ＴＧ 開始コドンを含む１個のＮｄｅ Ｉ制限部位を有
している。従って、所望の遺伝子の適正な配置が可能に
なる。該１個のＮｄｅ Ｉ部位は、リボソーム結合部位
のすぐ後に見出される。 １０．Ｎｕｔ部位 宿主により供給されるＮ蛋白質は発現ベクター上のＮｕ
ｔ 部位に結合し、従って、ｔＲＩ部位における転写終
結又はクローン化遺伝子内の早期転写終結を阻止する。
【表３】 菌株Ａ３１０８及びＡ３１１２に３０℃でλｉｍｍ４３
４Ｉ−ｍｉｎｉ Ｔｎ１０を感染させ、テトラサイクリ
ン耐性コロニーを分離した。コロニーを精製し、アンピ
シリン耐性を試験した。単一のコロニーを選択し、アン
ピリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地中で３０℃で
一晩増殖させた。培養株をＬＢ培地で１／１０００に希
釈し、約５×１０８株／ｍｌに増殖させ、更に別のＬＢ
で１／１０００００に希釈し、一晩増殖させた。ＬＢプ
レート上及びアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬ
Ｂプレート上に試料を展開させた。各ＬＢプレートから
約５０コロニーを抽出し、アンピシリンを含有するＬＢ
プレート上の増殖について調査した。その結果、選択さ
れたクローンのプラスミド安定性が確認された。実施例１９ ｐＨＧ ５０の増殖 Ｉ．保存培養株 ｐＨＧ ５０の保存株をカゼイン培地（接種材料の項参
照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希釈し、−８
０℃で保存した。凍結培地５００ｍｌ中の含有成分を以
下に示す。 ＩＩ．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０／ｌ及びＮ
ａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラス
コ内の滅菌培地に保存株を接種し、振盪器上で３０℃及
び約２００ｒ．ｐ．ｍ．で１５時間培養した。必要に応
じて撹拌通気発酵器中で接種材料増殖の後続段階を実施
した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種し、空気
飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保つように
撹拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．５で１５時
間培養した。 ＩＩＩ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地にはアンピシリン１００ｍｇ／ｌを更に含有させ
た。アンピシリンは産生に任意の成分であるが、接種材
料の増殖用として使用される培地中に常に見出される。
ピチオン、チアミン及びアンピシリンの濃縮溶液をそれ
ぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培地に添加し
た。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌまで添加し
た。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを添加し
た。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に０．５−１０％の接種材料培養株を接種し、３０
℃で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。ｐＨをＮＨ
３で７±０．２に維持した。細胞濃度が約３．５ｇ／ｌ
（ＯＤ６６０＝１０）に達してから誘導を開始した。温
度を４２℃に上昇させ、４２℃を１−５時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。実施例２０ ｐ８３００−１０Ａ ｐ８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ番号３９７８５）の構築
は第７図に示され図面の説明中に説明されている。構成
多コピー数プラスミドｐＯＰｌΔ６（ゲルファンド、デ
ィー・エイチ他、ピー・エヌ・エイ・エス（Ｇｅｌｆａ
ｎｄ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９７８）
７５，５８６９）；ミュージング他、細胞（Ｍｅｕｓｉ
ｎｇ，ｅｔ ａｌ，，Ｃｅｌｌ）（１９８１）２４，２
３５−２４２）からプラスミドｐ８３００−１０Ａを誘
導した。同じく第７図に示すｐ７２００−２２をＣｌａ
Ｉで消化し、λＰＬプロモーター、ｂＧＨ遺伝子及び
Ｔ１Ｔ２配列を含むＣｌａ Ｉ−Ｃｌａ Ｉフラグメン
トを単離した。Ｃｌａ Ｉ−Ｃｌａ Ｉフラグメントを
ｐＯＰ１Δ６の単一Ｃｌａ Ｉ部位に挿入した。（プラ
スミドｐ７２００−２２は、λＰＬプロモーターの「上
流」のＢｇｌ ＩＩ部位に合成Ｃｌａ Ｉリンカーを導
入させたｐＳＡＬ５６００−１（第１０図）の誘導体で
ある。） プラスミドｐ８３００−１０Ａは、約４２℃におけるλ
ＰＬプロモーターの誘導後も構成高コピー数表現型を維
持することが認められた。これは、ｂＧＨ配列の３′末
満にＴ１Ｔ２終結配列が存在することに起因すると思わ
れ、この存在により、ｐＯＰｌΔ６の複製起点で他のｍ
ＲＮＡ転写体に干渉し得るλＰＬプロモーターからの長
鎖ｍＲＮＡ転写体が形成されるのを阻止する。当業者に
公知の方法を使用する形質転換により、ｐ８３００−１
０Ａを大腸菌株Ａ２０９７に導入した。増殖及び誘導後
にこの菌株から、フェニルアラニン形の天然ｂＧＨのア
ミノ末端に付加されたメチオニン残基を有するウシ成長
ホルモンのアナログが産生された。ｂＧＨアナログの産
生量は、クーマシー染色エス・ディー・エス・ポリアク
リルアミドゲルの走査により計算した処、細菌により産
生される総蛋白質の約３７−４３％であった。菌株の増
殖、産生されたｂＧＨアナログの回収、及びｂＧＨアナ
ログの精製に使用した方法は、実施例２４でｐＳＡＬ−
１７０／１０について記載する方法と同様である。実施例２１ 一般用発現ベクターは、ｂＧＨ遺伝子の切除によりプラ
スミドｐ８３００−１０Ａ（第７図、ＡＴＣＣ番号３９
７８５）から誘導され得る。こうして誘導されたベクタ
ーは、従来開示の発現ベクターに較べて以下に示すよう
な多くの利点を有する。 １．著しく高い発現レベル ベクターは、総細胞蛋白質の４４％程度の高レベルで大
腸菌中に外来蛋白質を発現させることが可能である。 ２．構成高コピー数 ベクターは、細胞１個当たり約２００−３００コピーの
構成高コピー数を維持する。この点は、低コピー数の他
のλＰＬ発現ベクターと区別される。高コピー数は発現
レベルの向上をもたらす。 ３．転写終結暗号 ｐ８３００−１０ＡからｂＧＨ配列の切除により得られ
るベクターは、λＰＬプロモーター及びＣＩＩリボソー
ム結合部位から「下流」に配置されたＴ１Ｔ２転写終結
暗号を含んでいる。高発現レベルの一因は、挿入遺伝子
の端部にＴ１Ｔ２転写ターミネータが存在するという点
にある。というのは、Ｔ１Ｔ２暗号はＮ修飾ＲＮＡポリ
メラーゼの転写を終結させるからである。従って、転写
ターミネータは、好ましくないプラスミド蛋白質のλＰ
Ｌ制御転写を阻止し、その結果、所望の蛋白質の相対収
量を増加させる。更に、Ｔ１Ｔ２転写終結暗号の存在
は、プラスミドの複製起点を通って続く長鎖ｍＲＮＡ転
写体を阻止する。従って、高コピー表現型の安定性が向
上する。λＰＬプロモーターを含んでいながら転写終結
配列を含まない同様の高コピー数プラスミドは不安定で
あり、高コピー数表現型を失い易い。 ４．置換可能なリボソーム結合部位 ｐ８３００−１０Ａは、リボソーム結合部位の「上流」
に配置された単一ＥｃｏＲＩ部位と、リボソーム結合部
位の「下流」に配置されたＮｄｅ Ｉ部位とを含んでい
る。従って、リボソーム結合部位は２個の単一制限部位
によりその境界が定められている。従って、プラスミド
の他の特徴を変えることなく、容易に現在のリボソーム
結合部位（λＣＩＩリボソーム結合部位）を切除、かつ
ほとんどの他のあらゆる天然又は合成リボソーム結合部
位と置換することができる。その結果、所望のポリペプ
チドの最適発現が著しく促進される。 ５．発現の熱誘導調節 λＰＬプロモーターは、ｃＩリプレッサーが結合してい
るときは不活性である。ｃＩ８５７リプレッサーは熱感
受性である。即ち該リプレッサーは３０℃でプロモータ
ーと結合するが、４２℃では不活性化される。従って、
発酵温度を４２℃まで増加させることにより、宿主細菌
は所望の蛋白質を産生するように誘導される。このよう
な系の利点を以下に述べる。 （ａ）大腸菌に対して毒性の外来蛋白質が発酵プロセス
の後期に産生され得るので、早期の細菌死が避けられ
る。 （ｂ）蛋白質の過剰産生により蛋白質が安定化され、蛋
白質分解が阻止される。（チエン、ワイ・イー他、遺伝
子（１９８１）１４，１２１）。従って、λＰＬのよう
な厳密に調整されたプロモーターを使用する「一時的」
過剰産生の方が、連続的低レベル産生よりも好適であ
る。 ６．誘導プロトコールの単純化 本願明細書及び本出願人名義の米国特許出願第５１４１
８８号中に記載のプラスミドによる蛋白質産生は、熱感
受性ｃＩ８５７リプレッサーにより調節される。前記米
国特許出願中に記載のプラスミドに必要な誘導プロトコ
ールは、４２℃の誘導後に３８℃で増殖させることを定
めている。一方、プラスミドｐ８３００−１０Ａ又はｐ
ＳＡＬ−１３０／１５又はそれらのプラスミド誘導体を
使用する場合の蛋白質合成の最適誘導では、４２℃で誘
導後、同一温度、即ち４２℃で増殖を行った。従って、
発酵器を冷却する必要がなくなる。 ７．リボソーム結合部位及び開始コドン この発現ベクターは、強力な原核性リボソーム結合部位
（ＲＢＳ）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）とを含んでい
る。従って、開始コドンを添加しなくてもあらゆる真核
性遺伝子をクローン化できる。更に、高効率のＲＢＳに
より発現レベルが向上する。リボソーム結合部位はλＣ
ＩＩリボソーム結合部位である。リボソーム結合部位の
配列を以下に示す。
【化１６】 野性型λに見出されるリボソーム結合部位とは塩基対１
個が異なっている。 ８．好適な制限部位 発現ベクターは、部位内にＡＴＧ開始コドンを含む単一
のＮｄｅ Ｉ制限部位を有している。このため、所望の
遺伝子の適正な配置が可能になる。単一ＮｄｅＩ部位
は、リボソーム結合部位のすぐ後に見出される。 ９．Ｎｕｔ部位 宿主により供給されるＮ蛋白質は、発現のベクター上の
Ｎｕｔ部位に結合し、その結果、ｔＲＩ部位における転
写の終結又はクローン化遺伝子内における早期転写終結
を阻止する。菌株 ベクター及びプラスミドに好適な宿主は、Ａ１６３７，
Ａ２６０２，Ａ１５６３，Ａ１６４５（ｃ６００ｒ−ｍ
＋ｇａｌ＋ｔｈｒ−ｌｅｕ−ｌａｃ−ｂｌ（λｃＩ８５
７ΔＨＩΔＢａｍ ＨＩ Ｎ＋））及びＡ２０９７（Ａ
１６４５ｌａｃΔｘ Ａ２１ｐｒｏ Ｃ：：Ｔｎ１０）
を包含する形質転換に好適な大腸菌の菌株である。実施例２２ ｐＳＡＬ−１３０／５ ｐＳＡＬ−１３０／５の構築は第８図に示され図面の説
明中に説明してある。ｍｅｔ−ｐｈｅ ｂＧＨ遺伝子を
ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ ｂＧＨ遺伝子に置換すること
により、ｐ８３００−１０Ａ（ＡＴＣＣ番号３９７８
５）からｐＳＡＬ−１３０／５を得た。ｍｅｔ−ａｓｐ
−ｇｌｎ ｂＧＨ遺伝子は、Ｎｅｄ Ｉ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ消化によりプラスミドｐＨＧ４４（第６図）（Ａ
ＴＣＣ番号３９８０６）から得た。当業者に公知の方法
を使用する形質転換により、ｐＳＡＬ−１３０／５を大
腸菌菌株Ａ１６４５に導入した。この菌株は、増殖及び
誘導後、フェニルアラニン形の天然ｂＧＨのＮ末端に付
加されたアミノ酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎを有する
ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のアナログを産生した。ｐ
ＳＡＬ−１３０／５により産生されたｂＧＨアナログの
量は、クーマシー・ブルー染色エス・ディ・エスポリア
クリルアミドゲルの走査により計算した処、細菌により
産生される総蛋白質の約３９−４４％であった（第Ｉ
表）。菌株の増殖、産生されたｂＧＨアナログの回収、
及びｂＧＨアナログの精製に使用した方法は、実施例２
４でｐＳＡＬ−１７０／１０について記載する方法と同
様である。実施例２３ ｐＳＡＬ−１７０／１０ ｐＳＡＬ−１７０／１０の構築は第８図に示され図面の
説明中に説明されている。公知方法を使用する形質転換
によりｐＳＡＬ−１７０／１０を大腸菌菌株Ａ１６４５
に導入した。この菌株は、増殖及び誘導後、フェニルア
ラニン形の天然ｂＧＨのアミノ末端に加えられたアミノ
酸配列ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎを有するｂＧＨのアナロ
グを産生する。ｐＳＡＬ−１７０／１０により産生され
たｂＧＨアナログの量を、クーマシー染色エス・ディー
・エス・ポリアクリルアミドゲルの走査により計算した
処、細菌により産生される総蛋白質の約４０−４６％で
あった（第Ｉ表）。実施例２４ ｐＳＡＬ−１７０／１０の増殖 Ｉ．保存培養株 ｐＳＡＬ一１７０／１０の保存株をカゼイン培地（接種
材料の項参照）上で増殖させた後、凍結培地で２倍に希
釈し、−８０℃で保存した。凍結培地５００ｍｌ中の含
有成分を以下に示す。 ＩＩ．接種材料 カゼイン水解物２０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ及び
ＮａＣｌ２ｇ／ｌ中で接種材料を増殖させた。振盪フラ
スコ内の滅菌培地に保存培養株を接種し、振盪器上で３
０℃及び約２００ｒ．ｐ．ｍ．で１５時間培養した。必
要に応じて撹拌通気発酵器内で接種材料増殖の後続段階
を実施した。滅菌培地に２−１０％の接種材料を接種
し、空気飽和の２０％を越えるような溶存酸素濃度を保
つように撹拌及び通気しながら３０℃、ｐＨ７±０．５
で１５時間培養した。 ＩＩＩ．産生 産生用培地の含有成分を以下に示す。 培地には、更にテトラサイクリン１２．５ｍｇ／ｌを含
有させた。テトラサイクリンは産生に任意の成分である
が、接種材料の増殖用に使用される培地中に常に見出さ
れるものである。ピオチン、チアミン及び抗生物質の濃
縮溶液をそれぞれ濾過滅菌し、接種以前の滅菌産生用培
地に添加した。滅菌グルコース溶液をまず１０ｇ／ｌま
で添加した。誘導段階で更に１０ｇ／ｌのグルコースを
添加した。微量元素溶液の含有成分を以下に示す。 培地に０．５−１０％の接種材料培養株を接種し、３０
℃で培養した。空気飽和の２０％を越えるような溶存酸
素濃度を保つように撹拌通気率を設定した。ｐＨはＮＨ
３で７±０．２に保った。細胞濃度が約３．５ｇ／ｌ
（ＯＤ６６０＝１０）に達してから誘導を開始した。温
度を４２℃に上昇させ、４２℃を１−５時間維持した。
次に培養株を冷却し、ホルモン精製用に遠心分離法によ
り細胞を回収した。ｂＧＨの回収 ポリトロン（キネマテイカ）混合機を使用し、発砲を最
小にするように混合機の速度を調節しながら、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する溶液５容量
中に細菌細胞１３ｋｇ（湿潤ケーキ）を懸濁させた。均
質懸濁液を８０ｌ／時で連続的にダイノミル細胞破砕器
ケー・ディー・５（ウイリー・エイ・バシヨフエン、バ
ーゼル）中に通過させ、破砕細胞の均質懸濁液をシー・
イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で４５ｌ／時の流量
で遠心分離により清澄化させた。遠心分離段階から得ら
れた沈殿物を収集し、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１５．５
ｌ中に再懸濁させた。最終濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌに
なるまでリゾチームを添加し、懸濁液を３７℃で１６時
間インキュベートした。最終濃度が１％になるまでトリ
トン・エックス・１００を添加した。次に懸濁液を室温
で３０分間インキュベートし、連続フローセル音波処理
器（熱システム）内で１８ｌ／時で音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。沈
殿物を収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）に再懸濁させ、上記同様に音波処理し、シー・
イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離した。５
０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１５．
５ｌ中に細胞を再懸濁させ、２度沈殿させ、蒸溜水１
５．５ｌ中に再懸濁させた。遠心分離により沈殿物を収
集し、−２０℃で保存した。ｂＧＨの精製 沈殿物を蒸溜水３０−４０ｌ中に再懸濁させ、０．５Ｎ
ＮａＯＨの滴定によりｐＨ１１．８として可溶化させ
た。次に溶液を連続的に音波処理し、必要に応じてシー
・イー・ピー・エイ・１０１遠心機内で遠心分離により
清澄化させるか又はワットマンＮｏ．１濾紙で濾過し
た。清澄化蛋白質溶液（２８０ｎｍでＯＤ＝２９７００
０の溶液３２．６ｌ）を、それぞれ５００００−６００
００ＯＤの各部分（６×５．４ ｌ）に分割した。各面
積５ｆｔ２の３個の１０００００分子量カットオフカセ
ット（ビー・ティー・エイチ・ケー型）を備えるミリポ
ア・ペリコン限外濾過器で各部分をそれぞれ限外濾過し
た。５．４ ｌ部分を１ｌの保持物容量まで濃縮した。
限外濾過物を収集し、保存した。保持物をｐＨ１１．８
の別の１０ｍＭホウ酸塩緩衝液で当初の容量まで希釈
し、十分混合した。保持物容量が１ｌになるまでバッチ
を更に濃縮した。限外濾過物を収集し、最初の限外濾過
物と混合した。限外濾過物中のＯＤの経常合計値が、限
外濾過器に最初にチャージしたＯＤの２０％になった
ら、次の濃縮段階の保持物容量を１ｌでなく０．５ ｌ
とした。０．５ ｌの保持物容量からの限界濾過物の２
８０ｎｍ（１ｃｍセル）における吸光度が０．１より小
さくなるまで濃縮及び１０ｍＭホウ酸塩緩衝液による希
釈サイクルを継続した。一般に濃縮及び希釈サイクルは
９から１２サイクルとした。最終保持物を排出した。全
限界濾過物を混合し、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ９．０に調整
した。別の５．４ｌ部分を同様に限界濾過し、ｐＨを調
整された全限界濾過物を混合した。代表的な一工程か
ら、ＯＤ＝１０００００に相当する吸光度０．２６の限
界濾過物総量３８０ｌが産生され、所要時間は２４から
４０時間であった。１００Ｋ限界濾過段階からの混合さ
れた限界濾過物（２８０ｎｍでＯＤ＝１０００００の濾
過物３８０ｌ）を、線流速２３ｃｍ／時（２５ｌ／時）
でセファロース・シー・エル・６・ビー・ディー・イー
・エイ・イー・イオン交換カラムに通した。直径３７ｃ
ｍ、高さ１５ｃｍのカラムを、ｐＨ９．０の１０ｍＭホ
ウ酸塩緩衝液２床容量（３２Ｌ）で洗浄した。充填及び
洗浄段階から得た溶出液を廃棄した。溶離液を段階的に
１０ｍＭホウ酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９
に変化させ、ｂＧＨをカラムから排出させた。溶出流速
は２３ｃｍ／時であった。２８０ｎｍにおける溶出液の
吸光度を追跡することにより工程の進行を監視した。ｂ
ＧＨピークを４から５床容量（２８０ｎｍでＯＤ＝４３
０００の容量８４ｌ）収集した後、１００００分子量切
断カセットを備えるミリポア・ペリコン限界濾過装置を
使用して約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次に溶液を凍結
乾燥した。収量は純粋ｂＧＨ約７０ｇであった。実施例２５ ｐＳＡＬ−１７０／１０により産生されるｂＧＨアナロ
グの活性 １．ｂＧＨアナログ及び天然ｂＧＨ間のラジオイムノア
ッセイ比較 リン酸塩で緩衝した食塩水（１％ＢＳＡ）を用いて１０
０ｎｇ／ｍｌのｂＧＨアナログを含む溶液を調製した。
この溶液を５０，２５，１２．５，６．２５，３．１
２，１．５６及び０．７８ｎｇ／ｌの濃度に逐次希釈し
た。これら溶液の０．１ｍｌアリコートを夫々一対ずつ
用意し、二抗体法を用いるＲＩＡにかけた。希釈曲線は
天然ｂＧＨの場合とほぼ同じであった。 ２．放射線受容体結合アッセイ トレーサとしての１２５Ｉ−ＢＧＨとカリブレーション
曲線を形成するための真正ｂＧＨ溶液とを使用し、ツシ
マ，ティー（Ｔｕｓｈｉｍａ，Ｔ．）及びフライセン，
エッチ・ジー（Ｆｒｅｉｓｅｎ，Ｈ．Ｇ，）の方法（ワ
イ．シン（Ｙ．Ｃｈｉｎ．），内分泌物代謝（Ｅｎｄｏ
ｃｒ．Ｍｅｔａｂ．）（１９７３年），３７；３）に従
ってウサギ肝臓膜での放射線受容体結合アッセイ（ｒａ
ｄｉｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａ
ｙ）を行なった。試料を各３部ずつ０．３ｍｌのアッセ
イ緩衝液（５０ｍＭのトリス，１５ｍＭのＣａＣｌ２及
び５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン，ｐＨ７．６）中
で室温で２時間インキュベートした。管には１２５Ｉ−
ｂＧＨ（２０，０００ｃｐｍの３０〜６０μＣｉ／μｇ
試料）、１５０〜２５０μｇの肝臓膜タンパク質及び天
然ｂＧＨ（１〜１００ｎｇ）又はバクテリアｂＧＨ抽出
物のいずれかを入れた。アッセイの結果このｂＧＨアナ
ログのｂＧＨ活性は天然ｂＧＨに比肩することが判明し
た。 ３．脛骨テスト 実施例５に従いバクテリア細胞から回収したｐＲＯ１２
産生ｂＧＨアナログの生物学的活性を脛骨テストにより
測定した（パーロー，エー・エフ（Ｐａｒｌｏｗ，Ａ．
Ｆ．）他，内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）
（１９６５年）７７：１１２６参照）。ラットを生後２
８〜３０日で下垂体切除し、その後無処理で１０〜１４
日間放置した。ウシ下垂体又は組換え体大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）から得たウシ成長ホルモ
ンをｐＨ１０．０の０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１Ｍ
ホウ酸塩に溶解した。ラット（４〜７匹／グループ）に
ｂＧＨ溶液（０．２ｃｃで５〜１２５μｇ／日）を５日
間毎日皮下注射し、その間食餌は普通に与えた（プリナ
ラット チャウ（Ｐｕｒｉｎａ Ｒａｔ−Ｃｈｏｗ）
及び任意に水）。６日目にラットを殺して前脚膝骨を取
り出し、長手方向に切断し、アセトンで固定し且つ２％
ＡｇＮＯ３で染色した。解剖用双眼顕微鏡（ニコン）で
の観察により骨端板の幅を測定した。平均値（４０記録
／ラット）を用いて長い用量−応答曲線を形成した。テ
ストの結果ｐＳＡＬ−１７０／１０産生ｂＧＨアナログ
のｂＧＨ活性は天然ｂＧＨと比肩することが判明した。実施例２６ 実施例３のＳＯＤ宿主−ベクター系により産生されるヒ
ト超酸化物ジスムターゼの収率及び活性は前記宿主−ベ
クター系の成長条件の改変により向上し得る。下記のデ
ータが示すように、前記宿主−ベクター系の成長培地に
Ｃｕ及び／又はＺｎを補足すると活性ダイマー形状の前
記酵素の収率が増大する。バクテリア含有ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の成長 Ｉ．保存培養株 保存培養ｐＳＯＤβ１Ｔ１１をカゼイン培地（接種材料
の項参照）で成長させ、次いで凍結用培地（ｆｒｅｅｚ
ｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）で２倍に希釈し−８０℃で保存
した。前記凍結用培地の組成は次の通りである。 ＩＩ．接種材料 接種材料を２０ｇ／ｌのカゼイン水解物、１０ｇ／ｌの
イースト抽出物及び２ｇ／ｌのＮａＣｌ中で増殖させ
た。シェークフラスコ内の無菌培地に保存培養物を接種
し、シェーカー内３０℃で且つ約２００ｒ．ｐ．ｍ．で
１５時間インキュベートした。必要に応じ、接種材料増
殖過程におけるその後のステップは撹拌曝気発酵槽中で
実施した。無菌培地に２−１０％のフラスコ培養物を接
種し、溶存酸素レベルを２０％空気飽和以上に保持すべ
く撹拌及びアエレーションを行ないながらｐＨ７±０．
５，３０℃で１５時間インキュベートする。 ＩＩＩ．産生 産生培地は下記の物質を含む。 濃縮溶液状のビオチン、チアミン及びテトラサイクリン
は別個にフイルタ滅菌処理し、接種前の無菌産生培地に
加えた。無菌グルコース溶液を最初に１０ｇ／ｌとなる
ように加えた。誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）ステップで
更に１０ｇ／ｌのグルコースを加えた。トレース微量元
素溶液は下記の成分を含む。 この培地に０．３−１０％の接種材料培養物を接種し、
３０℃でインキュベートする。撹拌−通気は溶存酸素レ
ベルを２０％空気飽和以上に維持すべく調整する。ｐＨ
はＮＨ３で７±０．２に維持する。細胞濃度が約３．５
ｇ／ｌ（ＯＤ６６０＝１０）に達すると誘導が開始され
る。温度を４２℃に上げ、１−５時間４２℃に維持す
る。次いで培養物を冷却し、細胞を遠心分離により回収
することによって酵素精製用とする。ＳＯＤの回収 ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ブレンダー（キネマチ
カ）を用い、起泡を最小限に抑えるべく速度調整しなが
ら１．５ｋｇのバクテリア細胞（ウェットケーキ）を１
２１の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）に懸濁
させる。この均質懸濁液をダイノミル細胞破砕器（Ｄｙ
ｎｏｍｉｌｌ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）ＫＤ５
（ウイリー，エー。バシヨフエン，バーゼル（Ｗｉｌｌ
ｙ，Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂａｓｅｌ）に連続的に通
す。連続フローセル（エン，バーゼル（Ｗｉｌｌｙ，
Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂａｓｅｌ）に連続的に通す。
連続フローセル（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ｃ
ｅｌｌ）を使用して該破砕細胞均質懸濁液を超音波処理
し、ＣＥＰＡ１０１遠心分離器で分離処理する。上澄み
を２時間６５℃に加熱し、冷却後前述の如く遠心分離に
かける。１０，０００分子量カットオフカセット（ＰＴ
ＧＣタイプ）を用いるミリポア ペリコン（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置で前記の透
明な上澄みを１ｌまで濃縮する。この濃縮されたタンパ
ク質溶液を１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）で平衝化したＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌ）カラム（２ｋｇのＤＥＡＥセファセル）に通
す。通過溶液を回収し濃縮してペリコン限外慮過器によ
りｐＨ７．８の２０ｍＭトリス−ＨＣｌに対して透析
し、その後２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衝化した
ＱＡＥ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに
通す。このカラムをｐＨ７．８の２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液と塩グラジエント（０〜２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ）とで展開する。ＳＯＤ含有分画を集め、ペリコン限
外濾過装置を用いて濃縮し、蒸留水に対して透析し、そ
の後ｐＨ４．８の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液を加えて１
００ｍＭ酢酸ナトリウムにする。このタンパク質溶液を
ｐＨ４．７の１００ｍＭ酢酸ナトリウムで平衝化したＣ
Ｍ−セファローズカラムで更に分離処理する。同一の緩
衝液と塩グラジエント（１００〜５００ｍＭ ＮａＣ
ｌ）とを用いて前記カラムを展開する。ＳＯＤ含有分画
を集め、ペリコン限外濾過装置を用いて濃縮し、凍結乾
燥する。実施例２７ バクテリアにより産生されるＳＯＤの酵素活性 標準的成長条件（即ちＣｕＳＯ４を補足しない）では実
施例２６のバクテリアにより産生される精製ヒトＳＯＤ
（ｈＳＯＤ）はウシＣｕ／ＺｎＳＯＤと比べて５％の酵
素活性しか示さなかった。金属含量分析の結果、該酵素
はＣｕを予定値の８％に過ぎない極めて少量しか含まな
いことが判明した。更に、該タンパク質はＺｎを必要量
のほぼ２倍も含んでいることから、大部分のＣｕ＋＋部
位がＺｎイオンにより置換されているものと考えられ
る。これに対し、バクテリア産生ｈＳＯＤから製造され
る金属を全く含まないアポプロテインは溶液中で再構成
（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）すると本質的に完全な酵
素活性を回復する。この溶液はＣｕ＋＋及びＺｎ＋＋を
双方共モル活性部位当り１．２モルの濃度で含む（表Ｉ
Ｖ参照）。前述のデータは細胞内Ｃｕ＋＋濃度が限定さ
れており、産生されたｈＳＯＤを飽和するには不十分で
あることを示唆している。一連の実験から、成長培地の
Ｃｕ＋＋濃度を増加するとｈＳＯＤの比活性が増加する
ことが判明した。実際、２００ｐｐｍＣｕ＋＋を補足し
たカゼイン水解物（実施例２６）中で増殖した大腸菌は
誘導後天然金属組成と十分な酵素活性とをもつ極めて活
性の高いｈＳＯＤを産生した（表ＩＶ参照）。更に実験
を続けた結果、添加される外因性Ｃｕ＋＋が５０〜２５
０ｐｐｍであると同様の効果が得られることが判明し
た。７５ｐｐｍのＣｕ＋＋を補足したＬＢ（ルリアブロ
ス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ））培地でも同様の効果が
観察された。
【表４】 Ｃｕ＋＋及びＺｎ＋＋を補足しない培地を使用した。ｈ
ＳＯＤ２は実施例２６に従い製造。Ｃｕ＋＋及びＺｎ
＋＋を補足した培地を使用した。基準としてウシ血清ア
ルブミンを使用し、ロウリー（Ｌｏｗｒｙ）の方法によ
ってＳＯＤ濃度を測定した（ローリー，オー・エッチ
（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．），ローズブロー，エヌ・ジェ
ー（Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ．Ｊ．），ファー，エー
・エル（Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．）及びランドール，アール
・ジェー（Ｒａｎｄａｌｌ Ｒ．Ｊ．），生物学化学誌
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），１９３，２６５〜２７
５（１９５１年）参照）。フエリシトクロム−ｃの還元
阻止を検査すべく、マッコード（ＭｃＣｏｒｄ）及びフ
リドビッチ（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ）の方法で活性測定を
行なった（マッコード，Ｊ．Ｍ．及びフリドビッチ，
Ｉ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ誌，２４４，６０４９−６０
５５（１９６９年）参照）。原子吸収により精製ＳＯＤ
試料のＣｕ及びＺｎ含量を測定した。ウィーザー（Ｗｅ
ｓｅｒ）及びハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）に従ってＳ
ＯＤアポ酵素を製造し（ウィーザー，Ｕ．及びハートマ
ン，Ｈ．ｊ．，ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ．），１７，７８−８０（１９７１年）参照）、Ｃｕ
及びＺｎの同時添加によって再構成した（ジュウェッ
ト，エス・エル（Ｊｅｗｅｔｔ，Ｓ．Ｌ．），ラトレン
タ，ジー・エス（Ｌａｔｒｅｎｔａ，Ｇ．Ｓ．）及びベ
ック，シー・エム（Ｂｅｃｋ，Ｃ．Ｍ．），生化学生物
物理学誌（Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．）２１５，１１６−１２８（１９８２年）参照）。実施例２８ バクテリア産生ｈＳＯＤのアミノ末端配列 実施例２６に従い製造した精製ＳＯＤのアミノ末端の５
つのアミノ酸の配列をエドマンデグラデーション（Ｅｄ
ｍａｎｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）により検査した。
このアミノ酸配列はヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤのＮ末端と同
一、即ちＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌであ
る。これは該バクテリア産生物の真正を立証するもので
ある。従って可溶性ｈＳＯＤはＮ末端メチオニンを除去
する大腸菌処理酵素を受入れ易いと考えられる。論 考 我々は、ＬＢ又はカゼイン水解物培地で成長すると多量
のｈＳＯＤを産生すべく誘導されるバクテリアが酵素活
性をもたないタンパク質を産生することを確認した。こ
のようにして産生されたタンパク質は再構成と消失Ｃｕ
＋＋，Ｚｎ＋＋イオンの補足とによって活性化すること
ができる。意外なことに、このバクテリアはＣｕ＋＋を
補足した培地で成長させると酵素活性をもつｈＳＯＤを
産生すべく誘導され得る。理論として決めつけるつもり
はないが、我々は肥沃培地（例えばＬＢ及びカゼイン水
解物）の或る種の成分が有効銅の大部分と結合してキレ
ートを形成し、そのためバクテリアが高レベルで産生さ
れるＳＯＤ分子の全ての部位を満たす程十分な遊離銅を
持たないのだと考える。培地に５０〜２５０ｐｐｍのＣ
ｕ＋＋イオンを加えると、バクテリア内部のＣｕ＋＋イ
オン濃度は明らかに増加し、過剰産生されるヒトＣｕ／
ＺｎＳＯＤに必要な全てのＣｕ＋＋を提供するに十分な
レベルに到達する。実施例２９ 組換型ヒト超酸化物ジスムターゼによる全体的虚血後の
再灌流傷害の減少 実施例３の如く大腸菌Ａ１６４５内の宿主−ベクター系
ｐＳＯＤβ１Ｔ１１により産生し、実施例２６の条件下
で成長させ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは全
体的虚血後の再灌流傷害（損傷）を減少させることが判
明した。摘出し灌流したウサギ心臓 １．２〜２．０ｋｇの雌ニュージーランド白ウサギをヘ
パリン化し、麻酔をかけて心臓を取出し、低温（４℃）
灌流液中に即刻配置した。上行大動脈にカニューレを挿
入し、１１７ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化カリウ
ム、３．０ｍＭ塩化カルシウム、１．０ｍＭ硫酸マグネ
シウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１６．７ｍＭグルコ
ースを含み最終ｐＨが約２４ｍＭの炭酸水素ナトリウム
の添加により７．４０に調整された改質クレブス−リン
ガーズ（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ）緩衝溶液により
一定圧力（水１１０ｃｍ）下でこれら心臓の灌流を行な
った。前記灌流液には９５％の酸素及び５％の二酸化炭
素で連続的に気泡を与えた。真空吸引によりＮＭＲ試料
管から冠状流（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｆｌｏｗ）を除去し
た。飽和塩化カリウムに浸漬しポリエチレン管に入れて
グラス（Ｇｒａｓｓ）ＳＤ−９ステイミュレータに接続
したガーゼ（ｗｉｃｋ）を用い、右心室ペーシングによ
ってこれらの心臓に１７５指動／分のペースを与えた。
左心室収縮機能を定量すべく、空気泡を入念に除去し３
路ストップコックを介してステイサム（Ｓｔａｔｈａ
ｍ）Ｐ２３Ｄｂ変換器に接続した長さ１００ｃｍのＰＥ
１９０管の先端にラテックスラバーバルーンを取付け
た。等容量圧（ｉｓｏｖｏｌｕｍｉｃｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ）をブラッシュ（Ｂｒｕｓｈ）２チャネル直接書込み
レコーダにより記録した。前記バルーンは注入器により
１０ｍｍＨｇの末端拡張期圧を得るに足る十分な量の食
塩水を注入して膨満させた。発生圧力の以後の測定はこ
の末端拡張期圧で行った。全ての心臓を３０分間全体的
虚血状態におき、その間温灌流液を周囲に流すことによ
り３７℃に保持した。灌流線のクロスクランピングによ
り大動脈流入を完全に遮断した。前記虚血時間終了後４
５分間の正常温度再灌流（３７±２℃）を行なった。左
心室に発生する圧力の回復を虚血前対照のパーセンテー
ジとして計算した。虚血開始時にはバルーンを収縮させ
ペーサーを切断した。再流（ｒｅｆｌｏｗ）開始１５分
後、第１回目の機能測定直前にバルーンを虚血時に除去
した量と同量だけ再膨満させた。虚血の前と、再流後５
分の時点と、再灌流開始後１５分，３０分及び４５分の
時点とにおいて真空吸引により冠状血液流の体積測定を
行なった。核磁気共鳴法 内径の大きい超伝導磁石内で４．２３テルサ（Ｔｅｌｓ
ａ）でブラッカー（Ｂｒｕｃｈｅｒ）ＷＨ１８０スペク
トロメータによりリン−３１ＮＭＲスペクトルを得た。
この磁界強さでは前記リンは７２．８９ＭＨｚで共鳴す
る。リンプローブの直径は２５ｍｍである。この道具は
パルス状フーリエ変換モードで作動させ、ノコレット
（Ｎｏｃｏｌｅｔ）１２８０コンピュータとインタフェ
ース接続させた。データは高密度磁気ディスクに記録し
た。超伝導磁石の磁界は安定しているため磁界／周波数
ロックは不要である。２秒間隔で送出される４５°パル
スに続く過渡電流から５分間プロトン減結合スペクトル
（ｆｉｖｅ ｍｉｎｕｔｅｐｒｏｔｏｎ ｄｅｃｏｕｐ
ｌｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ）を集めた。これらはスペクト
ル飽和を最小にするための既に立証された条件である。
データは３，０００Ｈｚのスペクトル幅で２Ｋテーブル
を用いて保持した。ＮＭＲスペクトルに基づく組織細胞内ｐＨの測定 細胞内ｐＨの測定値は次の方程式 ｐＨ１＝ｐＫ−ｌｏｇ（δＯ−δＢ／δＡ−δＯ） により無機リン酸塩ピークの化学シフト（δＯ）から求
められる。組織異種効果（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｏｍｏ
ｇｅｎｅｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ）を最小限に抑えるべ
く、化学シフト値はこれらの研究で見られるｐＨ範囲内
では比較的低いｐＨ依存度を示すホスホクレアチンの共
鳴に関して測定した（ｐＫＡ＝４．６）。この方程式で
使用する定数は既に知られているようにｐＫ＝６．９
０，δＡ＝３．２９０ＰＰＭ及びδＢ＝５．８０５ＰＰ
Ｍである。ＮＭＲスペクトルに基づく代謝産物の定量 コンピュータで決定される標準化定数又は規準化ファク
タを考慮に入れて個々のピーク下の面積をプラニメータ
測定することにより組織のホスホクレアチン（ＰＣ
ｒ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び無機リン酸塩
（Ｐｉ）を測定した。面積積分の実施にはヒューレット
−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）デジ
タル化装置を使用した。このようにして得られるＰｃ
ｒ、ＡＴＰ及びＰｉの定量データは虚血前対照含量のパ
ーセントテージとして表わされる。 実験プロトコール １７個の心臓を次の２グループに分割した。 グループＩ （ｎ＝８）このグループの心臓は６０，０
００単位のヒト組換型超酸化物ジスムターゼ（ｈＳＯ
Ｄ，比活性３，２００ＩＵ／ｍｇ）を１０ｍｌの濃縮塊
（ｂｏｌｕｓ）として再流の直前に投与し、次いで再流
の最初の１５分間の間６０，０００単位を連続注入する
ことにより処理した。ｈＳＯＤは３７℃のクレブス−リ
ンガーズ重炭酸塩灌流液に溶解した。 グループＩＩ （ｎ＝９）このグループの心臓には再流
の直前に１０ｍｌの灌流液濃縮塊を投与し、次いで正常
温度再漕流を行なった。 結 果左心室機能の回復 この研究で使用した虚血実験モデルは中程度のひどさの
回復不能傷害を受け且つ治療によって改善する可能性を
保持するような心臓を得るべく一連の予備研究に基づい
て特別に選択したものである。４５分間の再流終了後の
左心室機能回復は（対照発生圧力のパーセンテージとし
て測定）対照グループの場合４７±５％であり、末端拡
張期圧は４８±７ｍｍＨｇであった（１０ｍｍＨｇの虚
血前対照値と比較）。これらのパラメータは３０分間及
び４５分間の再灌流の間に余り変化しなかった。これは
比較的安定した回復状態が得られたことを意味する。再
流直前と最初の１５分間の再灌流の間とにｈＳＯＤを投
与した結果、心臓機能保存状態が著しく改善され、対照
心臓と比較して末端拡張期圧の増加が減少した。ｈＳＯ
Ｄで処理した心臓は対照発生圧力の７１±６％を回復
し、末端拡張期圧は僅か２７±４ｍｍＨｇであった（い
ずれも対照に対し、Ｐ＜０．０１）。虚血の間及びこれに続く再灌流の間の心筋代謝 心筋の高エネルギーリン酸塩含量を対照心臓及びｈＳＯ
Ｄ処理心臓に関して虚血の間及びその後の再灌流の間に
順次測定した。３０分間の虚血期間では心筋クレアチン
ホスフエート及びＡＴＰ含量の漸減が観察された。ホス
ホクレアチン含量は虚血期間終了までに対照心臓では虚
血前基線量値の８±３％に減少し、ｈＳＯＤ処理心臓で
は対照の１０±５％に減少した。ＡＴＰ含量は対照心臓
では基線量の３６±６％に達し、ｈＳＯＤ処理心臓では
３３±６％に達した。これらのデータは２つのグループ
の心臓がいずれも同程度の虚血を受けたことを明示して
いる。これらのデータはまた、メカニズム制御されない
ものによって細胞代謝が虚血期間の間より良く保存され
るがために、ｈＳＯＤ受容心臓がより良い機能回復を示
したという可能性を否定する。４５分間の再流後にｈＳ
ＯＤ処理心臓がほぼ正常なホスホクレアチン含量（対照
の９３±９％）を示したのに対し、対照心臓は元の値の
６９±７％しか回復しなかった（Ｐ＜０．０５）。この
再流期間終了時のＡＴＰ含量はどちらのグループの心臓
でも同等であった（対照心臓では４１±４％、ｈＳＯＤ
処理心臓では４２±５％）。このＡＴＰ含量に関する結
果は、高エネルギーリン酸塩産生率を増加させる能力が
制限されている場合に心臓がより良い左心室機能回復を
得るにはより多くのエネルギーを必要とすることを示唆
していると考えられる。これに対し対照心臓のより低い
機能回復は高エネルギーリン酸塩代謝産物のより低い使
用度につながり、場合によってはエネルギー生産のより
厳しい制限さえ遮蔽し得る。結論としてこれらのデータ
は、中程度の虚血傷害を受け次いで再灌流処理される心
臓では、再灌流の前と初期とにｈＳＯＤを投与すると収
縮機能及び拡張機能がより良く回復し且つ心筋のホスホ
クレアチン含量が増加することを示している。これらの
データはまた、虚血心筋の再灌流の結果構造的及び／又
は機能的損傷成分が生じるが、この成分は再灌流時にｈ
ＳＯＤの如き酸素遊離基スカベンジャーを投与すれば除
去又は減少し得ることも示唆している。従って虚血心筋
の再酸素付加に起因する前記再流傷害成分を抑制するこ
とにより、ｈＳＯＤは急性心筋梗塞後早期に治療を受け
る患者の血栓融解療法及び／又は冠状血管形成に加えて
更に別の利益をもたらし得る。実施例３０ 再灌流中の組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ投与による
実験的梗塞サイズの縮小 実施例３に記載の大腸菌Ａ１６４５中のｐＳＯＤβ１Ｔ
１１宿主−ベクター系により産生され、実施例２６の条
件で成長及び精製したヒト超酸化物ジスムターゼは心臓
の梗塞サイズを縮小させることが判明した。虚血性心筋
の時を得た再灌流は梗塞サイズ（ＩＳ）を縮小せしめ
る。しかしながらこの有益な効果は、有害酸素遊離基の
発生により媒介される再流傷害の同時発生によって低減
し得る。組換型ヒト超酸化物ジスムターゼ（ｈＳＯＤ）
による遊離基の除去が再灌流のみの場合と比較してＩＳ
を縮小させる結果をもたらし得るか否かをテストすべ
く、１６匹のイヌに麻酔をかけ、どの辺縁枝よりも手前
で回旋冠動脈を９０分間閉塞した。再灌流時にこれら動
物にｈＳＯＤ（４００，０００単位を濃縮塊として左心
房投与し、次いで３００，０００単位を１時間静脈内注
入；ｎ＝８）又は同量の食塩水（対照，ｎ＝８）を投与
した。胸部を閉鎖して動物を回復させた。４８時間後に
これら犬を殺し、一般病理学によるＩＳの測定と死後血
管造影法による危険領域の測定とを行なうべく心臓を盲
検法（ｂｌｉｎｄｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）で処理した。
回旋動脈を中心に近い方で閉塞した結果、対照グループ
では左心室（ＬＶ）の４０．８＋２．３％、処理グルー
プでは４１．８＋２．０％が虚血状態になった。対照グ
ループのイヌでは再灌流に伴い危険領域５２．２＋７％
の梗塞が生じた。これに対しｈＳＯＤ処理は壊死を著し
く減少させ、ＩＳは危険領域が３３．６＋２．１％であ
った（Ｐ＜０．０５）。対照動物では危険領域の大部分
に亘って広がる壁を越えない（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｕ
ｒａｌ）融合性梗塞が発生したのに対し、処理動物では
より不統一（ｐａｔｃｈｙ）な非融合性梗塞が現われ
た。結論すれば、再灌流時に投与されるｈＳＯＤによる
遊離基除去は、恐らくは再流傷害の回避によって、壊死
の規模を著しく縮小させた。実施例３１ 低温保存虚血腎臓の再灌流傷害の媒介における酸素遊離
基の役割 １ 最近の指摘によれば、ヒト超酸化物ジスムターゼは臓器
移植後の再灌流傷害を減少させ得る。次の実施例は腎臓
移植後の再灌流に伴う障害が前記超酸化物ジスムターゼ
により改善されることを示す。この実施例で使用したヒ
ト超酸化物ジスムターゼは実施例３の大腸菌Ａ１６４５
中のｐＳＯＤβ１Ｔ１１宿主−ベクター系により産生さ
れ、実施例２６の条件で成長させ且つ精製したものであ
る。この実施例で括弧内に記されているアラビア数字は
該実施例の後の参考文献表に列挙されている文献を示
す。ブタにおける腎臓の保存及び移植虚血のモデル 体重１５〜１８ｋｇの異系交配雌ブタをアセプロマジン
及びアトロピンで薬剤前処理し、ケタミン及びハロタン
で麻酔した。１５００ｃｃのリンガー乳酸塩（Ｒｉｎｇ
ｅｒｓ′ｌａｃｔａｔｅ）、フロセミド（２０ｍｇ）及
びマンニトール（１２．５ｇ）の静脈内投与により、採
取３０分前にドナーのブタに利尿作用を与えた。ブタに
しばしば見られる腎臓血管痙攣を回避すべくフエノキシ
ベンザミン（５０ｍｇ）を静脈内投与した。正中線に沿
って腹部を切開し、末端大動脈及び大静脈を分岐の直ぐ
近傍まで可動化した。尿管を剥離し膀胱レベルで分割し
た。分岐の直ぐ上の大動脈に導入用カテーテルを配置
し、下方大静脈に導出カテーテルを配置した。ヘパリン
（５，０００単位）を静脈内投与し、腎臓動脈の直ぐ上
の大動脈のクロスクランピングと合致する末端大動脈を
介して４℃のユーロ−コリンズ（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉ
ｎｓ）溶液での連続的フラッシュ（ｆｌｕｓｈ）を開始
した。腎臓をその場で冷却した後一括して取出した。次
いで腎臓を分離し、一方を対照他方をテスト腎臓として
使用した。これは対による実験法を容易にするためであ
る。各腎臓を４℃のユーロ−コリンズ液で再度フラッシ
ュした。プロトコールにより必要とされる場合にはテス
ト物質をこの時点で第２腎臓の保存液に加えた。これら
腎臓は双方共無菌状態で包装し４℃で一晩保存した。２
４時間の低温虚血の後、新たなレシピエント動物に麻酔
をかけ、保存腎臓を腸骨管に移植した。各吻合に要した
時間は２５〜３０分であった。対照（未処理）腎臓を必
ず最初に移植し、テスト腎臓を次に移植した。従ってテ
スト腎臓の再灌流は常に対照腎臓の再灌流より合計１時
間遅れた。これは対照腎臓が低温虚血状態に２３時間お
かれたのに対し、テスト腎臓は２４時間おかれたことを
意味する。ＳＯＤアナログの動脈内投与を対照腎臓の再
灌流の１時間後に当たるテスト腎臓の再灌流時に開始し
た。従って対照腎臓はテスト腎臓に与えられる全ての物
質効果に曝される１時間前に再加熱及び再灌流の有害効
果に曝されたことになる。第２腎臓の再灌流に次いでレ
シピエントたるブタ自体の腎臓を除去した。臨床操作を
模倣して更に１０ｇのマンニトールを先ず対照腎臓の再
灌流前に投与し、次いでテスト腎臓の再灌流前に再び投
与した。これによって従来の最適保存／移植技術に加え
られる遊離基改変物質の効果を測定し得た。各腎臓から
の尿管は皮膚尿管瘻造設術として別個に取出した。移植
後２日間レシピエントを軽く麻酔して各腎臓（尿管造瘻
術）から別個に尿を１時間収集し、量とクレアチニン濃
度とを測定した。血清クレアチニンも測定した。これは
各腎臓毎にクレアアチニンクリアランスを計算するため
である。全ての結果は平均値±ＳＥＭで表わされる。ス
チューデントｔ−テスト（両側検定）の間にデータを分
析した。実験が対で行なわれるため、殆んどの場合に対
テストを適用し得た。 １ この実施例で使用した略号： ＣＣＲ クレスチニンクリアランス ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＡＤＰ アデノシンニリン酸 ＡＭＰ アデノシン一リン酸 実験プロトコール超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼ ４匹のブタのテスト腎臓にシグマウシ血液超酸化物ジス
ムターゼ、酸素遊離基スカベンジャーを投与した。再灌
流の直前に腎臓動脈に５ｍｇの濃縮塊を投与し、再灌流
開始後１５分間１ｍｇ／分で一定の動脈内注入を続け
た。その結果合計２０ｍｇのＳＯＤが与えられたことに
なる。４匹のブタからなる第２グループではＳＯＤに加
えてカタラーゼ（シグマ社）を同一投与量でテスト腎臓
に与えた。これら各ブタの他方の腎臓は処理せずに対照
として使用した。ＳＯＤに対する用量応答 最大の保護を得るための最小限の用量を決定すべく用量
応答関係（ｄｏｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｌａｔｉｏ
ｎｓｈｉｐ）を調べた。血管再分布（ｒｅｖａｓｃｕｌ
ａｒｉｚａｔｉｏｎ）時に一方の腎臓には２種類の用量
のうち少ない方のＳＯＤを注入し他方には多い方のＳＯ
Ｄを注入した。実施例９に従い製造したヒト組換型ＳＯ
Ｄを前述の如く投与した。各用量範囲内で２つの比較を
行なった。最初の比較では０．２ｍｇのＳＯＤを対照た
る食塩水と比較した。段階的に０．２ｍｇを２ｍｇと比
較し、２ｍｇを２０ｍｇと比較し、２０ｍｇを１００ｍ
ｇと比較した。いずれの場合も少ない方の用量を受容す
る腎臓を最初に移植した。これは第２移植時にＳＯＤの
循環が滞留し得るという問題を回避するためである。 結 果ウシＳＯＤ及びカタラーゼの効果 我々が使用した大きさのブタの単一正常腎臓のクレアチ
ニンクリアランスは、前述の麻酔及び水分補給（ｈｙｄ
ｒａｔｉｏｎ）条件下では２５．５＋６．３ｍｌ／分で
あった（ｎ＝８）。２０ｍｇのＳＯＤを再灌流の最初の
１５分間に亘って腎臓動脈内に投与すると低温虚血後の
腎機能減損が実質的に改善された。ＳＯＤのみで処理し
た４つの腎臓は平均クレアチニンクリアランスが２３．
２±４．５ｍｌ／分であった。これは対照腎臓（８．４
±１．７ｍｌ／分，ｐ＜０．０５）のほぼ３倍に当た
る。ＳＯＤ及びカタラーゼを組合わせて使用した場合に
も同程度の保護が得られ、それ以上の効果は見られなか
った（ＣＣＲ＝１９．０±４．５ｍｌ／分）。先に行な
った予備実験では４匹のブタからなる別のグループを４
０分を越える吻合時間をかけて移植処理した。ＳＯＤ及
びカタラーゼにより腎機能は著しく向上したが、これら
の動物では処理腎臓も対照腎臓も極めて低い機能を示し
た（ＣＣＲ＝４．８±０．８対１．６±０．４ｍｌ／
分）。それ自体再灌流に先立つ虚血に起因してより重大
な傷害を受けたと思われるこれらの腎臓では、遊離基の
危害を改変しても正常腎機能を回復することはできなか
った。ヒトＳＯＤアナログ用量応答関係 ヒトＳＯＤアナログ（０．２ｍｇ及び２ｍｇ）を注入し
ても対照と比較して腎機能には何らの改善も見られなか
った。しかしながら２０ｍｇのＳＯＤアナログを投与し
た腎臓の平均クレアチニンクリアランスは１４．２±
１．１ｍｌ／分であり、２ｍｇ注入した腎臓（７．７±
１．０ｍｌ／分，ｐ＜０．０５）を遥かに上回ってい
た。１００ｍｇのＳＯＤアナログを投与してもそれ以上
の効果は得られなかった（ＣＣＲ＝１６．１±１．２ｍ
ｌ／分）。従ってＳＯＤアナログの最小有効量はこのよ
うな方法で投与する場合には２ｍｇより多く２０ｍｇよ
り少ない量であることが判明した。ヒトＳＯＤアナログ
はウシＳＯＤと同程度の効力を示した。 論 考 使用処理法に起因する差異を最大限にし且つ特定ドナー
又はレシピエント動物に係る種々の変数に関する制御を
行なうべく対で実験する方式を用いた。この対方式では
結果の統計分析を対で行なうこともでき、従って少数の
比較的高価な実験動物の最適利用を可能にするものであ
った。これらの研究における重要な発見は遊離基媒介再
灌流傷害の除去によって得られる利益の大きさであっ
た。対照腎臓は健康なドナー腎臓及びレシピエント動
物、水分補給、αアドレナリン作用阻害、抗凝血並びに
利尿を含む従来の最適臓器保存法の利益を受けたにも拘
らず重大な機能障害を示し、クレアチニンクリアランス
のレベルが正常レベルの１／３以下に低下した。この２
４時間の虚血状態保持は、同様の臨床的状況下でしばし
ば見られるように従来の職器保存能力を越えるものであ
る。有効量のウシＳＯＤ又はヒトＳＯＤアナログで処理
するとこの障害が驚く程効果的に回避され、腎機能がほ
ぼ正常レベルに維持される。実際、このように処理した
腎臓で、移植後４８時間目に測定した時に、対をなすも
う一方の未処理対照腎臓の少なくとも２倍のクレアチニ
ンクリアランスを示さなかったものは１つもない。この
利益の大きさは従って４５〜６０分の温暖虚血後に見ら
れるものより量的に大きかった。これは、従来の最適保
存技術を用いると虚血自体に起因する障害は最小化さ
れ、再灌流時に発生する障害が優勢になることを示唆す
る。この解釈は更に、再灌流に先立ち１８時間保存して
おいた腎臓についての研究によっても裏付けられる。こ
れらの腎臓では対照グループ及び処理グループの双方共
優れた機能を示した。これは、再灌流時の遊離基発生に
適した条件を設定するだけの十分な代謝産物の蓄積に必
要な時間が未だ十分に経過していなかったことを意味す
る。一方、腎臓を吻合時間のより長い（即ち温暖虚血）
前記予備実験の場合のようにより重大な虚血状態におく
と、ＳＯＤを投与しても明らかな改善は見られたものの
機能を正常レベルまで回復させることはできなかった。
従ってこれらの腎臓はより短時間の温暖虚血（７，８，
９）後に調べたものにより類似していると言えよう。他
の器官と同様に、遊離基傷害除去の利益は主として、再
灌流に起因する傷害と比較した虚血自体に起因する傷害
の相対比に関連する。更にこの利益増加の達成は悉無律
的であると考えられる。ＳＯＤに関する用量応答検査
は、最大限の保護が得られるか又は保護が全く得られな
いかのいずれかを示した。カタラーゼはＳＯＤのみに加
えてもそれ以上の利益はもたらさなかった。この研究を
定量的に分析した限りでは、再灌流傷害防止は悉無律的
現象であったと思われる。しかしながら、この研究にお
ける諸発見事項は臨床的用途に特に適していると考えら
れる。ここで選択した２４時間の低温虚血は臨床状況で
必要とされる死体移植組織保存期間に十分該当する。更
にこれらの研究では、従来の最適保存及び移植法に対し
て遊離基による再灌流時傷害の除去の効果が立証され
た。これにはそれ自体効果的なヒドロキシル基スカベン
ジャーであるマンニトールの使用が含まれる。従ってこ
れらの研究は、遊離基除去を現在使用されている臨床的
方法に加えて用いれば同程度の効果が得られることを示
唆する。ＳＯＤは無毒化合物であるため、この方法は有
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ｅ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ
Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ Ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉａ
ｔｏ Ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌｌｙ
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ｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ Ｌｕｎｇ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔ
ｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｘｙｇｅｎ Ｆｒｅｅ−Ｒａｄｉ
ｃａｌ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）。移植処置（Ｔｒａｎ
ｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ）１７：１４５４（１９８５
年）。 ５．サンフェイ，エッチ（Ｓａｎｆｅｙ，Ｈ．），バル
クレー，ジー・ビー（Ｂｕｌｋｌｅｙ Ｇ．Ｂ．），カ
メロン，ジェー・エル（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ｊ．Ｌ．），
急性膵炎発病における酸素誘導遊離基の役割（Ｔｈｅ
Ｒｏｌｅ ｏｆＯｘｙｇｅｎ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｆｒｅ
ｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｔｈｅＰａｔｈｏｇｅｎ
ｅｓ ｉｓ ｏｆ Ａｃｕｔｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｔ
ｉｓ）。年刊サージュリー（Ａｎｎ Ｓｕｒｇ）２０
０：４０５（１９８４年） ６．ハンソン，アール（Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｒ．），ギュ
スターブソン，ビー（Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，Ｇ．），
ジョンソン，オー（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｏ．）他。虚血
後の腎循環に対するキサンチンオキシダーゼ抑制の効果
（Ｅｆｆｅｃｔｏｆ Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ Ｒｅｎａｌ Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ｉｓｃｈｅｍｉａ）。
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ー・エス（Ｎａｊａｒｉａｎ，Ｊ．Ｓ．），プラスマ又
はプラスマ代換物で灌流した虚血腎臓の保存におけるア
ロプリノールの効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆＡｌｌｏｐｕ
ｒｉｎｏｌ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ
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進行阻止された全体的虚血心臓を再灌流時に保護する
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９８３年）。実施例３２ 摘出ウサギ角膜の生存と遊離基スカベンジャー 実施例３の大腸菌Ａ１６４５中ｐＳＯＤβ１Ｔ１１宿主
ベクター系により産生し、実施例２６の条件下で成長さ
せ且つ精製したヒト超酸化物ジスムターゼは切除した摘
出（単離）角膜の生存期間を長くすることが判明した。
この実施例で括弧内に記されたアラビア数字は該実施例
の説明の後に列挙された参考文献を示す。ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏのウサギ角膜内皮ポンプに対する低濃度アデノシン
の有益な効果は種々の研究で既に立証されている
（１）。前記流体ポンプの作動は単離角膜に平衡食塩水
中生理濃度グルコース（５ｍＭ）及びアデノシン（１０
−６Ｍ）を灌流させることによって実現された。生存時
間は約７時間であった。我々の次の目標は生存時間の延
長であった。超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）（２）は
反応Ｏ２・−＋Ｏ２・−＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２を促
進することにより超酸化物遊離基を除去する。ＳＯＤ投
与は部分的酸素欠乏後の虚血組織の生存を著しく高める
ことが知られている（３）。虚血に起因するかなりの程
度の組織破壊は単離組織の再灌流及び再酸素付加の間に
生じる。この危害の大部分は超酸化物ラジカルとその一
族とによって媒介される。本研究の目的は超酸化物ジス
ムターゼ（ＳＯＤ）又はカタラーゼが単離角膜の生存期
間を延長させ得るか否かを調べることにある。体重２．
０〜３．０ｋｇのシロウサギから角膜を単離した。その
技術としては既に詳述されているものを使用した
（１）。要約すれば、眼を切除して角膜上皮を剥離し、
次いで角膜を記載の如く単離し、灌流処理した。 結 果 ５ｍＭグルコース及び１μアデノシンを含む基礎食塩水
にＳＯＤアナログを２μ／ｍｌで加えると単離角膜の生
存時間が７時間から１４時間まで延びた。アデノシンを
除外すると生存時間は１２時間までしか延長されなかっ
た。結論としては、ＳＯＤアナログは単離角膜の生存時
間の延長に有効であることが判明した。ＳＯＤアナログ
は他の単離（摘出）臓器の生存時間延長でも重要な役割
を果たし得る。ウシＳＯＤを用いて得た同様のデータが
エクスペリメンタルアイリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）４：１５３−１５
４（１９８５年）に発表されている。 参考文献 １．ニューワース，オー（Ｎｅｕｗｉｒｔｈ，Ｏ．）及
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テネリ，エム・エム（Ａｎｔｈｅｎｅｌｌｉ，Ｍ．
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及びフープス，ジェー・イー（Ｈｏｏｐｅｓ，Ｊ．
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る細胞侵入（Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ
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眼科学研究（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．）１
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Ｌｕｘ，Ｏ．）（１９８４年）ウサギ角膜内皮ポンプの
生存（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｃｏｒｎ
ｅａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｕｍｐ）。エルサ
レムヘブライ大学理事会（ｔｈｅ Ｓｅｎａｔｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ）に提出された博士論文。実施例３３ ｐ９２００の構築とｐ９２００を用いる大腸菌Ａ１６４
５及びＡ４２５５内でのｂＧＨの産生 ｐ９２００の構築は第２６図に示されており図面の説明
の項で説明されている。ｐＨＧ ４４をＣｌａ Ｉ及び
ＰｓｔＩで分割し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー
（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて「フィル イン（ｆｉｌ
ｌ ｉｎ）」し、次いで大きなＤＮＡ断片を単離した。
Ｅｃｏ ＲＩ及びＡｖａ ＩでｐＢＲ３２２を開裂し次
いでＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて「フ
ィルイン」することにより単離したｐＢＲ ３２２のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片に前記断片
を結びつけた。その結果得られたプラスミドｐ９２００
を受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ）ＡＴ
ＣＣ５３２１５としてＡＴＣＣに寄託した。プラスミド
ｐ９２００はｐＨＧ ４４（第６図）に類似している
が、このプラスミドはアンピシリン耐性ではなくテトラ
サイクリン耐性を付与する。プラスミドｐ９２００を普
通の知識をもつ当業者に公知の方法を用いる形質転換に
より大腸菌株Ａ１６４５及びＡ４２５５内に導入した。
これらの株は成長及び誘導時に、真正ｂＧＨのフェニル
アラニン形状のアミノ末端に加えられたアミノ酸配列ｍ
ｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎを有するウシ成長ホルモン（ｂＧ
Ｈ）のアナログを産生した。これらの株によって産生さ
れたｂＧＨアナログの量はｐＨＧ ４４により産生され
たものとほぼ同等であった。菌株Ａ１６４５／ｐ９２０
０（ｐ９２００で形質転換した宿主株Ａ１６４５）の成
長（増殖）、ｂＧＨアナログの回収及びｂＧＨアナログ
の精製に使用した方法は１００ｍｇ／ｌのアンピシリン
に代えて１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを加えた
以外はｐＨＧ ４４に関する実施例１３と同一である。
Ａ４３２０と称されてきた株Ａ４２５５／Ｐ９２００の
成長及び誘導に使用した方法は実施例３６に記載の方法
である。ｂＧＨアナログの精製に使用した方法は実施例
１３のｐＨＧ ４４の場合と同じである。菌株Ａ４３２
０（プラスミドｐ９２００で形質転換した宿主株Ａ４２
５５）を受託番号ＡＴＣＣ５３２１５としてＡＴＣＣに
寄託した。アンピシリン遺伝子をテトラサイクリン遺伝
子で代換すると、アンピシリンを産生プロセスから除外
し得、そのため重大なアレルギー反応の原因となり得る
最終産生物のアンピシリン汚染の可能性が回避されると
いう利点が得られる。実施例３４ ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔ ヒトＡｐｏ
Ｅアナログの産生 プラスミドｐＴＶＲは新規なアポリポタンパク質Ｅ３ア
ナログの発現を支配する。このアナログのＮ−末端配列
はｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔ であり、
この直後に成熟アポリポタンパク質Ｅ３の配列が存在す
る。ｐＴＶＲ２７９−８の組立（構築） ｐＴＶＲ２７９−８の組立は第２５図及び図面説明に示
されている。プラスミドｐＴＶＲ２７９−８は受託番号
５３２１６号でＡＴＣＣに寄託済である。プラスミドｐ
ＴＶ １９０（第２１図）をＡｖａ Ｉで部分消化し、
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片で「埋め戻し
（ｔｉｌｌ ｉｎ）」，連結してＥ．ｃｏｌｉを形質転
換させた。得られたプラスミドは３′Ａｖａ Ｉ部位が
除去されておりこれをｐＴＶ ２６４−４５と命名し
た。ｐＴＶ ２６４−４５をＮｄｅ Ｉで完全に消化し
以下の合成オリゴヌクレオチドに結合（連結）した。
【化１７】 得られたプラスミドをｐＴＶＲ２７９−８と命名し、当
業者に公知の方法でＥ．ｃｏｌｉ．Ａ１６４５を形質転
換した。このプラスミドを含む細胞を、３２Ｐ−標識オ
リゴヌクレオチドＮｏ．１２１８をプローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーションによって同定した。ＤＮＡ
配列決定によって間違いなくこのプラスミドであること
が確認された。ｐＡｐｏＥＥ２を含むＡ１６４５株は受
託番号３９７８７号でＡＴＣＣに寄託済である。ｐＴＶ
Ｒ２７９−８は増殖及び誘発によって天然アポリポタン
パク質Ｅ３のＮ−末端に付加アミノ酸配列ｍｅｔ−ｌｅ
ｕ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｍｅｔをもつヒトアポリポタンパ
ク質Ｅ３のアナログを産生する。菌株の増殖に使用され
る方法は、実施例１７に記載のｐＴＶ−１７０の増殖方
法に等しいが、但し４２℃での誘発期間が１５分でなく
１〜５時間である。ｐＴＶＲ２７９−８が産生するＡｐ
ｏ Ｅ３アナログはｐＴＶ １７０及びｐＴＶ １９０
によって産生されたｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ３アナログより
も細菌に対する毒性が小さい。ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｌｅｕ
−ｌｅｕ−ｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ３アナログは４２℃での
誘発後６０分を経過したときも細胞内に蓄積し続けて、
培養物１ｌ当り４００〜６００ｍｇのレベルに到達す
る。実施例３５ ヒト成長ホルモンアナログの産生ｐＴＶ ３００の組立 ｐＴＶ ３００の組立については第２７図及び図面説明
に示した。プラスミドｐＴＶ １８（１）に由来のｈＧ
Ｈ遺伝子をｐ５７９（第１９図）のＮｄｅ Ｉ部位に挿
入してプラスミドｐＴＶ ３００を構築した。ｐＴＶ
１８（１）の組立は、１９８５年１月２３日付の欧州特
許公開第０１３１８４３Ａ１号及び対応する１９８３年
７月１５日付の米国特許出願第５１４１８８号に開示さ
れている。引用した特許出願は本明細書に含まれるもの
とする。ｈＧＨアナログの合成 当業者に公知の方法を用いｐＴＶ ３００をＥ．ｃｏｌ
ｉＡ１６４５菌株に形質転換によって導入した。この菌
株は増殖及び誘発によって天然成長ホルモンの最初の１
３個のアミノ酸が欠失したヒト成長ホルモンアナログを
産生した。菌株の増殖とｈＧＨアナログの精製とのため
に実施例１３と等しい方法を使用した。実施例３６ 原栄養菌株の組立及び原栄養宿主を用いたｂＧＨの産生 最小培地で増殖させた場合であっても多くの前記プラス
ミドによって高レベルにタンパク質を発現し得るＥ．ｃ
ｏｌｉの原栄養株を構築した。最小培地を使用する細菌
増殖プロトコールの利点は、（ａ）細菌を高い細胞密度
に増殖できること、（ｂ）培地成分が「より簡単であ
り」従って高品質なので増殖条件を再現し易いこと、及
び、（ｃ）培地がより安価なことである。本発明の好ま
しい原栄養株はＡ４２００，Ａ４２５５及びＡ４３４６
と命名されている。プラスミドｐ９２００を含む菌株Ａ
４２５５は受託番号５３２１５号でＡＴＣＣに寄託済で
ある。これをＡ４３２０と指称する。原栄養株の選択及び組立 最小培地での増殖率とファージλ，λ４３４及びファー
ジＰ１に対する感受性とに基いて以下の菌株をスクリー
ニングした。 テストの結果より、上記ファージに感受性で増殖率が最
も高い菌株ＡＴＣＣ１２４３５とＡＴＣＣ２５４０４と
に基いた原栄養株を主として開発することに決定した。
これらの２種の菌株を使用し、λｃＩ８５７ΔＨＩΔＢ
ａｍ ＨＩ：Ｔｎ１０を含むＰ１を形質導入してλｃＩ
８５７リプレッサーを含有する新しい菌株を構築した。
テトラサイクリン耐性コロニーを精製し、必要な場合は
Ｐ１を除去した。得られた菌株とその遺伝子型とを以下
に示す。 Ａ４２００＝ＡＴＣＣ１２４３９（λｃＩ８５２ΔＨＩ
ΔＢａｍ ＨＩ）：Ｔｎ１０ Ａ４２０６＝ＡＴＣＣ２５４０４（λｃＩ８５７ΔＨＩ
ΔＢａｍ ＨＩ）：Ｔｎ１０ 双方の菌株をｐＨＧ ４４で形質転換して菌株Ａ４２０
２及びＡ４２０７を夫々得た。増殖及び誘発 以下の条件で菌株Ａ４２０２とＡ４２０７とを増殖及び
誘発させ、ウシ成長ホルモンアナログの産生をアッセイ
した。 Ａ４２０２とＡ４２０７との双方共が最小培地で十分に
増殖する。しかし乍らＡ４２０２だけが有意レベルのｂ
ＧＨアナログを発現する。Ａ４２０２は、実施例１３に
記載の濃厚培地（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ）で増殖した
ｐＨＧ ４４とほぼ同じレベルでｂＧＨ アナログを発
現する。Ａ４２００からのテトラサイクリン耐性の除去 テトラサイクリン耐性マーカーのみを含むプラスミドで
原栄養株Ａ４２００を利用するために、Ｔｎ１０マーカ
ーを除去した菌株を構築した。Ａ４２００株をマッコン
キー（ＭａｃＣｏｎｋｙ）ガラクトースプレートに画線
し、ｇａｌ＋復帰細胞を選択しテトラサイクリン感受性
とλファージに対する免疫性とをテストした。この菌株
をＡ４２５５と命名した。ビオチン独立性（非依存性）原栄養株の組立 前記原栄養株は全てλｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａｍ ＨＩ
欠損プロファージを含む。ΔＨＩ欠失はｂｉｏ ｕｖｒ
Ｂ領域に及び、ビチオン生合成オペロンが除去されて
いる。従って、菌株の増殖培地にビオチンを加える必要
がある。Ａ４２００及びＡ４２５５由来の菌株のビオチ
ン要求を除去するために、これら菌株にＡ８９株のＦ′
エピソームを導入した。Ａ８９株はＦ′ｇａｌ プラス
ミドを含んでいる。このＦ′プラスミドがビオチンの内
因合成に必要な全ての遺伝子を含むことが判明した。こ
のプラスミドはｂｉｏ オペロンの好適ソースとなり得
る特性をいくつか備えている。 １．Ｆ′ｇａｌ はユニットコピー（ｕｎｉｔ ｃｏｐ
ｙ）プラスミドである； ２．このプラスミドはＥ． ｃｏｌｉ中で極めて安定で
ある； ３．Ｆ′プラスミドは、出願人等の発現ベクターのベー
スとなるｃｏｌ Ｅ１プラスミドと適合性である； ４．Ｆ′ｇａｌは接合性プラスミドである。従って細胞
間を容易に移動し得る； ５．ビオチン独立性菌株のスクリーニングが容易であ
る。 Ａ４２０２株をＡ８９と３０分間接合し、ビオチン独立
性コロニーを選択した。得られたＡ４３４６株を、ビオ
チンを含まない最小グルコース培地で誘発させると高レ
ベルのウシ成長ホルモンアナログが産生した。他の増殖
因子は不要である。当業者に公知の標準方法でＡ４３４
６からｐＨＧ ４４を除去し得る。得られた原栄養宿主
菌株は、本出願に記載の全てのプラスミドによって形質
転換され得る。最小培地 原栄養株による産生のために以下の最小培地を標準的に
使用した。 菌株がアンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性のい
ずれであるかに従ってアンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）
又はテトラサイクリン（１２．５ｍｇ／ｌ）を培地に添
加し得る。別に５０％グルコースをオートクレーブ処理
し２０ｇｍ／ｌまで加えた。発酵中に５０％グルコース
を、Ｆ′エピソームを含まない菌株に対してはＯ．Ｄ．
単位当りグルコース１．０８ｇｍの割合で加え、Ａ４３
４６株に対してはＯ．Ｄ．単位当りグルコース１．８ｇ
ｍの割合で加えた。２５％ＮＨ４を送ってｐＨを調節し
た。必要に応じて消泡剤を加えた。Ａ４２００，Ａ４２
５５及びＡ４２０６をベースとする菌株にビオチンを１
５ｍｇ／ｌの割合で添加した。溶液は以下の微量元素を
含有するバイオテクノロジカル・バイオエンジニアリン
グ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）１６：９
３３−９４１（１９７４）： かっこ内の化合物は、かっこの前の化合物の代りに使用
し得る代替化合物である。かっこ内の数値はこの代替化
合物の量である。前出のプラスミドの多くを、原栄養株
Ａ４２００とＡ４２５５とに導入した。これら菌株の一
部のリストを次表に示す。 実施例３７ 溶菌宿主の組立及びこれら溶菌宿主を使用するｂＧＨ
の産生 １．菌株Ａ４０４８及びＡ３１１１の組立 λファージの増殖には多くの場合Ｗ３３５０株が使用さ
れている（例えばオッペンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉ
ｍ）及びサロモン（Ｓａｌｏｍｏｎ）（１９７０），４
１ヴィロロジイ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），１５１−１５９
参照）。Ｗ３３５０の原栄養誘導体たるＡ２５０９株に
Ａ１６３７で増殖したＰｌｃＩｔｓを形質導入し、ま
た、Ｔｎ１０マーカーを含むλｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａ
ｍ ＨＩ欠損プロファージを形質導入した。得られたＡ
４０４８菌株を、欠損プロファージλｃＩ８５７ΔＨＩ
ΔＢａｍ ＨＩを含むテトラサイクリン耐性クローンと
して選択した。この菌株はまたＰｌｃＩｔｓプラスミド
を含んでいた。この菌株をｐＨＧ ４４で形質転換して
Ａ３１１１株を作成した。同様にして、同じくＡ２５０
９株を用いこの菌株にλｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａｍ Ｈ
を挿入しｐＨＧ ４４で形質転換する前にＴｎ１０トラ
ンスポゾンを除去し且つＰｌｃＩｔｓプラスミドを除去
してＡ４０８５株を構築した。Ａ４０８５株は欠損プロ
ファージλｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａｍ Ｈを含んでお
り、ＰＩプラスミドを存在させずに行なわれるｂＧＨ産
生と自己溶菌とを測定するためのコントロールとして作
用する。Ａ３１１１株は受託番号５３２１７号でＡＴＣ
Ｃに寄託されている。 ２．ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の合成 保存培養物 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）
を含むＬＢ培地でＡ３１１１株（Ａ４０４８細胞中のｐ
ＨＧ ４４）の保存培養物を３０℃で一晩増殖した。培
養物を５０％グリセロールで２倍に希釈し−２０℃で保
存した。接種物 接種物は１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ を含むＬ
Ｂ寒天プレートで増殖したＡ３１１１の単一コロニーか
ら得られた。次に、保存培養物から採取した材料をＬＢ
プレートに塗抹した。５０μｇ／ｍｌのＡｍＰを含む３
ｍｌの無菌ＬＢ培地にＡ３１１１の単一コロニーを接種
し３０℃の振盪浴で１８時間増殖させた。産生 ５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐ を含むＢＨＩ 培地（脳心インフュ
ージョン培地（Ｄｉｆｃｏ），３７μｇ／ｌ）でｂＧＨ
を産生した。新鮮ＢＨＩ＋５０μｇ／ｍｌのＡｍｐ
を収容したフラスコで接種物を１００倍に希釈し、細胞
濃度が約４×１０８細胞／ｍｌ（ＯＤ６００＝０．５）
になるまで３０℃の振盪浴で増殖させた。ｂＧＨ 産生
を誘発するために、フラスコを４２℃に調温した振盪浴
に移した。誘発開始後０分と９０分との時点で細胞サン
プルを採取した。ｂＧＨ産生の分析 １０〜２６％の濃度勾配のアクリル
アミドゲルでｂＧＨ産生を分析した。細胞サンプルをマ
イクロ遠心機で回転させ上清を除去してペレットをサン
プルバッファ（２％ＳＤＳ，５０ｍＭトリスｐＨ７．
０，３％ショ糖、５％β−メルカプトエタノール）に溶
解し、ゲルにロードした。２００ボルトで２−１／２時
間電気泳動にかけ、ゲルをクーマシーブルー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｅｉｂｌｕｅ）で染色し、ゲルスキャナーで走査
してｂＧＨ の量を測定した。４２０℃での誘発の９０
分後にｂＧＨ はＡ３１１１の総タンパクの約２０％を
含む。 ３．自己溶菌 Ａ３１１１株は、ｐＨＧ ４４と欠損プロファージλｃ
Ｉ８５７ΔＨＩΔＢａｍ ＨＩと安定なＰｌｃＩｔｓプ
ラスミドとを含む。４２℃で長時間誘発すると、Ｐ１に
よって支配されるエンドリシンの産生によって細胞の溶
解が始まる。２．５〜３時間後に培養物が完全に溶解す
る。調節自己溶解テスト ４２℃で（９０分間）の誘発の以
前及び以後に５ｍｌのＡ３１１１培養物を採取し、ソー
バル（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心機に入れ７０００ｒｐｍで
７分間回転させた。上清を除去しペレットを−２０℃で
一晩冷凍した。次にペレットを０．５ｍｌのＴ．Ｅ．バ
ッファ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤ
ＴＡ）に再懸濁させ、０．１ｍｌをＴ．Ｅ．で１０倍に
希釈し、ＯＤ６００を測定した。この実験のコントロー
ルとして、Ａ３１１１と同様にｐＨＧ ４４と欠損プロ
ファージλｃＩ８５７ΔＨＩΔＢａｍ ＨＩを含むがＰ
ｌｃＩｔｓプラスミドを含まないＡ４０８５株を使用し
た。この実験の結果を表Ｖに示す。この表の結果より、
ＰｌｃＩｔｓプラスミドを含む細胞（Ａ３１１１）が解
凍直後に溶解することが判明した。解凍混合物の検査に
より、この処理後に細胞の９５％以上が溶解することも
判明した。
【表５】 この溶菌手順を用いると、ｂＧＨ産生を妨害すること無
く誘発細胞からｂＧＨを簡単に抽出できる。実施例３８ Ｍｅｔ−Ａｐｏ Ｅ３アナログの生物学的活性 実施例１７の方法で細菌ｐＴＶ １９４を増殖させた。
かっこ内の数字は実施例末尾に列記した参考文献の参照
番号を示す。細菌抽出物の分析 細菌細胞を遠心採取し、５ｍＭのＥＤＴＡと２ｍＭのフ
ェニルメチルスルホニルフルオリドとを含む５０ｍＭの
リン酸カリウムバッファ、ｐＨ７．５に懸濁させた。分
取サンプルを１．５倍量のバッファ（１５％グリセロー
ル、４．５％ＮａＤｏｄＳＯ４，１ｍＭのβ−メルカプ
トエタノール、９３．５ｍＭのトリス、ＨＣｌ，０．２
５％のブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）に溶解
し、１００℃で１０分間加熱し、１０％ＮａＤｏｄＳＯ
４ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分析した（２
６）。ポリアクリルアミドゲルで分離したタンパク質を
クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色するか、又
は、ニトロセルロールシートに電気泳動させ（２７）
１２５Ｉ標識抗ヒトＡｐｏＥモノクローナル又はポリク
ローナルＩｇＧ と反応させた。免疫ブロットを洗い、
風乾しＸ線フイルムに露光した。Ａｐｏ Ｅの単離 従来技術のセフアクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３
００カラムクロマトグラフィー（１４）を用い、高トリ
グリセライド血症患者のｄ＜１．０２血漿リポタンパク
質（Ｅ３／３表現型）から真正Ａｐｏ Ｅを単離した。
プレパラティブインモビリン等電点電気泳動法（ｐｒｅ
ｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ｉｓｏｅｌ
ｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（エル・ケー・ビー
・インストルメンツＬＫＢ Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ，ブ
ロンマ（Ｂｒｏｍｍａ），スエーデン，ｐＨ４．９〜
５．９）（２８）を用いＥ３のアイソフォーム（ｉｓｏ
ｆｏｒｍ）を得た。Ａｐｏ Ｅアナログを３３ｇの凍結
乾燥細胞から単離した。後者は５１発酵で得られる細胞
量である。（４℃に）冷した乳鉢と乳棒とを用い２２ｇ
のアルミナ（ベーラー・リミテッド（Ｂｕｅｈｌｅｒ
Ｌｔｄ．），エバンストン市、イリノイ州）によって細
胞を微粉に粉砕した。０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３と２ｍ
ＭのＰＭＳＦと０．１％トラシロール（モベー・ケミカ
ル・コーポレーション（Ｍｏｂａｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｒｐ．），ニューヨーク市、ニューヨーク州）と
を含む（脱イオン直後の）６Ｍの尿素（ｐＨ７．８）３
００ｍｌで粉砕細胞を抽出した。不溶細胞残渣をベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ２８ロータ内で（２５，０
００ｒｐｍで５０分間）４℃で超遠心して沈降させ、２
００ｍｌの６Ｍ尿素バッファで再抽出した。上清画分を
合せて透析した。透析には、２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３
と２ｍＭのＰＭＳＦと２ｍＭのＥＤＴＡと０．１％のト
ラシロールと０．１％のβ−メルカプトエタノールとを
含む２Ｍ尿素（ｐＨ７．４）を３回交換して用いた。透
析後、抽出上清に〜２００ｍｌのヘパリン−セファロー
スを加えた。後者は従来通りに（２９）調製し、２Ｍ尿
素バッファで平衡させておく。ゲルと上清との混合物を
回転台に載せ４℃で一晩インキュベートし、次にガラス
カラム（４．０×３．５ｃｍ、コンテス・ガラス（Ｋｏ
ｎｔｅｓ Ｇｌａｓｓ）、ヴアインランド（Ｖｉｎｅ
ｌａｎｄ）、ニュー・ジャーシ（ＮＪ））に充填した。
〜３００ｍｌの２Ｍ尿素バッファを２５ｍｌ／時の速度
でカラムに流してヘパリン−セファロースに結合しなか
った物質をカラムから洗い流した。次に、２Ｍ尿素に入
れた５０ｍｌの１．０Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３で結合した物
質をカラムから溶出し、５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に透析
して凍結乾燥した。この半精製Ａｐｏ Ｅを０．１Ｍの
トリスＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡと１．０％のβ−メル
カプトエタノールとを含む１５ｍｌの６Ｍグアニジン
（ｐＨ７．４）に可溶化し、セファクリルＳ−３００
（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ウプサラ（Ｕ
ｐｐｓａｌａ），スエーデン（Ｓｗｅｄｅｎ））カラム
（２．５×３００ｃｍ）にかけ、４Ｍのグアニジンと
０．１Ｍのトリス．ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡと０．１
％のβ−メルカプトエタノールと（ｐＨ７．４）によっ
て平衡させた。Ａｐｏ Ｅを含む画分をプールし、５ｍ
ＭのＮＨ４ＨＣＯ３に完全に透析して凍結乾燥した。固
定ゲル上の分取形等電点電気泳動法（２８）を用いて最
終精製を終了した。Ａｐｏ Ｅアナログの構造的特性決定 アミノ酸解析用のタンパク質又はペプチドサンプルを密
封減圧管内で１１０℃の６Ｎ ＨＣｌ中で２０時間加水
分解した。標準的１２６データシステムを備えたベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１２１ＭＢアナライザーで分析
を実施した。セフアクリルＳ−３００カラムで精製した
３ｍｇのＡｐｏ Ｅを６００μｌの７０％ＨＣＯＯＨに
入れた９０ｍｇのＣＮＢｒにより室温で３０時間消化し
てアミノ酸及びその配列を解析するためのペプチドを得
た。得られたペプチドを前述の真正ＡｐｏＥと同様に
（４）セフアデックスＧ−５０カラムで分離した。最新
型ベックマン８９０Ｃシーケンサ（Ｂｅｃｋｍａｎ８９
０Ｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用い標準０．１Ｍカドロ
ール（Ｑｕａｄｒｏｌ）プログラムで配列解析を実施し
た。３ｍｇのポリブレンと０．５％のＮａＤｏｄＳＯ４
との存在中で完全形タンパク質を分解し、ポリブレンの
みを存在させてペプチドを分解した。従来の高性能液体
クロマトグラフィー（１４）を用いてフェニルチオヒダ
ントインアミノ酸の同定及び定量を実施した。 分析用
等電点電気泳動法とＮａＤｏｄＳＯ４ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法（１４）とを実施した。システアミン
（β−メルカプトエタノールアミン）による電荷修正を
行なった（１４）。Ａｐｏ Ｅアナログの生物学的特性決定 Ａｐｏ Ｅアナログとジミリストイルホスファチジルコ
リン（ＤＭＰＣ）とのリン脂質複合体を従来通りに調製
し単離した（１４）。従来の線維芽細胞（３１）及び肝
膜（３２）の場合に準じてリポタンパク質レセプター結
合アッセイを実施した。ヨード−ビーズ（Ｉｏｄｅ−Ｂ
ｅａｄｓ）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を製造業者の指
示通りに用い０．１０ＭのＮＨ４ＨＣＯ３中でＡｐｏＥ
をヨウ素化した。ウサギ及びラットのインビボテストの
ためにヨウ素化した真正ＡｐｏＥとＡｐｏＥアナログ
（各９０μｇ）とを１ｍｌのウサギ又はラットの血漿と
共に室温で３０分間インキュベートし、ニュージーラン
ド白ウサギの雄に注射した。従来の沈殿（３３）を使用
し血漿放射能によってＴＣＡ沈殿可能タンパク質を測定
する。血漿量を体重の４．５％と仮定し、種々の経過時
間での注射物質の血漿中残存パーセントを計算する。結果及びその考察 ヒトＡｐｏ Ｅの発現 ｐＴＶ １９４でトランスフエクトした細胞の誘発によ
り、ＡｐｏＥに等しい見掛け分子量をもつタンパク質が
特異的に誘発された。この誘発タンパク質は抗ヒトＡｐ
ｏＥ抗体と反応した（図示せず）。誘発期間が３０分以
上の場合細胞溶解が観察された（第２８図）。この細胞
溶解はＡｐｏＥの細胞内蓄積と関係がある。３０℃に維
持された非誘発細胞は安定であった（第２８図）。この
ような崩壊性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）細胞溶解はこの発現
ベクターの一般的特徴ではない。何故ならヒト成長ホル
モンｃＤＮＡを含むとき同じ発現系が同じ結果を生じな
いからである。細胞溶解後のタンパク分解によってＡｐ
ｏＥは破壊された。ＡｐｏＥ蓄積によって生じる毒性の
問題を解決するために、細胞の誘発を短時間にし（〜２
０分）次に発酵槽に氷を加えて細胞を冷却した。固相ラ
ジオイムノアッセイで定量すると短時間誘発細胞中のＡ
ｐｏ Ｅレベルは可溶細胞タンパクの約１％であった。
Ａｐｏ Ｅを単離し、ヘパリンセファロースとセファク
リルＳ−３００クロマトグラフィーとによって細胞抽出
物から精製した。この２段階プロセスで９０％より高純
度のＡｐｏ Ｅ調製物が細胞抽出物中のＡｐｏ Ｅ存在
量の約２０％に相当する収率で得られた。特性決定する
ための最終精製には分取型インモビリン等電点電気泳動
を用いた。これらのテストで用いた精製手順は総回収率
を最も良くするように設計されたものでなく特性決定の
ための純粋物質が得られるように設計されたものであ
る。Ａｐｏ Ｅアナログの構造的特性決定 インモビリン精製Ａｐｏ ＥアナログはＳＤＳゲル上で
真正Ａｐｏ Ｅに等しい見掛けＭｒをもつ単一バンドと
して泳動した。生物工学的（ｂｉｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｅｄ）Ａｐｏ Ｅは等電点電気泳動にかけるとインモビ
リン精製ＡｐｏＥ３と等しいｐＩをもつ１つの主要バン
ドとして集束した。１つのシステイン残基の存在に対応
してＡｐｏ Ｅアナログはシステアミン修飾後にアノー
ド側に１電荷ユニットだけシフトした。イモビリン精製
産物のアミノ酸解析を同じ方法で精製した真正ヒトＡｐ
ｏ Ｅ３に比較した。表ＶＩに示す如くＡｐｏ Ｅアナ
ログと真正Ａｐｏ Ｅとの分析結果は互いにほぼ等しく
ヒトＡｐｏ Ｅの従来の配列解析から得られた理論組成
にもほぼ等しい。しかし乍らこの分析結果は、Ａｐｏ
Ｅアナログが真正Ａｐｏ Ｅに比較して付加的なメチオ
ニン残基を含むことを示唆している。更に、システアミ
ン処理によって示唆された１つのシステイン残基の存在
も確認された。完全形Ａｐｏ Ｅアナログ（約６ナノモ
ル）の配列解析の結果、付加メチオニン残基がタンパク
質のＮＨ２末端に存在し、単鎖配列
【化１８】 を形成することが判明した。メチオニン以後の配列はヒ
トＡｐｏ Ｅの残基１−１７に対応する。これらの結果
より、Ａｐｏ ＥのＮＨ２末端をコードする部分を再構
築する合成オリゴヌクレオチドが正しく翻訳されたこと
及び（細菌による翻訳開始コドンとして付加された）付
加的メチオニンがプロセシングメカニズムによって除去
されなかったことが判明した。配列解析に於いて初期収
率は予想外に低かったが（約２０％）、その理由は恐ら
く、ＮＨ２−末端メチオニンの一部分がホルミル化され
たためでなく、ホルミル化タンパク質が非ホルミル化ポ
リペプチド（及び真正Ａｐｏ Ｅ）とは明らかに異なる
ｐＩを有しこれが観察されなかったためであろう。いく
つかのＣＮＢｒペプチドをそれらのアミノ酸組成に関し
て特性決定し、（図示しないが）真正Ａｐｏ Ｅとの間
に違いはないことを知見した。更にＣＢ４（真正Ａｐｏ
Ｅの残基１０９−１２５）の配列解析とＣＢ５の（Ａ
ｐｏ Ｅの１６４位に対応する残基までの）部分配列解
析とによって、Ａｐｏ Ｅアナログが重要なレセプター
結合領域に於いては真正Ａｐｏ Ｅ３と等しい配列を有
することを確認した。これらのデータは全て、ＮＨ２末
端の付加メチオニンを除くとＡｐｏ ＥアナログがＡｐ
ｏ Ｅ３と等しい構造を有することを示す。Ａｐｏ Ｅアナログのインビトロ及びインビボ代謝の特
性決定 Ａｐｏ Ｅ．ＤＭＰＣ複合体のレセプター結合の比較に
より、Ａｐｏ Ｅアナログが真正Ａｐｏ Ｅと本質的に
等しい結合特性を有することが判明した。培養線維芽細
胞上でのＡｐｏＢ，Ｅ（ＬＤＬ）レセプターの結合を測
定をするために１２５Ｉ−ＬＤＬを用いた競合テストを
行なうと、５０％置換濃度はＡｐｏ Ｅアナログで０．
０１９μｇ／ｍｌ、真正Ａｐｏ Ｅで０．０２４μｇ／
ｍｌであった（第２９図）。線維芽細胞への直接結合テ
ストでは、双方のＡｐｏ Ｅ調製物が同様に結合した
（第２９図）。直接結合データのスキャッチャード（Ｓ
ｃａｔｃｈａｒｄ）分析によれば、生物工学Ａｐｏ Ｅ
と真正Ａｐｏ Ｅとの夫々に対するＫｄｓ及び最大結合
量は各々０．９３及び０．９６×１０−１０Ｍ、並び
に、２９．４及び３４．２μｇ／ｍｇ細胞タンパク質で
あった。更に、双方のＡｐｏ Ｅ調製物はイヌ肝膜上の
Ａｐｏ Ｅレセプターにも同様に効率良く結合した（第
３０図）。Ａｐｏ Ｅアナログと真正Ａｐｏ Ｅとのイ
ンビボ代謝特性とを比較すると、双方の調製物が同様の
挙動を示すことが判明した。１３１Ｉ標識Ａｐｏ Ｅア
ナログと１２５Ｉ標識真正Ａｐｏ Ｅとを混合し正常ウ
サギ血漿と共にインキュベートし次に混合物を正常ウサ
ギに注射すると双方のラベルは等しい反応速度論に従っ
て血液から除去された（第３１図）。注射後約２０分で
双方のラベルの注射量の５０％が除去された。ラベルを
互いに交換して標識したタンパク質に関しても等しい結
果が得られた。またラットを用いたターンオーバーテス
トでも等しい結果が得られた（図示せず）。従って、イ
ンビトロ及びインビボのテストの双方に於いて生物工学
Ａｐｏ Ｅと真正Ａｐｏ Ｅとは同様の特性を示し、本
質的に同様に作用する。要約すれば、単離Ａｐｏ Ｅア
ナログの構造的特性決定の結果、Ａｐｏ Ｅアナログは
アミノ末端の付加メチオニン残基を除いて真正Ａｐｏ
Ｅに等しい構造を有することが判明した。更にインビト
ロ及びインビボの双方に於いてＡｐｏＥアナログと真正
Ａｐｏ Ｅとは等しい代謝特性を有していた。
【表６】 （注）結果は重複定量（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｄｅｔｅ
ｒｍｉｕａｔｉｏｎｇ）から得られるものでありモル当
りの残基として示される。システインは過ギ酸酸化後別
個に定量された。スレオニンとセリンとの値は加水分解
損を補正していない。トリプトファンは測定されなかっ
た。Ａｐｏ Ｅ３配列は参考文献４による。 参考文献目録 １．アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅ
ｙ）（１９７８）脂質及びリポタンパク質の代謝障害
（Ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄａｎｄ
Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ），
ジェー・エム・ディッチー（Ｊ．Ｍ．Ｄｉｅｔｓｃｈ
ｙ），エー・エム・ゴットー・ジュニア（Ａ．Ｍ．Ｇｏ
ｔｔｏ Ｊｒ．）及びジェー・エー・オント（Ｊ．Ａ．
Ｏｎｔｋｏ）（米国生理学協会（Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ），ベセズ
ダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），メリーランド（ＭＤ），１８
１〜１９７ページ。 ２．アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅ
ｙ），ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅ
ｒａｒｉｔｙ），エス・シー・ラール・ジュニア（Ｓ．
Ｃ．Ｒａｌｌ Ｊｒ）及びケー・エッチ・ワイスグレー
バー（Ｋ．Ｈ，Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）（１９８４）ジ
ャーナル・オブ・リピド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．）２５，１２７７−１２９４。 ３．アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅ
ｙ）及びティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎ
ｅｒａｒｉｔｙ）（１９８３）バイオシミカ・バイオケ
ミカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ，Ａｃｔ
ａ）７３７，１９７−２２２。 ４．エス・シー・ラール・ジュニア（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌｌ
Ｊｒ），ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．
Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）及びアール・ダブリュ・マーレ
イ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）（１９８２）生化学会報
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５７，４１７１−４１
７８。 ５．ジェー・ダブリュ・マクリーン（Ｊ．Ｗ．Ｍｃｌｅ
ａｎ），エヌ・エー・エルズアワバギー（Ｎ．Ａ．Ｅｌ
ｓｈｏｕｒｂａｇｙ），ディー・ジェー・チャン（Ｄ．
Ｊ．Ｃｈａｎｇ），アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．
Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）及びジェー・エム・テイラー（Ｊ．
Ｍ．Ｔａｙｌｏｒ）（１９８４）生化学会報（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．ｃｈｅｍ．）２５９，６４９８−６５０４。 ６．ビー・オライゼン（Ｂ．Ｏｌａｉｓｅｎ），ピー・
テイスバーグ（Ｐ．Ｔｅｉｓｈｅｒｇ）及びティー・ゲ
ッドーダールジュニア（Ｔ．Ｇｅｄｄｅ−Ｄａｈｌ Ｊ
ｒ）（１９８２）ヒューマン・ジェネテイクス（Ｈｕ
ｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６２，２３３−２３６。 ７．ワイ・ケー・ペイク（Ｙ．Ｋ，Ｐａｉｋ），ディー
・ジェー・チャン（Ｄ．Ｊ．Ｃｈａｎｇ），シー・エー
・リアドン（Ｃ．Ａ．Ｒｅａｒｄｏｎ），ジェー・イー
・ダビー（Ｊ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ），アール・ダブリュ
・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）及びジェー・エム
・テイラー（Ｊ．Ｍ．Ｔａｙｌｅｒ）プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），米国，投稿
中。 ８．ジー・ユターマン（Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎ），ユー・
ランゲンベック（Ｕ．Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋ），ユー・
ベイジーゲル（Ｕ．Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ）及びダブリュ
・ウェーバー（Ｗ．Ｗｅｂｅｒ）（１９８０）アメリカ
ン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネテイクス
（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）３２，３３９−３
４７。 ９．ヴィ・アイ・ザンス（Ｖ．Ｉ．Ｚａｎｎｉｓ）及び
ジェー・エル・ブレスロウ（Ｊ．Ｌ．Ｂｒｅｓｌｅｗ）
（１９８１）バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）２０，１０３３〜１０４１。 １０．ヴィ・アイ・ザンス（Ｖ．Ｉ．Ｚａｎｎｉｓ），
ジェー・エル・ブレスロウ（Ｊ．Ｌ．Ｂｒｅｓｌｅ
ｗ），ジー・ユターマン（Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎ），アー
ル・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ），ケ
ー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒ
ａｂｅｒ），アール・ジェー・ハーヴェル（Ｒ．Ｊ．Ｈ
ａｖｅｉ），ジェー・エル・ゴールドシュタイン（Ｊ．
Ｌ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ），エム・エス・ブラウン
（Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ），ジー・ションフェルド（Ｇ．
Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ），ダブリュ・アール・ハザード
（Ｗ．Ｒ．Ｈａｚｚａｒｄ），シー・ブラン（Ｃ．Ｂｌ
ｕｍ）（１９８２）ジャーナル・オブ・リピド・リサー
チ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．）２３，９１１−９１
４。 １１．ジー・ユターマン（Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎ），エー
・シュタインメッツ（Ａ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｓ）及びダ
ブリュ・ウェーバー（Ｗ．Ｗｅｂｅｒ）（１９８２）ヒ
ューマン・ジェネテイクス（Ｈｎｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６
０，３４４−３５１。 １２．アール・ジェー・ハーベル（Ｒ．Ｊ．Ｈａｖｅ
ｌ）（１９８２）米国医学講座（Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎ
ｏｒｔｈ Ａｍ．）６６，４４１−４５４。 １３．エッチ・ジェー・メンゼル（Ｈ．Ｊ．Ｍｅｎｚｅ
ｌ），アール・ジー・クラデッキー（Ｒ．Ｇ．Ｋｌａｄ
ｅｔｚｋｙ）及びジー・アスマン（Ｇ．Ａｓｓｍａｎ）
（１９８３）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，）２５６，９０７
７−ｄ９０８３。 １４．ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒ）等，ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５
６，９０７７−９０８３。 １５．エス・シー・ラール・ジュニア（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌ
ｌ Ｊｒ），ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．
Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ），ティー・エル・イネラリ
ティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ）及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）（１９８
２）プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミッ
ク・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｐａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．），米国，７９，４６９６〜４７００。 １６．エス・シー・ラール・ジュニア（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌ
ｌ Ｊｒ），ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．
Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ），ティー・エル・イネラリ
ティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ），アール・ダブ
リュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）及びジー・ア
スマン（Ｇ．Ａｓｓｍａｎ）（１９８３）臨床研究会報
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）７１，１０２３−１
０３１。 １７．ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒ），エス・シー・ラール・ジュニア
（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌｌ Ｊｒ），ティー・エル・イネラリ
ティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ），アール・ダブ
リュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ），ティー・ク
ーシ（Ｔ．Ｋｕｕｓｉ）及びシー・エーンホルム（Ｃ．
Ｅｈｎｈｏｌｍ）（１９８４）臨床研究会報（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｎｅｓｔ．）７３，１０２４−１０３３。 １９．アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌ
ｅｙ），ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎ
ｅｒａｒｉｔｙ），エス・シー・ラール・ジュニア
（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌｌ Ｊｒ）及びケー・エッチ・ワイス
グレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）ニューヨ
ーク科学学会年報（Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）投稿中。 ２０．ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅ
ｒａｒｉｔｙ），イー・ジェー・フリードランダー
（Ｅ．Ｊ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ），エス・シー・ラ
ール・ジュニア（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌｌ Ｊｒ），ケー・エ
ッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅ
ｒ）及びアール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈ
ｌｅｙ）（１９８３）生化学会報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ，）２５８，１２３４１−１２３４７。 ２０ａ．ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎ
ｅｒａｒｉｔｙ），ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（Ｋ．Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ），ケー・エス・アー
ノルド（Ｋ．Ｓ．Ａｒｎｏｌｄ），エス・シー・ラール
・ジュニア（Ｓ．Ｃ．Ｒａｌｌ Ｊｒ）及びアール・ダ
ブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）（１９８
４）生化学会報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２５９，７
２６１−７２６７。 ２１．ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ・Ｈ・Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒ），ティー・エル・イネラリティ
（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ），ケー・ジェー・ハ
ーダー（Ｋ．Ｊ．Ｈａｒｄｅｒ），アール・ダブリュ・
マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ），アール・ダブリュ
・ミルン（Ｒ．Ｗ．Ｍｉｌｎｅ），ワイ・エル・マーセ
ル（Ｙ．Ｌ．Ｍａｒｃｅｌ）及びジェー・ティー・スパ
ロウ（Ｊ．Ｔ．Ｓｐａｒｒｏｗ）（１９８３）生化学会
報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）２５９，１２３４８−１
２３５４。 ２６．ユー・ケー・レムリ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）
（１９７０）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）
２２７：６８０−６８５。 ２７．エッチ・タウビン（Ｈ．Ｔｏｗｂｉｎ），ティー
・スターヘリン（Ｔ．Ｓｔａｅｈｅｌｉｎ）及びジェー
・ゴードン（Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ）（１９７９）プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．）米国１
４８：１０７−１２７。 ２８．エッチ・ジェー・マンゼル（Ｈ．Ｊ．Ｍａｎｚｅ
ｌ）等（１９８４），生化学会報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）２５４：３０７０−３０７６（１９８４）。 ２９．ケー・エッチ・ワイスグレーバー（Ｋ．Ｈ．Ｗｅ
ｉｓｇｒａｂｅｒ）及びアール・ダブリュ・マーレイ
（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）（１９８０）ジャーナル・オ
ブ・リピド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．）２
１，３１６−３２５。 ３０．ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅ
ｒａｒｉｔｙ），アール・イー・パイタス（Ｒ．Ｅ．Ｐ
ｉｔａｓ）及びアール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．
Ｍａｈｌｅｙ）（１９７９）生化学会報（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）２５４，４１８６−４１９０。 ３１．ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅ
ｒａｒｉｔｙ）及びアール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．
Ｗ．Ｍａｈｌｅｙ）（１９７８）バイオケミストリイ
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７，１４４０−１４４
７。 ３２．ディー・ワイ・ヒューイ（Ｄ．Ｙ．Ｈｕｉ），テ
ィー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎｅｒａｒｉ
ｔｙ）及びアール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａ
ｈｌｅｙ）（１９８１）生化学会報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）２５６，５６４６−５６５５。 ３３．アール・ダブリュ・マーレイ（Ｒ．Ｗ．Ｍａｈｌ
ｅｙ），ティー・エル・イネラリティ（Ｔ．Ｌ．Ｉｎｎ
ｅｒａｒｉｔｙ），ケー・エッチ・ワイスグレーバー
（Ｋ．Ｈ．Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）及びエス・ワイ・オ
（Ｓ．Ｙ．Ｏｈ）（１９７９）臨床研究会報（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｕｖｅｓｔ．）６４，７４３−７５０。実施例３９ ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｂＧＨアナログの生物学的活
性 最近の研究によれば（ピー・ジェー・エパード（Ｐ．
Ｊ．Ｅｐｐａｒｄ）及びディー・イー・バウマン（Ｄ．
Ｅ．Ｂａｕｍａｎ）、１９８４年コーネル食品製造業者
用栄養学会会報（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ １９
８４ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｎｆ
ｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕ
ｒｅｒｓ）５〜１２ページ）、メチオニル−ウシ成長ホ
ルモンを１２時間に亘り連続投与すると、コントロール
に比較して１０〜４０％の産乳量の増加が得られた。実
施例１３に記載の如く増殖、回収及び精製されたｐＨＧ
４４プラスミドでコードされたｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ
−ｂＧＨアナログを使用しても同様の結果が得られた。実施例４０ ｍｅｔ−ｐＧＨアナログの生物学的活性 最近の研究（シー・エー・スペンスＣ．Ａ．Ｓｐｅｎｃ
ｅ等の論文「雌ブタの胎児内エネルギ蓄積及び乳汗分泌
性能に関する外因性成長ホルモンの効果（Ｆｆｆｅｃｔ
ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒ
ｍｏｎｅ ＯｎＦｅｔａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｓｔｏｒａ
ｇｅ ａｎｄ ＬａｃｔａｔｉｏｎＰｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ ｉｎ Ｓｏｗｓ）」、米国動物科学協会年例会
（Ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ミズーリ大学、１９８４年８
月７〜１０日）によれば、下垂体由来のブタ成長ホルモ
ンは雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とを向上さ
せることが判明している。乳汗分泌性能テストに於い
て、ｍｅｔ−ｐＧＨアナログを妊娠ブタに投与すると、
雌ブタの乳汗分泌と同産仔ブタの生存率とが改良され
た。実施例４１ 脊髄虚血の治療に於ける組換ＳＯＤの使用 麻酔をかけた犬をニコレットコンパクト（Ｎｉｃｏｌｅ
ｔ Ｃｏｍｐａｃｔ）４励起ポテンシャルシステムにつ
なぎ、後脳骨神経に４．７回／秒の割合で連続的に２５
０回の刺激を与えて基準量ＳＥＰ（体感励起ポテンシャ
ル（Ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖｏｋｅｄ Ｐｏ
ｔｅｎｔｉａｌｓ））を得た。２５０回の刺激に関する
励起ポテンシャルをＦｐｚとＣｚ（頭皮上の２つの特異
点）での２つの電極から記録し、信号平均化装置で平均
化して信号対ノイズ比を低減し、ＳＥＰをスクリーンに
ディスプレイした。次に、左胸部を切開し、左鎖骨下動
脈の真向いの遠位の下行大動脈を解剖単離してクロスク
ランプができるように準備した。動脈のクロスクランプ
を行なう予定部位の近傍に巾着縫合糸を挿入した。ま
た、近位の動脈血圧をモニターし同時に実験グループに
ついては投与薬剤の注入をモニターするために２０ゲー
ジサイズのカニューレを挿入した。更に、動脈のクロス
クランプ後の血圧のモニターと血圧調節用の瀉血とを行
なうために１４ゲージサイズのカニューレを右大腿動脈
に挿入した。溶血ガスを連続的に採取し、溶血ガスが正
常範囲内に維持されるようにしスピレータを調節した。
次に左鎖骨下動脈の真向の遠位の動脈のクロスクランプ
を実施した。ＳＥＰは１分間隔でリピートした。近位動
脈の高血圧をコントロールするために、平均血圧を９０
〜１１０ｍｍＨｇに維持するように大腿動脈から瀉血し
た。ＳＥＰ消滅後、動脈クロスクランプを１０分間維持
した。ＳＥＰ追跡図の消滅は、胸大動脈のクロスクラン
プによって生じた脊髄内部の虚血が、脊髄の背柱内部の
求心性インパルスの伝達を調節できないほど重症になっ
たことを意味する。ＳＥＰ消滅の１０分後にクロスクラ
ンプを中止した。犬が低血圧状態になったため、血液、
リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）乳酸塩及び炭酸水素ナトリウ
ムを注入した。コントロールグループ（８頭）に対して
は組換ＳＯＤを与えなかった。１つの実験グループ（８
頭）に対しては、クロスクランプ中止以前に組換ＳＯＤ
２５，０００単位の丸塊を投与し以後１０分間は５，０
００単位／分ずつ投与した。第２の実験グループ（７
頭）に対しては、クロスクランプ中止以前に組換ＳＯＤ
を５０，０００単位投与し、以後１０分間は１０，００
０単位／分ずつ投与した。手術後、後肢の神経状態をタ
ーロブ（Ｔａｒｌｏｖ）の判定基準によって採点した。
この判定基準では、０＝後肢麻痺、１＝後肢が僅かに運
動可、２＝後肢が十分に動けるが起立が不可、３＝立て
るが正常ではない、４＝完全回復を示す。手術の７日
後、基準量と比較するためにＳＥＰをリピートし記録し
た。その後、動物を殺した。結果は以下の通りである。 手術後７日目の神経状態、（ＰＯＤ）：コントロールグ
ループ（８頭） −４頭が評点０ −４頭が評点２又は３ 第１実験グループー２５，０００単位のＳＯＤ丸塊プラ
ス５，０００単位／分×１０回の投与 −６頭が完全回復 −２頭が評点２又は３ 第２実験グループ−５０，０００単位のＳＯＤ丸塊プラ
ス１０，０００単位／分×１０回の投与 −７頭全部が完全回復。 動脈クロスクランプの開始後、ＳＥＰ消滅までに要する
時間は１２〜１９分である。ＳＥＰ消滅後にクロスクラ
ンプを十分間継続したので、クロスクランプの総継続時
間は２０分より長くなる。切開胸部の縫合後の手術直後
期間内に再度ＳＥＰを検査した。コントロール動物では
ＳＥＰ追跡図が得られなかった。対照的に処置動物では
潜伏期間の波形遅れを伴なうＳＥＰ追跡図が回復してい
た。要約すれば、組換ＳＯＤは脊髄虚血による神経障害
を防止するために有効である。この処置方法は胸大動脈
瘤の外科手術の際に特に重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＡＬ５００の構築説明図。
【図２】ｐＲＯ２１１とｐＲＯ１２の構築説明図。
【図３】ｐＳＡＬ５２００−６の構築説明図。
【図４】ｐ３００８の構築説明図。
【図５】ｐ５００２の構築説明図。
【図６】ｐＨＧ４４とｐＨＧ５０の構築説明図。
【図７】ｐ８３００−１０Ａの構築説明図。
【図８】ｐＳＡＬ−１３０／５とｐＳＡＬ−１７０／１
０の構築説明図。
【図９】ｐＳＡＬ−２１０／４の構築説明図。
【図１０】ｐＳＡＬ５６００−１の構築説明図。
【図１１】ｐ３００９の構築説明図。
【図１２】ｐ５００３の構築説明図。
【図１３】ｐＳＯＤα２の構築説明図。
【図１４】ｐＳＯＤα１３とｐＳＯＤβ１の構築説明
図。
【図１５】ｐＳＯＤβ１Ｔ１１の構築説明図。
【図１６】ｐＳＯＤβ１Ｔ ＬＴ−１の構築説明図。
【図１７】ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２の構築説明図。
【図１８】ｐＴＶ−１８８の構築説明図。
【図１９】ｐ５７９の構築説明図。
【図２０】ｐＴＶ−１７０の構築説明図。
【図２１】ｐＴＶ−１９０の構築説明図。
【図２２】ｐＴＶ−１９４の構築説明図。
【図２３】ｐＳＡＬ１６０−５の構築説明図。
【図２４】ｐＴＶ−２１４の構築説明図。
【図２５】ｐＴＶ２７９−８の構築説明図。
【図２６】ｐ９２００の構築説明図。
【図２７】ｐＴＶ３００の構築説明図である。
【図２８】Ａｐｏ Ｅアナログの細胞内蓄積に伴う細胞
毒性を示し、横軸は培養時間を、縦軸はコロニー数を表
わす。
【図２９】線維芽細胞のＡｐｏ−Ｂ，Ｅ（ＬＤＬ）レセ
プターに対するＡｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の結合を示
し、左図は培養線維芽細胞レセプターに対する結合能、
右図は培養線維芽細胞に対する直接結合能を表わす。横
軸はＡｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の濃度、縦軸は結合率
を表わす。
【図３０】肝臓膜のＡｐｏ Ｅレセプターに対する
１２５Ｉ−Ａｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の結合を示す。
横軸は１２５Ｉ−Ａｐｏ Ｅ・ＤＭＰＣ複合体の濃度、
縦軸は結合の量を表わす。
【図３１】ウサギ血漿からのヨウ素化Ａｐｏ Ｅのクリ
アランスを示す。横軸は時間、縦軸は血漿中の放射活性
の％を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６４４６７１ (32)優先日 1984年８月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６４５１１９ (32)優先日 1984年８月27日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９８０６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９８０５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９７８５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３２１５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ３９７９２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ５３２１６ 前置審査 (72)発明者 マリアン・ゴレツキ イスラエル国、レホヴオツト、ハナシ・ ハリシヨン・ス トリート・５ (72)発明者 ヤコブ・アール・ハートマン イスラエル国、ホロン、ケドシエイ・カ ヒール・ストリ ート・30 (72)発明者 ドヴ・カナー イスラエル国、レホヴオツト、ゴード ン・ストリート・ 21 (72)発明者 アヴイグドル・レヴアノン イスラエル国、ネタンヤ、ボロデツキ イ・ストリート・ ３ (72)発明者 ヒラ・ロツカー−ギラデイ イスラエル国、エルサレム、ハーラツ プ・ストリート・ 39 (72)発明者 アモス・ビー・オツペンハイム イスラエル国、エルサレム、シユレム・ ストリート・５ ／12 (56)参考文献 国際公開84／2918（ＷＯ，Ａ１)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．非耐熱性リプレッサーＣＩを含有する適切な細菌宿
    主細胞に導入すると、この宿主細胞が、宿主細胞の温度
    がリプレッサー不活化温度まで上昇した際、ベクターに
    挿入されているウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、
    ニワトリ成長ホルモン、スーパーオキシドジスムターゼ
    又はアポリポプロテインＥをコードする遺伝子を発現し
    得かつ前記遺伝子がコードしている前記ポリペプチドを
    産生し得るようになるベクターと、第２の制限酵素部位
    に挿入された前記ポリペプチドまたはそのアナログをコ
    ードしている遺伝子とを含むポリペプチドの産生用プラ
    スミドを適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主中に含むそ
    の宿主細胞を前記ポリペプチドを産生せしめ得る適切な
    条件下で成育せしめ、得られるポリペプチドを回収する
    ことからなる前記ポリペプチドの製造方法であって、前
    記ベクターが５′から３′に向かって、 ラムダバクテリオファージ由来のプロモーターおよびオ
    ペレーターＰＬＯＬを含有するＤＮＡ配列と、 抗転写終結因子Ｎタンパク質を結合するためのＮ利用部
    位と、 この後に続くリボソーム結合部位を含有するＤＮＡ配列
    の置換を可能にする第１の制限酵素部位と、 所望遺伝子のｍＲＮＡが宿主細胞内のリボソームに結合
    し得るようにするための以下のリボソーム結合部位： 次の配列を有するラムダバクテリオファージ由来ＣＩＩ
    の変異体のリボソーム結合部位： 【化１】 または、 ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受託番号第３７０１７号）に由
    来する天然のβ−ラクタマーゼリボソーム結合部位； または、 次の配列を有する合成オリゴヌクレオチド： 【化２】 または、 次の配列を有する合成オリゴヌクレオチド： 【化３】 を含有するＤＮＡ配列と、 ＡＴＧ開始コドン、または所望遺伝子をベクター内に挿
    入する際にＡＴＧ開始コドンに変換されるＤＮＡ配列
    と、 ＡＴＧ開始コドンと位相を合わせて所望遺伝子をベクタ
    ー内に挿入するための第２の制限酵素部位と、 を含む二本鎖ＤＮＡ分子を含んでおり、 さらに、宿主細胞中で自律複製し得る細菌プラスミド由
    来複製起点を含有するＤＮＡ配列と、このベクターが宿
    主細胞中に存在するときに現れる選択可能または同定可
    能な表現形質に関連する遺伝子を含有するＤＮＡ配列か
    ら成る選択手段と、を含んでおり、 ここで、ＰＬＯＬプロモーターおよびオペレーター配列
    の３′末端とＮ利用部位の５′末端との間の距離が約８
    ０塩基対未満であり、Ｎ利用部位の３′末端とリボソー
    ム結合部位の５′末端との間の距離が約３００塩基対未
    満であること、 また、前記プラスミドが以下の制限地図を有する、ｐＲ
    Ｏ１２、ＡＴＣＣに寄託されている（受託番号第３９８
    ０６号）ｐＨＧ４４、ＡＴＣＣに寄託されている（受託
    番号第３９８０５号）ｐＨＧ５０、ＡＴＣＣに寄託され
    ている（受託番号第３９７８５号）ｐ８３００−１０
    Ａ、ｐＳＡＬ−１３０／５、ｐＳＡＬ−１７０／１０、
    ＡＴＣＣにＡ４３２０として寄託されている（受託番号
    第５３２１５号）ｐ９２００、ＰＳＯＤβ１、ｐＳＯＤ
    β１Ｔ１１、ｐＳＯＤβ１−ＢＡ２、ｐＳＯＤβ １ ＴＴ
    −１、ｐ３００９、ＡＴＣＣに寄託されている（受託番
    号第３９７９２号）ｐ５００３、ｐＴＶ−１８８、ｐＳ
    ＡＬ１６０−５、又はＡＴＣＣに寄託されている（受託
    番号第５３２１６号）ｐＴＶＲ２７９−８から選択され
    ること、を特徴とする前記方法。 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】
JP6330419A 1984-08-27 1994-11-24 ポリペプチドおよびその製造方法 Expired - Lifetime JP2777074B2 (ja)

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