DD251787A5 - Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen desselben - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen davon, bei dem erfindungsgemaess ein spezieller Vektor in einen geeigneten Wirt, der den thermolabilen Repressor, CI enthaelt, eingefuehrt wird. Hierbei versetzt der Vektor den Wirt in die Lage, die Expression eines gewuenschten Gens durchzufuehren. Die Vektoren koennen Originale von Replikationen sein, die zur autonomen Produktion in dem Wirt von wenigstens 400 konstitutiven Kopien in der Lage sind. Durch die Erhoehung des Niveaus der Polypeptid-Expression wird ein aeusserst wirtschaftliches Verfahren bereitgestellt. Es lassen sich Plasmide herstellen, die zur Erzeugung von Rinder-, Huehner-, Schweine- und menschlichen Wachstumshormonen, menschlichem Apolipoprotein E und menschlicher Superoxid-Dismutase und Analogen davon verwendet werden koennen. Die Superoxid-Dismutase und deren Analoge koennen verwendet werden, um die Reduktion von Superoxid-Radikalen zu katalysieren, die Reperfusionsverletzung herabzusetzen, die Ueberlebenszeit isolierter Organe zu verlaengern und eine neurologische Verletzung zu verhindern.

Description

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Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen desselben

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen desselben.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Ein Aspekt der Gentechnologie umfaßt den Einbau fremder DHA-Sequenzen, die von eukaryotischen Quellen stammen, in Escherichia coli oder andere Mikroorganismen. Eine Weiterentwicklung der Gentechnologie betrifft die Induktion des betreffenden Mikroorganismuses, um Polypeptide zu produzieren, welche durch das fremde DIiA kodiert sind. Die Herstellung der Polypeptide kann als Zweistufenνerfahren aufgefaßt v/erden, wobei jede Stufe zahlreiche Zwischenstufen umfaßt. Die beiden Stufen sind die Transkription und die Translation. Um ein Polypeptid wirksam und in einer ausreichenden Menge herzustellen, müssen beide Stufen des Verfahrens effiziert sein. Die Transkription ist die Herstellung von mRITA aus dem Gen (DNA). Die Translation ist die Herstellung eines Polypeptids aus mRHA.

Eine kritische Zwischenstufe des Transkriptionsverfahrens ist die Initiierung, d.h. die Bindung der RNA-Polymerase an eine Promotor-Operator-Region. Die Sequenz der Desoxyribonucleotid-Basen, die die Promotorregion bildet, kann variieren und dabei die relative Effizienz des Promotors beeinträchtigen.

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Die Effizienz hängt ab von der Affinität der RNA-PoIymerase gegenüber dem Promotor.

r, Die Effizienz der Translation wird durch die Stabilität ο

der mRNA beeinflußt. Eine erhöhte Stabilität der mRNA erlaubt eine verbesserte Translation. Obgleich die genauen Determinanten der mRNA-Stabilität nicht genau bekannt sind, ist es bekannt, daß die sekundäre mRNA-Struktur, wie sie durch die Sequenz ihrer Basen bestimmt wird, für die Stabilität eine Rolle spielt.

Der erste Zwischenschritt der Translation umfaßt die Bindung des Ribosoms an eine Basensequenz an der ^RNA,

welche als Shine-Dalgarno- Sequenz oder als ribosomale 15

Bindungsstelle (RBS) bekannt ist. Die Synthese der Polypeptide beginnt, wenn das Ribosom entlang der mRNA ¹Zu dem AUG-Start-Kodon der Translation migriert. Im allgemeinen werden diese Kodons etwa 10 Basen "stromabwärts" der Shine-Dalgarno-Stelle gefunden. Faktoren, welche die' Effizienz der Translation erhöhen, sind jene, welche die Bindung der Ribosome an die Shine-Dalgarno-Stelle verstärken. Es ist gezeigt worden, daß die Struktur der mRNA in der Region der Shine-Dalgarno-Sequenz und das AUG-Kodon und der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Seqüenz und dem AUG-Kodon jeweils eine kritische Rolle bei der Bestimmung der Effizienz der Translation darstellen. Andere Faktoren, welche die Effizienz der Translation beeinflußen, sind eine vorzeitige Terminierung und Attenuierung. Die Effizienz der Translation kann verbessert werden, indem die Attenuierungsstellen entfernt werden.

Eine Schwierigkeit, auf die man bei Versuchen trifft, um eine große Menge eukaryotischer Polypeptide in 5

bakteriellen Zellen zu erzeugen, stellt die Unfähigkeit der Zellen dar, welche große Mengen an mRNA erzeugen,

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um wirksam zu wachsen. Diese Schwierigkeit kann eliminiert werden, wenn die Transkription durch ein Verfahren verhindert wird, das als Repression bekannt ist. Bei der

Repression werden Gene aufgrund der Wirkung eines Pro-5

teininhibitors (Repressorprotein) abgeschaltet, welcher eine Transkription durch Bindung an die Operatorregion verhindert. Nachdem die Mikroorganismen zu der gewünschten Zelldichte gewachsen sind, werden die einer Repression unterworfenen Gene durch Zerstörung des Repressors oder durch Zugabe von Molekülen, welche als Induktoren bekannt sind, aktiviert, wodurch die Wirkung des Repressors beseitigt wird.

Es gibt zahlreiche Berichte in der Literatur, die das Klonen von eukaryotischen Genen in Plasmiden betreffen, welche den P -Promotor des ^"Bakteriophagen enthalten (Bernard, H. V. , et al., Gene (1979), Band 5, S. 59; Derom, C. et al., Gene (1982), Band 17, S. 45; Gheysen, D., et al·., Gene (1982), Band 17, S. 55;. Hedgpeth, J. et al, Mol. Gen. Genet. (1978), Band 163, S. 197; Remaut, E., et al. , Gene,(1981),. Band 15, S. 81 und Derynck, R. et al., Nature (1980), Band 287, S. 193. Darüberhinaus werden in der europäischen Patentanmeldung Nr. 041767,

die am 16. Dezember 1981 veröffentlicht worden ist, 25

Expressionsvektoren beschrieben, die den P -Promotor

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des /!-Bakteriophagen enthalten. Keine dieser Druckschriften beschreibt jedoch die Verwendung der C_TT-ribosomalen Bindungsstelle.

Die Verwendung eines Vektors, der den P —Promotor als

/!-Bakteriophagen und der C -ribosomalen Bindungsstelle enthält, ist bereits beschrieben worden (Oppenheim, A. B. et al, J. Mol. Biol. (1982), Band 158, S. 327 und

Shirnatake, H. and Rosenberg, M., Nature, (1981), Band 35

292, S. 128). Diese Veröffentlichungen beschreiben die Herstellung von erhöhten Gehalten des C -Proteins,

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betreffen und beschreiben jedoch nicht die Herstellung eukaryotischer Proteine.

Andere Vektoren, welche den P -Promotor und die C_TT-

c L 11

ribosomale Bindungsstelle enthalten, sind ebenfalls beschrieben worden (Courntey, M. et al., -PNAS (1984) , Band 81, S. 669-673; Lautenberger, J. A. et.al., Gene (1983), Band 23, S. 75 - 84 und Lautenberger J. A. et al., Science (1983) , Band 221 , S. 858 - 860) . Alle diese Vektoren führen jedoch zur Herstellung verschmolzener Proteine, welche den Amino-Endabschnitt des C -Proteines enthalten.

1982 haben Shatzman und Rosenberg ein Plakat auf dem 14. Miami-Winter-Symposium gezeigt (Shatzman, A. R. und Rosenberg, M., 14 Miami Winter Symposium, Abstract S. 98 (1982)). Diese Zusammenfassung stellt eine nicht ausführbare Offenbarung der Anwendung eines Vektors dar, der P von λ-Bakteriophagen, Nut und die C_TT-ribosomale

Ii 11

Bindungsstelle enthält um ein "eukaryotisches" Polypeptid zu synthetisieren (SV40, ein kleines T-Antigen, ist an sich kein eukaryotisches Polypeptid, sondern ein virales Protein), und zwar in einer Menge größer als 5% des Zellproteins in einem nicht genannten bakteriellen Wirt. Der verwendete Operator wird nicht definiert, wederein Ursprung der Replikation noch ein Gen für einen selektierbaren Phenotyp angegeben. Dieses System, bei dem der Vektor verwendet wird, wird als bestimmte Wirtlysogene enthaltend -beschrieben, in welche der Vektor stabil transformiert werden können.

Der Anmelderin ist ferner die anhängige US-Patentanmeldung von M. Rosenberg bekannt, die vom National Institute of Health, Department of Health and Human Services, U.S.A. unter dem amtlichen Aktenzeichen Nr. 457352 hinterlegt worden ist. Teile dieser Anmeldung sind von dem National Technical Information Service, U. S. Department of Commerce,

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erhalten worden. Die Ansprüche sind jedoch nicht erhält-, lieh und werden geheim gehalten. Die verfügbaren Teile der Anmeldung sind durchgesehen worden. Diese Offenbarung ist für eine Ausführung nicht ausreichend. Sie gibt an,, daß der Wirt wichtig ist (S. 8, Zeile 17), gibt jedoch keinen brauchbaren Wirt an. Sie hängt ferner von der' Anwendung eines λ-Mutanten ab, der jedoch nicht beschrieben wird (S. 4, Zeile 20). Es wird darauf hingewiesen, daß der Wirt Lysogene enthält (S. 8, Zeile .18) , im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung, bei der Wirt nicht lysogen ist. Sie erwähnt das Klonen und ein eukaryotisches Gen, ein Affenmetallothionin-Gen, (S. 7, Zeile 18), liefert jedoch keine Details. Sie gibt an, daß weder die Sequenz noch die Positions eines Nukleotids in der C -ribosomalen

Bindungsregion geändert worden ist (S. 3, Zeile 27).

Die anhängige, mit-umgeschriebene US-Patentanmeldung mit dem amtlichen Aktenzeichen Nr. 514188, hinterlegt am

15. Juli 1983, beschreibt neue Vektoren, die zur Expres-

sion von Polypeptiden in Bakterien geeignet sind. Diese Vektoren umfassen P O_T , N-Anwendungsstellen des Bindungs-

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antiterminator-N-Proteins, eine ribosomale Bindungsstelle, ein ATG-Kodon, eine Restriktionsenzymstelle zur Einführung des Gens, welches das gewünschte Polypeptid kodiert,

eine Ursprung der Replikation und eine selektierbare Markierung. Bei diesen Vektoren ist der Abstand zwischen der N-Anwendungsstellung und der ribosomalen Bindungsstelle größer als etwa 300 Basenpaare. Darüber hinaus enthält jeder dieser Vektoren eine spezifische ribosomale Bindungs-

stelle, welche nicht leicht ersetzt werden kann. Diese Vektoren sind nicht gleich anwendbar zur Expression verschiedener Polypeptide.

T₁T₉-rRNA-Transkriptions-Terminierungs-Sequenzen sind bereits beschrieben worden (Brosius, J., et al, J. Mol. Biol^ Band 148, S. 107 (1981)). Die Plazierung der

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T.T -rRNA-Terminierungs-Sequenzen von dem 3'-Ende eines

prokaryotischen Gens und die Expression eines solchen Gens unter der Kontrolle eines Promotors sind beschrieben ,- worden (Amann, E. et al, Gene (1983), Band 25, S. 167; Zabeau, M., et al,, The EMBO Journal (1982), Band 1, S. 1217) .

Die europäische Patentanmeldung Nr. 81 304 5 73.9, die am ..Q 14. April 1982 unter der europäischen Veröffentlichungsnr. 049,619 erschienen ist, offenbart die Verwendung eines /jcl857-thermoinduzierbaren Repressors als Stabilisierungselement. Der Repressor wurde auf ein Plasmid geklont. Ein ^cI90-Prophage, das hinsichtlich der p. Repressorsynthese einen Defekt aufweist, wird durch Infektion eingeführt. Das Prophagen wird mit dem geklon-ten Repressor bei einer Temperatur unter 32⁰C gehalten. Jede Zelle, die das Plasmid verliert, löst sich auf. Falls die Temperatur über 38⁰C erhöht wird, wird der Repressor zerstört oder inaktiviert und die Zellen lösen sich auf. Dieses Stabilisierungssystem ist mit den erfindungsgemäßen Vektoren nicht kompatibel, welche einen \V -Promotor aufweisen und welche Polypeptide · bei Temperaturen über 38⁰C erzeugen. _ j

Der Ursprung der Replikation von konstitutiven Plasmiden

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hoher Vervielfältigungszahl ist bekannt. Beispielsweise ist der ρθΡΐΔβ-Ursprung der Replikation Von Co1Ei beschrieben worden (Gelfand, D. H. ,et al,PNAS (1978, Band 75, (12) , S. 5869 und Muesing, M. , et al, Cell (1981) , Band 45, S. 235). Darüber hinaus sind verändernde Replikationsplasmide hoher Vervielfältigungszahl, als Gegenstück zu konstitutiven Plasmiden honer Vervielfältigungszahl, bekannt (Remant, E., et al, Gene, (1983), Band 22, S. 103).

__ Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Expressionsdo

vektoren, welche unerwarteterweise eine erhöhte Expression unterschiedlicher Polypeptide hervorrufen. Durch Anwendung

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verschiedener ribosomaler Bindungsstellen in den Vektoren nach, der Erfindung ist es möglich, ein erhöhtes Expressionsniveau verschiedener Polypeptide gegenüber den .Niveaus zu erhalten, die mit bisherigen Vektoren erhalten worden sind. Durch die Verwendung der gleichen ribosomalen Bindungsstellen wie bei den bisherigen Vektoren ist es darüber hinaus möglich, eine erhöhte Expression der gleichen Polypeptide zu erhalten. Durch das Plazieren der T₁ T_?rRl\IA-Terminierungs-Sequenzen an dem 3'-Ende des Gens, welches ein Polypeptid kodiert, dessen Expression erwünscht ist, ist es weiterhin möglich, die Menge des ge- wünschten Polypeptids gegenüber dem gesamten von einem bakteriellen Wirt erzeugten Polypeptids zu erhöhen. Wichtig ist, daß die Gegenwart der T-Tp^RlTA-Transkriptions- -Terminierungs-Sequenzen den Ursprung der Replikation ermöglicht, welcher sich von konstitutiven Plasmiden hoher Vervielfältigungszahl ableitet, welche in den Expressionsvektor einverleibt v/erden, ohne die Fähigkeit der Replikation hinsichtlich einer hohen konstitutiven Vervielfältigungszahl zu verlieren.

Der Ursprung der Replikation, welcher sich von pBR3'22 oder nicht-konstitutiven Plasmiden hoher Vervielfältigungszahl ableitet, und zwar anderen als den sich ändernden Plasmiden hoher Vervielfältigungszahl, wenn sie einem Vektor einverleibt v/erden, ist in der Lage, lediglich eine bestimmte Anzahl von Vervielfältigungen oder Kopien pro Zelle zu bilden, typischerweise weniger als 40 Kopien pro Zelle.

Ziel der Erfindung;

Mit der Erfindung sollen die genannten Nachteile des Standes der Technik beseitigt, d.h. es soll ein Verfahren bereitgestellt werden, bei dem die Herabsetzung der Ausbeute, die bisher durch die beschriebene Plasmidinstabilität hervorgerufen wird, beseitigt ist.

Darlegung des 'Wesens der Erfindung;

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen desselben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Wirt-Vektor-System mit einem Plasmid, enthaltend

a) einen Vektor, der bei Einführung in eine geeignete bakterielle Wirtszelle, die einen thermolabilen Repressor Cj aufweist, die Wirtszelle in die Lage vers'etzt, nach Erhöhung der Temperatur der VTirtszelle auf eine Temperatur, bei welcher der Repressor inaktiviert wird, die Expression eines in den Vektor eingeführten gewünschten Gens sowie die Produktion von Polypeptiden, die durch dieses-Gen kodiert werden, zu bewirken, mit

1) einem doppelsträngigen DNA-Molekül, welches in der Reihenfolge 5' bis 3',

eine DNA-Sequenz mit dem Promotor und Operator P-rO-j. einen λ Bakteriophagen, eine N-Nutzungssteile zur Bindung eines Antiterminator-N-Proteins,

eine erste den Austausch der DNA-Sequenz mit der folgenden ribosomalen Bindungsstelle gestaltende Restriktonsenzymstelle,

eine DNA-Sequenz mit einer ribosomalen Bindungsstelle, die die mRNA des gewünschten Gens zur Bindung an Ribosome in der Wirtszelle befähigt,

ein ATG-Initiierungs-Kodon oder eine DNA-Sequenz, die bei Einführung des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiierungs-Kodon umgewandelt wird, und

eine zweite Restriktionsenzymstelle zur Einführung des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiierungs-Kodon

enthält sowie

2) darüber hinaus einer DNA-Sequenz mit einem Replikationsstart aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtszelle fähigen bakteriellen Plasmid und einem Selektionsmittel in Form von DNA-Sequenzen mit einem Gen mit selektierbarem oder identifizierbarem Phänotypusmerkmal, welches sich bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifestiert, oder von DNA-Sequenzen mit dem als el bezeichneten Fragment, welches das Gen für das el Repressorprotein und dessen assoziierte Promotor- und Operatorsequenz beinhaltet, wobei der Abstand zwischen dem 3'-Ende der P-rO-.-Promotor- und Operatorsequenz und dem 5'-Ende der N-Ausnutzungsstelle geringer als etwa 80 Basenpaare und der Abstand zwischen dem 3'-Ende der N-Ausnutzungsstelle und dem 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle weniger als etwa 300 Basenpaare beträgt, umfaßt, und

b) ein Gen, das ein Polypeptid oder ein Analoges desselben kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingefügt ist, in einem geeigneten E. coli-Wirt, unter die Produktion des Polypeptids oder von dessen Analogen erlaubenden geeigneten Bedingungen wachsen gelassen und das erhaltene Polypeptid oder dessen Analoges abgetrennt wird.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß sich das Niveau der Polypeptid-Expression in unerwarteter Weise erhöht, Y/enn im Ursprung der Implikation von einem konstitutiven Plasmid hoher Vervielfältigungszahl ersetzt wird.

Wie bereits soeben ausgeführt, werden also bevorzugte Vektoren in dem bakteriellen Wirt stabilisiert, und wenn das Bakterium wächst, welches die Plasmide enthält, welche die Vektoren und die die Gene kodierenden Polypeptide enthalten, gehen die Plasmide nicht verloren. Auf diese Weise wird die Herabsetzung der Ausbeute, die durch Plasmidinstabilität hervorgerufen wird, beseitigt. Durch die Verwendung derart bevorzugter Vektoren wird darüber hinaus die Anwendung einer antibiotischen Resistenz wie einer selektierbaren Markierung, vermieden, wodurch die Kosten der Herstellung der Polypeptide herabgesetzt werden können.

Die Superoxid-Dismutase (SOD) und Analoge davon sind einige der verschiedenen Polypeptide, welche erzeugt werden können, wenn die neuen Expressionsvektoren nach der Erfindung eingesetzt werden.

Bei den Expressionsplasmiden, welche überraschenderweise zu einer erhöhten Expression von Superoxid-Dismutase oder Analogen davon führen, v/erden die gleichen ribosomalen Bindungsstellen wie bei den bisherigen Vektoren verwendet, wobei, wie beschrieben, verschiedene ribosomale Bindungsstellen eingesetzt werden.

Die Erfindung bildet die Grundlage für eine, erhöhte Produktion von SOD und Analogen davon in Bakterien unter Verwendung der soeben erwähnten Plasmide.

Die Superoxid-Dismutase (SOD) und das Phänomen der freien Sauerstoff radikale (Op."") wurde 1968 von Mc Cord and Pridovich entdeckt (McCord, J. M. und Pridovich, I., J. Biol,

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Chem., Band 244, S. 6049-6055, 1969). Superoxidradikale und andere hochreaktive Sauerstoffarten werden in Jeder atmenden Zelle als Nebenprodukt des oxidativen Metabolismus erzeugt, und es ist gezeigt worden, daß sie einer großen Anzahl von Makromolekülen und Zellkomponenten großen Schaden zufügen (vgl. Fridovich I. in "Advances in Inorganic Biochemistry, eds. Eichhorn, G. L. und Marzilli, L. G. (Elsevier/lorth Holland, Hew York), S. 67 - 90 (1979), and Freeman B. A. und Grapo, J. D., "Laboratory Investigation", Band 47, S. 412 - 426, 1982). Eine Gruppe von Metalloproteinen, die als Superoxid-Dismutasen bekannt sind, katalysieren die Oxi-

dations-Reduktions-Reaktion 2O₂-* + 2H⁺ ^H₂ ⁰? ⁺ °p *

und bilden auf diese V/eise einen Abv/ehrme chanismus gegen die Sauerstofftoxizität. Es gibt drei bekannte Formen von SOD, welche verschiedene Metalle in den Proteinmolekülen enthalten, nämlich Eisen, Mangan oder sowohl Kupfer als auch Zink. Sie alle katalysieren die gleiche Reaktion mit letztlich gleicher Effizienz, und alle arbeiten nach einem ähnlichen Mechanismus, bei dem das Metall den katalytischen Faktor der aktiven Stelle darstellt. Diese Enzyme fallen in verschiedene evolutionäre Gruppen. Die Mn- und Fe-SODs werden primär in prokaryotischen Zellen gefunden, während CuZn-SOD praktisch in allen eukaryotischen Organismen gezeigt worden ist (Steinmann, H. M. in "Superoxide Dismutase", ed. Oberley, L. Y/. (CRG Press, Florida)., S. 11 -68, 1982).

Die humane Cu/Zn-SOD-1 ist ein dimeres Metallprotein, das aus identischen nicht-kovalenten verbundenen Untereinheiten besteht, welche jeweils ein Molekulargewicht von 16000 DaI-tons aufweisen und ein Atom Kupfer und ein Atom Zink enthalten (Hartz, J. W. und Deutsch, H. F., J. Biol. Chem.,. Band 247, S. 7043 - 7050, 1972).

Jede Untereinheit ist aus 153 Aminosäuren zusammengesetzt, deren Sequenz bestimmt wurde (Jabusch, J. R., Färb, D. L., Kerschensteiner, D. A. und Deutsch, H. F., "Biochemistry",

Band 19, S. 2310 - 2316 (1980) und Barra, D., Martini, P., Bannister, J. V., Schinina, M. W., Rotilio, W. H., Bannister, W.H. und Bossa, P., PEBS Letters, Band 120, S. 53 - 56, 1980). Weiterhin ist kürzlich ein cDM-Klon, das die-gesamte kodierende. Region von Human-S0D-1 enthält, isoliert und in seiner Sequenz bestimmt worden (Lieman-Hurwitz, J., Dafni, Ή., Lavie, V. und .Groner, Y., Proc. ITatl. Acad. Sei. USA, Band 79, S. 2808 - 2811, (1982) und Sherman, L., Dafni, Ei., L eiman-Hurwitz, J. und Groner, Y. ,,Proc. ITatl. Acad. Sei. USA, Band 80, S. 5465 - 5469, 1983).

Das analog erzeugte Human-Cu-Zn-S0D unterscheidet sich von natürlichen Human-Cu-Zn-SOD dadurch, daß Alanin als endständige Aminosäure nicht acetyliert ist. Das natürliche Human-SOD ist am endständigen Alanin acetyliert (Hartz, J. W. und Deutsch, H. P., J. Biol. Chera. (1972), Band 247, S. 7043 - 7050, Jabusch, J. R., et al., Biochemistry (1980), Band 19, S. 2310 - 2316;. Barra, et al, PEBS Letters (1980), Band 120, S. 53, und Oberly, L. W. "Superoxide Dismutase", Band I, CRC Press, Florida, (1982), S. 32 - 33). Das natürliche Human-SOD ist wahrscheinlich glykosyliert wie das Rinder-SOD (Huber, W., U.S. Patent Hr. 3,579,945, veröffentlicht am 18. Mai 1971). Bakteriell erzeugtes Human-SOD ist fast sicher nicht glykosyliert, da Escherichia coli Proteine nicht glykosyliert, welche es erzeugt. Die Aminosäuresequenz des bakteriell erzeugten SOD-Analogen ist identisch mit der von reifem Human-SOD und enthält keinen Methioninreöt als N-Endgruppe.

Die Superoxid-Dismutase ist von erheblichem Interesse wegen ihrer pharmakologischen Eigenschaften. Bei der vom Rind herrührenden, natürlich vorkommenden Superoxid-Dismutase (Orgotein) ist festgestellt worden, daß sie antiinflammatorische Eigenschaften besitzt, wobei sie in bestimmten europäischen Ländern, beispielsweise BRD, zur Be-

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handlung von Entzündungen auf den Markt gebracht worden ist. Sie wird ferner in einer Vielzahl von Ländern, einschließlich den USA, als veterinärmedizinisches Produkt zur Behandlung von Entzündungen verkauft, insbesondere zur Behandlung entzündeter Sehnen von Pfernden. lach der wissenschaftlichen Literatur soll SOD darüber hinaus in einem weiten Bereich klinischer Anwendungen brauchbar sein. Diese timfassende Verhinderung der Onkogenese und der Tumorpromotion und die Herabsetzung cytotoxischer und kardiotoxischer Effekte von Anti-Krebs-Arzneimitteln (Oberley, L. W. und Buettner, G. R., Cancer Research, Band 39, S. 1141 - 1149, 1979); den Schutz ischämischen Gewebes (McCord, J. M., und Roy, R. S., Can. J. Physiol. Pharma., Band 60, S. 1346 - 1352, 1982), sowie den Schutz der Spermatozoe (Alvarez, J. G. und Storey, B. T¹., Biol. Reprod., Band 28, S. 1129 - 1136, 1983). Darüber hinaus besteht ein großes Interesse die Wirkung von SOD auf den Alterungsprozeß zu untersuchen (Talmasoff, J. M., Ono, T. und Cutler, R. G., Hatl. Acad. Sei. USA, Band 77, S. 2777 _ 2782, 1980).

Durch Verwendung von rekombinierter Human-Superoxid-Dismutase (hSOD) und Analogen davon ist es möglich, die Reduktion der Superoxidradikale in Gegenwart von H zu Wasserstoffperoxid und molekularem Sauerstoff zu katalysieren. •Besonders erwähnt sei die Verwendung von hSOD-Analogen, um eine Reperfusionsverletzung herabzusetzen, die auf eine Ischämie folgt und um die uberlebensdauer von exzitierten, isolierten Organen zu erhöhen. Von Bedeutung ist ferner die Verwendung von hSOD oder Analogen, um die Verletzung durch Reperfusion herabzusetzen, die nach einer Organplantation stattfindet, sowie die Rückenmarkischämie.

Bevorzugte Vektoren sind jene, bei denen das Selektionsmittel ein Gen ist, das mit einem phänotypischen Merkmal verbunden ist, beispielsweise pJH200 und pR0211.

Die Vektoren können ferner eine DNA-Sequenz aufweisen, welche eine T.,T₂rRlM.-Sequenz enthält, welche 3' von der zweiten Restriktionsenzymstelle angeordnet ist. Vorzugsweise ist die ^^rHIA-Transkriptions-Terminierungssequenz kleiner als etwa 100 Basenpaare von dem 3'-3nde der zweiten Restriktionsenzymstelle angeordnet,'noch mehr bevorzugt weniger als etwa 20 Basenpaare von dem 3'-Ende der Stelle.

Der gegenwärtig bevorzugte Vektor, der die T₁ T_?rR5iA-Transkriptions-Terminierungssequenz enthält, ist p579, wobei das Selektionsmittel ein Gen ist, welches mit einem phänotypiseben Merkmal assoziiert ist.

Bei den Vektoren, die das el ^ -Fragment enthalten, ist das

el -Fragment 3' von T^T^rRHA-Terminierungssequenz angeordnet.

Vorzugsweise umfassen die Vektoren sowohl das mit dem phänotypischen Merkmal assoziierte Gen wie das el -Fragment. Der gegenwärtig bevorzugte Vektor, der beide Gene enthält, ist p579, welcher das el -Fragment aufweist, das in die C1al-Stelle geklont ist.

Die Vektoren können auch ein Original der Replikationen ' ^! von einem bakteriellen Plasmid zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle und Produktion von wenigstens > 4.00 konstitutiven Kopien des Vektors enthalten. . ι

Das gegenwärtig bevorzugte Original der Replikation ist pOPl*Δ6,welches sich vom colEl-Plasmid ableitet.

Bevorzugt werden Vektoren, welche die T^Tp rungssequenz aufweisen,·einem Original der Replikation, welches in der Lage ist, wenigstens 400 konstitutive Kopien in der Y/irtszelle zu erzeugen, und welche sowohl ein Gen für ein phänotypisches Merkmal wie ein Gen für das -Fragment enthalten.

ZSl787

Gene, z.B. cDITA, welche gewünschte Polypeptide kodieren, beispielsweise Wachstumshormone, z.B. Rinder-, Schweine-, Hühner- oder menschliche Wachstumshormone, menschliche Superoxid-Dismutase, menschliche Apolipoprotein Ξ oder Analoge davon, können in die zweite Restriktionsenzymstelle des,Vektors eingeführt werden, um Plasmide zu bilden. Die Plasmide können ihrerseits in ge-eignete Wirte eingeführt werden, in denen die Gene einer Expression unterliegen können und die gewünschten Polypeptide erzeugt werden. Die gegenwärtig bevorzugten Plasmide sind für bGH, pRO12, pSAL 5200-6, pHG44, pSAL 5600-1, p7200-22, pHG50, p8300-10A, pSAL-170/10 pSAL-210/4 und p9200, für Humanperoxid-Dismutase pSOD .₂, pSODßi , PSODB₁T₁₁, pS0Dß₁~BA2 und pSODß.TT-1, für pGH, P3008 und p3OO9, für cGH, p5OO2 und p5OO3 für hGH, pTV 3OO, und für menschliches Apolipoprotein Ξ, pTV-188, pSAL 160-5, pTY-170, pTY-190, pTV-194, pTV-214 und pTVR .279-8.

Bevorzugte Wirte sind S. coli A 1637, Al 645, A26O2, A2097, und AI563 sowie A1645 ( A i434cI~miniTn10), falls das Plasmid das el -Fragment enthält. Bevorzugte prototrophische Wirte sind E. coli A4200, A4255 und A4346. Ein bevorzugter lytischer Wirt ist Ξ. coli A4048.

Die gebildeten V/irtsvektorsysteme können zur Herstellung von Polypeptiden verwendet werden. Wirtszellen, die die Plasmide enthalten, werden unter geeigneten Bedingungen zur Erzeugung von Polypeptiden wachsen gelassen und die gebildeten Polypeptide werden gewonnen. Unter Verwendung der Wirtsvektorsysteme sind Analoge von Humanpolipoprotein E, Rinderwachstumshormon, Schweinewachstumshormon, Hühnerwachstumshormon, menschliches Wachstumshormon und menschliche Superoxid-Dismutase hergestellt worden.

Auf diese Weise hergestellte SOD-Analoge. wurden veterinärmedizinischen und pharmazeutischen Zusammensetziingen einverleibt, welche die SOD-Analogen und geeignetg^rägersubstanz en enthalten.

Diese Superoxid-Dismutase-Analogen wurden verwendet, um die folgende Reaktion zu katalysieren:

.2O₂- + 2H⁺ —) H₂O₂ + 0,

Insbesondere wurden diese Analogen verwendet, um Verletzungen zu mildern, welche durch Reperfusion nach einer Ischämie oder Organtransplantation verursacht wurden, um die kardiologische Infarktgröße herabzusetzen oder die Überlebenszeit der exzitierten isolierten Organe zu erhöhen. Diese Analogen können auch dazu verwendet werden, eine Rückmarkverletzung oder eine bronchiale Lungendispersie zu heilen.

Ein Verfahren zur Erzeugung einer enzymatisch aktiven eukaryotischen Superoxid-Dismutase oder einem Analogen davon in einer bakteriellen Zelle ist ebenfalls festgestellt worden. Die bakterielle Zelle enthält und ist in der Lage eine DHA-Sequenz auszudrücken, welche die Superoxid-Dismutase oder ein Analoges kodiert enthält. Das Verfahren umfaßt die Aufrechterhaltung der bakteriellen Zelle unter geeigneten Bedingungen und in einem Produktionsmedium, dem Cü zugesetzt ist, so daß die Konzentration von Cu , das der Zelle zur Verfügung steht, in dem Medium größer als etwa 2ppm ist.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist die bakterielle Zelle eine E. coli-Zelle, welche eine Plasmid enthält, welches eine DHA-Sequenz aufweist, welche ein Analog der Human-Superoxid-Dismutase kodiert enthält.

Ein Verfahren zur Gewinnung gereinigter enzymatisch aktiver eukaryotischer Superoxid-Dismutase oder eines Analogen davon, das in einer bakteriellen Zelle erzeugt wird, umfaßt

die Isolierung der bakteriellen Zelle aus dem Kahrmedium und die Suspension der bakteriellen Zelle in einer geeigneten Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0. Die Zellwand der suspendierten bakteriellen Zelle ist unterbrochen und die gebildete homogene Lösung wird dann unter geeigneten Bedingungen mit Schall behandelt. Die mit Schall behandelte Lösung wird unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert und der Überstand wird entfernt und zwei Stunden auf etwa 65 C erwärmt. Der Überstand wird dann gekühlt und unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert, um eine klare überstehende Proteinlösung zu erhalten. Der erhaltene überstand wird auf ein geeignetes Volumen konzentriert und einer Ionenaustauschchromatographie.mit einem geeigneten Anionenaustauscher unterworfen, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt worden ist. Die gebildete Lösung, die Superoxid-Dismutase und Analoge enthält, wird gesammelt, auf ein geeignetes Volumen konzentriert und dialysiert, gegen eine gepufferte Lösung mit einem pH. von etwa 7,0 bis etwa 8,0. Die konzentrierte gepufferte Lösung wird dann einer Ionenaustauschchrornatographie mit einem geeigneten Anionenaustauscher unterworfen, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt worden ist,, und der Anionenaustauscher-Protein- -Komplex wird mit einem geeigneten Salzgradienten behandelt. Die Fraktionen, die die Superoxid-Dismutase und Analoge enthalten, werden gesammelt, konzentriert und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Der pH der betreffenden Lösung wird auf etwa-4,0 bis etwa 5,0 mit einem geeigneten Puffer eingestellt. Die gepufferte Lösung wird dann einer Ionenaus tauschchxomatographie mit einem geeignetem Kationenaustauscher unterworfen, der auf einen pH von etwa 4,0 bis etwa 5,0 eingestellt ist. Der Protein-Kationenaüstauscher- -Kornplex wird mit einem geeignetem Salzgradienten behandelt und die gebildeten Fraktionen, welche die gereinigte Superoxid-Dismutase und Analoge enthalten, werden gesammelt.

COIf Ό ~^:

Beschreibung der Figuren

Die Restriktionstafeln jedes der Plasmideϊ die in den Figuren 1 bis 31 dargestellt- sind, geben nicht alle Restriktionsstellen wider, die an dem jeweiligen plasmid vorhanden sind. In einigen Fällen sind die Restriktionsstellen in einer Figur dargestellt, jedoch in einer anderen nicht. In allen Fällen sind jedoch jene Restriktionsstellen dargestellt, T/elche für ein vollständiges Verständnis der Erfindung erforderlich sind.

Fig. 1 Herstellung von ρΑΙ500

Ein Plasmid, das bGH cDM, D4 (ATGC Nr. 31826), enthält, wurde mit Haell umgesetzt. Das resultierende große I6OO Bas enpaar fragment wurde gereinigt Lind bei 37 C 5 Minuten S1-Exonuclease ausgesetzt. Ein synthetischer EcoRI-Kuppler mit der Sequenz:

GGMTTCC CCTTAAGG

wurde an die Enden der gebildeten Fragmente durch Ligation gebunden. Das Ligationsgemisch wurde mit EcoRI gespalten und in pBR322 (ATCC Mr. 37017) eingeführt, welches mit EcoRI gespalten wurde. Ein Klon, pALRI, wurde erhalten,' welches nach der Spaltung mit EcoRI ein 1200 Basenpaarfragment freisetzte mit der Sequenz:

AATTCCCAGCCATG.... GGGTCGGTAC....

an dem 5'-Ende. Diese Sequenz zeigte, daß ρALRI eine EcoRI-Restriktionssteile aufweist, welche das TTC-Kodon des Restes Ur. 1 (Phenylalanin) von natürlichem bGH auf-

weist. pALRI wurde einer partiellen Spaltung mit Pstl unterworfen. Das Umsetzungsprodukt wurde mit einem großen DNA-Polymerase-I-Fragment (Klenow) unterworfen und HindiII-Kuppler mit der Sequenz:

GAAGCTTC CTTCGAAG

wurden durch Ligation verbunden. Das Ligationsgemisch wurde mit EcoRI und Hindlll gespalten. Das Fragment, das bGH-cDNA enthält, wird isoliert und in pBR322 zwischen den EcoRI und Hindlll Restriktionsstellen subgeklont, um pAL500 (ATCC Nr. 39782) zu erhalten.

Fig. 2 Herstellung von pRO211 und pRO12

Das Plasmid pJH200 (ATCC Nr. 39783) wird teilweise mit Ndel umgesetzt, bzw. davon angegriffen, mit DNA-PoIymerase I (Klenow) behandelt, um die Enden zu füllen, wobeidie gebildeten. Enden einer erneuten Ligation.unterworfen werden, um den Expressionvektor pR0211 zu bilden. Der Expressionsvektor pR0211 wird Ndel und Hindlll umgesetzt, das große Fragment wird isoliert und einer Ligation mit einem NdeI-HindiII-bGH-Fragment unterworfen, das aus pAL500 (ATCC Nr. 39782) isoliert worden ist, um pR012 zu erhalten. (Das Ndel-HindiII-Fragment wurde aus pAL50 0 erhalten, indem es mit EcoRI umgesetzt wurde und die Enden des Umsetzungsprodukts einer Ligation unterworden wurden mit einem synthetischen Kuppler mit der Sequenz:

TATGGATC

ACCTAGTTAA

Das Ligationsgemisch wurde mit Ndel und Hindlll umgesetzt

und das gebildete NdeI-HindiII-bGH-Fragment isoliert.

8.85- 2.77996

ft

Fig. 3 Herstellung von pSAL 5200-6

pRO12 (Fig. 2) wurde teilweise mit PvuII umgesetzt, gefolgt von einer Umsetzung mit Ndel; um ein 72-Basenpaar-5

fragment zu eliminieren. Eine synthetisches DNA-Fragment, das die ersten 24 Aminosäuren'des N-Terminus von authentischem bGH kodiert, wurde mit dem einer Umsetzung unterworfenen pRO12 einer Ligation unterworfen.

Ein synthetisches DNA-Fragment wurde hergestellt, indem zwei phosphorylierte synthetische einsträngige DNA folgender Sequenz einer Wärmebehandlung unterworfen wurden:

(XAIATGICCITGirCGGCC^ '

3' -

Das einer Wärmebehandlung unterworfene Fragment wurde

mit DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von sämtlichen 20

vier Desoxiribonucleosidtriphosphaten behandelt, um das doppelsträngige DNA der vollen Lange zu erhalten. Das Fragment wurde mit PvuII und Ndel umgesetzt, bevor es einer Ligation mit pRO12 umgesetzt wurde, um pSAL5200-6

zu bilden

25

Fig. 4 Herstellung von p3008

P3008 (ATCC Nr. 39804) wurde hergestellt, indem Ndel ,

das mit pRO211 (Fig. 2) umgesetzt worden ist, mit dem 30

pGH-Fragment einer Ligation.unterworfen wurde, welches aus dem Nde_I-Umsetzungsprodukt des Plasmids ppGH-Ndel/RI isoliert worden ist.

ppGH-Ndel/Ri enthält die volle Länge von pGH-cDNA an beiden Enden, an die Ndel-Stellen mit synthetischen Kupplern geknüpft wurden.

S.S5- 277996

Fig. 5 Herstellung von P5002

p5002 wurde hergestellt durch dreiteilige Ligation eines dimerisierten synthetischen Kupplers und dem 2 cGH-Fragmenten, die isoliert wurden von einem Ndel- und Benll-Umsetzungsprodukt des Plasmids pcGH-Ndel/RI. Das Liga-• tionsgemisch wurde mit Ndel umgesetzt und dann einer Ligation mit dem Expressionsvektor pRO211 (Fig. 2) unterworfen, nachdem es mit Ndel einer Restriktion unterzogen worden ist. Eine Kolonie, die das Plasmid p5002 · enthält, wurde isoliert.

Der synthetische Kuppler wurde aus zwei einsträngigen synthetischen DNA der folgenden Sequenz hergestellt: 15

tatgttccctgccatgcccctctccaacctgtttgccaacgctgtgctgagggct acaagggacggtacggggagaggttggacaaacggttgcgacacgactc

Der Kuppler wurde vor der Ligation phosphoryliert. Der 2Q Kuppler kodiert die.ersten 18 Aminosäuren des N-Terminus der authentischen cGH.

Das Plasmid pcGH-Ndel/RI enthält cGH-cDNA in voller Länge, an dessen 5 ' -Ende eine EcoRI-Restriktionssteile sich befindet und an dessen 3'-Ende eine Ndel-Restriktionsstelle, Diese Restriktionsstellen werden mit synthetischen Kupplern addiert.

Fig. 6 Herstellung pHG44 und pHG50

pRO12 (Fig. 2) wurde mit Hindlll umgesetzt. DNA der linearen Form (Form III) wurde mit Agarose-Gel gereinigt und an ein HindiII-HindiII-Fragment mit etwa 1200 Basenpaaren geknüpft, welches die rRNA-Operon-Transkriptions-Terminierungssequenzen T.T_ enthält. Das T₁T₇ Hindlll-HindlII-Fragment wurde von dem Plasmid pPS1 (ATCC Nr. 39807) isoliert, welches mit Hindlll umgesetzt worden ist.

Il Öl· 277996

Das gebildete Plasmid pHG44 (ATCC Nr. 39806) enthält die T₁T₂~Seqi

bGH-Sequenz.

die T-T„-Sequenzen an dem 3'-Ende der Rekombinations(rec)

Das Plasmid pSK434 (ATCC Nr. 39784) , welches die

\ 434

ACl -Repressorsequenzen enthält, wurde mit Hpall um-

\ 434

gesetzt. Das AcI Hpall-Hpall-Fragment wurde isoliert und mit pHG44 verknüpft, welches mit CIaI umgesetzt worden ist. Das gebildete Plasmid pHG50 (ATCC Nr. 39805) enthält die T..T„-Transkriptions-Terminierungssequenzen und die AcI -Repressorsequenz.

Fig. 7 Herstellung von p8300-10A.

Das Plasmid p8300-10A (ATCC Nr. 39785) , welches ein Analoges der natürlichen Phenylalaninform von bGH wiedergibt, das Methionin als N-Terminus (met-phe-bGH) aufweist,'wurde folgendermaßen hergestellt. Das Plasmid p7200-22 enthält den ^P -Promotor und eine ribosomale Bindungsstelle, welche sich von pJH200 (ATCC Nr. 39783) ableitet, DNA, welches met-phe-bGH kodiert und die T-T„-rRNA-Terminierungssequenzen. Das CIaI-CIaI-Fragment, das den)cP_T -Promotor, die C_TT-ribosomale Bindungsstelle,

L· 1.1.

das met-phe-bGH-Gen und die T..T₇-Transkriptions-Terminie-I^

rungssequenzen enthält, wurde in die einzige Clal-Stelle des Plasmids pOP1£i6 eingeführt, ein Plasmid einer hohen konstitutiven Vervielfältigungszahl, um p8300-10A zu bilden.

Fig. 8 Herstellung von pSAL-130/5 und pSAL-170/10

Das Plasmid pHG44 (ATCC Nr. 39806) , welches met-asp-glnbGH-Protein widergibt, wurde mit Ndel und Hindlll umgesetzt. Das gebildete Ndel-Hindlll bGH-Fragment ^uvJ wurde isoliert und an ein Fragment von p8300-10A (ATCC Nr. 39785) geknüpft, welches durch teilweise Umsetzung sowohl mit Ndel und Hindlll hergestellt worden ist.

- 2779S6

Durch eine derartige Ligation wird das met-phe-bGH-Genfragment durch das met-asp-gln-bGH-Genfragment ersetzt. Das so erhaltene Plasmid gibt rec-bGH wider. pSAL-170/10 wurde hergestellt, indem das EcoRI-Aval-Fragment, welches

das Tet^R-Gen des pBR322-Plasmids (ATCC Nr. 37017) enthält f mit DNA-Polymerase I (Klenow) behandelt wurde und indem in pSAL-130/5 eingeführt wurde, das mit BamHI umgesetzt wurde und das mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt wurde

10

Fig. 9 Herstellung von pSAL-210/4

DNA der linearen Form (Form III) wurde hergestellt durch teilweise Umsetzung von CIaI mit pSAL-170/10. Es wurde mit Agarose-Gel gereinigt und mit einem

4 34 el -Genfragment verknüpft, welches von einem Hpall-Umsetzungsprodukt des Plasmids pSK434 (ATCC Nr. 39784) isoliert worden ist.

20 Fig. 10 Herstellung von pSAL 5600-1

pSAL 5200-6 (Fig. 3) wurde mit HindiII umgesetzt. DNA der linearen Form (Form III) wurde mit Agarose-Gel gereinigt und mit einem HindiII-HindiII-Fragment mit

etwa 1200 Basenpaaren verknüpft, welches die rRNA Operon Transkriptions-Terminations-Sequenzen T..T-enthält

Das T.T_? -HindiII-HindIII-Fragment wurde aus dem Plasmid pPSl (ATCC 39807) isoliert, welches mit HindiII umgesetzt worden ist. Das gebildete Plasmid pSAL5600-1

enthält T^T^-Sequenzen an dem 3 '-Ende der met-asp-glnbGH-Sequenz.

Fig. 11 ' Herstellung von p3009

Das Ndel-Nde-I pGH-Fragment wurde isoliert aus Plasmid p3008 (ATCC Nr. 39804) (Fig. 5). Das Fragment wurde in die einzige Ndel-Stelle der Expressionsvektors p579

Tl. 8.35- 277996

Ί51 7

(Fig. 19) eingeführt, welcher mit Ndel umgesetzt worden ist. Das gebildete Plasmid p3009 gibt ein Analoges des natürlichen Schweinewachstumshormonproteins wieder, das einen Methioninrest aufweist, das an den N-Terminus addiert worden.ist.

Fig. 12 Herstellung von p5003

Das Ndel-Ndel-cGH-Fragment wurde aus Plasmid p5002 isoliert. Das Fragment wurde in die einzige Ndel-Stelle des Expressionsvektors p579 (Fig. 19) eingeführt, welcher mit Ndel umgesetzt worden ist. Das gebildete Plasmid p5003 (ATCC Nr. 39792) gibt ein Analoges des natürlichen Hühnerwachstumhormonproteins wieder, welches einen Methioninrest aufweist, der an den N-Terminus addiert ist.

Fig. 13 Herstellung von pS0Dct2

Der pJH200 (ATCC Nr. 39783) Expressionsvektor wurde mit Ndel umgesetzt. Das 550 Basenpaar-Ndel-Fragment, das den Ap_t -Promotor und die C-j-j-ribosomale Bindungsstelle enthält, wurde isoliert und in die einzige Ndel-Stelle des Plasmids pSOD NH-10 eingeführt, welches rät Ndel umgesetzt worden ist {Plasmid pSOD NH-10 wird von einem cDNA-Klon von humanem SOD abgeleitet [jäeman-Hurwitz, J. et al, PNAS (1982), Band 79, S. 2808]). Das gebildete Plasmid pSOD NH-550 wurde mit AIuI umgesetzt. (In der Figur ist -lediglich die relevante Alu-Stelle dargestellt) Das große Alu-Fragment, das den \p_T-Promotor und das SOD-Gen enthält, wurde isoliert. BarnHI-Kuppler wurden hinzugefügt und das gebildete Fragment wurde mit BamHI umgesetzt. Das BamHI-Umsetzungsprodukt wurde in die einzige BamHI-Stelle von pBRM (ATCC Nr. 37283) eingeführt, um pSOD(X2 (ATCC Nr. 39786) zu bilden.

Fig. 14 Herstellung von pSOPpLi 3 und pSODßi

Das Plasmid pSODC(2 (ATCC Nr. 39786) wurde teilweise mit

27.8.85- 277996

EcoRI umgesetzt und das gebildete DNA linearer Form wurde isoliert mit Agarose-Gel. Das gereinigte DNA-wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt und erneut einer Ligation unterworfen. Das gebildete Klon pS0Do:13 enthält eine EcoRI-Steile, welche an dem 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet'ist. Das Fragment, das den ß-Lactamase-Promotor und eine ribosomale Bindungsstelle enthält, wurde aus dem Plasmid pBLA11 isoliert (ATCC Nr. 39788),..welches ,mit EcoRI und AIuI ungesetzt wurde. Das 200 Basenpaarfragment wurde mit dem großen Fragment verknüpft, welches aus pSODcO 3 isoliert worden ist, welches mit Ndel umgesetzt worden ist, gefüllt mit DNA-Polymerase I (Klenow), und dann mit EcoRI umgesetzt wurde. Das gebildete Plasmid pSODßi enthält die ribo- · somale Bindungsstelle des ß-Lactamase-Gens und des ^P_T-Promotors.

Fig. 15 Herstellung von pSODß.T..

Plasmid pBR322 (ATCC Nr. 37017) wurde mit EcoRI und Aval umgesetzt. Das gebildete DNA wurde mit DNA-Polymerase (Klenow) gefüllt. Das Tet -Gen-Fragment wurde dann isoliert und mit dem großen Fragment verknüpft, welches aus dem pSODßi-Plasmid (Fig. 14) isoliert wurde, welches

mit Pstl umgesetzt wurde, gefolgt von einer teilweisen BamHI-ümsetzung, und dann mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt wurde. Das gebildete Plasmid pSODß.T.. enthält das Tet^R-Gen.

Fig. 16 Herstellung von pSODß.TT-1

Das rRNA-T.jT^-Transkriptions-Terminierungsfragment wurde aus dem Plasmid pPSl (ATCC Nr. 39807) isoliert, welches mit HindiII umgesetzt und mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt wurde. Das Fragment wurde mit dem Plasmid pSODß.T.. (Fig. 15) verknüpft, welches teilweise mit BamHI umgesetzt und mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt

Ul- 277996

Fig. 17 Herstellung von pSODB..BA-2

Ein.sythetisches DNA-Fragment mit der Sequenz:

5'-AATTCAATAATATTGAAAAIAGGAAGAG-S'

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT

welches ähnlich der Sequenz der natürlich ß-Lactamase

ribosomalen Bindungsstelle ist, wurde phosphoryliert 10

und mit dem großen Fragment von pSODcc.13-Plasmid (Fig. 14) verknüpft, welches mit Ndel und EcoRI umgesetzt wurde.

Fig. 18 Herstellung von pTV-188

Das Plasmid pApoE-EX2 (ATCC Nr. 39787) wurde mit Ndel umgesetzt und die Fragmente wurde mit DNA-Polymerase .1 (Klenow) gefüllt. Das gebildete ApoE-Genfragment wurde isoliert und die einzige stumpfe Stul-Endstelle des

'PSODB₁T₁₁-PIaSmId (Fig. 15) eingeführt. Das gefüllte im

Plasmid pTV-188 gibt ein verschmolzenes ApoE-Protein wieder.

Fig. 19 Herstellung von p579

Das rRNA-Operon-T.T_-Transkriptions-Terminierungsfragment wurde aus dem Plasmid pPS1 (ATCC Nr. 39807) isoliert,

welches mit HindiII umgesetzt wurde. Das T₁T -Fragment ι ζ

wurde in die einzige HindIII-Steile von pRO211 (Fig. 2)

eingeführt, welches mit Hindlll umgesetzt worden ist. ν

Der gebildete Expressionsvektor p579 enthält den ΛΡ_Τ-Promotor, die C-j-ribosomale Bindungsstelle, gefolgt von den T.T -Transkriptions-Termini^rö^rrungssignalen.

Fig. 20 Herstellung von pTV-170 35

Das Njje.1 -NdeI-ApoE-Fragment wurde aus dem Plasmid pApoE-EX2 (ATCC Nr. 39787) isoliert und dann in die einzige Ndel-

11. 8.8b- 277996

* Stelle des Expressionsvektors p579 (Fig. 19) eingeführt, welcher mit Ndel umgesetzt wurde. Das gebildete Plasmid pTV-170 gibt ein Analoges des natürlichen menschlichen ApoE-Proteins wider, welches einen Methioninrest aufweist, der an den N-Terminus addiert worden ist.

Fig. 21 Herstellung von pTV-190

Das Plasmid pTV-170 (Fig. 20) wurde teilweise mit Ndel umgesetzt und mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt. Das isolierte DNA linearer Form wurde einer erneuten Ligation unterworfen, um das Plasmid pTV-190 zu erhalten, welches analysiert wurde, wobei festgestellt wurde, daß es 'lediglich eine Ndel-Stelle an dem 5'-Ende des ApoE-Gens aufweist.

Fig. 2 2 Herstellung von pTV-194

Der ß-Lactamase-Promotor und das ribosomale Bindungs-Stellenfragment wurden aus Plasmid pBLAi1 isoliert (ATCC Nr. 39788) nach Umsetzung mit EcoRI und Alul. Dieses Fragment wurde mit dem großen Fragment des pTV-170-Plasmids (Fig. 20) verknüpft, welches mit Ndel umgesetzt worden ist, gefüllt mit DNA-Polymerase I' (Klenow) und dann umgesetzt mit EcoRI.

Fig. 23 Herstellung von pSAL 160-5

-Ava_I-Fragment, welches die ApoE-DMA-Sequenz enthält, wurde aus pTV-170 (Fig. 21) isoliert, welches mit Aval umgesetzt worden ist. Das Fragment wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt und mit Agarose-Gel isoliert. Das gereinigte ApoE-Fragment wurde in die Pstl-Stelle des pTV 104(2)-Plasmids (ATCC Nr. 39384) eingeführt, welches mit P_stl teilweise umgesetzt und mit .DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt worden ist. Das gebildete Plasmid wurde als pSAL 160-5 bezeichnet.

273.05- 277996

Fig. 24 Herstellung von pTV-214

Ein synthetisches Fragment, das die ersten 14 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons mit folgender Sequenz enthält:

tatgttcccaaccattccattatcccgtctgttcgacaacgc acaagggttggtaaggtaatagggcagacaagctgttgcgat

-32 wurde phosphoryliert unter Verwendung von χ P-ATP und Polynukleotidkinase. Der phosphcfrylierte Kuppler wurde in die einzige Ndel-Stelle des pTV-190-Plasmids eingeführt, welches Ndel umgesetzt wurde,

Fig. 25 Herstellung von pTVR 279-8

pTVR 279-8 wurde hergestellt aus pTV 264-45, welches aus pTV 190 hergestellt worden ist.

^Da-S Plasmid pTV 190, welches die Expression des Met-ApoE3-Analogen steuert, wurde teilweise mit Aval gespalten, das unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I gefüllt und einer erneuten Ligation unterworfen wurde. Das gebildete Plasmid, das als pTV 264-45 bezeichnet wird, wird an der Aval-Stelle am 3'-Ende des Gens weggelassen .

Plasmid pTV 264-45 wurde vollständig mit Ndel umgesetzt und an phosphorylierte synthetische Kuppler folgender Sequenz gebunden:

5'-TATGCTGCTGCT

ACGACGACGAAT-S'

Das gebildete Plasmid, das als pTVR 279-8 bezeichnet

wird, bestimmt die Expression eines met-leu-leu-leu-met- ApoE3-Analogen.

ο"? ο

2/3.05- 277996

Fig. 26 Herstellung von p9200

Das Plasmid p9200 wurde hergestellt, indem von dem pHG44 das meiste des Ampecillinwiderstandsgens eliminiert und dasselbe durch das Tetracyclinwiderstandsgen von pHG44 ersetzt wurde.

pHG4 4 wurde mit CIaI und Pstl gespalten, das mit dem

Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt wurde, 10

und das große DNA-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde an das kleine DNA-Fragment von pBR322 gebunden, das nach der Spaltung von pBR32 2 mit EcoRI und Aval und der Behandlung mit dem Klenow-Fragment isoliert wurde. Das Pläsmid, das durch die Ligation gebildet wurde, wurde

als p9200 bezeichnet.

Das Plasmid p9200 bestimmt die Expression des met-asp-glnbGH-Analogen und verleiht seiner Wirtszelle Tetracyclin-

resistenz'. 20

Fig. 27 ' Herstellung von pTV

1 pTV 300 bestimmt die Expression des met -hGH-Analogen.

pTV 300 wurde hergestellt durch Spaltung von pTV 18(1) mit

1

Ndel, Isolierung der met -hGH-DNA und Verknüpfung derselben mit p579 (Fig. 19), das mit Ndel gespalten wurde.

pTV 18(1) kann erhalten werden, wie in der veröffentlich-

ten europäischen Patentanmeldung Nr. 0131843 A1 , veröffentlicht am 13. Januar 1985, beschrieben, oder wie in der korrespondierenden US-Patentanmeldung Nr. 514188. beschrieben, die am 15. Juli 1983 hinterlegt wurde, wobei letztere

durch Bezugnahme hier aufgenommen wird. 35

Ti. S.85- 277996

2 S I 7

Fig. 28 Zelluläre Toxizität, die mit der intrazellulären Akkumulation des ApoE-Analogen zusammenhängt

Kulturen von C600-Zellen (5 ml), die pTV 194 enthalten, oder von nicht-transfektierten Kontrollzellen wurden induziert, indem die Inkubationstemperatur von 3O⁰C auf 4 2°C erhöht wurde. Nach den angegebenen Zeiten wurde ein 1 ml-Aliquot der Kultur entnommen, rasch mit Eis gekühlt, in Serie mit dem Nährmedium verdünnt, in Gegenwart geeigneter Antibiotika nach dem Blattverfahren auf Agar aufgebracht und über Nacht bei 30⁰C inkubiert. Die Zahl der Kolonien wurde anhand des Durchschnitts der duplizierten Platten bestimmt. Parallele Kulturen von mit pTV 194 transfektierten und nicht nicht-transfektierten C600-Zellen, die auf 3O⁰C gehalten wurden, dienten als nicht-induzierte Kontrollen.

Fig. 29 Bindung von ApoE-DMPC-Komplexen an Apo-B,E(LDL) -

Rezeptoren auf Fibroplasten 20

Phospholipide Komplexe von biomanipuliertem (met-ApoE-3-Analoges) und von authentischem ApoE wurden durch Inkubation der Proteine und DMPC bei 22°C hergestellt. Die Komplexe wurden von dem nicht-komplexierten Material durch Dichtegrandient-Ultrazentrifugation getrennt, wie beschrieben (30, nach Beispiel 38). Links: Fähigkeit der biomanipulierten und authentischen ApoE-DMPC-Komplexe beim Wettbewerb 125

um I-markiertes Human-LDL um die Bindung an kultivierte Fibroplast-Rezeptoren bei 4⁰C. Rechts: Fähigkeit von 12 5 I-markierten ApoE-Analogem und authenischen ApoE-DMPC-Komplexen zur direkten Bindung an kultivierte Fibroplasten.

Fig. 30 Bindung von ^{1 25}I-ApoE-DMPC-Komplexen an ApoE-

Rezeptoren an hepatischen Membranen 35

Phospholipid-(DMPC)-Komplexe wurden hergestellt, wie in Fig. 29 beschrieben. Hepatische Membranen von erwachsenen

Tl. 8.35- 277996

mit Cholesterol gefütterten Hunden dienten als Quelle für die ApoE-Rezeptoren und wurden hergestellt, wie beschrieben (32, nach Beispiel 38). Die Bindung von den 1 25l-markierten biomanipulierten und authentischen ApoE-DMPC-Komplexen an die Membranen wurde bei 4⁰C durchgeführt, wie beschrieben (32, nach Beispiel 38).

Fig. 31 Diagramm von jodiertem ApoE aus Kaninchenplasma

Biomanipuliertes und authentisches ApoE wurden bei 37°C 30 Minuten mit 1 ml Kaninchenplasma vor der Injektion des Gemischs in eine Kaninchenvene inkubiert. Etwa 2 ml Blut wurden an den angegebenen Zeitpunkten in ein Gläschen, das EDTA enthält, gegeben und das Plasma wurde zum Zählen hergerichtet. Die Zählimpulse wurden für TCA-lösliche Zersetzungsprodukte korrigiert, wie beschrieben (33, nach Beispiel 38).

Detaillierte Beschreibung, der Erfindung

Es wurde ein Vektor entwickelt, der es erlaubt, erhöhte Niveaus der Genexpression und Polypeptidproduktion zu erhalten. Das Plasmid ist ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Nach der Einführung in eine geeignete bakterielle Wirtszelle, die den thermolabilen Repressor C_T enthält, versetzt das Plasmid die Wirtszelle in die Lage, nachdem die Temperatur der Wirtszelle auf eine Temperatur erhöht worden ist, bei der der Repressor inaktiviert wird, die Expression des erwünschten Gens durchzuführen, welches in das Plasmid eingeführt worden ist, sowie die Produktion eines Polypeptids, das durch das Gen kodiert ist.

Der Vektor umfaßt in der 5'- bis 3'-Reihenfolge folgendes: Eine DNA-Sequenz, welche den Promotor und Operator P 0_T

Li L· aus /^-Bakteriophagen enthält;

?7. 8.85- 277996

2 5 f 7 8"

die N-Verwendungsstelle zur Bindung eines Anti-Terminator-N-Proteins;

eine erste Restriktionsenzymstelle, die den Ersatz der DNA-Sequenz ermöglicht, welche die ribosomale Bindungsstelle enthält, die nachstehend angegeben ist;

eine DNA-Sequenz, welche eine ribosomale Bindungsstelle enthält, um die mRNA des gewünschten Gens in die Lage zu versetzen, die Ribosomen an die Wirtszelle zu binden;

einen ATG-Initiierungs-Kodon oder eine DNA-Sequenz,, welche in einen ATG-Initiierungs-Kodon umgewandelt wird, nach dem das gewünschte Gen in den Vektor eingeführt wor- *° den ist; und

eine zweite Restriktionsenzymstelle zur Einführung des erwünschten Gens in den Vektor in einer Phase mit dem

ATG-Initiierungs-Kodon

2Ö

Der Vektor weist ferner eine DNA-Sequenz auf, welche einen Urspung der Replikation des bakteriellen Plasmids enthält, welches zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist, sowie ein Selektionsmittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DNA-Sequenzen besteht, welche ein Gen enthalten, das mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal verbunden ist, welches sich manifestiert, wenn der Vektor in der Wirtszelle vorhanden ist, sowie DNA-Sequenzen, welche das Fragment enthalten, das als el bezeichnet

4 34 wird, welches Fragment das Gen für das el -Repressorprotein umfaßt und dessen assoziierte Promotor- und

4 34 4 34

Operatorsequenz, el unterdrückt ein el -Lysogen; der Verlust des Plasmid führt zur Zellyse. Der Abstand zwischen dem 3 '-Ende des P₇-CL -Promotors und der Operatorsequenz und dem 5'-Ende der N-Verwendungsstelle ist kleiner als etwa 80 Basenpaare und der Abstand zwischen

0.35- 2.77996

51.7-

dem 3'-Ende und der N-Verwendungsstelle und dem 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle ist kleiner als etwa :30 0 Basenpaare.

Eine mögliche zusätzliche Komponente des Vektors ist eine T..T_-rRNA-Transkriptions-Terminierungs Sequenz , die an 3' der zweiten Restriktionsenzymsteile angeordnet ist. Die T^T^-rRNA-Transkriptions-Terminierungssequenz ist vorzugsweise kleiner als etwa 100 Basenpaare von dem 3'-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle. Noch bevorzugter ist die T.T -rRNA-Transkriptions-Terminierungssequenz kleiner als etwa 20 Basenpaare von dem 3'-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle.

Der Vektor enthält entweder eine DNA-Sequenz, welche ein Gen umfaßt, das mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal verbunden ist, welches sich manifestiert, wenn der Vektor in der Wirtszelle

434' vorhanden ist, oder eine DNA-Sequenz, welche das el Repressor-Gen enthält, welches das ^imm4 34cl -Lysogen unterdrückt, oder beides.

Geeignete Gene, welche mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal verbunden sind, sind jene, welche mit einer Temperaturempfindlichkeit oder Arzneimittelbeständigkeit verbunden sind, z. B. einer Beständigkeit gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol

4 34 oder Tetracyclin. Wenn das el -Repressorgen in dem Wirt enthalten ist, ist der Wirt an einer ^imm4 Prophageninduktion gehindert. Es besteht deshalb keine Notwendigkeit, teure antibiotische Selektionssalzlösungen

434 zu verwenden, wenn el vorhanden ist.

Der Vektor umfaßt vorzugsweise sowohl eine DNA-Sequenz, welche ein Gen enthält, das mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal behaftet ist, wie eine DNA-Sequenz, welche ein Fragment enthält, das

Tl. 8 85- 277996-

434

als el bezeichnet wird.

434 Wenn das el -Gen bei dem Vektor vorhanden ist, ist es

vorzugsweise nach dem 3'-Ende der T₁T-₎-rRNA-Sequenz angeordnet.

Der Vektor umfaßt ferner einen Ursprung der Replikation eines bakteriellen Plasmids, das zur autonomen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Ein geeigneter derartiger Ursprung der Replikation kann aus zahlreichen Quellen erhalten werden, beispielsweise aus pBR322 oder pRi.

Der Vektor weist vorzugsweise einen Ursprung der Replikation von einem bakteriellem Plasmid mit hoher konstitutiver Vervielfältigungszahl auf, welches zur autonomen Replikation in der Wirtszelle mit wenigstens 400 konstitutiven Vervielfältigungen des Vektors in der Lage ist. Am meisten bevorzugt als Ursprung der Replikation ist CoIEl. Der am meisten bevorzugte Ursprung ist das Plasmid ρΟΡ-1Δ6 , welches eine Restriktionskarte aufweist, die in Fig. 7 widergegeben ist.

Eine weitere Komponente des Vektors ist eine erste Restriktionsenzymstelle, die den Ersatz der DNA-Sequenz erlaubt, welche die ribosomale Bindungsstelle enthält, wie nachstehend angegeben. Zahlreiche derartige Stellen können verwendet werden. Geeignete Stellen umfassen EcoRI.

Eine andere Komponente des Vektors ist eine zweite

Restriktionsenzymstelle zur Einführung des gewünschten Gens in das Plasmid in einer Phase mit dem ATG-Initiierungs-

Kodon. Zahlreiche derartige Stellen können verwendet • werden. Geeignete Stellen umfassen Ndel, CIaI, Hindlll, Smal, BgIII, Xbal, Sacl und Alul.

27 0.05- 277996

Im allgemeinen ist es erwünscht, daß die zweite Restriktionsenzymstelle ebenfalls als die zweite Restriktionsstelle funktioniert, welche notwendig ist, um die DNA-Sequenz zu ersetzen, welche die ribosomale Bindungsstelle aufweist. Falls die zweite Restriktionsstelle nicht ebenfalls zu diesem Zweck verwendet wird, dann muß der erfindungsgemäße Vektor ferner eine-dritte Restriktionsenzymstelle nach der ribosomalen Bindungsstelle aber vor der zweiten Restriktionsstelle aufweisen.

Der Vektor enthält vorzugsweise zwei einzigartige Restriktionsenzymstellen. Die erste Stelle ermöglicht den Ersatz der DNA-Sequenz, welche die ribosomale Bindungsstelle enthält. Die zweite Stelle ermöglicht die Einführung des gewünschten Gens in das Plasmid in einer Phase mit dem ATG-Initiierungs-Kodon. Der Ausdruck "einzigartige Restriktionsenzym" -Stelle soll hier eine Restriktionsenzymstelle bezeichnen, die .lediglich ein einziges Mal in dem Plasmid vorkommt. Bei der gegenwärtig bevorzugten ^O Ausführungsform ist EcoRI die erste Restriktionsenzymstelle und Ndel die zweite Restriktionsenzymstelle.

Vorzugsweise ist der Vektor ein kovalt geschlossenes kreisförmiges doppelsträngiges Molekül. Es ist jedoch nicht wesentlich, daß das Plasmid kovalent geschlossen ist.

Das Plasmid erreicht sein erhöhtes Expressionsniveau, nachdem die Wirtszelle auf eine Temperatur erwärmt worden

^O ist, bei der das C^-Repressor-Protein inaktiviert wird. Eine Temperatur oberhalb etwa 38⁰C ist zu diesem Zweck wirksam, und da es erwünscht ist, daß eine unnötige Wärmebeschädigung der Wirtszellen soweit wie möglich verhindert wird, ist es im allgemeinen erwünscht, daß die Temperatur 42⁰C um mehr als wenige Grade nicht übersteigt .

278.85- 277996

23 1 7 6

Eine wichtige Komponente des Vektors ist die ribisomale Bindungsstelle. Geeignete Stellen sind'C vom λ-Bakteriophagen mit folgender Sequenz:

TAAGGAAATACTTACAT

ATTCCTTTATGAATGTA;

eine Mutante von C_TT des λ-Bakteriophagen mit folgender Sequenz: 10

TAAGGAAGTACTTACAT

ATTCCTTCATGAATGTA;

das Hauptkopf-Protein-Gen des Bakteriophagen \ mit folgender Sequenz:

_TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC;

die natürliche ß-Lactamase ribosomale Bindungsstelle, die sich von pBR32 2 ableitet;

ein synthetisches Oligonukleotid mit folgender Sequenz:

AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA

GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT;

ein synthetisches Oligonukleotid mit folgender Sequenz:

AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT;

und

eine natürliche ribosomale Bindungsstelle, die sich vom Bazillus thurengensis ableitet.

27. a85-- 277996

2 5 1 7 £

Bezüglich der vorstehend beschriebenen Vektoren sei bemerkt, daß die erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden können, um eine erhöhte Expression einer großen Anzahl von Genen zu erhalten, die erwünschte Polypeptid-Produkte kodieren. Geeignete Gene sind Gene, welche Wachstumshormone kodieren, z. B-. Rinder-, Schweine-, Hühner- oder -menschliche Wachstumshormone; Superoxid-Dismutase; Apolipoprotein E oder Analoge oder eines der vorstehenden. Unter einem Analogen ist ein Polypeptid zu verstehen, das die gleiche Aktivität wie ein natürlich vorkommendes Polypeptid aufweist, bei dem jedoch eines oder mehrere verschiedene Aminosäuren hinzugefügt oder weggelassen oder sowohl hinzugefügt und weggelassen an dem N-Terminus des Polypeptids.

Der bevorzugte Wirt zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Plasmiden ist E. coli. Die gegenwärtig bevorzugten Stämme sind A1637, A1645, A2602, A2097, A1563 und A1645 (\i434cl~ mini Tn10).

A1645 stellt gegenwärtig den am meisten bevorzugten Stamm zu Expression der Superoxid-Dismutase und eines Analogen davon dar.

A1645 und A1645 (\i4 34cl mini TN10) werden gegenwärtig am meisten bevorzugt als Stämme zur Expression von tierischen Wachstumshormongenen.

A2097 ist der gegenwärtig am meisten bevorzugte Stamm zur Expression von Genen, welche erzeugen:

1) ein Analoges von bGH mit einer Aminosäuresequenz met-asp-gln, die dem Amino-Terminus der Phenylalaninform von authentischen bGH zugefügt ist; oder "

2} ein Analoges von cGH mit der Aminosäure Methionin, die dem Amino-Terminus der Phenylalaninform von

27 3.05- 277996

natürlichem cGH hinzugefügt ist.

A16 37 wurde aus C6 00 erhalten, indem Transposon eingeführt wurde, welches ein tetracyclinresistentes Gen in dem

\

Galaktose-Operon aufweist, sowie das Α-System zur Expression, welches dem Galaktose-Operon nahe steht. c600 ist erhältich von der "American Type Culture Collection" unter der Zugangsnurttner 23724.

A1645 wird aus A16 37 erhalten durch Selektion von GaI (Fähigkeit, Galaktose zu fermentieren) sowie als Verlust der Tetracyclinbeständigkeit. Es enthält das Lambda-Expressionssystem, iedoch ist ein Teil des Transposons durch Selektion entfernt worden. Sein Phänotyp ist C600 r~m⁺ gal⁺ thr"" leu~lacZ~ bl ( ^d 8 5 7AH1ÄBamH1 " N ⁺ ) A1645 ist beider "American Type Culture Collection" in Rockwell, Maryland, U.S.A., hinterlegt worden und enthält zahlreiche Plasmide, welche nachstehend näher

beschrieben werden

20

A1645 (^i434cl mini Tn10) wurde erhalten durch Infektion eines E. coli-Stammes Ά1645, der ein Plasmid enthält, und zwar mit imm4 34 CI3008 mini Τη10Δΐ6£/Ι7 bei 3O⁰C. Tetracyclinresistente Kolonien wurden isoliert und

gereinigt. Dieser Stamm, der Plasmid bHG50 enthält, wurde bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC-Zugangsnr. 39805 hinterlegt.

A2602 und A1563 wurden aus SA500 erhalten. Ihre Phänotypen sind SA500, his" ile~ gal⁺ Δ3 {\cl857AHi^Bam N⁺) bzw. SA500 his~ile~gal⁺Ä8 lacz" A21 (\cl857 int2 xisl

A2097 wurde aus A1645 erhalten. Sein Phänotyp ist A1645 lacAVA21 proC::Tn10.

277996

5 !

Prototrophische Stämme von Escherichia coli, welche ein hohes Niveau der Polypeptidexpression ermöglichen, selbst wenn sie in einem minimalen Medium wachsen, können ebenfalls als Wirte für die erfindungsgemäßen^/ Vektoren verwendet werden. Bevorzugte prototrophische Stämme sind A4200 und A4255. Der Stamm A4255, der das Plasmid p9200 enthält, wurde bei der ATCC unter der Zugangariummer 5 3215 hinterlegt. Noch mehr bevorzugt sind biotinunabhängige prototrophische Stämme, wie A4346, das das Plasmid pGH44 enthält, welches bei ATCC unter der Zugangsnummer 5 3218 hinterlegt wurde.

Lytische Stämme von Escherichia coli können ebenfalls als Wirte der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden. Geeignete lytische Stämme sind jene, welche bei einer Temperatur, bei welcher das Polypeptid mit einer niedrigeren Rate erzeugt wird, als der bei der das Polypeptid gebildet wird, eine Substanz erzeugen, beispielsweise ein Enzym, wie Endolysin, welches eine

Lyse der Zelle hervorruft. Dadurch kann die Zelle relativ große Mengen des gewünschten Polypeptids erzeugen, bevor die Menge der gebildeten eine Lyse hervorrufenden Substanz ein Niveau erreicht, welches eine Lyse der Zelle hervorruft. Beispiele für geeignete

ts

lytische Stämme sind jene, welche das P1cl -Plasmid enthalten, wie der Stamm A4048, der pGH44 enthält, welches bei ATCC unter der Zugangsnummer 5 3217 hinterlegt worden ist.

Alle Hinterlegungen wurden entsprechend dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen durchgeführt, außer daß pBR322 und pBRM, die von der "American Type Culture Collection" unter der ATCC-Zugangsnummer 37017 bzw. 37283 voll erhältich sind, wobei D4 unter der ATCC-Zugangsnummer 31826 im Zusammenhang mit einer US-Patentanmeldung hinterlegt wurde.

Ti. a85- 27799G

Z 5 1 7 € ;

Der Vektor kann nach Methoden gebildet werden, die einem Fachmann auf dem Gebiet,auf das sich die Erfindung bezieht, geläufig sind. Derartige Methoden werden im einzelnen in

verschiedenen hier angegebenen Veröffentlichung beschrie-5

ben, deren Inhalt hiermit in die vorliegende Offenbarung miteinbezogen wird, um eine vollständige Information hinsichtlich des Standes.der Technik zu geben.

Ein gegenwärtig bevorzugter Vektor istpjH200, welcher die in Fig. 2 dargestellt Restriktionskarte besitzt. Dieser Vektor wird in Escherichia coli unter Verwendung eines Stammes A1645 nach einer konventionellen Transformationsmethode eingeführt. Das gebildete Wirt-Vektorsystem wurde unter der ATCC-Zugangsnummer 39783 hinterlegt. Ein Gen, welches ein gewünschtes Polypeptid kodiert, beispielsweise ein Rinderwachstumshormon, kann in pJH200 eingeführt werden.

Ein zweiter bevorzugter Vektor, pRO211, wurde aus teilweise mit Ndel umgesetztem pJH200 erhalten. pRO211 weist die in Fig. 2 dargestellt Restriktionskarte auf. Rinderwachstumshormon cDNA wurde in pRO211 eingeführt durch Umsetzung des Vektors mit Ndel und Hindlll, Isolierung des großen Fragments und dessen Verknüpfung mit pGH-cDNA, das aus pAL500 (ATCC-Zugangsnr. 39782) erhalten worden ist. Das gebildete Plasmid wird als pRO12 bezeichnet. Die Restriktionskarte ist ebenfalls in Fig. 2 dargestellt. Das Plasmid pRO12 wurde teilweise mit PvuII, gefolgt von Ndel, umgesetzt. Ein synthetisches DNA-Fragment, das die ersten 2 4 Aminosäuren von dem N-Terminus des authentischen bGH kodiert, wurde mit dem umgesetzten ρR01.2 verknüpft. Das gebildete Plasmid das als pSAL 5200-6 bezeichnet wird, hat die Fig. 3 dargestellt Restriktionskarte

35

Die erfindungsgemäßen Vektoren können ebenfalls so manipuliert werden, daß sie Plasmide ergeben, welche mensch-

27. 3.Bj- 277996

' liehe Superoxid-Dismutase (SOD) oder deren Analoge produzieren. Ein Fragment von pJH200 (ATCC-Zugangsnrι 39783), das den Xp_t-Promotor und eine C_x -ribosomale Bindungsstelle enthält, wurde isoliert und dann in ein Plasmid pSOD NH-10 eingeführt, welches das Gen für humanes SOD enthält, um ein Plasmid zu bilden, das als pSOD NH-550 bezeichnet wird, wie in Fig. 13 dargestellt. Ein Fragment, das sowohl den ^P_x-Promotor und das SOD-Gen enthält, wurde aus pSOD NH-550 isoliert, gefolgt von einer Umsetzung mit Alu1. Nach der Addition von BamHI-Kupplern und nachfolgender Restriktion mit BamHI wurde das Fragment in die einzigartige BamHI-Stelle von pBRM eingeführt. pBRM ist ein Plasmid hoher Vervielfältigungszahl, welches unter der ATCC-Zugangs-Nr.

-37283 hinterlegt worden ist. Das gebildete Plasmid wird als pS0Dj>!2 bezeichnet. Es weist die in Fig. 13 dargestellte Restriktionskarte auf. Dieses Plasmid ist dem E. coli-Stamm 2097 unter der ATCC-Zugangsnummer 39786 hinterlegt worden.

Das Plasmid pSODc<2 (ATCC-Zugangs-Nr. 39786) enthält die C_TT-ribosomale Bindungsstelle. Diese ribosomale Bindungsstelle ist ersetzt worden durch ein Fragment, welches den ß-Lactamase-Promotor und die Shine-Dalgarno-ribosomale Bindungsstelle enthält, welche isoliert wurde von einem Umsetzungsprodukt von pBLAi1 mit EcoRI-AluI. (Plasmid pBLA11 weist die in Fig. 14 dargestellte Restriktionskarte auf und ist in dem Escherichia coli-Stamm A1645 unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39788 hinterlegt worden.) Die C_TT-ribosomale Bindungsstelle wird von dem pS0Dpt«2-Plasmid entfernt, wie in Fig. 14 dargestellt. pSOD0(2 wird mit EcoRI einer teilweisen Restriktion unterworfen, mit DNA-Polymerase I (Klenow) gefüllt oder ergänzt und einer erneuten Ligation unterworfen, sodaß die einzige E_coRI-Stelle, die in dem Plasmid zurückbleibt, an dem 5'-Ende von C RBS angeordnet ist. Das gebildete Plasmid, das als pSOD 13 bezeichnet wird, wird mit Ndel umgesetzt, welches mit DNA-Polymerase I

27. 8.85- 277996

(Klenow) gefüllt oder ergänzt wurde und dann mit EcoRI umgesetzt. Das große Fragment wurde isoliert und mit dem Fragment verknüpft, welches den ß-Lactamase-Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthält, welche von pBLAi 1 isoliert wor.den ist, um Plasmid pSODßi zu bilden.

pSODßi kann modifiziert werden, um ein tetracyclinresisten-

tes Genfragment (Tet ) zu enthalten anstelle eines

n -n

ampicillinresistenten Genfragmentes (Amp ) . Das Amp Fragment wurde vo^ch pSOD 1 durch Umsetzung mit Pstl entfernt, gefolgt von teilweiser BamHI-Umsetzung. Das gebildete Plasmid wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow) ergänzt. Das Tet -Genfragment wurde separat von einem Umsetzungsprodukt von pBR322 und EcoRI-Aval isoliert, ergänzt und mit dem ergänzten Plasmid verknüpft. (Plasmid pBR322 ist an vielen Stellen erhaltlich, beispielsweise bei der "American Type Culture Collection" unter" der ATCC-Zugangs-Nr. 37017.) Das dann gebildete Plasmid wird als pSODß.T.. bezeichnet. Es weist die in Fig. 15 dargestellte Restriktionskarte auf.

Ein weiteres Plasmid, welches verwendet werden kann, um menschliche Superoxid-Dismutase zu bilden, wird als PSODB₁-BA2 bezeichnet. Seine Herstellung aus pSODcxi 3 ist in Fig. 17 dargestellt.

Der erfindungsgemäße Vektor, beispielsweise pR0211, kann auch so manipuliert werden, daß er Schweine- oder Hühner-Wachstumshormone erzeugt. Wie in Fig. 4 dargestellt, wurde auf diese Weise Schweinewachstumshormon cDNA von einem Ndel-Umsetzungsprodukt von ppGH- Ndel/RI isoliert. Das erhaltene Fragment,das das pGH-Gen enthält, wurde mit einem Ndel-Umsetzungsprodukt von pR0211 verknüpft.

Das gebildete Plasmid, das als p3008 bezeichnet wird, wurde in dem E_. coli-Stamm A2097 unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39804 hinterlegt.

27 8.05- 27799-6

-43-

1 Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden zwei Hühnerwachstumshormonfragmente von einem Ndel-Banll-Umsetzungsprodukt von pcGH-Ndel/RI isoliert, wie in Fig. 5 dargestellt. Die beiden cGH-Fragmente werden mit einem phosphorylierteiti synthetischen Kuppler verknüpft, welcher die ersten 18 Aminosäuren des N-Terminus der authentischen cGH kodiert. Die Sequenz des Kupplers war folgendermaßen:

TATGTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCT 10

ACAAGGGACGGTACGGGGAGAGGTTGGACAAACGGTTGCGACACGACTC.

Das gebildete Fragment wurde dann mit einem Ndel-ümsetzungsprodukt von pRO211 verknüpft, um das Plasmid zu bilden, ,c welches als p5002 bezeichnet wird und die in Fig. 5 dargestellt Restriktionskarte aufweist.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch so manipuliert werden, daß sie menschliches Apolipoprotein E erzeugen.

2Q Das Gen für menschliches Apolipoprotein E (ApoE) kann isoliert werden aus dem Plasmid pApoE-EX2 durch Ndel-Umsetzung. pApoE-Ex2 weist die in Fig. 18 dargestellte Restriktionskarte auf. Es wurde hinterlegt in dem E. coli-Stamm A1645 unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39787.

r,c Das ApoE-Gen (cDNA) kann in verschiedene Plasmide eingeführt werden. Zu den bevorzugten Ausführungsformen gehört das Plasmid pTV-188, welches die in Fig. 18 dargestellte Restriktionskarte aufweist. pTV-188 wurde hergestellt durch Ligation oder Verknüpfung des ApoE-Gens,

on das aus pApoE-Ex2 erhalten wurde, mit einem Stul-Umsetzungsau _

produkt des Plasmid pSODß.T... pTV-188 enthält das Tet -· Fragment, die P_T-Promotor-Sequenz, den ß-Lactamase-Promotor und die Shine-Dalgarno-Sequenz. Dieses Plasmid gibt eine ApoE-verschmolzenes Protein wider.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Plasmids, welches das ApoE-Gen enthält, ist pSAL 160-5, welches die in Fig. 23 dargestellte Restriktionskarte afuweist.

Tl. 3.35-277996

9 ^ I 7 Ss 7

pSAL-160-5 wurde aus pTV 104(2) (ATCC-Zugangs-Nr. 39384) und dem Plasmid pTV-170 hergestellt (vgl. auch Fig. 20). Das ApoE-Gen wurde aus pTV-170 isoliert und in pTV-104(2)

an der PstI-Steile in die menschliche Wachstumshormon-5

gensequenz eingeführt. Das gebildete Plasmid pSAL 160-5

R enthält das Amp -Fragment und die P -Promotor'-Sequenz.

Xj

Ein gegenwärtig bevorzugter Vektor ist p579, welcher die in Fig. 19 dargestellte Restriktionskarte aufweist. Dieser Vektor kann in einen geeigneten Escherichia coli-Stamm eingeführt werden, z. B. A1637, A2602, A1563, A1645 oder A2097, und zwar unter Verwendung einer herkömmlichen Transformationsmethode, die einem Fachmann geläufig ist. Ein Gen, das ein gewünschtes Polypeptid kopiert, z. B.

ein Schweinewachstumshormon oder Hühnerwachstumshormon, kann in p5 9 7 eingeführt werden. Das Schweinewachstumshormon cDNA wurde eingeführt in die p5 79 durch Umsetzung des Vektors mit Ndel und Verknüpfung des offenen Stranges mit pGH-cDNA, das aus p3008 (ATCC-Zugangs-Nr. 39804) erhalten worden ist. Das gebildete Plasmid wird als p3009 bezeichnet. Seine Restriktionskarte ist in Fig. 11 widergegeben.

Hünhnerwachstumshormon-cDNA wurde eingeführt in p5 7 9 durch Umsetzung des Vektors mit Ndel und Verknüpfung des offenen Strangs mit cGH-cDNA, das aus p5002 erhalten wurde. Das gebildete Plasmid wird als p5003 bezeichnet und weist die in Fig. 12 dargestellte Restriktionskarte auf. p5003 wurde in dem Escherichia coli-Stamm A2097

-

unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39792 hinterlegt.

Das Gen zur Erzeugung des menschlichen Apolipoprotein E (ApoE3), vermutlich mit der Aminosäure Methionin zu dem

Amino-Terminus des Endprodukts addiert, kann ebenfalls 35

in p579 eingeführt werden. Die Herstellung des gebildeten Plasmids, das als pTV-170 bezeichnet wird, ist in Fig.

27.8.85- 277996

dargestellt. Dieses Plasmid enthält die C_TT-ribösomale Bindungsstelle, die sich von pJH200 (ATCC-Zugangs-Nr. 39783) ableitet.

Plasmid pTV-170 kann modifiziert werden durch Entfernung einer der Nde_I-Stellen, die das ApoE-Gen binden. Das erhaltene Plasmid, das als pTV-190 bezeichnet wird, ist in Fig. 21 dargestellt.

pTV-170 kann ebenfalls modifiziert werden, durch Ersatz der C₁ -ribosomalen Bindungsstelle durch ß-Lactamase-Promotor und der Shine-Dalgarno-ribosomalen Bindungsstellen-Sequenz, die von pBLA11 (ATCC-Zugangs-Nr. 39788) isoliert worden ist. Das gebildete Plasmid, das als pTV-194 bezeichnet wird, weist die in Fig. 22 dargestellte Restriktionskarte auf.

pTV-190 (Fig. 21) kann so modifiziert werden, daß es ein Analoges von humanem ApoE3 produziert, welches an seinem Amino-Terminus die 14 Aminosäuren-Aminoterminussequenz von menschlichem Wachstumshormon aufweist, gefolgt von Methionin, verknüpft mit der Sequenz von erwachsenem menschlichem ApoE3. Ein derartiges Plasmid wird als pTV-214 bezeichnet und weist die in Fig. 24 dargestellte Restriktionskarte auf.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Plasmids, welches das ApoE3-Gen enthält, ist pTVR 279-8, welches die in Fig. 25 dargestellte Restriktionskarte besitzt.

pTVR 279-8 wurde hergestellt aus pTV 264-45, welches aus pTV 190 erhalten worden ist. Das Plasmid pTV (Fig. 21) wurde teilweise mit Aval gespalten, aufgefüllt oder ergänzt unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und einer erneuten Ligation unterworfen.

Das gebildete Plasmid, das als pTV 264-45 bezeichnet wird, wird von der Aval-Stelle bei dem 3'-Ende des Gens weggelassen. Das Plasmid pTV 264-45 wird vollständig

273.85- 2779SG

mit Ndel umgesetzt und mit phosphorylierten synthetischen Kupplern folgender Sequenz verknüpft:

5'-TATGCTGCTGCt acgacgacgaat-s¹

Das gebildete Plasmid, das als pTVR 279-8 bezeichnet wird, wurde bei der ATCC unter der Zugangs-Nr. 53216 hinterlegt

10

Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch so aufgebaut werden, daß sie Plasmide bilden, welche in der Lage sind, menschliches Wachstumshormon zu erzeugen. Ein Beispiel eines solches Plasmids ist pTV 300, welches die in Fig. 27 dargestellte Restriktionskarte aufweist. pTV 300 kann hergestellt werden durch Spaltung von pTV 18(1) mit Ndel, Isolierung der met¹⁴-hGH-DNA und Verknüpfung derselben mit p579 (Fig. 19), gespalten mit Ndel. pTV. 18(1) kann erhalten, wie in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0131843 A1 beschrieben, welche am 23. Januar 1985 veröffentlicht worden ist, oder in der korrespondierenden US-Patentanmeldung Nr. 514,188 beschrieben, welche am 15. Juli 1983 hinterlegt worden ist, wobei die letztere hier mit einbezogen wird.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch aufgebaut werden, um Plasmide zu erhalten, welche ein Analoges der menschlichen Cu-Zn-Superoxid-Dismutase (SOD) erzeugen, welche von der natürlichen menschlichen SOD sich darin unterscheidet, daß der Amino-Terminus nicht acetyliert ist. Ein derartiges Plasmid kann entsprechend Fig. 16 hergestellt werden und wird als pSODß.TT-1 bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können aufgebaut werden, um Plasmide zu bilden, welche ein rekombiniertes Schweine-

Ti 0.35' 277996

251

wachstumshormon erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung eines Analogen von bGH, welches die Animosäuresequenz met-asp-gln aufweist, addiert an den Aminoterminus der Phenylalaninform von authentischem bGH, welches ebenfalls als rec-bGH bezeichnet wird. Plasmid bGH44 , welches ein derartiges Hormon produziert, wurde entsprechend dem Schema der Fig. 6 hergestellt und in dem Stamm A2097 unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39806 hinterlegt.

Ein weiteres Plasmid, welches das met-asp-gln-Rinderwachstumshormon erzeugt, ist p9200. Das Plasmid p9200 ist dem pHG44 (Fig. 6) ähnlich, jedoch verleiht das Plasmid eine Tetracyclinresistenz anstelle einer Ampicillinresistenz. Der Aufbau von p9200 ist in Fig. 26 widergegeben. pHG4 4 wird gespalten mit CIaI und Pstl, gefüllt unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I, worauf das große DNA-Fragment isoliert wurde. Dieses Fragment wurde verknüpft mit einem DNA-Fragment, welches das tetracyclinresistente Gen von pBR322 enthält, welches isoliert wurde durch Spaltung von pBR322 mit RI und Aval und anschließendem "Auffüllen" unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I. Das gebildete Plasmid p9200 wurde bei der ATCC unter der

Zugangs-Nr. 53215 hinterlegt

25

Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung eines Analogen von bGH mit der Aminosäure Methionin, addiert an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH. Plasmid pSAL5600-1, welches ein derartiges Hormon erzeugt, wurde nach dem Schema der Fig. 10 hergestellt. Das Plasmid p7200-22 erzeugt ebenfalls ein derartiges Hormon. Dieses Plasmid^weist eine Restriktionskarte auf, die in Fig. 7 dargestellt ist.

Ein gegenwärtig bevorzugter Vektor ist der Vektor p579

434 mit einer DNA-Sequenz, die das el -Fragment enthält, geklont in die Clal-Stelle. p579 weist die in Fig. 19

27 a85- 277996

251 7ί

-48-dargestellte Restriktionskarte auf.

Plasmide, welche Analoge des Rinderwachstumshormons widergeben, welches die Aminosäuresequenz rnet-asp-gln addiert an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem Rinderwachstumshormon (das auch als rec-Rinderwachstumshormon bezeichnet wird) aufweist, sind hergestellt worden. Ein derartiges Plasmid ist pHG50, welches die in Fig. 6 dargestellt Restriktionskarte aufweist. Dieses Plasmid ist in dem Stamm A1645 (\i434cl mini Tn10) bei der American Type Culture Collection unter der ATCC-Zugangs-Nr. 37805 hinterlegt worden. Ein anderes derartiges Plasmid ist pSAL-210/4, welches die in Fig. 9 dargestellt Restriktionskarte aufweist.

Ein gegenwärtig bevorzugter Vektor wird hergeleitet, indem das met-phe-bHG-Gen vom Plasmid p8300-10A entfernt wird. Das Plasmid weist die in Fig. 7 dargestellte

Restriktionskarte auf und ist in dem Stamm A2097 bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC-Zugangs-Nr. 39785 hinterlegt worden.

Ein anderer gegenwärtig bevorzugter Vektor wird her-

geleitet durch Entfernung des rec-bHG-Gens vom Plasmid pSAL-170/10. Das Plasmid weist die in Fig. 8 dargestellte Restriktionskarte auf.

Ein dritter gegenwärtig bevorzugter Vektor wird hergelei-

tet durch Entfernung des rec-bHG-Gens vom Plasmid pSAL-210/4. Das Plasmid weist die in Fig. 9 dargestellte Restriktionskarte auf.

Die erfindungsgemäßen Vektoren, können nach Einführung

in den Wirt, auch so hergestellt oder manipuliert werden, daß sie Plasmide erzeugen, welche Analoge des Rinder-

11. BJo- 277996

wachstumshormons produzieren. p8300-10A (ATCC-Zugangs-Nr. 39785) , ein Beispiel für ein solches Plasmid, wurde entsprechend dem Schema der Fig. 7 hergestellt. Das Analoge, das es produziert, weist einen Methioninrest auf, der an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH addiert ist.

Andere Plasmide produzieren Analoge, welche die Aminosäuresequenz met'-asp-gln addiert an den N-Terrninus der Phenylalaninform von natürlichem bGH aufweisen. Diese Plasmide umfassen pSAL-130/4 (Fig. 8), pSAL-170/10_ (Fig. 8) und pSAL-210/4 (Fig. 9).

Auf die gleiche Weise können andere Plasmide hergestellt

werden, indem die Gene, die das gewünschte Polypeptid kodieren, an der zweiten Restriktionsenzymstelle des. Plasmids ersetzt werden.

Zahlreiche Witt-Vektor-Systeme umfassen E. coli A1637, ?n

A1645, A2606, A2097 oder A1563, falls das Plasmid

4 34 kein el -Fragment enthält, sowie den Stamm A1645

- 434

(i434cl mini Tn10), falls das Plasmid das el -Fragment aufweist. Wirt-Vektor-Systeme nach der Erfindung können auch prototrophischen E. coli umfassen, wie

O C ——

A4200, A4255 und Biotin einschließen, unabhängig von dem Wirt-Vektor-System, beispielsweise Ά4346. Lytische Wirt-Vektor-Systeme nach der Erfindung sind jene, bei denen der Wirt A4048 ist, insbesondere A3111.

Die Wirt-Vektor-Systeme und das hier beschriebene Plasmid können auch verwendet werden, um verschiedene Polypeptide zu produzieren, wie Rinder-, Schweine-, Hühner- und menschliche Wachstumshormone, menschliche Superoxid-Dismutase und menschliches Apolipoprotein E. Dazu wird das Wirt-Vektor-System unter geeigneten Bedingungen wachsen gelassen, so daß sich Polypeptid bilden kann, welches dann gewonnen wird.

27 8.85- 277996

2 5 1

Geeignete Bedingungen sind ein Wachstum des Wirt-Vektor-Systems während einer geeigneten Zeitdauer bei etwa 42⁰C. Die Zeitspanne des Wachstums bei 42⁰C für sämtliche Wirt-Vektor-Systeme, außer jenen, welche dazu bestimmt sind, menschliches Polyprotein E zu bilden, beträgt

vorzugsweise 1 bis 5 Stunden. Die Wachstumsperoide der Wirt-Vektor-Systeme, welche bestimmt sind, um menschliches Apolipoprotein E zu bilden, betrgät vorzugsweise etwa 15 Minuten. Geeignete Medien umfassen Kaseinhydrolysate. 10

Nach dem vorstehenden Verfahren kann eine Anzahl von bGH-, pGH-, cGH-, hGH-, ApoE- und SOD-Analogen hergestellt werden.

Es sind ApoE-Analoge hergestellt worden, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die der von natürlichem ApoE entspricht, abgesehen von Variationen am N-Terminus. Beispiele sind folgende:

1) Methionin-Aminosäure addiert and den N-Terminus von natürlichem menschlichem Apolipoprotein E;

2) natürliches menschliches Apolipoprotein E an dessen N-Terminus die 4 2 Aminosäuren-N-terminale Sequenz von menschlicher Superoxid-Dismutase gebunden ist, und dann Methionin;

3) natürliches menschliches Apolipoprotein, bei dem die

11 N-terminalen Aminosäuren weggelassen und durch die 4 5-Aminosäuren-N-terminale Sequenz von erwachsenem menschlichem Wachstumshormon ersetzt ist, gefolgt von Methionin;

4) die- Aminosäuresequenz von natürlichem humanem Apo-

lipoprotein E, an dessen N-Terminus die 14-Aminosäuren-

N-terminale Sequenz von manschlichem Wachstumshormon gebunden ist, gefolgt von Methionin;

27. 3.35- 277996

5) natürliches menschliches Apolipoprotein E3 mit der Aminosäuresequenz met-leu-leu-leu-met, gebunden and den N-Terminus.

Ein pGH-Analoges ist hergestellt worden, bei dem die Aminosäure Methionin zu dem N-Terminus des natürlichen Schweinewachstumshormons addiert worden ist.

Ein cGH-Analoges ist hergestellt worden, bei dem die Aminosäure Methionin an den N-Terminus von natürlichem Hütmerwachstumshormon addiert worden ist.

Ein hGH-Analoges ist hergestellt worden, bei dem die ersten 13 Aminosäuren des natürlichen menschlichen Wachs-

'14 tumshormons weggelassen worden sind, d. h. met hGH.

Es sind SOD-Analoge hergestellt worden, bei denen die Aminosäuresequenz identisch mit der von natürlichem SOD, abgesehen von den Variationen am N-Terminus. Beispiele sind folgende:

1) natürliches menschliches SOD, das nicht acetyliert ist; und

2) natürliches menschliches SOD, welches nicht acetyliert und nicht glykosyliert ist.

Diese SOD-Analogen, können verwendet werden, um die Dismutation oder univalente Reduktion des Superoxidanions in Gegenwart von Protonen zu katalysieren, um Wasser- ' stoffperoxid zu bilden, wie in der folgenden Reaktionsgleichung wiedergegeben:

SOD 2O₂ ¹ + 2H⁺ > H₂O₂ + O₂ '

*

Veterinärmedizinische Zusammensetzungen können hergestellt werden, welche wirksame Mengen von einem oder

'?/' SJ]- 277996

ί η

mehreren bGH-, cGH- oder pGH-Analogen sowie einen geeigneten Trägerstoff enthalten. Derartige Trägerstoffe sind den Fachleuten ohne weiteres geläufig. Die Analogen können direkt oder in Form einer Zusammensetzung einem Rind verabreicht werden, um die Milch oder Fleischproduktion zu erhöhen, einem Huhn, um die Fleischproduktion zu erhöhen oder einem Schwein, um die Milchoder Fleischproduktion zu erhöhen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden, welche wirksame Mengen von einem oder mehreren Analogen von ApoE oder hGH sowie einen geeigneten Trägerstoff aufweisen. Derartige Träger sind den Fachleuten ohne weiteres geläufig. Die Analogen können direkt oder in Form einer Zusammensetzung einer menschlichen Person verabreicht werden, beispielsweise im Fall von ApoE, um Mängel der ApoE-Produktion der Person, zu behandeln, oder um eine Arteriosklerose oder im Falle von hGH Mängel in der hGH-Produktion der Person zu behandeln.

Veterinärmedizinische und pharmazeutische Zusammensetzungen können auch hergestellt werden, welche wirksame Mengen von SOD oder eines oder mehrere SOD-Analoger und einen geeigneten Trägerstoff enthalten. Derartige Trägerstoffe sind den Fachleuten ohne weiteres geläufig. Das SOD oder das Analoge kann direkt in Form einer Zusammensetzung dem Tier oder der betreffenden Person verabreicht werden, beispielsweise um einen Patienten der Entzündungen aufweist, zu behandeln oder eine Verwundung des Patienten durch sauerstoffreie Radikale bei Reperfusion nach einer globalen Ischämie oder einer .Organtransplantation, beispielsweise einer Nierentransplantation, herabzusetzen. Das SOD oder das Analoge kann auch direkt oder in Form einer Zusammensetzung dem Perfusionsmedium des isolierten Organs zugeführt werden, beispielsweise um Verletzungen eines isolierten Organs durch freie Sauerstoffradikale bei ^Perfusion nach der Excision herabzusetzen und

Π 3.35- 277996

51

dadurch die Überlebensperiode des Organs, z. B. der Hornhaut, zu verlängern. Das SOD oder Analoge kann außerdem verwendet werden, um eine neurologische Verletzung

zu mildern

5

Eine Methode zur Erzeugung enzymatisch aktiver eukaryotischer Superoxid-Dismutase (SOD) oder eines Analogen davon in einer bakteriellen Zelle ist festgestellt worden. Die

bakterielle Zelle enthält und ist in der Lage, eine 10

DNA-Sequenz wiederzugeben, die die Superoxid-Dismutase oder ein Analoges kodiert. Die Methode umfaßt die Aufrechterhaltung der bakteriellen Zelle unter geeigneten Bedingungen und in einem geeigneten Produktionsmedium.

Das Produktionsmedium wird durch eine Menge von Cu + +

ergänzt, so daß die Konzentration des Cu in dem Medium größer als eta 2 ppm ist.

Die bakterielle Zelle kann irgendein Bakterium sein, in welchem eine DNA-Sequenz, welche die eukaryotische

Superoxid-Dismutase kodiert, eingeführt worden ist durch rekombinierende DNA-Techniken. Das Bakterium muß in der Lage sein, die DNA-Sequenz wiederzugeben und das Proteinprodukt zu erzeugen. Die geeigneten Bedingungen

und das Produktionsmedium hängen von der Art und dem 25

Stamm des Bakterium ab.

Die bakterielle Zelle kann die DNA-Sequenz enthalten, die die Superoxid-Dismutase kodiert, oder ein Analoges in dem Körper eines·Vektor-DNA-Moleküls, wie eines Plasmids.

Der Vektor oder das Plasmid wird durch rekombinierende DNA-Techniken hergestellt, sodaß die Sequenz, die das SOD kodiert, in einer geeigneten Position des Moleküls enthalten ist.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die bakterielle Zelle eine Escherichia coli- Zelle. Der bevorzugte Stamm von E. coli ist der Stamm A1645.

Tl 8.S5- 27799G

^Die E. coli-Zelle nach der Erfindung enthält ein Plasmid,-welches das SOD oder dessen Analoges kodiert. Nach einer bevorzugten Ausführungform der Erfindung ist das SOD eine

Human-Superoxid-Dismutase oder ein Analoges davon. 5

Die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung betreffen E_-. coli-Stämme, welche die Plasmide pSODßi, pSODoC2, pSODßTH, pSODß1-BA2 oder pSODß1TT1 enthalten. In der Beschreibung der Figuren sind Verfahren zur Herstellung dieser Plasmide beschrieben, sowie in Fig. 3 die Plasmide selbst. Diese Plasmide können aus Fachleuten zugänglichen Ausgangsmaterialien hergestellt werden. _E. coli-Stämme, die verschiedene Plasmide enthalten, welche sich zur Herstellung von Plasmiden eignen, die eukaryotische Superoxid-Dismutase kodieren, sind bei der "American Type Culture Collection, Rockwell, Maryland, 20852, entsprechend den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Patentierung hinterlegt worden. Diese Plas-

²^ mide und ihre ATCC-Zugangs-Nummmern sind: pBRM ATCC 37283; pSODo(2 ATCC 39786; pBR322 ATCC 37017; pBLA1 1 ATCC 39788; pJH200 ATCC 39783 und pPSI ATCC 39807.

Bei einer .speziellen Ausführungform der Erfindung wird ° ein enzymatisch aktives Human-Superoxid-Dismutase-Analoges mit einer E. coli-Stammzelle A2097 hergestellt, welche das Plasmid pSOQX2 enthält. Diese Zelle ist bei der "American Type Culture Collection" unter der Zugangs-

Nr. ATCC 39786 hinterlegt worden

30

Das geeignete Produktionsmedium für die bakterielle Zelle kann irgendeine Art eines akzeptablen Nährme.diums sein, beispielsweise ein Kaseinhydrolysat oder ein LB (Luria Broth oder Nährlösung) Medium. Die geeigneten Wachstumsbedingungen ändern sich mit dem Stamm von E. coli und und mit dem Plasmid , das er enthält. Beispielsweise wird E_. coli A1645 ,der das Plasmid. pSODßiT11 enthält,

bei 42⁰C induziert und auf dieser Temperatur etwa 1 bis 5 Stunden gehalten. Die geeigneten Temperatur-, Zeit-, Bewegungs- und Belüftungsbedingungen zum Wachstum des Impfmaterials und zum Wachstum der Kultur bis zur gewünschten Dichte vor der Produktionsphase sowie für die Aufrechterhaltung der Kultur während der Produktions-'Periode sind in Beispiel 26 beschrieben.

Die Konzentration des Cu -Ions in dem Medium, das erforderlich ist, um enzymatisch aktives SOD zu produzieren, ändert sich mit der Art des verwendeten Mediums. Bei einem Kaseinhydrolysatmedium wurde eine Cu -Ionenkonzentration von 200 ppm als wirksam ermittelt.

In einem LB-Medium hat sich eine Cu -Konzentration von 75 ppm als wirksam herausgestellt. Vorzugsweise ist bei allen komplexen Arten von Wachstumsmedien die Konzentration von Cu in dem Medium etwa 50 bis etwa 250 ppm.

Die meisten eukaryotischen Superoxid-Dismutasen sind Cu/Zn-Metalloproteine. Nach einer speziellen Ausführungs-form der Erfindung wird Zn als Zusatz zu dem Medium hinzugefügt, so daß die Konzentration an Zn in dem Medium größer als etwa 2 ppm ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Cu - und Zn Konzentrationen durch Zusatz von 0,8 g/l von CuSO₄-5HpO und 10 mg/1 ZnSO₄-TH₃O ergänzt.

Die spezifischen Bestandteile des geeigneten Ausgangsmaterials, der Kultur, des Impf- und Produktionsmediums können variieren und sind den Fachleuten bekannt. Spezielle Beispiele geeigneter Medien sind im Beispiel 26 beschrieben.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem enzymatisch aktivem eukaryotischem SOD oder einem Analogen davon, welches in einer

21. 8.35- 277996

251

bakteriellen Zelle entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert worden ist.

Die bakterielle Zelle wird von dem Produktionsmedium erst isoliert, nachdem die Kultur abgekühlt worden ist. Die Zelle kann nach irgendeinem nicht unterbrechenden Verfahren isoliert werden, beispielsweise durch Zentri- fugation oder Filtration. Die Zelle wird dann in einer geeigneten Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 suspendiert. Vorzugsweise wird eine 50 mM Natriumphosphatlösung mit einem pH von etwa 7,8 verwendet. Die ZeIl-Vand wird zerstört durch geeignete Mittel, beispielsweise einen Mischer oder einen Zellzerkleinerer und die gebildete homogene Suspension wird unter geeigneten Bedingungen Schall ausgesetzt. Die Schalleinwirkung kann mit einer kontinuierlichen Durchflußzelle erfolgen. Die gebildete, ^:einer Schalleinwirkung ausgesetzte Lösung wird dann unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert, so daß die Zelltrümmer von der überstehenden Proteinlösung getrennt werden.

Der überstand wird dann etwa 2 Stunden auf etwa 65⁰C erwärmt, gekühlt und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert, wie sie bei dem vorhergehenden Zentrifugationsschritt angewendet wurden, um eine klare Proteinlösung als Überstand zu erhalten. Der überstand wird dann auf ein geeignetes Volumen konzentriert, beispielsweise auf einen Liter mit einer Ultrafiltrationseinrichtung, wobei ein Schnitt bei einem Molekulargewicht von 10000 erfolgt.

Die konzentrierte Proteinlösung wird dann einer Ionenaustauscherchromatogrphie mit einem geeigneten Anionenaustauscher unterworfen, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt worden ist. Vorzugsweise wird die Chromatographie mit einer DEAE-Sephacel-Säule durchgeführt, die mit einem 150 mM Natriumphosphatpuffer mit

0 7 Q 3 ί - 177Q0C

einem pH von etwa 7,8 eingestellt worden ist. Die gebildete durchgeflossene Lösung, die die Superoxid-Dismutase oder das Analoge enthält, wird dann gesammelt, auf ein geeignetes Volumen konzentriert und gegen eine gepufferte Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis 8,0 dialysiert. Dies kann mit einer Ultrafiltrationseinrichtung gegen eine 20 mM Tris-HCl-Lösung von einem pH von etwa 7,8 erfolgen.

Die konzentrierte Lösung wird dann einer Ionenaustauscherchromatographie mit einem geeigneten Anionenaustauscher unterworfen, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt worden ist. Geeignet ist eine QAE-Sepharose-Säule, die mit 20 mM Tris-HCl mit einem pH von etwa 7,8 eingestellt worden ist. Das an den Anionenaustauscher gebundene Protein wird einem geeigneten Salzgradienten ausgesetzt, beispielsweise 0 bis 2 0OmMNaCl in 20 rrM Tris-HCl pH 7,8. Die gebildeten Fraktionen, die das SOD oder das Analoge enthalten, werden gesammelt, beispielsweise mit einer ültrafiltrationseinrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf einen pH von etwa 4,0 bis etwa 5,0 mit einem geeigneten Puffer eingestellt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die hier interessierende Lösung auf 100 mM Natriumacetat gebracht, indem 1M Natriumacetat mit einem pH von etwa 4,8 zugegeben wird.

Diese gepufferte Lösung wird dann nochmals einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen, jedoch mit einem Kationenaustauscher. Geeignet ist eine CM-Sepharose-Säule, die mit einem 10OmM Natriumacetat mit einem pH von etwa 4,7 eingestellt worden ist. Das Protein, das an den Kationenaustauscher gebunden ist, wird einem geeigneten Salzgradienten ausgesetzt, beispielsweise 100 bis 500 mM NaCl in 100 mM Natriumacetat pH 4,7, wobei die gebildeten Fraktionen, die'das gereinigte SOD oder das Analoge enthalten, gesammelt werden.

27. a85- 27799G

Die Fraktionen, die das gereinigte SOD enthalten, können . beispielsweise durch Ultrafiltration konzentriert und zur Lagerung lyophilisiert werden.

Die ..Erfindung bezieht, sich ferner auf gereinigte ^ enzymatisch aktive eukaryotische Superoxid-Dismutase und Analoge davon, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und gereinigt worden sind. Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft gereinigte enzymatisch aktive Human-Superoxid-Dismutase und Analoge davon, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und gereinigt worden sind.

Beispiele 15

Die nachstehenden Beispiele sollen zum Verständnis der Erfindung beitragen, nicht jedoch'deren Schutzumfang in irgendeiner Weise einschränken. Die Beispiele umfassen keine detaillierte Beschreibung der herkömmlichen Metho-

den, die zum Aufbau der Vektoren angewendet'werden, die Einführung der Gene, die interessierenden Polypeptide kodieren, in diese Vektoren oder die Einführung des gebildeten Plasmids in bakterielle Wirte. Derartige Methoden sind den Fachleuten bestens bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, beispielsweise in folgenden:

97 8.85- Ί77996

1 78:

-59-

T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982).

Methods in Enzymology, Bd. 65, "Nucleic Acids (Part I)," hrsa von lawrence Grossman und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1980)

10

Methods in Enzymology, g^ 68, "Recombinant DNA," hrsg. ν. Ray Wu, Academic Press, New York (1981).

Methods in Enzymology, g^ 100, "Recombinant DNA (Part B)," hrsg. von Ray Wu, Lawrence Grossman und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1983).

Methods in Enzymology, Bd. 101, "Recombinant DNA (Part C) ," hrsg.ν.by Ray Wu, Lawrence Grossman und Kivie Moldave, Academic Press, New York (1983).

Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Edition, hrsg. ν. R.W. Old und

S.B. Primrose, University of California Press (1981).

H.V. Bernard, et al., Gene (1979) 5_, 59.

A.B. Oppenheim, et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327

30

E. Remaut, et al., Gene (1981) 15, 81.

27 8.-85- 2.77996

25178?

Ausführungsbeispiele; Beispiel 1 Expressionsvektoren

Unter der Bezeichnung "Expressionsvektor" wird hier eine Gruppe von Plasiniden verstanden, die sich eignet, die gewünschten Gene in Bakterien wiederzugeben oder hervorzurufen, insbesondere in E. coli. Das gewünschte Gen kann in den Expressionsvektor eingeführt werden oder umgekehrt, wobei die Promotoren von dem Expressionsvektor entfernt werden und gegenüber dem gewünschten Gen angeordnet werden können.

PJH200

pJH200, das in Fig. 2 dargestellt ist, besteht aus einem DM, das in das Multikopie-Plasmid pBR322 eingeführt worden ist. Die hervorragenden Eigenschaften des Λ DM sind jene, das es den Λ P-r-Promotor, die linke IT-Einsatzstelle (nut_T), eine ScoRI-Restriktionssteile, die rungsstelle, gefolgt von der C-r-jribosomalen Bindungsstelle und ein ATG-Initierungskodon enthält, welches Teil der MeI-Restriktionssteile ist. 116 (in Worten einhundertsechzehn) Basenpaare abwärts von der KDel-Restriktionsstelle sind vier einzigartige Restriktionsstellen, wie in Pig. 2 dargestellt. Die Restriktionsstellen ermöglichen einen leichten Einbau des gewünschten Gens. Die C_TT-ribosomale Bindungsstelle unterscheidet sich von der natürlichen ribosomalen Bindungsstelle durch eine Mutation in einem einzigen Punkt.

pJH200 wird aus pOG11 hergestellt (A. Oppenheim et al., J. Hol. Biol. (1982), Band 158, S. 327) und enthält den λ.P-^-PrOmOtOr und die CUj-ribosomale Bindungsstelle, die in pOG11 gefunden wird. 346 bp von ADM, das zwischen den AP_L-Promotor und der C-j-j-ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist, ist jedoch v/eggelassen, und eine EcoRI-Restrlk-

tionsstelle ist an der Verbindung zwischen diesen beiden Elementen eingeführt worden. Ferner wurde "abwärts" der ribosomalen Bindungsstelle ein Multirestriktionsstellen-Kuppler eingeführt. pJH200 ist bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC Nr. 39783 hinterlegt worden.

pRO21

pR0211, das in Fig. 2 dargestellt und in der 'Beschreibung der Figuren im einzelnen beschrieben ist, wurde aus pJH200 durch Eliminierung eines der beiden Ndel-Restriktionsstellen erhalten.

. pJH200, pRO211 und Derivate davon, die eukaryotische Gene enthalten, werden in geeigneten E. coIi Wirten gehalten. Das wichtigste Merkmal eines geeigneten Wirtes ist, das er den thermosensitiven Repressor cI857 und das Antiterminierungs-N-Protein liefert (M. E. Gottesman et al., J. Mol. Biol. (1980), Band 140, S. 57-75).

pRO211 weist zahlreiche Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Expressionsvektoren auf, einschließlich

1. einem extrem hohen Expressionsniveau

Der Vektor ist in der Lage die Expression fremder Proteine in E_. coli auf ein so hohes Niveau wie 35 % des gesamten zellulären Proteins zu bringen.

2. einer ersetzbaren ribosomalen Bindungsstelle

pRO211 enthält eine einzigartige EcoRI-Stelle, welche "aufwärts" der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist, sowie eine Ndel-Stelle, welche "abwärts" der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist. Die ribosomale Bindungsstelle wird deshalb durch zwei einzig-

I! B.85- 277996

artige Restriktionsstellen gebunden. Dadurch wird eine leichte Entfernung der vorhandenen ribosomalen Bindungsstelle (die ^C₁ -ribosomale Bindungsstelle) und eine Substitution von praktisch jeder anderen natürlichen und synthetischen ribosomalen Bindungsstelle ermöglicht, ohne die Merkmale des Plasmids zu verändern. Dadurch wird eine optimale Expression der gewünschten Polypeptide erheblich erleichtert.

3. eine thermoinduzierbare Regulation der Expression

Der ^P_T-Promotor ist inaktiv, wenn der C -Repressor

Ij .1

an ihn gebunden ist. Der cl857-Repressor ist thermosensitiv, d. h., er wird an den Promotor bei 30⁰C gebunden, jedoch bei 42°C inaktiviert. Durch Erhöhung der Temperatur der Fermentation auf 42°C werden damit die Wirtbakterien induziert, um das gewünschte Protein zu bilden.

Die Vorteile eines solchen-Systems sind folgende:

(a) Ein fremdes Protein-, das gegenüber Escherichia coli toxisch ist, kann später in dem Fermentationsprozeß erzeugt werden-, I wodurch ein früher Zelltod verhindert wird,

(b) eine Überproduktion eines Proteins kann das Protein stabilisieren und eine proteolytische Zersetzung verhindern (Cheng, Y. E. et al., Gene (1981), Band 14, S. 121). Eine "plötzliche" Überproduktion, bei der ein engregulierter Promotor, wie ^P_T verwendet wird, kann daher einer kontinuierlichen Produktion mit niedrigem Niveau vorzuziehen sein.

11. 3.85- 277996

Z Ό 1 7 B

4 . ein vereinfachtes Induktionsprotokoll

Die Proteinproduktion durch Plasmide, die in dieser Patentanmeldung und in der gleichfalls anhängigen, mitübertragenen U.S. Patentanmeldung Nr. 514 188 beschrieben ist, wird durch den thermosensitiven cl857-Repressor reguliert.

Das Induktionsprotokoll, das die Plasmide.benötigen, ist in der mitanhängigen, mitübertragenen Anmeldung beschrieben und umfaßt eine Induktion bei 42⁰C, gefolgt von einem Wachstum bei 38⁰C. Im Gegensatz dazu, umfaßte die optimale Induktion der Proteinsynthese, wenn die Vektoren pJH200, pR0211 oder deren Plasmidderivate verwendet wurden, eine Induktion bei 42⁰C, gefolgt von einem Wachstum bei der gleichen Temperatur, d. h. bei 42⁰C. Dadurch wird das Erfordernis eliminiert, den Fermentor zu kühlen.

5. eine Vervielfältigungs- oder Kopieanzahl

Der \P_T-Promotor in pJH200 und pRO211 hat sich als ein Plasmid mit einer Vervielfältigungs- oder Kopieanzahl erwiesen, die höher ist als die der \transduzierenden Phagenvektoren, welche in E^ coli vorhanden sind. Dadurch wird das Expressionsniveau erhöht.

6. eine ribosomale Bindungsstelle und ein Initiierungskodon · ·

Dieser Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiierungskodon (ATG). Irgendein eukaryotisches Gen kann deshalb geklont werden, ohne das Initiierungskodon zuzusetzen. Weiterin kann das wirksame RBS das Niveau der Expression erhöhen. Die ribosomale Bindungsstelle ist die AC_TT-ribosomale-Bindungsstelle.

TI. 3.35- 277996

2 5 t 7 δ

-64-

Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist folgende :

TAAGGAAGTACTTACAT _φ ATTCCTTCATGAATGTA

. Ein Basenpaar unterscheidet sich von der ribosomalen Bindungsstelle, die in dem wilden Typ λ. gefunden wird

10

7. eine geeignete Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor weist eine einzigartige Ndel-Restriktionsstelle auf, welche in der Stelle des ATG-Initiierungskodons enthalten ist. Dies erlaubt eine geeignete Positionierung des gewünschten Gens. Die einzigartige Ndel-Stelle wird unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle gefunden.

8· geeignete Restriktionsstellen für die Geneinführung

116 Basenpaare abwärts von der Ndel-Restriktionsstelle sind 4 andere einzigartige Restriktionsstellen mit folgender Reihenfolge angeordnet: BgIII, Smal, Hindlll and CIaI. Die Multiplizität der einzigartigen Restriktionsstellen ermöglicht eine leichte Einführung der gewünschten Gene.

9. eine N-Einsatzstelle

Das N-Protein, welches durch den Wirt zur Verfügung gestellt wird, bindet die N-Einsatzstelle (Nut-Stelle) an dem Expressionsvektor und verhindert dadurch die Terminierung der Transkription an der t_nT-

Stelle oder eine vorzeitige Transkriptionsterminierung in dem geklonten Gen.

27. 8.85- 277996

Geeignete Stämme für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind Stämme von E. coli, die sich zur Transformation eignen', einschließlich Al 63 7, A2602, A1563,- A1645 (c600 r'm⁺gal ⁺ thr"leu"lac~bl (/lcI857ÄHl /\_BamHI N⁺)) und A2097 (A1645 lacAV A21 proC :: Tn10)

BEISPIEL 2

Tierische Wachstumshormone

Der Aufbau von pRO12 ist Γη Fig. 2 wiedergegeben und in der Beschreibung der Figuren beschrieben. bGH-cDNA aus pAL500, dessen Aufbau in Fig. 1 dargestellt ist, wurde vor der Einführung in pRO211 manipuliert,

um einen korrekten Leserahmen und eine Ndel-Re-20

striktionsstelle zu bilden.

pRO1 2 wurde in einen Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation nach den Fachleuten bekannten Methoden eingeführt.. Dieser Stamm erzeugte nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges des Rinderwachstumshormons (bGH) mit der Aminosäuresequenz metasp-gln addiert an den N-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH. Die Menge des bGH Analogen_/

die durch pR012 produziert wird, beträgt etwa 30 bis 30

36 % des gesamten durch das Bakterium produzierten Proteins, berechnet durch Bestimmung von mit Coomasie-Ll au gefärbten SDS Polyacrylamidgele (Tabelle I).

II. pSAL 5200-6 35

Der Aufbau von pSAL 5200-6 ist in Fig. 3 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren beschrie-

27 3JS- :-!7799G

ben. Die DNA-Sequenz, die das met-phe-bGH kodiert, wurde durch Restriktion von pRO12 mit PvuII und Ndel sowie Einführung eines synthetischen DNA-Fragments erhalten, das aus zwei einzelsträngigen synthetischen Oligonucleotiden mit 10 überlappende Basenpaare aufweisenden Segmenten gebildet wurde.

pSAL 5200-6 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation nach bekannten Methoden eingeführt. Dieser Stamm produziert nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von bGH mit einem Methionin, das zu dem Aminoterminus des phe-bGH hinzugefügt ist. Die Menge des met-phe-bGH-Analogen, das durch pSAL 5200-6 gebildet wird, betrug etwa 18 - 20 % des gesamten durch das Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgele. Die Methoden, die zum Wachstum des Stamms, zum Gewinnen des erzeugten bGH und zur Reinigung des bGH angewendet wurden, sind die gleichen wie jene, die nachstehend im Beispiel 5 für die bGH-Produktion von pRO12 beschrieben sind.

III. p3008

Der Aufbau von p3008 ist in Fig. 4 wiedergegeben und in der Beschreibung der Figuren erörtert. p3008 wurde bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC Nr. 39804 hinterlegt. Die DNA-Sequenz, welche das met-phe-pGH codiert (Schweinewachstumshormon), wird erhalten, indem pGH-cDNA in pRO211 eingeführt wird.

p3008 wurde in Escherichia coli des Stamms A1645 durch Transformation mit für den Fachmann bekannten Methoden eingeführt. Dieser Stamm erzeugt nach dem

277996

Wachsturn und der Induktion pGH, welches ein Methionin aufweist, das zu dem Aminoterminus des phe—pGH hinzugefügt ist. Die Menge des met-phe-pGH-Analogen, die mit p3008 erzeugt wird, beträgt etwa 18 - 20 % des gesamten von dem Bakterium produzierten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-gefärbten SDS-Polyacrylarnidgele. Die Methoden zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten pGH und zur Reinigung des pGH sind die gleichen, wie sie nachstehend in Beispiel 5 für die bGH-Produktion von pRO12 beschrieben sind.

IV.

I^ Der Aufbau von p5002 ist in Fig. 5 beschrieben und " in der Beschreibung der Figuren erörtert. Die DNA-Sequenz, die met-phe-cGH (Hühnerwachstumshormon) kodiert, wurde erhalten, indem cGH-cDNA in pRO211 eingeführt wurde und das 5'-Ende des Gens mit

2Q · synthetischen Oligonucleotidkupplern vervollständigt wurde.

p5002 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 j durch Transformation nach bekannten Methoden eingeführt. Der Stamm erzeugt nach dem Wachstum und der Induzierung cGH mit einem Methionin, das zu dem

Aminoterminus des phe-cGH hinzugefügt ist. Die Menge des met-phe-cGH-Analogen, das mit p5002 erzeugt wird, beträgt etwa 18 - 20 % des gesamten von dem Bakterium OQ erzeugten Proteins, berechnet auf der Bestimmung der Coomasie-verfärbten SDS-Polyacrylamidgele. Das Verfahren, das zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten cGH und zur Reinigung des cGH verwendet wurde, ist das gleiche wie jenes, das nachstehend „,- im Beispiel 5 für die bGH-Produktion mit pR01 2 be- ' schrieben ist. ,

L I. u.

85- 277996

	TABELLE I	Wirt	%bGH2	Bemerkungen	T T
Plasmid	A1637.	23	R Amp	τ τ · 1 2'
pRec 2/3	A1637'	28	Amp	CHCN;
pRO1 1	A1 645	30-36	λ R Amp	CHCN;
pRO1 2	A2097	37-42	Λ R Amp ,
pHG44	A1645	37-42	R Amp ,
pHG50	A1645 '	39-44	. R Amp ;
pSAL-130/5	A1645	40-46	TetR;
pSAL-170/10

1. Die Tabelle faßt die bGH-Expressionsniveaus verschiedener Plasmide, die sich von pRO211 ableiten , zusammen. Die Plasmide pRec 2/3 und pRO11 werden in der anhängigen, mitübertragenen US-Patentanmeldung Nr. 514 188 , die am 15. Juli 1983 hinterlegt worden ist, beschrieben.

2. Menge des erzeugten bGH als Prozentsatz des gesamten bakteriellen Proteins.

ABKÜRZUNGEN

= hohe konstitutive Vervielfältigungszahl

= Ampicillinresistenz

= Tetracyclinresistenz

= Transkriptions terminierungssequenzen

4 = Plasmidstabilisierungs-cI -System

CHCN R

Amp Tet

T T 1

el

434

η 7

ο :

7 g ο :

⁷⁷996

τ y ι

-69-BEISPIEL 3

Human-Cu-Zn-Superoxiddismutase (SOD)

Den Ausgangspunkt der Cu-Zn-SOD—cDNA-Modifikation bildet das Plasmid pS61-10, das beschrieben ist in Lieman-Hurwitz, J. et al, PNAS (1982), Band 79, Seite 2808. Das SOD-cDNA wird ebenfalls in der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 489 786 beschrieben, die am

29. April 1983 hinterlegt worden ist. Die SOD-cDNA wurde modifiziert, um eine Ndel Restriktionsstelle an dem 5'-Ende des Gens und eine Hindlll-Restriktionsstelle an dem 3'-Ende des Gens einzuführen. Das gebildete Plasmid, pSOD NH-10, enthält SOD-cDNA an

]_5 einzigartige Restriktionsstellen gebunden.

I. pSODCX 2

Der Aufbau von pSOD.:x 2 ist in Fig. 13 dargestellt und 2Q in der Beschreibung der Figuren erörtert. pSODc*2 wurde bei der "American Type Culture Collection" unter ATCC Nr. 39786 hinterlegt. Um pSOD<* 2 , den

/\p_r Promoter, -zu bilden, wurde die Nut. und 'die C _- ribosomale Bindungsstelle von dem Expressionsvektor pJH200 entfernt und gegenüber dem SOD—Gen des Plasmids pSOD NH-10 angeordnet. Das Fragment, das sowohl den Promoter , das RBS und das SOD-Gen enthält, wurde dann in den Vektor pBRM eingeführt (Hartmann, J.Rl et al, PNAS Band 79, Seiten 233-237 (1982)). pBRM on wurde bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC Nr. 37283 hinterlegt.

pSODtf 2 wurde in den Escherichia coli Stamm A2097 durch Transformation unter Verwendung bekannter oc ' Methoden eingeführt. Die erhaltenen Klone produzierten nach dem Wachstum und der Induzierung ein SOD-

27 a85- 277996

25t ?8

analoges Protein. Die Menge des SOD Analogen, das von pSODc<2 produziert wird, betrug etwa 0,1 - 0,3 % des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen (Tabelle II). Das gebildete . SOD-Analoge ist wahrscheinlich identisch mit dem, das mit pSODßi erzeugt wird, wie in dem nachstehenden Absatz beschrieben. " .

H- pSODßi

Der Aufbau von pSODßi ist in Fig. 14 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Um pSODßi herzustellen, wurde das Cp-RBS des pSODw.2 ersetzt ' durch den ß-Lactamasepromotor und RBS, welches sich von pBLA11 ableitet. pBLA11 wurde bei der "American Type Culture Collection unter der ATCC Nr..39788 hinterlegt.

pBLA11 enthält den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle des ß-Lactamasegens, welches in pBR322 zwischen den Koordinaten 4157 und 4353 gefunden wird. Ein EcoRI^Kuppler wurde oberhalb des Promotors zugesetzt, und ein Multirestriktionsstellen-Kuppler wurde unmittelbar nach dem Initiierungskodon ATG ' hinzugefügt. Die Seguenz des kodierenden Strangs, der mit dem Initiierungskodon beginnt, ist ATGAGCTCTAGAATTC..

2Q pSODßi wurde in den Escherichi coli Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung bekannter Methoden eingeführt. Die erhaltenen Klone produzierten nach dem Wachstum und der Induktion ein SOD-Analoges. Das erzeugte menschliche Cu-Zn-SOD-Analoge unterscheidet

2g sich vom natürlichen menschlichen Cu-Zn-SOD darin,

27 885- 277996

daß der Aminoterminus Alanin nicht acetyliert ist, wie durch Aminosäuresequenz-Stöchiometrie demonstriert, während natürliches menschliches SOD an dem Aminoterminus Alanin acetyliert ist (Hartz, J.W. und Deutsch, H.F., J. Biol. Chem. (1972) Band 234, Seiten 7043 7050; Jabusch, J.R. et al, Biochemistry (1980) Band 19, Seiten 2310-2316; Barra et al, FEBS Letters (1980) Band'120, Seite 53 und Oberley, L.W. "Superoxide Dismutase", Band I, (1982), CRC Press,.Florida, Seiten 32-33). Weiterhin ist natürliches menschliches SOD glycosiliert (Huber, W. US-Patent Nr. 3 579 495, veröffentlicht am 18. Mai 1971), während bakteriell gebildetes Human-SOD fast sicher nicht glycosidiert ist, da Escherichia coli Proteine, die er bildet, nicht glycosiliert. Die Aminosäuresequenz des bakteriell erzeugten SOD-Analogen ist mit dem von erwachsenem Human-SOD identisch und enthält keinen Methioninrest an seinem N-Terminus.

Die Menge des SOD, das durch pSODßi erzeugt wird, betrug etwa 3 - 8 % des von dem Bakterium insgesamt erzeugten Proteins, berechnet nach der Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS Polyacrylamidgelen (Tabelle II). Die verwendeten Verfahren zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten SOD und zur Reinigung des SOD sind die gleichen wie jene, die nachstehend im Beispiel 7 für pSODß.T.. beschrieben sind.

III.

Der Aufbau von pSODß.T.- ist in Fig. 14 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das ß-Lactamasegen von pSODßi wurde ersetzt durch das Gen das die Tetracyclinresistenz kodiert, die sich von pBR322 ableitet.

Π 8.85- 27799G

Die Menge des SOD-Analogen, das durch pSODß^T^ erzeugt wird, betrug etwa 8- 13 % des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen (Tabelle II). Das SOD-Analoge, das erzeugt wird, ist identisch mit dem, das mit pSODßl erzeu,gt wird.

IV.

Der Aufbau 'von pS0Dß--BA2 ist in Fig. 17 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Die C _T~ ribosomale Bindung-sstelle von pSODOC 1 3 wird ersetzt durch ein synthetisches DNA-Fragment mit folgender Sequenz:

.AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT

.welche ähnlich der Sequenz der natürlichen ß-Lactamase-RSS ist.

pSODß--BA2 wurde in den Escherichia coli Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Die erhaltenen Klone erzeugten nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von Human-SOD. Die Menge des von pS0Dß₁-BA2 erzeugten SOD betrug etwa 2 - 4 % des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgel (Tabelle II). Das erzeugte SOD-Analoge ist mit dem identisch, das mit pSODßl erzeugt wird.

/ H y S -

/. 0. υ J

TABELLE II

Plasmid

RBS Wirt

% SOD"

Bemerkungen

pSODc* 2 pSODß.

¹¹I BLA

BLA¹ BLA

pSODß -BA2 BLA'

A2097 A1645 A1645 A1645 A1645

0,1 - 0,3 3-8 8-13 10 - 15 2-4

Amp

Amp

Tet^!

Tet¹

Amp

1. Promotor und ribosomale Bindungsstelle des ß-Lactamasegens.

2. Synthetische ribosomale Bindungsstelle, die der des ß-Lactamasegens entspricht.

3. Die Menge des erzeugten SOD-Analogen , ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten bakteriellen Proteins

ABKÜRZUNGEN

Amp Tet

Ampicillinresistenz

Tetracyclinresistenz

Transkriptionsterminierungssequenzen

BEISPIEL 4 Humanapolipoprotein E (ApoE3)

Den Ausgangspunkt der ApoE3-cDNA-Modifikationen bildete das Plasmid pNB178, das von Dr. John Taylor von der Gladstone Foundation, San Francisco, Californien, zur Verfügung gestellt worden ist. Dieses Plasmid enthält eine cDNA-Kopie voller Länge des humanen ApoE3 Gens. Das cDNA in pNB178 wurde modifiziert, um nicht kodieren-

27 8.05- 277996

des DNA an dem 5'-Ende des Gens zu entfernen und.Ndel-Restriktionsstellen zu beiden Enden des Gens hinzuzufügen. Dieses ApoE3-cDNA-Fragment wurde in den Vektor pND5 eingeführt (wie in der anhängigen, mitübertragenen US-Patentanmeldung 514 188 , die am 15. Juli 1983 hinterlegt worden ist, beschrieben). Das gebildete Plasmid , pApoE-Ex2, das in Fig. 18 dargestellt ist, wurde bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC Nr. 39787 hinterlegt

10

I. pTV-188

Der Aufbau von pTV-188 ist in Fig. 18 wiedergegeben und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pTV-188 wurde durch Einführung von Ndel-Ndel aufgefüllten ApoE3-Fragment in die einzigartige stumpfe Stu I-Endstelle von PSODIi₁T₁₁ erhalten (wie in Fig. 14 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert).

pTV-188 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mit dem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Die erhaltenen Klone erzeugten nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges des Human-ApoE3, welches 42 Aminosäuren der N-terminalen Sequenz der humanen Superoxiddismutase an den N-Terminus des authentischen ApoE3 gebunden aufweist, gefolgt von Methionin am N-Terminus des Analogen. Das gebildete ApoE3-Analoge stellte etwa 10% des gesamten von den Bakterien gebildeten Proteins dar, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-PoIyacrylamidgelen. Das Verfahren zum Wachstum des Stamms ist das gleiche ,wie im Beispiel 5 für die bGH-Produktion aus pR012 beschrieben, außer daß 12,5 mg/Liter Tetracyclin anstelle von Ampicillin verwendet wurden.

27 8.85- 2.7799G

^ΙΧ· pSAL 160-5

Der Aufbau von pSAL 160-5 ist in Fig. 23 beschrieben und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pSAL 160-5 wurde erhalten durch Einführung von AvaI-AvaI-ApoE3-Genfragment aus pTV-170 (Fig. 20).

pSAL 160-5 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mit dem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Die erhaltenen Klone erzeugten nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von ApoE3, welches an seinem Aminoterminus Methionin enthält und dann 45 Aminosäuren vom N-Terminus des humanen Wachstumshormons, verschmolzen mit ApoE3, von dem die 11N-terminalen Aminosäuren weggelassen sind. Die Menge des durch pSAL 160-5 erzeugten ApoE3-Analogen betrug etwa 5 % des gesamten von den Bakterien erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung der SDS-Polyacrylamidgele. Das verwendete Verfahren

2.0 zum Wachstum des Stamms ist das gleiche wie jenes, das im Beispiel 5 für die bGH-Produktion aus pRO12 beschrieben ist.

BEISPIEL 5 25

Wachstum von pROI2

I. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pRO12 wurden auf einem Kaseinmedium wachsen gelassen (vgl. Impfmaterial), dann mit einem Gefriermittel um das doppelte verdünnt, und bei -80⁰C aufbewahrt. Das Gefriermittel enthält pro 500 ml :

2Π85- 777996

-76-

K2HPO4	6,3	g	g	g
KH2PO4	1 ,8	g	g	g
Na Citrat	0,45
MgSO4-7H2O	0,09
(NH4)2SO4	0,9
Glyzerin	44,0
Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde 'in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Steriles Medium in einem Schüttelkolben wurde mit der Vorratskultur geimpft und dann 15 h auf einer Schütteleinrichtung bei 30⁰C und etwa 200 Umdrehungen/min inkubiert. Die erforderlichen anschließenden Stufen der Impfmaterialzüchtung wurden in bewegten, belüfteten Fermentoren durchgeführt. Steriles Medium wurde mit 2 10 % Impfmaterial beimpft und 15 Stunden bei 30⁰C pH 7 - tf.,5 unter Bewegung und Belüftung inkubiert, um ein Niveau von gelöstem Sauerstoff von mehr als 20 %iger Luftsättigung zu erreichen.

III. Herstellung Das Produktionsmedium enthält:

Kaseinhydrolysat	20	g/i
Hefeextrakt	10	g/i
K2HPO4	2,	5 g/l
MgSO ·7Η Ο	1	g/i
NaCl	5	g/i
Biotin	0,	1 mg/1
Thiamin	1	mg/1
Spurenelementlösung	3	ml/1

27 8.85- 277996

Das Medium enthält außerdem 100 mg/1 Ampicillin. Das Ampicillin ist für die Produktion nicht zwingend, jedoch wird es immer in dem Medium gefunden, das zum Wachstum des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Ampicillin in konzentrierter Lösung werden durch Filtrieren separat sterilisiert und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugegeben. Eine sterile Glucoselösung wurde zu Beginn zugesetzt, um 10 g/l zu erhalten. Nach dem Induktionsschritt werden nochmals 10* g/l Glucose zugegeben.

Die Spurenelementlösung enthält; 15

FeCl3	• 2H	2°	16	g/i
ZnCl2		2°	2	g/i
CoCl2		2H2O	2	g/i
	konzentr	2°	2	g/i
•4H			1	g/i
•6H		1	g/i
Na2MoO4-	.HCl	0	,5 g/l
CaCl2.	1	00 ml/l
CuCl2
H3BO3

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30"C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungs.rate wird so eingestellt, daß ein Gehalt an gelöstem Sauerstoff aufrechterhalten wird, der oberhalb 20 % Luftsättigung liegt. Der pH wird mit NH auf 7 - 0,2 eingestellt. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l (ODg₆₀ = 10) erreicht, wird die Induktion gestartet.

Die Temperatur wird auf 42⁰C erhöht und auf 42⁰C 1 5 h gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die ge Zellen werden durch Zentrifugieren zur Hormonreinigung gewonnen.

27.8.85- 277996

-78-Gewinnung von bGH

13 kg bakterielle Zellen (nasser Kuchen) werden in 5 Volumen einer Lösung, suspendiert, die 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4)/ 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält, wobei ein Polytron (Kinematica)-Mischer verwendet wird, wobei die Geschwindigkeit des Mischers so eingestellt wird, daß nur eine minimale Schaumbildung auftritt. Die homogene Suspension wird dann kontinuierlich durch einen Dynomill Zelldisruptor KD5 (Willy A. Bachofen, Basel) mit einer Geschwindigkeit von 80 l/h geschickt, wobei die homogene Suspension der zerstörten Zellen durch Zentrifugieren mit einer CEPA 101 Zentrifuge mit einer Fließgeschwindigkeit von 45 l/h aufgeklärt wird. Das,Präzipitat des Zentrifugierungsschritts wird gesammelt und in 15,5 1 eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) , der 50 mM EDTA enthält, erneut suspendiert. Es wird ein Lysozym mit einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml zugesetzt und die Suspension wird 16 h bei 37°C inkubiert. Es wird Triton X-100 mit einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Die Suspension wird dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, in einem kontinuierlichen Durchflußzellensonificator (Wärmesystem) mit einer Geschwindigkeit von 18 l/h Schall ausgesetzt und in einer CEPA 101 Zentrifuge zentrifugiert. Das Präzipitat wird gesammelt, erneut in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) suspendiert, wie oben angegeben_x Schall, ausgesetzt und mit einer CEPA 101 Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellen werden in 15,5 1 eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) erneut suspendiert, der 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält,.wobei zweimal ausgefällt und erneut 'in 15,5 destilliertem Wasser suspendiert wird. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt und bei -20°C aufbewahrt.

27 8.B5- 277996

-79_ Reinigung von bGH

Das Precipitat wird erneut in 30 - 40 1 destilliertem Wasser suspendiert und durch Titration mit 0,5 N NaOH auf pH 11,8 gelöst. Die Lösung wird dann kontinuierlich Schall ausgesetzt und durch Zentrifugieren mit einer CEPA 101 Zentrifuge geklärt, falls erforderlich, oder durch ein Whatman Nr. 1-Papier gefiltert.

Die geklärte Proteinlösung (32,6 1 enthalten 297000 OD bei 280 nm) wird in mehrere Teile (6 χ 5,4 1) geteilt, welche jeweils 50000 - 60000 OD aufweist. Jeder·Teil wird getrennt einer Ultrafiltrierung mit einem Millipore Pellicon Ultrafilter unterworfen, welcher mit drei Schneidekassetten (vom Typ PTHK) für ein Molekulargewicht von 100000 versehen ist und jeweils eine Fläche von 5 ft² aufweist. Ein 5,4 1-Teil wird auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und aufgehoben. Das Konzentrat wird rückverdünnt mit frischem 10 mM Boratpuffer (pH 11,8) auf sein ursprüngliches Volumen und gut gemischt. Die Charge wird erneut auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und mit dem ersten Ultrafiltrat kombiniert. Wenn die Gesamtmenge des OD in den Ultrafiltraten 20 % des ursprünglich auf den Ultrafilter aufgegebenen OD's entspricht, wird das Volumen des nächsten Konzentrierungsschritts auf 0,5 anstelle von 1 1 gebracht. Der Zyklus der Konzentration und der Verdünnung mit 10 mM Boratpuffer wird fortgesetzt, bis das Ultrafiltrat von dem Konzentrationsvolumen von 0,5 1 eine Absorption bei 280 nm (1 cm Zelle) von weniger als 0,1 aufweist. Dies dauert normalerweise 9 bis 12 Zyklen der Konzentration und Verdünnung. Das letzte Konzentrat wird verworfen.

Sämtliche Ultrafiltrate werden kombiniert und mit 6 N HCl auf pH 9,0 eingestellt. Die anderen 5,4 1-Teile wurden

27.8.8.5- 277996

Si 78^

- 80-

einer Ultrafiltration in der gleichen Weise unterworfen, wobei sämtliche pH eingestellten Ultrafiltrate kombiniert wurden. Bei einem typischen Ansatz wurden insgesamt 389 1 Ultrafiltrate mit einer Absorption von 0,26 Äquivalenten von 100000 OD erhalten, wobei 24 bis 40 h zur Fertigstellung notwendig waren.

Die kombinierten Ultrafiltrate (380 1 , welche 100000 OD bei 280 nm enthalten) aus dem 100 K Ultrafiltrationsschritt wurden auf eine Sepharose CL-6B DEAE 'Ionenaustauschersäule mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 23 cm/h (25 l/h) gegeben. Die Säule mit einem Durchmesser von 37 cm und einer Höhe von 15 cm wurde mit Zweibett-Volumen (32 1) 10 mM Boratpuffer mit pH 9,0 gewaschen. Das Eluat der Aufgabe- und Waschschritte wurde verworfen. Ein stufenweiser Wechsel des Eluenten zu 10 mM Borat, 100 mM Natriumchlorid, pH 9, führt zu einer Freisetzung des bGH von der Säule. Die Elutionsströmungsgeschwindigkeit beträgt 23 cm/h. Das Fortschreiten des Ansatzes wird überprüft, indem die Absorption des Eluats bei 280 nm verfolgt wird. Das bGH-Maximum wird mit 4 bis 5 Bettvolumina (84 1 , die 43000 OD bei 280 nm enthalten) gesammelt und dann auf etwa 10 mg/ml unter Verwendung eines Milliporpelliconultrafiltrationsgeräts mit einem Molekulargewicht von

1OQOQ- abschneidenden Kassetten konzentriert. Die Lösung wird dann lyophilisier't. Die Ausbeute beträgt etwa 70 g reines bGH.

27 B.85- 1:77996

-81-BEISPIEL 6

Aktivität eines bGH Analogen, hergestellt mit pR012

1. Radioimmunoassay-Vegleich des bGH-Analogen mit natürlichem bGH

Eine Lösung, die 100 ng/ml bGH-Analoges enthält, wurde in einer Phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (1 % BSA) hergestellt. Diese Lösung wurde in Serie auf eine Konzentration von 50, 25, 12,5 , 6,25 , 3,12 , 1,56 und 0,78 ng/1 verdünnt. Doppelte 0,1 ml Aliquots dieser Lösungen wurden einem RIA unterworfen, und zwar unter Anwendung der Doppelantikörperprozedur.

Die Verdünnungskurve ist mit derjenigen vergleichbar, die mit dem natürlichen bGH erhalten wird.

2. Radiorezeptorbindungsbestimmung

Eine Radiorezeptorbindungsbestimmung wurde mit Kaninchenlebermembranen durchgeführt, wie von Tushima, T. und Freisen, H.G. beschrieben (Y. Chin., Endocr. Metab. (1973), Band 37, Seite 3) , und zwar unter Verwendung von 12 5X-J₃GH als Tracer und mit authentischen bGH-Lösungen zur Bildung der Eichkurven. Es wurden. Dreifachbogen 2 h bei Raumtemperatur in 0,3 ml des Bestimmungspuffers (50 mM Tris, 15 mM CaCl- und 5 mg/ml Rinderserumalbumin pH 7,6) inkubiert. Die Gläschen

125

enthielten " I-bGH (20000 Zerfälle/min der Präparation von 30 - 60 uci/1g), 150 - 250 ug Lebermembranprotein und entweder natürliches bGH (1 - 100 ng) oder Extrakte von bakteriellem bGH. Das Ergebnis.-zeigte, daß die bGH-Aktivität des bGH-Analogen vergleichbar ist mit der des natürlichen bGH.

Ti. 8.85- .'^? 779.96

5! 7 a

-82-3. Tibia-Test

Die Bioaktivität des mit pR012 erhaltenen bGH-Analogen, das nach dem Beispiel 5 aus bakteriellen Zellen gewon-nen wurde, würde nach dem Tibia-Test bestimmt. (Parlow, A.F., et al, Endocrinology (1965) Band 77, Seite 1126). Ratten mit einem Alter von 28 - 30 Tagen wurde die Hypophyse entfernt, worauf sie 10 bis 14 Tage ohne Behandlung gehalten wurden. Rinderwachstumshormon, das von Rinderhypophyse oder von rekombiniertem Escherichia coli stammt, wurde in 0,15 M NaCl + 0,01 M Borat, pH 10,0 , gelöst. Ratten (4 - 7 je Gruppe) erhielten täglich subkutane Injektionen von bGH-Lösungen (5 125 ug/Tag in 0,2 ml) für 5 Tage, wobei sie eine normale Nahrung erhielten (Purina Rat-Chow und Wasser adlibitum), Die Tiere wurden nach 6 Tagen getötet, die Knieknochen der Vorderbeine wurden entnommen,' der Länge nach geschnitten, mit Aceton fixiert und mit 2 %iger AgNO., gefärbt. Die Breite der epiphysealen Platten wurde durch Beobachtung mit einem Sezierungsstereomikroskop (Nikon) .bestimmt.* Die Mittelwerte (40.Bestimmungen pro Ratte) wurden zur Erstellung der Langdosis-Empfindlichkeitskurven verwendet. Die Ergebnisse zeigen, daß die bGH-Aktivität des mit pRO12 erzeugten bGH~Analogen vergleichbar ist mit der von natürlichem bGH.

BEISPIEL 7

Wachstum von SODß.T..

1. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pSODß' T₁₁ wurden auf einem Kaseinmedium (vergleiche Impfmaterial) wachsen gelassen, dann um das zweifache mit einem Gefriermittel verdünnt und

Ti. 8/85- 277996

251 7

-83-bei -80⁰C gelagert. Das Gefriermittel enthält je 500 ml:

K2HPO4	6,3	g
KH2PO4	1/8	g '
Na-Citrat	0,45	g
MgSO4.7H2O	0,09	g
(NH4V2SO4	0,9	g
Glycerin	44,0	g
Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Das sterile Medium wird in einem Schüttelkolben mit der Vorratskultur geimpft und 15 h auf einem Schüttelgerät bei 30⁰C und etwa 200 Umdrehungen /min inkubiert. Wie erforderlich, wurden die anschließenden Stufen der Impfmaterialzüchtung in gerührten belüfteten Fermentationsgefäßen durchgeführt. Das sterile Medium wurde mit 2 - 10 % Impfmaterial geimpft und 15 h bei 30⁰C, pH 7 - 0,5 unter Rühren und Belüftung· inkubiert, um einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff oberhalb 20 % Luftsättigung zu erreichen.

III. Herstellung

Das Produktionsmedium enthält:

Kaseinhydrolysat 20	10	27 8.05-	0,	277996	g/i
Hefeextrakt	2,	10	g/i
K2HPO4	1	5 g/l
MgSO4.7H2O	5	g/i
NaCl	0,	g/i
Biotin	1	1 mg/1
Thiamin	Spurenelementlösung 3	mg/1
CuSO4	ml/1
ZnSO4	8 g/l
mg/1

co ι 78

Das Medium enthält außerdem 12,5 mg/1 Tetracyclin. Das Tetracyclin ist für die Produktion nicht zwingend, jedoch wird es immer in dem Medium_/ das zum Wachsen des Impfmaterials verwendet wird, gefunden.

Biotin, Thiamin und Tetracyclin in konzentrierter Lösung werden separat einer Filtersterilisation unterworfen und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugesetzt. Es wird eine sterile Glucoselösung, um ursprünglich 10 g/l zu erhalten, zugesetzt. Beim Induktionsschritt wird nochmals 10 g/l Glucose zugesetzt.

Die Spurenelementelösung enthält:

FeCl3	4H2O	1	6	g/i
ZnCl2.	6H2O		CN	g/i
CoCl2-	4-2H2O		2	g/i
Na2MoO	2H2°		2	g/i
CaCl2-			1	g/i
CuCl2			1	g/i
H3BO3	tr.HCl	O	,	5 g/l
konzen	1	OO ml/1

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % der . Impfkultur geimpft und bei 30"C inkubiert. Die Rühr- und Belüftungsrate wird so eingestellt, daß das Niveau des gelösten Sauerstoffs über 20 % Luftsättigung liegt. Der pH wird mit NH, auf 7 - 0,2 eingestellt. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l gestartet.

OD,,_n = 10) erreicht, wird die Induktion boU

Die Temperatur wird auf 42°C erhöht und bei 42°C 1 - 5 h gehalten. Die Kultur wird dann gekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugieren zur Enzymreinigung gewonnen.

27. a85- 277996

-85-Gewinnung von SOD

.1 1/2 kg bakterieller Zellen (nasser Kuchen) werden in 12 1 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) in einem Polytron (Kinematica)-Mischer suspendiert, wobei die Geschwindigkeit so eingestellt wird, daß eine möglichst minimale Schaumbildung auftritt. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomillzell-Disrupter KD5 (Willy, A. Bachofen, Basel) geschickt. Die homogene Suspension der aufgerissenen oder zerstörten Zellen'wird Schall ausgesetzt, und zwar unter Verwendung einer kontinuierlichen Durchflußzelle, und mit einer CEPA 101-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird 2 h auf 65°C erwärmt, gekühlt und wie zuvor zentrifugiert. Der klare Überstand wird auf 1 1 mit einem Millipore-Pellicon-Ultrafiltriergerät konzentriert , unter Verwendung von Kassetten (Typ PTGC), die das Molekulargewicht von 10000 abschneiden. Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEÄE-Sepharosesäule geschickt (2 kg DEAE Sepharose), welche mit 150 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7', 8) eingestellt ist. Die durchströmende Lösung wird gesammelt, konzentriert und mit einem Pelliconultrafiltriergerät gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert und dann auf eine QAE-Sepharosesäule gegeben, die mit 20 mM Tris-HCl-Puffer eingestellt ist. Die Säule wird mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8 und einem Salzgradienten (0 - 200 mM NaCl) entwickelt. Die SOD-enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter Verwendung einer Pelliconultrafiltriereinrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Natriumacetat gebracht, unter Verwendung eines 1 M Natriumacetatpuffers, pH 4,8..Die Proteinlösung wird dann weiter mit einer CM-Sepharosesäule getrennt, die mit 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,7 eingestellt ist. Die Säule wird entwickelt, in-

27 8.05- 277996

251 78

dem der gleiche Puffer und ein Salzgradient (100 J500 mM NaCl) verwendet wird. Die SOD enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter Verwendung eines Pelliconultrafiltriergerats konzentriert und lyophilisiert.

BEISPIEL 8

Aktivität von durch PSODB₁T₁₁ erzeugtem SOD

Die enzymatische Aktivität des SOD Analogen, das mit PSODB₁T₁₁ gemäß dem Beispiel 7 hergestellt worden ist, wurde bestimmt, indem die Inhibition der Reduktion von Ferricytochrom-c verfolgt wurde, wie von McCord und Fridovich in J. Biol. Chem. (1969) Band 244, Seiten 6049 - 6055 beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität des mit PSODB₁T₁₁ produzierten SOD-Analogen vergleichbar ist mit der von natürlichem humanen SOD (Sigma) und mit demjenigen von Rinder-SOD (Orgotein:

Grunenthal GmbH).

BEISPIEL 9 Expressionsvektoren

I. p579

Der Vektor p579, der in Fig. 19 gezeigt ist, und im einzelnen in der Beschreibung der Figuren erläutert ist, setzt sich zusammen aus einem P -Promotor, einer N-Einsa.tzstelle (Nut_r), der C -ribosomalen Bindungsstelle, gebunden an die einzigartigen EcoRI- und Ndel-Restriktionsstellen, einem ATG-Initiierungscodon und den T₁T,,-Transkriptionsterminierungssignalen, welche von dem Ende des rrnB-ribosomalen RNA-Gen-Operon von Escherichia coli stammen. Diese Elemente werden auf pBR322 geklont,

278.85- 277996

das das ampicillinresistente Gen trägt. Weitere Merkmale sind in Fig. 19 dargestellt.

p579 wurde hergestellt durch Einführung der T₁T--Transkriptionsterminierungssignale, die auf dem Plasmid pPS1 enthalten sind, in die Hindlll-Stelle des Vektors pRO211 . pRO211 ist in Fig. 2 dargestellt. pPS1 wurde beschrieben von Sarmientos et al, Cell (1983), Band 32, Seiten 1337 - 1346 und wurde hinterlegt bei der "American Type Culture Collection"unter der ATCC Nr. 39807. p579 und seine Derivate, welche eukaryotische Gene enthalten, werden mit geeigneten Escherichia coli Wirten gehalten. Das wichtigste Merkmal des Wirts besteht darin, daß er den thermosensitiven Repressor CI857 und das Antiterminierungs-N-Protein liefert (Gottesman, M. et al, J. Mol. Biol. (1980) Band 140, Seiten 57-75).

p5?9 weist zahlreiche Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Expressionsvektoren auf, einschließlich

1 . extrem hoher Expressionsniveaus

Dieser Vektor ist in der Lage, die Expression von fremden Proteinen in E. coli auf ein so hohes Niveau wie 42 % des gesamten cellulären Proteins zu heben. Dieses Niveau der Expression ist höher als das , das für andere ähnliche /\PL- Plasmide beschrieben worden ist, welchen die T T„-Transkripitonsterminierungssequenzen fehlen.

2. Transkriptionsterminierungssignalen

Der Vektor p579 enthält die T. T^Transkriptionsterminierungssignale, welche abwärts von dem

27 3.85- 277996

25 t 7t

Promotor und der C--ribosomalen Bindungsstelle angeordnet sind. Das hohe Niveau der Expression,, das erhalten werden kann wenn dieser Vektor verwendet wird, ist teilweise auf die Gegenwart der T-T„-Transkriptionsterminatoren am Ende des eingeführten Gens zurückzuführen, da die T- Τ,,-Transkriptionsterminatoren in der Lage sind, die Transkription der 'N-modifizierten RNA-Polymerase zu terminieren. Die Transkriptionterminatoren verhindern auf diese Weise die A^pr kontrollierte Transkription unerwünschter Plasmidproteine, wodurch die relativen Ausbeuten der erwünschten Proteine erhöht werden.

3. ersetzbarer ribosomaler Bindungsstellen .

p579 enthält eine einzigartige EcoRI-Stelle, welche oberhalb der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist, wobei eine einzigartige Ndel-Stelle an dem ATG-Initiierungsk'odon sich befindet. Die ribosomale ' Bindungsstelle ist damit mit zwei einzigartigen · Restriktionsstellen verbunden. Dies führt zu einer leichten Entfernung der vorhandenen ribosomalen Bindungsstelle ( /1 C-ribosomale Bindungsstelle) und eirier Substitution von praktisch allen anderen natürlichen und synthetischen ribosomalen Bindungs-ι stellen, ohne andere Merkmale des Plasmids zu ver-

t ändern. Dadurch wird die optimale Expression des

erwünschten Polypeptides erheblich erleichtert. 4· einer thermoinduzierbaren Regulation der Expression Der λ P -Promotor ist inaktiv-,- wenn der C-Repressor

Lj X

an ihn gebunden ist. Der cI857 Repressor ist thermosensitiv, d.h., er wird an den Promotor bei 30⁰C gebunden, jedoch bei 42°C inaktiviert. Durch Erhöhung

27 8.85- 277996

der Temperatur der Fermentierung auf 42°C kann so das Wirtsbakterium induziert werden, um das gewünschte Protein zu bilden.

Die Vorteile eines derartigen Systems umfassen folgendes :

a) ein fremdes Protein, welches gegenüber Escherichia coli toxisch ist, kann in einem späteren Stadium des Fermentierungsprozesses gebildet werden,

wodurch ein früher Zelltod verhindert wird.

b) eine Überproduktion eines Proteins kann das Protein stabilisieren und eine proteolytische Zersetzung verhindern (Cheng, Y.E. et al, Gene

(1981), Band 14, Seite 121). Eine "schlagartige" Überproduktion unter Verwendung eines eng regulierten Promotors, wie ,\p , kann daher einer

Lj

kontinuierlichen Produktion auf niedrigem Niveau vorzuziehen sein.

5. eines vereinfachten Induktionsprotokolls

Die Plasmide, die von p579 abstammen, werden bei etwa 42⁰C induziert und bei 42° während der ganzen Zeit der Proteinsynthese gehalten. Das Induktionsprotokoll für Plasmide, die von pMG100 und pND5 abstammen, sind in der anhängigen, mit übertragenen US-Patentanmeldung 514 188 beschrieben, und benötigen eine Temperaturerhöhung auf 42°C, gefolgt von einer langer andauernden Wachstumsperiode bei 38°C. Das optimale Induktionsprotokoll für p579 erfordert keinen Kühlschritt auf 38°C und ist daher vereinfacht.

' 27. 8.35"- 27799G

25! 7

-90-6. einer hohen Vervielfältigungs- oder Kopiezahl

Es hat sich herausgestellt, daß der /\p -Promotor in p579 auf einem Plasmid eine höhere Vervielfälti-. gungszahl aufweist als die -transduzierenden Phagenvektoren, welche in Escherichia coli verwendet werden. Dadurch wird das Expressionsniveau erhöht.

7. einer ribosomalen Bindungsstelle und eines Initiierungskodons

Dieser Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiierungskodon (ATG). Auf diese Weise kann jedes eukaryotische Gen geklont werden, ohne ein Initiierungskodon zuzugeben. Weiterhin erhöht das wirksame RBS das Expressionsniveau. Die ribosomale Bindungsstelle ist die /) C_TT-ribosomale Bindungsstelle, welche vorher in den Vektor pND5 geklont worden ist. Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist

TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA

also ein Basenpaar anders als die ribosomale Bindungsstelle, die in einem wilden Typ A gefunden wird.

8. einer geeigneten Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor weist eine einzigartige Ndel-Restriktionsstelle auf, die in sich das ATG-Initiierungskodon enthält. Dadurch wird eine geeignete Positionierung des gewünschten Gens ermöglicht. Die einzigartige Ndel-Stelle wird unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle gefunden.

27 8.05- 277996

9. geeigneten Restriktionsstellen zur Geneinführung

116 Basenpaare abwärts von der Ndel Restriktionsstelle sind einzigartige Restriktionsstellen BgIII und Smal , in dieser Reihenfolge, zu finden. Diese einzigartigen Restriktionsstellen ermöglichen einen einfachen Einbau der erwünschten Gene.

10. einer "nut"-Stelle

Das N-Protein, welches durch den Wirt zur Verfügung gestellt wird, wird an die Nut-Stelle (N-Einsatzstelle) auf dem Expressionsvektor gebunden und verhindert "dadurch eine Terminierung der Transkription an der t_RI-Stelle oder eine vorzeitige Transkriptionsterminierung in dem geklonten Gen.

Stämme

Geeignete Wirte für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind.Stämme von Escherichia coli, die sich zur Transformation eignen, einschließlich A1637, A2602, A1563, A1645 (c600 r"m⁺ gal⁺ thr~ leu" la.c'bl ( AcI857 ΔΗ1 ZlBamHI N⁺) und A2097 (A1645 Iac ΔΥΑ21 proC::Tn 10).

BEISPIEL 10 . -^!

Tierische Wachstumshormone 30

Der Aufbau von pHG44 ist in Fig. 6 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert, wobei es unter der ATCC Nr. 39806 hinterlegt worden ist. Das Plasmid

27 R-85- 277996

stammt von dem pROi2-Plasmid ab, das in Fig. 2 dargestellt ist, und zwar durch Einführung der T.. T_-Transkriptionsterminierungssequenzen aus dem Plasmid pPS1, welches in Fig. 6 dargestellt und beschrieben wird von Sarmientos et al, Cell (1983), Band 32, Seiten 337 1346 und welches unter der ATCC Nr. 39807 hinterlegt worden ist. die Gegenwart der T₁T„-Terminierungssequen- zen verhindert lang andauernde mRNA-Transkriptionen und verhindert dadurch Expressionen des ß-Lactamasegens auf hohem Niveau und möglicherweise anderer unerwünschter Proteine unter der Kontrolle des \ P_r-Promotors.

Das Plasmid pHG44 ist eingeführt worden in den Escherichia coli-Stamm A2097 durch Transformation, indem die einem Fachmann geläufigen Methoden verwendet wurden. Der Stamm erzeugt nach dem Wachstum und der

Induzierung ein Analoges des Rinderwachstumshormons (bGH), welches eine Aminosäuresequenz met-asp-gln aufweist, welche an den' Amino-Terminus der Phenylalaninform des authentischen bGH addiert ist. Die Menge des bGH-Analogen , das mit pHG44 erzeugt wird, beträgt etwa 37 - 42% des von dem Bakterium insgesamt produzierten Proteins, berech¹ net durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen.

ι Γ

Die angewendeten Methoden zum Wachstum des Stamms, der Gewinnung des erzeugten bGH-Analogen und der Reinigung des bGH-Analogen werden in dem Beispiel 13 beschrieben.

Das Expressionsniveau ist höher als das, das mit PRO12 (Tabelle I) erhalten wird, und zwar aufgrund einer signifikanten Herabsetzung der ß-Lactamaseexpression, die durch die Einführung der T.T_-Terminierungssequenzen an dem 3'-Terminus des bGH-Gens beeinträchtigt wird.

27. 8.85- 27799G

251 78

-93-. II. pSAL 5600-1 ·

Der Aufbau von pSAL 5600-1 ist in Fig. 10 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pSAL 5600-1 stammt von pSAL 5200-6 ab (in Fig. 3 dargestellt), und zwar durch Einführung von T₁T -Terminierungssequenzen aus dem Plasmid pPS1 (ATCC Nr. 39807).

Das Plasmid pSAL 5600-1 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation eingeführt, indem die einem Fachmann bekannten Methoden verwendet wurden. Der Stamm erzeugte.nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von bGH, welches die Aminosäuremethionin addiert an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH aufweist. Die Menge des bGH-Analogen, das mit den pSAL 5600-1-Stämmen hergestellt worden ist, betrug etwa 22 - 28% des insgesamt von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der-Coomasie-Färbung von SDS -Polyacrylamidgelen. Die angewendeten Methoden für das Wachstum des Stamms, die -Gewinnung des erzeugten bGH-Analogen und die Reinigung des bGH-Analogen sind die gleichen wie jene, die für pHG44 in Beispiel 13 beschrieben sind.

Das Expressionsniveau war höher als das, das mit den pSAL 52.00-6-Stämmen erhalten wurde, und zwar aufgrund einer signifikanten Reduktion in der ß-Lactama^!seexpression, die durch die Einführung der T.T.-Terminierungssequenzen an dem 3'-Terminus des bGH-Gens beeintrachtigt wurde.

III.

Der Aufbau von p3009 ist in Fig. 11 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid p3009 wurde durch Einführung von Ndel-Ndel-Schweine-

27 3.05- 277996

C O

_94-

wachstumshormon-cDNA-Fragment in die. einzigartige Ndel-Stelle des p579 Expressionsvektors (Fig. 19) erhalten. Das Schweinewachstumshormon (pGH)-Fragment wurde von p3008 (ATCC Nr. 39804) durch Ndel-Umsetzung isoliert.

. Das Plasmid p3009 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung von einem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Dieser Stamm erzeugte nach dem Wachstum und der Induzierung ein Analoges von pGH, welches die Aminosäuremethionin, addiert an den Amino-Terminus der Phenylalaninform des natürlichen pGH aufwies. Die Menge des erzeugten pGH-Analogen betrug etwa 30 - 35 % des von dem Bakterium insgesamt erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen. Die angewendeten Verfahren für das Wachstum des Stamms, die Gewinnung des erzeugten pHG-Analogen und die Reinigung des pGH-Analogen sind die gleichen wie jene, die für pHG44 im Beispiel 13 beschrieben sind.

Das Expressionsniveau von p3009 war höher als das, das mit p3008-Stämmen erhalten, wurde, und zwar aufgrund der signifikanten Verminderung der ß-Lactamaseexpression, die beeinträchtigt wurde durch die Einführung der T₁T--Terminierungssequenzen an dem 3'-Terminus des pGH-Gens.

IV.

Der Aufbau von p5003 ist in Fig. 12 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. p5003 ist bei der "American Type Culture Collection" unter der ATCC Nr. 39792 hinterlegt worden. Das Plasmid wurde durch Einführung eines Ndel-Ndel-Hühnerwachstumshormons-cDNA-Fragments aus p5002 in die einzigartige Ndel-Stelle des p579 Expressionsvektors erhalten.

27 8.35- 277996

CO \ J ρ "

Das Plasmid p5003 wurde eingeführt in den Escherichia coli-Stamm A2097 durch Transformation nach einem Fachmann bekannten Methoden. Dieser Stamm erzeugte nach dem Wachstum und der Induzierung ein Analoges des Hühnerwachstumshormons (cGH), welches die Aminosäuremethionin aufweist, addiert an den Aminoterminus der . Phenylalaninform von natürlichem cGH. Die Menge des erzeugten cGH-Analogen betrug 30 - 35 % des von den Bakterien insgesamt produzierten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen. Die verwendeten Methoden zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten cGH-Analogen und zur Reinigung des cGH-Analogen sind die gleichen wie jene, die für pHG44 im Beispiel 13 beschrieben sind.

Das Expressionsniveau von p5003 war höher als das, das mit p5002-Stämmen erhalten wurde, und zwar aufgrund der signifikanten Reduktion in der ß-Lactamaseexpression, die beeinträchtigt wurde durch die Einführung der T..T,,-Terminierungssequenzen an dem 3'-Terminus des cGH-Gens.

BEISPIEL 11 Human-Cu-Zn-Superοχid-Dismutase (SOD)

I >' I. pSODß TT-1

ι '

I ,

Der Aufbau von pSODß.jTT-1 ist in Fig. 16 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pSODß.TT-1 wurde erhalten durch Einführung der TT Terminierungssequenzen an dem 3'-Ende des SOD-Gens, das in pSODß-T.. gefunden.wird (Fig. 15).

Das Plasmid pSODß.TT-1 wurde iri den Escherichia coli Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung von einem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Dieser

27.8.85- 27799G

Stamm erzeugte nach dem Wachstum ein SOD-Analoges. Die Menge des erzeugten SOD-Analogen betrug 10 - 15 % des von dem Bakterium insgesamt erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-

Polyacrylamidgelen. .

Die angewendeten Methoden zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten SOD-Analogen und zur Reinigung des SOD-Analogen sind in dem Beispiel 15 beschrieben. 10

Das Expressionsniv^leau von pSODß.TT-1 war höher als das , das mit pSODß T . (Tabelle II) erhalten wurde, und zwar aufgrund der T.T„-induzierten Reduktion der Transkription und Translation von unerwünschten DNA-Sequenzen.

.

Das erzeugte Human-Cu-Zn-SOD-Analoge unterscheidet sich vom natürlichen Human-Cu-Zn-SOD darin, daß der Aminoterminus Alanin nicht acetyliert ist, wie durch die Aminosäuresequenz-Stöchiometrie gezeigt wurde. Das natürliche Human-SOD ist acetyliert an dem Aminoterminus Alanin (Hartz, J.W. und Deutsch H.F., J. Biol. Chem.. (1972), Band 247, Seiten 7043-7050, Jabusch J.R. et al, Biochemistry (1980), Band 19, Seiten 2310 - 2316; Barra et al, FEBS Letters (1980) Band 120, Seite 53 und Oberley L.W. , Superoxide Dismutase, Band I, CRC Press, Florida, (1982) Seiten 32-33). Das natürliche Human-SOD ist glycosyliert (Huber, W., US-Patent Nr. 3 579 495, erschienen am 18. Mai 1971). Bakteriell produziertes Human-SOD ist fast mit Sicherheit nicht glycosyliert, da Escherichia coli Proteine, welches er erzeugt, nicht glycosyliert. Die Aminosäuresequenz des bakteriell erzeugten SOD-Analogen ist identisch mit dem von reifem Human-SOD und enthält keinen Methioninrest an seinem N-Terminus.

27 0.05- 277996

-97-BEISPIEL 12

Humanes Apolipoprotein E3 (Apo-E3) I. pTV-170

Der Aufbau von pTV-170 ist in Fig. 20 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pTV-170 wird erhalten durch Einführung des Ndel-Ndel-Apo-E3 Fragments, das von pApoE-EX2 (ATCC Nr. 39787) stammt, in die einzigartige Ndel-Stelle des Expressionsvektors p579 .

pTV-170 wurde eingeführt in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung von einem Fachmann geläufigen Methoden. Das erhaltene Klon erzeugte nach dem Wachstum Human-ApoE3, vermutlich mit der Aminosäure Methionin addiert an den Amino-Terminus des natürlichen Human-ApoE3. Die Menge des gebildeten Human-ApoE3 Analogen betrug 1 % des von dem Bakterium insgesamt erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Färbung von SDS~Polyacrylamidgelen. Die angewendeten Methoden zum Wachstum des Stamms sind die gleichen , wie in Beispiel 17 beschrieben.

II. pTV-194

Der Aufbau von pTV-194 ist in Fig. 22 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. pTV-194 wurde abgeleitet von pTV-170 (Fig. 20), indem die C -ribosomale Bindungsstelle durch den ß-Lactamasepromotor und eine ribosomale Bindungsstelle ersetzt wurde, der sich pBLA11 ableitet. pBLA11 enthält den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle des ß-Lactamasegens,

das in pBR322 zwischen den Koordinaten 4157 und 4353

27 8.85- :77996

A. v S /

. -98-

gefunden wird. Ein EcoRI-Kuppler wurde oberhalb des Promotors addiert und ein Multirestriktionsstellenkuppler wurde unmittelbar nach dem Initiierungskodon ATG addiert. Die Sequenz des codierenden Strangs , die mit dem Initiierungskodon beginnt, ist damit ATGAGCTCTAGAATTC. pBLA11 wurde in dem "American Type Collection Center" als ATCC Nr. 39788 hinterlegt.

pTV-194 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation mit einem Fachmann geläufigen Methoden eingeführt. Der erhaltene Klon produzierte nach dem Wachstum ein Analoges von Human-ApoE3, wahrscheinlich mit der Aminosäure: Methionin - addiert an den Amino-Terminus von natürlichem Human-ApoE3. Die Menge des erzeugten Human-Apo-E-Analogen betrug etwa 3 % des von dem Bakterium insgesamt erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Färbung von SDS-'Polyacrylamidgelen. Das angewendete Verfahren zum Wachstum des Stamms ist das gleiche, wie es für pTV-170 i^m Beispiel 17 beschrieben ist.

III. pTV-214

Der Aufbau von pTV-214 ist in Fig. 24 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. pTV-214

wurde abgeleitet von pTV-190 (in Fig. 21 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert), und zwar durch Einführung eines synthetischen DNA-Fragments, das die 14-Aminosäuren-terminale Sequenz des menschli-3Q chen Wachstumshormons kodiert, in die einzigartige Ndel-Stelle von pTV-190 .

. pTV-21.4 wurde in den Escherichia coli-Stamm A1645 durch Transformation nach einem Fachmann geläufigen Methoden 3g eingeführt. Der erhaltene Klon produzierte nach dem

27 8,35- 277996

Wachstum und der Induktion ein Analoges von Human-ApoE3 das an seinem Aminoterminus die 14-Aminosäuren-terminale Sequenz des Humanwachstumshormons aufweist, gefolgt von Methionin, das an die Sequenz des reifen Human-ApoE3 geknüpft ist. Die Menge des erzeugten Human-ApoE Analogen betrug etwa 2 % des insgesamt von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen. Die angewendeten Methoden zum Wachstum des Stamms sind die gleichen wie jene, die für pTV-170 im Beispiel 17 beschrieben sind.

BEISPIEL 13

Wachstum von pHG44 I. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pHG44 wurden auf einem Kaseinmedium (sh. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann um das zweifache mit einem Gefriermittel verdünnt und bei -80⁰C aufbewahrt. Das Gefriermedium enthält je 500 ml:

K₂HPO₄ 6,3 g

^KH2^PO4 ¹'^{8 g}

Na-Citrat 0,45 g

MgSO₄-7H₂O 0,09 g

(NH₄)₂SO₄ 0,9 g

Glycerin 44,0g

¹¹· Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Steriles Medium in einem Schüttelkolben wurde mit der Vorrats-

27.8.85- -77996

25!

-100-

kultur geimpft und 15 h auf einer Schütteleinrichtung bei 30°C mit etwa 200 Umdrehungen/min inkubiert. Falls erforderlich, wurden die anschließenden Stufen der Impfmaterialzüchtung in gerührten, belüfteten Fermentoren durchgeführt. Ein steriles Medium wurde mit 2-10% der Impfmaterialkultur geimpft und 15 h bei 30⁰C , pH 7 - 0,5, unter Rühren und Belüften inkubiert, so daß ein gelöster Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung aufrechterhalten wurde.

. III. · Produktion .

Das Produktionsmedium enthält:

Kaseinhydrolysat	20	g/i
Hefeextrakt	10	g/i
K2HPO4	2,	5 g/l
MgSO4·7H2O	1	g/i
NaCl	5	g/i
Biotin	o,	1 mg/1
Thiamin	1	mg/1
Spurenelementlösung	3	ml/1

Das Medium enthält ferner 100 mg/1 Ampicillin. Das Ampicillin ist nicht zwingend für die Produktion, es wird jedoch immer in dem Medium gefunden, das zum Züchten des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Ampicillin wurden jeweils in kon-3Q zentrierten Lösungen separat einer Filtersterilisation unterworfen und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugesetzt. Eine sterile Glucoselösung wurde anfangs zugesetzt, um 10 g/l zu erhalten. Nach dem Induktionsschritt wurden nochmals 10 g/l Glucose zugesetzt.

3.33- ::.7799"6

-101 Die Spurenelementlösung enthält:

FeCl3	2°	1	6	g/i
ZnCl2·4Η	2°		2	g/i
CoCl2-OH	2H2O		CNJ	g/i
Na2MoO4-	2°		2	g/i
CaCl2--2H			1	g/i
CuCl2			1	g/i
H3BO3	. HCl	0	,5	g/i
konzentr	1	00	ml/l

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30⁰C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsrate wird so eingestellt, daß der gelöste Sauer-, stoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung liegt. Der pH wird auf 7 - 0,2 mit NH., eingestellt. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l erreicht (OD,-,-. = 10) wird die Induktion gestartet.

Die Temperatur wird auf 42°C erhöht und bei 42⁰C 1 bis 5 h gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugieren zur Hormonreinigung gewonnen.

Gewinnung von bGH

13 kg bakterieller Zellen (nasser Kuchen) werden in 5 Volumen einer Lösung suspendiert, die 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält, unter Verwendung eines Polytron (Kinematica)-Mischers, wobei die Geschwindigkeit des Mischers so eingestellt wurde, daß eine minimale Schaumbildung auftrat. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomillzelldisruptor KD5 (Willy A. Bachofen-, Basel) mit einer Geschwindigkeit von 80 l/h geschickt,

27 8.05- "77996

25t 787

^ und die homogene Suspension der zerstörten Zellen wird durch Zentrifugieren mit einer CEPA 101 Zentrifuge mit einer Fließgeschwindigkeit von 45 l/h geklärt. Das Präzipitat des Zentrifugierungsschritts wird gesammelt und in 15,5 1 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) erneut suspendiert, welcher 50 mM EDTA enthält. Das Lysozym wird au'f eine Endkonzentration von 0,05 mg/ml gebracht und die Suspension 16 h bei 37°C inkubiert, es wird Triton X-100 für eine Endkonzentration von 1 % zugesetzt. Die Suspension wird dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, mit einem kontinuierlichen Durchflußzellensonifikator (Heat System) Schall bei einer Geschwindigkeit von 18 l/h ausgesetzt und mit einer CEPA-101 Zentrifuge zentrifugiert. Das Präzipitat wird gesammelt, erneut in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,.4) suspendiert, wie vorstehend Schall ausgesetzt und mit einer CEPA 101-Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellen werden erneut suspendiert in 15,5 1 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) , welcher 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält, worauf zweimal ausgefällt und in 15,5 1 destilliertem Wasser erneut suspendiert wird. Das Recipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt und bei -2O⁰C aufbewahrt.

Reinigung von bGH

Das Präzipitat wird in 30 - 40 1 destilliertem Wasser erneut suspendiert und durch Titrieren mit 0,5 N NaOH auf pH 11,8 gelöst. Die Lösung.wird dann kontinuierlieh Schall ausgesetzt und durch Zentrifugieren mit einer DEPA 101 Zentrifuge geklärt, falls erforderlich, oder durch ein Whatmann Nr. 1-Papier filtriert.

Die geklärte Proteinlösung (32,6 1 , die 297000 OD bei 280 nm ) enthält, wird in getrennte Teile (6 χ 5,4 1)

27. 3.35- 277996

geteilt, welche jeweils 50000 - 60000 OD enthalten. Jeder Teil wird separat einer Ultrafiltrierung mit einem Millipore Pellicon Ultrafilter unterworfen, das 3 Kassetten (Typ PTHK) mit jeweils einer Fläche von 5 ft² aufweist, welche ein Molekulargewicht von 100000 abschneiden. Ein 5,4 1-Teil wird auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat-wird gesammelt und aufbewahrt. Das Konzentrat wird zurückverdünnt auf sein Originalvolumen mit 10 mM Boratpuffer, pH 11,8, und gut gemischt. Die Charge wird erneut auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und mit dem ersten Ultrafiltrat vereinigt. Wenn das gesamte durchgelaufene OD in den Ultrafiltraten 20 % des ursprünglich auf den Ultrafilter aufgegebenen OD's ausmacht, wird das Volumen des nächsten Konzentrationsschritts auf 0,5 1 statt 1 1 gebracht. Die Zyklen der Konzentrierung und Verdünnung mit 10 mM Boratpuffer werden fortgesetzt, bis das Ultrafiltrat von dem konzentrierten Volumen von 0,5 1 eine Absorption bei 280 nm (1 cm-Zelle) von weniger als 0,1 aufweist. Dies dauert normalerweise 9 bis 12 Zyklen der Konzentration und Verdünnung. Das Endkorizentrat wird verworfen.

Sämtliche Ultrafiltrate werden vereinigt und auf pH 9,0 mit 6N HCl eingestellt. Die anderen 5,4 1-Teile werden in der gleichen Weise einer Ultrafiltrierung unterworfen, wobei sämtliche pH-eingestellten Ultrafiltrate vereinigt werden. Bei einem typischen Ansatz wurden insgesamt 380 1 Ultrafiltrate mit einer Absorption von 0,26 hergestellt, was 100000 OD entspricht, wobei zur Fertigstellung 24-4Oh erforderlich waren.

Die vereinigten Ultrafiltrate (380 1 enthalten bei 280 nm 10O000 OD) aus dem 100K Ultrafiltrierungsschritt 3g werden auf eine Sepharose CL-6B DEAE Ionenaustauschersäule mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von

27799S

23 cm/h (25 l/h) gegeben. Die Säule mit einem Durchmesser von 37 cm und einer Höhe von 15 cm wurde mit zwei Bettvolumen (32 L) 10 mM Boratpuffer mit pH 9,0 gewaschen. Das Eluat der Aufgabe- und Waschschritte wurde verworfen. Ein Stufenwechsel des Eluenten 'auf 10 mM Borat, 100 mM Natriumchlorid, pH 9, setzte das bGH von der Kolonne frei. Die Elutionsfließgeschwindigkeit beträgt 23 cm/h. Das Fortschreiten des Ansatzes wird überwacht, indem die Absorption des Eluats bei 280 nm verfolgt wird. Das bGH-Maximum wird in 4 - 5 Bettvolumen gesammelt (84 1, welche bei 280 nm 43000 OD enthalten) und dann auf etwa 10 mg/ml konzentriert, indem ein Millipore Pellicon Ultrafiltration verwendet wurde, mit einer Kassette, die ein Molekulargewicht von 10000 abschneidet. Die Lösung wurde dann lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 70 g reines bGH.

BEISPIEL 14 Aktivität des bGH-Analogen, hergestellt mit pHG44

1. Radioimmunoassayvergleich des bGH—Analogen mit natürlichem bGH

Eine Lösung, die 100 ng/ml bGH-Analoges enthält, wurde in einer physiologischen phosphat-gepufferten Salzlösung (1 % BSA) hergestellt. Diese Lösung wurde in Reihe auf Konzentrationen von 50, 25, 12,5 , 6,25 , 3,12 , 1,56 und 0,78 ng/1 verdünnt. Doppelte 0,1 ml Aliguots dieser Lösungen wurden einem RIA unterworfen, wobei die Doppelantikörperprozedur angewendet wurde. Die Verdünnungskurve war vergleichbar mit der, die mit natürlichem bGH erhalten wird.

?7 8.85- '!77996·

-105-2. Radiorezeptorbindungsbestimmung

Eine Radiorezeptorbindungsbestimrnung wurde mit Kaninchenlebermembranen durchgeführt, wie beschrieben von Tushima, T. und Freisen, H.G. (Y. Chin., Endocr.

Metab. (1973) Band 37, Seite 3) und zwar unter Verwen-

125

dung von I-bGH als Tracer und mit authentischen bGH-Lösungen zur Erstellung der Eichkurven. Es wurden Dreifachproben 2 h bei Raumtemperatur in 0,3 ml des Bestimmungspuffers (50 rnM Tris, 15 mM CaCl- und 5 mg/ml Bovinserumalbumin, pH 7,6) inkubiert. Die Röhrchen ent-

12 5

hielten I-bGH (20000 Zerfälle pro min der Präparation von 30 - 60 uci/ug), 150 - 250 ug Lebermembranprotein und entweder natürliches bGH (1 - 10 ng) oder Extrakte von bakteriellem bGH. Das Ergebnis zeigt, daß die bGH-Aktivität des bGH-Analogen vergleichbar ist mit der des natürlichen bGH.

3. Tibia-Test

· ' Die Bioaktivität des mit pRO12 erzeugten bGH-Analogen, das nach dem Beispiel 13 aus bakteriellen Zellen gewonnen wird, wurde mit einem Tibia-Test bestimmt (Parlow, A.F. et al, Endocrinology (1965), Band 77, Seite 1126)

Ratten mit einem Alter von 28 - 30 Tagen wurde die Hypophyse entfernt, worauf sie ohne Behandlung 10 14 Tage gehalten wurden. Rinderwachstumshormon, das von Knochenanhangdrüsen oder von rekombiniertem Escherichia coli stammt, wurde in 0,15 M NaCl mit 0,01 M Borat, pH 10,0, gelöst. Ratten (4- 7 je Gruppe) erhielten täglich subkutane Injektionen der bGH-Lösungen (5 - 125 ug/Tag in 0,2 ml) für 5 Tage, wobei sie eine normale Ernährung erhielten (Purina Rat-Chow und

gg Wasser adlibitum). Die Tiere wurden am sechsten Tag

27. S.85- '277996

getötet, ihre Vorderbeinknieknochen wurden entfernt, der Länge nach geschnitten, mit Aceton fixiert und mit 2 % AgNO, angefärbt. Die Breite der epiphysealen Platten wurde durch Beobachtung mit einem Sezierstereoskop (Nikon) bestimmt. Die mittleren Werte (40 Bestimmungen je Ratte) wurden zur Erstellung von Langdosisempfindlichkeitskurven benutzt. Die Ergebnisse zeigten, daß die bGH-Aktivität von pHG44 erzeugtem bGH-Analogem vergleichbar ist mit der von natürlichem bGH. 10

BEISPIEL 15

Wachstum von pSODß.TT-1

¹· Vorratskulturen

Vorratskulturen von pSODß-T.. wurden auf einem Kaseinmedium (sh. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann auf das Doppelte mit einem Gefriermittel verdünnt und bei -80⁰C aufbewahrt. Das Gefriermedium enthält je 500 ml:

K2HPO4 ·	6,3	g	g	g
KH2PO4	1 ,8	g	g	g
Na-Citrat	0,45
MgSO4-7H2O	0,09
(NH4J2SO4	0,9
Glycerin	44,0
Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Ein steri- les Medium in einem Schüttelkolben wurde mit der Vorratskultur geimpft und 15 h auf einer Schütteleinrichtung bei 30⁰C und etwa 200 Umdrehungen pro min inkubiert. Die erforderlichen anschließenden Stufen der

7 3.85- 277996

"1.787

- Ί ΟΤΙ Impfmaterialzüchtung wurden in bewegten belüfteten Fermentoren durchgeführt. Ein steriles Medium wurde mit 2 - 10. % Impfmaterial geimpft und 15 h bei 30⁰C , pH 7 - 0,5 , unter Rühren und Belüften geimpft, um einen gelösten Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung zu erhalten.

III. Produktion Das Produktionsmedium enthält:

Kaseinhydrolysat	20	g/i
Hefeextrakt	10	g/i
K2HPO4	2,	5 g/l
MgSO4.7H2O	1	g/i
NaCl	5	g/i
Biotin	0,	1 mg/1
Thiamin	1	mg/1
Spurenelementlösung	3	ml/1
CuSO4	0,	8 .g/l
ZnSO.	1	0 mg/1

Das Medium enthält außerdem 12,5 mg/1 Tetracyclin. Das Tetracyclin ist nicht zwingend für die Produktion, jedoch wird es immer in dem Medium gefunden, das zum Wachstum des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Tetracyclin werden in konzentrierten Lösungen separat einer Filtersterilisation unterworfen und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugesetzt. Die sterile Glucoselösung wird ursprünglich zugesetzt, um 10 g/l zu erhalten. Bei dem Induktionsschritt werden weitere 10 g/l Glucose zugesetzt.

Die Spurenelementlösung enthält:

27 a85-- ?77996

ι 73 γ

FeCl3	4H2O	1	6	C	g/i
ZnCl2-	6H2°		2	g/i
CoCl2.	)4-2H2O		2	g/i
Na2MoC	2H£0		2	g/i
CaCl2-			1	g/i _
CuCl2			1	g/i '
H3BO3	konzentr. HCl ·	0	5 g/l
	1	00 ml/1

Das Medium wird mit 0,5 -10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30⁰C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsrate wird so eingestellt, daß ein gelöster Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung aufrechterhalten wird. Der pH wird auf 7 ί 0,2 mit NH-, eingestellt.

Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l (ODg₆₀ = 10) . erreicht wird, wird die Induktion gestartet.

Die Temperatur wird auf 42⁰C erhöht und bei 42⁰C

1 bis 5 h gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und

die Zellen werden durch Zentrifugieren zur Enzymreinigung gewonnen.

Wiedergewinnung von SOD

11/2 kg bakterielle Zellen (nasser Kuchen) werden in 12 1 50 mM Natriumphosphat (pH 7,8) in einem PoIytron (Kinematica)-Mischer suspendiert, während die Geschwindigkeit so eingestellt wurde, daß eine möglichst geringe Schaumbildung auftrat. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomillzelldisrupter KD5 (Willy, A. Bachofen, Basel) geschickt. Die homogene Suspension der zerstörten oder aufgebro- r: _β chenen Zellen wird einer Schallbehandlung unter Verwendung einer kontinuierlichen Durchflußzelle unterworfen und mit einer CEPA 101 Zentrifuge zentrifugiert. Der

27. U)- 277996

Überstand wird 2 h auf 65⁰C erwärmt, gekühlt und wie zuvor zentrifugiert. Der klare Überstand wird auf 1 1 mit einer Millipore Pellicon Ult'raf iltriereinrichtung konzentriert, und zwar unter Verwendung von Kassetten (Typ PTGC), die ein Molekulargewicht von 10000 abschneiden. Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEAE-Sepharosesäule (2 kg DEAE-Sepharose) geschickt, welche mit 150 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) eingestellt ist. Die durchgeflossene Lösung wird gesammelt, konzentriert und mit einem Pellicon Ultrafiltriergerät gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert, worauf sie auf eine QAE-Sepharosesäule gegeben wird, die mit 20 mM Tris-HCl Puffer eingestellt worden ist. Die Säule wird mit 20 mM Tris-HCl Puffer, pH 7/8 und einem 'Salzgradienten (0 - 200 mM NaCl) entwickelt. SOD enthaltende Fraktionen werden gesammelt unter Verwendung einer Pellicon Ultrafiltriereinrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Natriumacetat gebracht, indem 1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,8 , zugesetzt wurde. Die Proteinlösung wurde dann weiter mit einer CM-Sepharosesäule getrennt, welche mit 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,7, eingestellt worden ist. Die Säule wurde entwickelt, indem' der gleiche Puffer und ein Salzgradient (100 - 500 mM NaCl) verwendet wurde. Die SOD enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, unter Verwendung eines Pellicon Ultrafiltriergeräts konzentriert, und lyophilisiert.

BEISPIEL 16

Aktivität des SOD , das mit pSODß TT-1 hergestellt ist

Die enzymatische Aktivität des SOD Analogen, das mit « pSODß.TT-1 produziert wird, das nach dem Beispiel 15 hergestellt worden ist, wurde bestimmt, indem die

27. 8.05- 277996

25ί 7

Inhibition der Reduktion von Ferricytochrom-c überwacht wurde, wie beschrieben von McCord und Fridovich in J. Biol. Chem. (1969), Band 244, Seiten 6049-6055. Die Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität des mit pSODß.TT-1 hergestellten SOD Analogen vergleichbar ist mit jener des natürlichen Human-SOD und jener des Rinder-SOD (Orgotein:Grunenthal GmbH).

BEISPIEL 17

^!

Wachstum von pTV-170

1. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pTV-170 wurden auf einem Kaseinmedium (sh. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann auf das Doppelte mit einem Gefriermittel verdünnt und bei -80°C aufbewahrt. Das Gefriermedium enthält je 500 ml:

K2HPO4	6,3 g
KH2PO4	1 ,8 g
Na-Citrat	0,45 g
MgSO4.7H2O	0,09 g
(NH4J2SO4	0,9 g
Glycerin	44,0 g

II. Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Ein steriles Medium in einem Schüttelkolben wurde mit der Vorratskultur geimpft und 15 h auf einer Schütteleinrichtung bei 3O⁰C und etwa 200 Umdrehungen pro min inkubiert. Da erforderlich, wurden die folgenden Stufen der Impfmaterialzüchtung in bewegten belüfteten Fermentoren durchgeführt. Ein steriles Medium wurde mit 2 bis

27.8.85- 277996

10 % Impfmaterial beimpft und 15 h bei 30⁰C, pH 7 --0,5, unter Rühren und Belüften inkubiert, um einen gelösten Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung aufrechtzuerhalten.

III. Produktion

Das Produktionsmedium enthält: 10

Kaseinhydrolysat	20	g/i
Hefeextrakt	10	g/i
K2HPO4	2,	5 g/l
MgSO4-7H2O	1	g/i
NaCl	5	g/i
Biotin	0,	1 mg/1
Thiamin	1	mg/1
Spurenelementlösung	3	ml/1

Das Medium enthielt außerdem 10 mg/1 Ampicillin. Das Ampicillin ist für die Herstellung nicht zwingend, jedoch wird es immer in dem Medium gefunden, das zum Wachstum des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Ampicillin wurden in konzentrierten Lösungen getrennt einer Filtriersterilisation unterworfen und zu dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugegeben. Eine sterile Glucoselösung wurde ursprünglich zugegeben, um 10 g/l zu erhalten. Beim Induktionsschritt werden weitere 10 g/l Glucose zugegeben.

Die Spurenelementelösung enthält:

FeCl₃ 16 g/l

ZnCl₂-4H₂O 2 g/l

CoCl₂-OH₂O 2 g/l

Na₂Mo0₄-2H₂0 2 g/l

99G

:^?7

251 71

CaCl₂-2H₂O 1 g/l

CuCl₂ 1 g/l

H₃BO₃ 0,5 g/l

konzentr. HCl 100 ml/1

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30⁰C -inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsraten werden so eingestellt, daß ein gelöster Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung aufrechterhalten wird. Der pH wird auf 7 - 0,2 mit NH, eingestellt. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l

(OD,,_Λ = 10) erreicht hat, wird die Induktion gestartet, ο ου

Die Temperatur wird auf 42⁰C erhöht und bei 42⁰C 15 min gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden zur Proteinreinigung durch Zentrifugieren gewonnen .

BEISPIEL 18 20

Rinderwachsturnshormon

Der Aufbau von pHG50 ist in Fig. 6 dargestellt und wird in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid pHG50 wurde erhalten durch Einführen des Hpall-Hpall

1 434

AcI -Fragments von pSK434 (ATCC Nr. 39784) in die einzige Clal-Stelle von pHG44 (ATCC Nr. 39806). Das Plasmid pHG51 wurde in der gleichen Weise aufgebaut. Das Ximm434 el -Fragment wurde jedoch in der entgegengesetzten Richtung in dem Plasmid gefunden, verglichen mit dem Plasmid pHG50.

pSK434 (ATCC Nr. 39784) wurde durch Umsetzung von A.imm434 mit BamHI und Verknüpfen des Gemischs von

?7 a35- 277996

\C

' BamHI-umgesetzten pBR322 aufgebaut. Das verknüpfte Gemisch wurde in Escherichia coli A2097 transformiert und Kolonien, welche gegenüber \ imm434cI3003~Phagen immun sind wurden isoliert. Das Plasmid pSK434, das aus einer dieser Kolonien isoliert wurde, enthält ein 6 kb BamHI-Fragment,· welches das \cI434-Gen enthält und sich von jenseits des N-Gens bis jenseits des P-Gens erstreckt. pSK434 weist die in Fig. 6 dargestellte Restriktionskarte auf.

pHG50 und pHG51 wurden in Escherichia coli A1645 durch Transformation eingeführt, indem dem Fachmann geläufige Methoden-verwendet wurden. Die erhaltenen Klone, die als A3108 bzw. A3112 bezeichnet werden, produzieren nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von bGH mit einer Aminosäuresequenz met-asp-gln, addiert an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH. Die Menge des erzeugten bGH-Analogen betrug 37 bis 42% des gesamten von dem Bakterium produzierten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen (Tabelle I).

Prophageneinführung

Um das /\_cI434 Selektionssystem anzuwenden, müssen die Zellen, die pHG50 enthalten, außerdem Prophagen Λ imm434cl~ enthalten. Wir haben deshalb einen Prophagen \ imm434 cI3003 mini TnIO^ 16Δ17 verwendet. Die mini .Tn10 Δ 16Δΐ7~Tetracyclinresistenzmarkierung (Foster et

3Q al., Cell (1981) Band 23, Seite 20 1-2 1 3 )' wurde in den Phagen eingeführt, um die Isolierung von seltenen und stabilen Prophageneiiifuhrungs vorfallen zu erleichtern. Dadurch wird auch eine einfache Überprüfung der Gegenwart von Prophagen durch Überwachung der Tetracyclinresistenz

gc ermöglicht.

η 8.85- 277996

-114-

Der Escherichia coli-Stamm A1645 , der das Plasmid pHG50 enthält, das in Gegenwart von Ampicillin gewachsen ist, wurde mit einer geringen Infektionsmultiplizitat mit Aimm434-CI3003 mini Tn10£J6^17 bei 30⁰C infiziert.

Tetracyclinresistente Kolonien wurden isoliert und gereinigt. Dieser Stamm wurde bei dem American Type Collection Center unter ATCC Nr. 39805 hinterlegt.

Nach einer alternativen Methode wurde der Prophage eingeführt durch Transformierung von Escherichia coli 1645 simultan mit pHG50 und ^imm434 CI3003 mini TnIOA 16j^17 und Selektion der Kolonien, welche sowohl ampicillin- wie tetracyclinresistent sind.Geeignete Wirte für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind Stämme von Escherichia coli, die sich zur Transformation eignen, einschließlich A1637, A2602, A1563, A1645 (C600AH ÄBamHI r~m⁺gal⁺ thr" leu~ Bl) oder A2097 (A1645 lacA^A21, proC::Tn10). Der gewünschte Prophage kann in sämtliche Stämme auf gleiche Art und Weise wie vorstehend beschrieben eingeführt werden.

pHG50 und der Vektor, welcher von ihm durch Abtrennung des bGH-Gens abgeleitet werden kann, weisen zahlreiche Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Expressions vektoren auf, einschließlich:

¹ · einer verbesserten Plasmidstabilität

43 4 Das Plasmid enthält das el Repressorgen, welches ein /\imm434ci -Lysogen unterdrückt. Der Verlust des Plasmids wird zu einer bakteriellen Zellyse aufgrund der /\_kimm434cl Prophageninduktion. Das Plasmid bleibt damit stabil, ohne antibiotische Selektionsschemata durchführen zu müssen, welche kostspielig sind. Tabelle III zeigt die erhöhte

>l UV 277996

251 7

4 3 4

Stabilität der Plasmide, die das el -Stabilisationssystem tragen.

434 Das el Plasmidstabilisationssystem ist mit dem thermoinduzierbaren \p -Promotor-Expressionssystem

kompatibel, und zwar trotz der Tatsache, daß der thermolabile Repressor für den A_-P -Promotor C ist.

Es ist zu bemerken, daß jeder /{imm434cl Prophage » . das /limm434cl3003 Prophagen ersetzten kann. Weiterhin kann jede antibiotische Resistenzmarkierung die Tetracyclinresistenzmarkierung ersetzen, welche durch das mini Tn1 0 Δ 1 6 Δ"! 7 eingeführt worden ist. Die Verfügbarkeit von /\imm21- und /\imm22-repressornegativen Mutanten ermöglicht den Ersatz des /\434-Systems durch ein vergleichbares System der Phagen 21 oder der Phagen 22.

2. extrem hohe Expressionsniveaus 20

Dieses Plasmid ist in der Lage, die Expression fremder Proteine in Escherichia coli auf ein so hohes Niveau wie 42 % des gesamten zellulären Proteins zu bringen. Dieses Expressionsniveau ist höher als das, das für ähnliche \ P -Plasmide beschrieben worden ist, denen die T₁T«-Transkriptionsterminierungssequenz fehlt.

3. TranskriptionsterminierungsSignale

Das Plasmid enthält die T.T„-Transkriptionsterminierungssignale abwärts von dem AP_r-Promotor und der

Lj

C_TT-ribosomalen Bindungsstelle angeordnet. Die hohen Expressionsniveaus , welche erhalten werden, wenn dieses Plasmid verwendet wird, dürften teilweise auf die Gegenwart der T.T„-Transkriptionsterminatoren

?7 885- "277996

am Ende des eingeführten Gens zurückzuführen sein, da die T₁T„-Transkriptionsterminatoren in der Lage sind, die Transkription von N-modifizierter RNA' Polymerase zu terminieren. Die Transkriptionsterminatoren verhindern so die A?_r"kontrollierte

Lj

Transkription unerwünschter Plasmidproteine, wodurch die relativen Ausbeuten der erwünschten Proteine erhöht werden.

4. eine austauschbare ribosomale - Bindungsstelle

pHG50 enthält eine einzigartige EcoRI-Stelle, welche "oberhalb" der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist, sowie eine Ndel-Stelle, welche an dem ATG-Initiierungskodon angeordnet ist. Die ribosomale Bindungsstelle wird damit durch zwei einzigartige Restriktionsstellen gebunden. Dadurch wird die Entfernung der vorhandenen ribosomalen Bindungsstelle (die Ac_TI~ribosomale Bindungsstelle) und die -Substitution von praktisch jeder anderen natürlichen und synthetischen ribosomalen Bindungsstelle erleichtert, ohne die Merkmale des Plasmids zu verändern. Dadurch wird die optimale Repression der erwünschten Polypeptide erheblich erleichtert.

5. eine thermoinduzierbare Regulation der Expression

Der /( P -Promotor ist inaktiv, wenn der C_T-Repressor an ihn gebunden ist. Der cI857-Repressor ist thermosensitiv, d.h. , er wird an den Promotor bei 30⁰C gebunden, jedoch bei 42°C inaktiviert. Durch Erhöhung der Temperatur der Fermentation auf 42⁰C wird so das Wirtsbakterium induziert, um das gewünschte Protein zu bilden.

Die Vorteile eines derartigen Systems umfassen folgendes:

^rl 8.R5- 2.77996

(a) Ein fremdes Protein, welches gegenüber Escherichia coli toxisch ist, kann spät produziert werden, wodurch ein früher Zelltod bei dem Fermentationsprozess vermieden wird

5

(b) Eine Überproduktion eines Proteins kann das Protein stabilisieren und eine proteolytische Zersetzung verhindern. (Cheng, Y.E. et al, Gene (1981), Band 14, Seite 121). Eine "plötzliche" Überproduktion unter Verwendung eines eng regu

lierten Promotors , wie /\P_r < kann daher gegenüber einer- kontinuierlichen Produktion auf niedrigem Niveau vorzuziehen sein.

6. ein vereinfachtes Induktionsprotokoll

pHG50 wird bei etwa 42°C induziert und bei 42⁰C während der gesamten Periode der Proteinsynthese gehalten. Das Induktionsprotokoll des Plasmids, das sich von pMG100 und pND5 ableitet, wird in der anhängigen, mitübertragenen US-Patentanmeldung 514 188 beschrieben und umfaßt eine Induktion bei 42°C, gefolgt von einer ausgedehnten Wachstumsperiode bei 38°C. Das optimale Induktionsprotokoll für pHG50 erfordert keinen Abkühlungsschritt auf 38°C und ist deshalb vereinfacht.

7. eine hohe Vervielfältigungszahl .

Der λ P,-Promotor in pHG50 wird bei einem Plasmid mit einer Vervielfältigungszahl gefunden, die höher ist als die der λ-transduzierende Phagenvektoren, welche in Escherichia coli vorhanden sind. Dadurch werden die Expressionsniveaus erhöht.

27.-8.85- 277996

i / Q

8· eine ribosomale Bindungsstelle und einen Initiier ungskodon

Dieser Expressionsvektor enthält eine stark prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiierungskodon (ATG). Auf diese Weise kann jedes eukaryotische Gen geklont werden, ohne ein Initiierungskodon hinzuzugeben. Das wirksame RBS erhöht ferner die Expressionsniveaus . Die ribosomale Bindungsstelle ist die /\c_T - ribosomale Bindungsstelle. Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist:

TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA

Ein Basenpaar unterscheidet sich von- der ribosomalen Bindungsstelle, welche in dem wilden Typ /} gefunden wird

20

9. eine geeignete Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor , der sich von dem Plasmid ableitet, weist eine einzigartige Ndel-Restriktionsstelle auf, in welcher das ATG-Initiierungskodon enthalten ist. Dies erlaubt eine geeignete Positionierung des erwünschten Gens. Die einzigartige Ndel-Stelle wird unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle gefunden.

10· eine nut-Stelle

N-Protein, welches durch den Wirt zur Verfügung gestellt wird, bindet die Nut-(N-Einsatz)Stelle an den Expressionsvektor und verhindert dadurch die Terminierung der Transkription an der t_DT-Stelle oder

κ ι

277396

eine vorzeitige Transkriptionsterminierung in dem geklonten Gen.

TABELLE III

434

Plasmidstabilisierung, erhalten mit dem el -System

	Plasmid	Wirt	% Zellen ohne
Stamm	pHG44	A2097	Plasmid
A3102	pHG50	A1 645	10 - 20
A3108	pHG50	A1645	10 - 20
A3109		( /\i434cl~mini Tn10)	< 1 ,0
	pHG51	A1645
A31 12	pHG51	A1645	10 - 20
A31 13		(A. i434cl~ mini Tn10)	<1,0

Die Stämme A3108 und A3112 wurden mit A imm434I mini Tn10 bei 30⁰C infiziert und es wurden tetracylinresistente Kolonien erhalten. Die Kolonien wurden gereinigt und auf ihre Amoicillinrestistenz getestet. Einzelne Kolonien, wurden ausgewählt und über Nacht bei 30⁰C in einem LB-Medium wachsen gelassen, das 50ug/ml Ampicillin enthält. Die Kulturen wurden 1/1000 in dem LB-Medium verdünnt, bis etwa 5x10 /ml wachsen gelassen und dann weiter 1/100000 in frischem LB verdünnt und über Nacht wachsen gelassen. Die Proben wurden auf LB-Platten verteilt sowie auf LB-Platten, die 50 ug/ml Ampicillin enthalten. Etwa 50 Kolonien von jeder LB-Platte wurden auf ihr Wachstum auf LB-Platten, die Ampicillin enthalten, überprüft. Die Ergebnisse zeigten eine Plasmidstabilitat der ausgewählten Klone.

27 8 85- 277996

-120_ BEISPIEL 19

Wachstum von pHG50 I. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pHG50 wurden auf einem Kaseinmedium (sh. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann mit Gefriermedium zweifach verdünnt und bei -80⁰C aufbewahrt. Das Gefriermedium enthält je 500 ml:

K2HPO4	6,3 g
KH2PO4	. " 1,8g
Na-Citrat	0,45 g
MgSO4-7H2O	0,09 g
(NH4J2SO4	0,9 g
Glycerin	44,0 g
Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20.g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Ein steriles Medium wird in einem Schüttelkolben mit der Vorratskultur geimpft und 15h auf einer Schütteinrichtung bei 30⁰C und mit etwa 200 Umdrehungen pro min inkubiert. Da erforderlich, wurden die anschließenden Stufen der Impfmaterialzüchtung in bewegten, belüfteten Fermentoren durchgeführt. Steriles Medium wurde mit 2 - 10 % Impfmaterial geimpft und 15 h bei 30°C ,pH 7 - 0,5 , inkubiert und zwar unter Bewegung und Belüftung, so daß ein gelöster Sauerstoffgehalt oberhalt 20 % Luftsättigung aufrechterhalten wird.

III.Produktion

Das Produktionsmedium enthält :

27.8.85- 27799G

Kaseinhydrolysat	20	1	g/i
Hefeextrakt	10	5	g/r
K2HPO4	(NJ	0,	5 g/l
MgSO4-7H2O	1	g/i
NaGl	3	g/i
Biotin	1 mg/1
Thiamin	mg/1
Spurenelernentlösung	ml/1

Das Medium enthält außerdem 100 mg/1 Ampicillin. Das Ampicillin ist nicht zwingend für die Produktion, jedoch wird es immer in dem Medium gefunden, das zum Wachstum des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Ampicillin werden in konzentrierten Lösungen separat einer Filtersterilisation unterworfen und zu dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugesetzt. Es wird eine Glucoselösung zu Beginn zugegeben, um 10 g/l zu erhalten. Beim Induktionsschritt

werden weitere 10 g/l Glucose zugesetzt. Die Spurenelementlösung enthält

16 g/l

ZnCl,-4H,0 2 g/l

2 g/l 2 g/l 1 g/l 1 g/i

^H3^BO3 · 0,5 g/l

konzentr. HCl 100 ml/1

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30.⁰C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsrate wird so eingestellt, daß ein Gehalt an

FeCl	3	l'	4H	2	0	0
ZnCl	2'	2	6H	2	0
CoCl	2*	3	4'		2H2O.
Na2MoO		2H	2
CaCl
CuCl
H3BO

27 8 85- '277996

1 /87

gelöstem Sauerstoff oberhalb 20% Luftsättigung aufrechterhalten wird. Der pH wird auf 7 - 0,2 mit NH₃ eingestellt. Wenn die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l

(OD,,η = 10) erreicht, wird die Induktion gestartet. DbU

Die Temperatur wird auf 42°C erhöht und bei 42°C 1 bis 5 h gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden für eine Hormonreinigung durch Zentrifugieren gewonnen.

BEISPIEL 20

P8300-10A

Der Aufbau von p8300-10A (ATCC Nr. 39785) ist in Fig. 7 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. Das Plasmid p8300-10A wurde abgeleitet von dem Plasmid pOP1Δ 6 mit hoher konstitutiver Vervielfältigungszahl (Gelfand, D.H. et al, PNAS (1978),,Band 75, Seite 5869; Meusing, et al, Cell (1981) Band 24, Seiten 235-242). p7200-22, das in Fig. 7 gleichfalls dargestellt ist, wurde mit CIaI und Clal-Clal-Fragment umgesetzt, welches den /\_P~ Promotor enthält, und das bGH-Gen und

Lj

die T.T_?-Sequenzen wurden isoliert. Das CIaI-CIaI-Fragment wurde in die einzigartige Clal-Stelle von pOPiA⁶ eingeführt. (Das Plasmid p7200-22 ist ein Derivat von pSAL5600-1 (Fig. 10), in welches ein synthetischer Clal-Kuppler an der Bglll-Stelle "oberhalb" des /\ P.-Promoters eingeführt worden ist).

Es zeigte sich, daß Plasmid p8300-10A den Phänotyp hoher konstitutiver Vervielfältigungszahl selbst nach der Einführung des ΛΡ_Τ—Promotors bei etwa 42⁰C auf-

Lj

rechterhält. Dies dürfte auf die Gegenwart der T.T_— Terminierungssequenzen an dem 3'-Ende der bGH-Sequenz zurückzuführen sein, welche die Bildung von langen mRNA-

273.85- 277996

-123-Transkriptionen von dem λ P -Promotor verhindert, wel-

Lj

eher durch die anderen mRNA-Transkriptionen an dem Ursprung der Replication von pOP1 {\ 6 gestört werden könnte.

p8300-10A wurde in den Escherichia coli-Stamm A2097 durch Transformation unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden eingeführt. Dieser Stamm erzeugt nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges des Rinder-Wachstumshormons mit einem Methioninrest, der an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH addiert ist. Die Menge des erzeugten bGH-Analogen beträgt etwa 37 - 43% des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen. Die verwendeten Methoden zum Wachstum des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten bGH-Analogen und zur Reinigung des bGH-Analogen sind die gleichen wie jene, die für pSAL-170/10 im Beispiel 24 beschrieben sind.

BEISPIEL 21

Ein allgemein verwendbarer Expressionsvektor kann von dem Plasmid p8300-10A (Fig. I₁ ATCC Nr. 39785) durch Entfernung des bGH-Gens abgeleitet werden. Der so abgeleitete Vektor weist zahlreise Vorteile gegenüber den bisher beschriebenen Expressionsvektoren auf, einschließlich

1. extrem hoher Expressionsniveaus

Der Vektor ist in der Lage, die Expression fremder Proteine in Escherichia coli auf ein so hohes Niveau wie 44 % des gesamten zellulären Proteins zu bringen.

27 8.03- 2.77996

· 2 . eine hohe konstitutive Vervielfältigungszahl

Der Vektor hält eine hohe konstitutive Vervielfältigungszahl von 200 - 300 Kopien pro Zelle aufrecht. Er unterscheidet sich damit von anderen Αρ_γ-Εχ-pressionsvektoren, die eine viel niedrigere Vervielfältigungszahl aufweisen. Die hohe Vervielfältigungszahl führt zu hohen Expressionsniveaus.

3. Transkriptionsterminierungssignale

Der Vektor, welcher durch Abtrennen der bGH-Sequenz von p8300-10A erhalten wird, enthält die ^T^Transkriptionsterminierungssignale' "abwärts" von dem /\ P -Promotor und der C - ribosomalen Bindungsstel-Ie angeordnet. Die hohen Expressionsniveaus sind, teilweise auf die Gegenwart der T₁T„-Transkriptionstertninatoren am Ende der eingeführten Gene zurückzuführen, da das T.T_?-Signal die Transkription von N-rnodif izierter RNA-Polymerase terminiert. Die Transkriptionsterminatoren verhindern auf diese Weise die /| P- kontrollierte Transkription unerwünschter Plasmidproteine, wodurch die relativen Ausbeuten der erwünschten Proteine erhöht werden. Die Gegenwart der T.T„—Transkriptionsterminationssignale verhindert ferner lange mRNA-Transkriptionen durch den Plasmidursprung der Replikation. Dadurch wird die Stabilität des hohen Vervielfältigungsphänotyps erhöht.

Plasmide mit ähnlicher hoher Vervielfältigungszahl welche den ΛP_r~Promotor enthalten, jedoch keine Transkriptions terminierungssequenzen aufweisen, sind nicht stabil und neigen dazu, den Phänotyp mit hoher Vervielfältigungszahl zu verlieren.

27. 8.35- 277996

-125-4. einer austauschbaren ribosomalen Bindungsstelle

p8300-10A enthält eine einzigartige EcoRI-Stelle, welche "oberhalb" der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist, sowie eine Ndel-Stelle, welche "unterhalb" der ribosomalen Bindungsstelle angeordnet ist. Die ribosomale Bindungsstelle wird auf diese Weise an zwei einzigartige Restriktionsstellen gebunden. Dadurch wird die Entfernung der vorhandenen ribosomalen Bindungsstelle ( /| C _T—ribosomale Bindungsstelle) ¹^d die Substitution von praktisch jeder anderen natürlichen oder synthetischen ribosomalen Bindungsstelle erleichtert, ohne die Merkmale des Plasmids zu verändern. Dadurch wird eine optimale Expression der erwünschten Polypeptide erheblich erleichtert.

5. einer thermoinduzierbaren Regulation der Expression

^Der /\ P." Promotor ist inaktiv, wenn der C_T-Repressor an ihn gebunden ist. Der cI857-Repressor istthermosensitiv, d.h. er wird an den Promotor bei 30⁰C gebunden, jedoch bei 42⁰C inaktiviert. Durch Erhöhung der Temperatur der Fermentation auf 42°C wird auf diese Weise das Wirtsbakterium induziert , um das gewünschte Protein zu bilden.

Die Vorteile eines solchen Systems umfassen folgendes

(a) Ein fremdes Protein, das gegenüber Escherichia coli toxisch ist, kann in dem Fermentationsprozess spät erzeugt werden, womit ein früher Zelltod verhindert wird.;

(b) eine Überproduktion eines Proteins kann das

Protein stabilisieren und eine proteolytische

27.8.85- 277996

Zersetzung verhindern. (Cheng, Y.E., et al, Gene

(1981),Band 14, Seite 121). Eine "plötzliche" Überproduktion mit einem eng regulierten Promoter, wie /|P_r kann daher gegenüber einer kontinuierliehen Produktion auf niedrigem Niveau vorzuzie

hen sein.

6. eines vereinfachten Induktionsprotokolls

Die Proteinproduktion durch Plasmide, die. in dieser Patentanmeldung und der anhängigen , mitübertragenen US-Patentanmeldung Nr. 514 188 beschrieben wird, wird durch den thermosensitiven cI857-Repressor reguliert.

.

Das Induktionsprotokoll, das die in der anhängigen mit übertragenen Anmeldung beschriebenen Plasmide benötigen, umfaßt eine Induktion bei 42⁰C, gefolgt von einem Wachstum bei 38°C. Die optimale Induktion

'20 der Proteinsynthese, wenn das Plasmid p8300-10A oder pSAL130/15 oder deren'Plasmidderivate verwendet werden, umfaßt hingegen eine Induktion bei 42°C, gefolgt bei einem Wachstum bei der gleichen Temperatur, nämlich 42⁰C. Dadurch wird die Notwendigkeit, den Fermentor zu kühlen, beseitigt.

7. einer ribosomalen Bindung.sstelle und eines Initiierungskodons

QQ Dieser Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindunqsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiierungskodon (ATG). Auf diese Weise kann jedes eukaryotische Gen geklont werden, ohne das Initiierungskodon zuzugeben. Die

gc effiziente RBS erhöht ferner die Expressionsniveaus. 'Die ribosomale Bindungsstelle ist die /\ C_T_-~ribo-

27 3.85- 277996

somale Bindungsstelle. Die Sequenz der ribosomalen Bindungsstelle ist folgendermaßen:

TAAGGAAGTACTTACAT ATTCCTTCATGAATGTA

• Ein Basenpaar unterscheidet sich von der ribosomalen Bindungsstelle, die in dem wilden Typ \ gefunden wird

10

8. einer geeigneten Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor weist eine einzigartige Ndel-Restriktionsstelle auf, welche in der Stelle des ATG-Initiierungskodons enthalten ist. Dadurch wird eine geeignete Positionierung des gewünschten Gens ermöglicht. Die einzigartige Ndel-Stelle wird unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle gefunden.

9. nut-Stelle

N-Prot'ein, welches durch den Wirt geliefert wird, bindet die Nut-Stelle (N-Einsatzstelle ) an dem Expressionsvektor und verhindert dadurch eine Terminierung der Transkription an der t -Stelle

κ ι

oder eine vorzeitige Transkriptionsterrninierung in dem geklonten Gen.

Stämme

Geeignete Wirte für die beschriebenen Vektoren und Plasmide sind Stämme von Escherichia coli, die sich zur Transformation eignen, einschließlich A1637, A2602, A1563, A1645 (c600 r"m⁺ gal⁺ thr" leu" Iac" bl ( /\ CI857A Hl ÄBamHI N⁺)) und A2097 (A1645 Iac Δ "Y A21 proC::Tn 10).

27 8.85- 277996

25!78?

-128-BEISPIEL 22

pSAL-130/5

Der Aufbau von pSAL-130/5 ist in Fig. 8 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert. pSAL-130/5 wird aus p8300-10A (ATCC Nr. 39785).erhalten, indem das met-phe-bGH-Gen durch das met-asp-gln-bGH-Gen ersetzt wird. Das met-asp-gln-bGH-Gen wird aus dem Plasmid pHG44 (Fig. 6) (ATCC Nr. 39806) durch Umsetzung mit Ndel und Hindlll erhalten.

pSAL-130/5 wurde in den Escherich'ia coli-Stamrn A1645 durch Transformation unter Anwendung von dem Fachmann bekannte Methoden eingeführt. Dieser Stamm produziert nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges des Rinderwachstumshormons (bGH).mit einer Aminosäuresequenz met-asp-gln , die an den N-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH addiert ist. Die Menge des bGH-Analogen, das durch pSAL-130/5 erzeugt wird, beträgt etwa 39 - 44% des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Blauverfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen (Tabelle I). Die verwendeten Methoden zum Wachstums des Stamms, zur Gewinnung des erzeugten bGH-Analogen und zur Reinigung des bGH-Analogen sind die gleiche wie jene, die für pSAL-170/10 im Beispiel 24 beschrieben sind.

BEISPIEL 23 pSAL-170/10

Der Aufbau von pSAL 170/10 ist in Fig. 8 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erörtert.

27. 8.85- 2.77996

pSAL 170/10 wird in den Escherichia coli Stamm A1645 durch Transformation unter Verwendung bekannter Methoden eingeführt. Dieser Stamm erzeugt nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von bGH mit einer Aminosäuresequenz met-asp-gln , die an den Amino-Terminus der Phenylalaninform von natürlichem bGH addiert ist. Die Menge des durch pSAL-170/10 erzeugten bGH-Analogen beträgt etwa 40- 46 % des gesamten von dem Bakterium erzeugten Proteins, berechnet durch Bestimmung der Coomasie-Verfärbung von SDS-Polyacrylamidgelen (Tabelle I).

BEISPIEL 24

Wachstum von pSAL-170/10 15

1. Vorratskulturen

Vorratskulturen von pSAL-170/10 wurden auf einem Kaseinmedium (sh. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann mit Gefriermedium doppelt verdünnt und bei -80⁰C aufbewahrt. Das Gefriermedium enthält je 500 ml:

K₂HPO₄ 6,3 g

KH₂PO₄ 1,8g

Na-Citrat 0,45 g

. MgSO₄-7H₂O 0,09 g

(NH₄)₂SO₄ 0,9 g

Glycerin 44,0g

II. Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Ein steriles Medium in einem Schüttelkolben wird mit der Vorratskultur geimpft und 15 h auf eine Schütteleinrichtung bei 30⁰C und mit 200 Umdrehungen pro min inkubiert.

27. 8.85- 2⁷7996

5ί 78 7

Da erforderlich, wurden die anschließenden Stufen der Impfmaterialzüchtung in bewegten, belüfteten Fermentoren durchgeführt.. Steriles Medium wurde mit 2 - 10 % Impfmaterial geimpft und 15 h bei 30⁰C , pH 7 - 0,5 inkubiert, und zwar unter Bewegung und Lüftung , um •einen gelösten Sauerstoffgehalt oberhalb 20 % Luftsättigung aufrechtzuerhalten.

III.Produktion

Das Produktionsmedium enthält:

Kaseinhydrolysat	20	g/i
Hefeextrakt	10	g/i
K2HPO4	2,	5 g/l
MgSO4.7H2O	1	g/i
NaCl	5	g/i
Biotin	0,	1 mg/1
Thiamin	1	mg/1
Spurenelementlösung	3	ml/1

Das Medium enthält außerdem 12,5 mg/1 Tetracyclin. Das Tetracyclin ist nicht zwingend für die- Produktion, jedoch wird es immer in dem Medium gefunden, das zum Wachstum des Impfmaterials verwendet wird.

Biotin, Thiamin und Antibiotika werden separat in konzentrierten Lösungen einer Filtersterilisation unter- worfen und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen zugesetzt. Eine sterile Glucoselösung wird zu Beginn zugesetzt , um 10 g/l zu erreichen. Beim Induktionsschritt werden weitere 10 g/l Glucose zugegeben

Die Spurenelementlösung enthält : 35

27. 3.85- 277996

5 ί 7Β-

FeCl3	-2H2O	1	6	g/i
ZnCl2-			2	g/i
CoCl2·			2	g/i
	konzentr.HCl·		2	g/i
'4Η2°		1	g/i
'6Η2°		1	g/i
Na2MoO4-2H2O	O	,5	g/i
CaCl2'	1	OO	ml/l
CuCl2
H3BO3

Das Medium wird mit 0,5 - 10 % Impfmaterialkultur geimpft und bei 30⁰C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsrate wird so eingestellt, daß ein gelöster Sauerstoffgehalt oberhalb 20% Luftsättigung aufrechterhalten wird, der pH wird mit NH, auf 7 - 0,2 eingestellt. Sobald die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l erreicht (OD-,. = 10)

DbU

wird die Induktion gestartet.

Die Temperatur wird auf 42⁰C erhöht und 1 bis 5 h auf 42°C gehalten. Die Kultur wird dann gekühlt und die Zellen werden für die Hormonreinigung durch Zentrifugieren gewonnen.

Gewinnung von bGH

13 kg bakterieller Zellen (nasser Kuchen) werden in 5 Volumina einer Lösung suspendiert, die 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) , 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält, wobei ein Polytron (Kinematica)-Mischer verwendet wird und die Geschwindigkeit des Mischers so kontrolliert wird, daß eine möglichst geringe Schaumbildung auftritt. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen "Dynomill Zelldisruptor KD5" (Willy A. Bachofen, Basel) mit einer Geschwindigkeit von 80 l/h geschickt und die homogene Suspension der aufgebro-' chenen Zellen wird durch Zentrifugieren mit einer CEPA 101 Zentrifuge mit einer Durchflußgeschwindigkeit von

27.8.85- 2,77996

78?

45 l/h geklärt. Das Präzipitat des Zentrifugierungsschritts wird gesammelt und erneut in 15,5 1 eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) , der 50 mM EDTA 'enthalt, suspendiert. Es wird Lysozym mit einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml zugesetzt und die Suspension wird 16 h bei 37°C inkubiert. Es wird Triton X-100 mit einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Die Suspension wird dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, in einem kontinuierlichen Durchflußzellensonifikator.(Heat System) mit einer Geschwindigkeit von 18 l/h Schall ausgesetzt und mit einer CEPA 101 Zentrifuge zentrifugiert. Das Präzipitat wird gesammelt, in einem 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) erneut suspendiert, wie oben angegeben_/ Schall ausgesetzt und mit einer CEPA 101 Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellen werden in 15,5 1 eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) , der 50 mM EDTA und 100 mM NaCl enthält, erneut suspendiert und zweimal gefällt und erneut in 15,5 1 destillierten Wassers suspendiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren.

gesammelt und bei -20⁰C aufbewahrt.

Reinigung von bGH

Das Präzipitat wird in 30 - 40 1 destillierten Wassers erneut suspendiert und durch Titration mit 0,5 N NaOH auf pH 11,8 gelöst. Die Lösung wird dann kontinuierlich

Schall ausgesetzt und durch Zentrifugieren mit einer ι CEPA 101 Zentrifuge geklärt, falls erforderlich, oder durch ein Whatman Nr. 1 Papier filtriert.

Die geklärte Proteinlösung (32,6 1 , die 297000 OD bei

280 nm enthalten) wird in einzelne Teile geteilt (6 χ 5,4 1), die jeweils 50000 - 60000 OD enthalten. Jeder Teil wird separat einer Ultrafiltration mit einem „r Millipore Pellicon Ultrafilter unterworfen, welches mit

Tl. 8.85- 277996

3 Kassetten (Typ PTHK) von 5 ft² Fläche versehen ist, welche ein Molekulargewicht von 100000 abschneiden. Ein 5,4 1 Teil wird auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und aufbewahrt. Das Konzentrat wird rückverdünnt auf sein ursprüngliches Volumen mit frischem 10 mM Boratpuffer, pH 11,8, und gut gemischt. Der Ansatz wird erneut auf 1 1 konzentriert. Das Ultrafiltrat wird gesammelt und mit dem ersten Ultrafiltrat vereinigt. Wenn die durchgelaufenen OD in den Ultrafiltraten 20 % des ursprünglich auf den Ultrafilter aufgegebenen OD's entsprechen, wird das Konzentratvolumen

des nächsten Konzentrationsschritts anstelle von 1 1 auf 0,5 1 gebracht. Die Zyklen der Konzentration und Verdünnung mit 10 mM Boratpuffer werden fortgesetzt, bis das Ultrafiltrat ein konzentriertes Volumen von 0,5 1 ,eine Absorption bei 280 nm (1 cm Zelle) von weniger als 0,1 aufweist. Dies erfordert normalerweise zwischen 9 bis 12 Zyklen der Konzentration und Verdünnung. Das Endkonzentrat wird verworfen.

Alle Ultrafiltrate werden vereinigt und auf pH 9,0 mit 6 N HCl eingestellt. Die anderen 5,4 1 Portionen werden in der gleichen Weise einer Ultrafiltrierung unterworfen und sämtliche pH eingestellten Ultrafiltrate werden miteinander vereinigt. Ein typischer Ansatz ergibt insgesamt 380 1 Ultrafiltrate mit einer Absorption von 0,26 , welche 100000 OD entspricht, und erfordert zu seiner Fertigstellung 24 bis 40 h.

Die vereinigten Ultrafiltrate (380 1 enthalten 100000 OD bei 280 nm) des 100K Ultrafiltrierungsschritts werden auf eine Sepharose CL-6B DEAE Ionenaustauschersäule mit einer linearen Durchflußgeschwindigkeit von 23 cm/h (25 l/h) gegeben. Die Säule mit einem Durchmesser von· 37 cm und einer Hohe von 15 cm wird mit zwei Bettvolumen

2Π85- 277996

25 t 7 8

(32 L) eines 10 mM Boratpuffers von pH 9,0 gewaschen. Das Eluat der Aufgabe- und Waschschritte wird verworfen. Ein Wechsel des Eluenten zu 10 mM Borat, 100 mM Natriumchlorid, pH 9, setzt das bGH von der Säule frei. Die Elutionsfließgeschwindigkeit beträgt 23 cm/h. Das Fortschreiten des Ansatzes wird überwacht, indem die Absorption des Eluats bei 280 nm verfolgt wird. Das bGH-Maximum.wird in 4 bis 5 Bettvolumen (84 1 enthalten 43000 OD bei 280 nm) gesammelt und dann auf etwa 10 mg/ml unter Verwendung einer Millipore Pellicorv Ultrafiltriereinrichtung konzentriert, die Kassetten aufweist, die ein Molekulargewicht von 10000 abschneiden. Die Lösung wird dan lyophilisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 70 g reines bGH.

BEISPIEL 25 · '

Aktivität des bGH-Analogen, erzeugt mit pSAL-170/10

"I · Radioimmunoassay-Vergleich des bGH-Analogen mit natürlichem bGH

Eine Lösung , die 100 ng/ml bGH~Analoges enthält, wurde mit einer phosphat-gepufferten physiologischen SaIzlösung (1 % BSA) hergestellt. Diese Lösung wurde in Serie auf Konzentrationen von 50, 25, 12,5 , 6,25 , 3,12 1,56 und 0,78 ng/1 verdünnt. Doppelte 0,1 ml Aliquots dieser Lösungen wurden einem RIA zugeführt, und zwar unter Verwendung einer Doppelantikörperprozedur. Die

on Verdünnungskurve wurde mit derjenigen verglichen, die mit natürlichem bGH erhalten wurde.

2Π85- 277.996

251 7

2. Radiorezeptor-Bindungsbestimmung

Eine Radiorezeptor-Bindungsbestimmung wurde mit Kaninchenlebermembranen durchgeführt, wie von Tushima, T. 5

und Freisen, H. G., { Y. Chin., Endocr. Metab. (1973),

1 25

Band 37, S. 3) beschrieben, wobei .. I-bGH als Tracer

- und authentische bGH-Lösungen für die Erstellung der Eichkurven verwendet wurden. Dreifachproben wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 0,3 ml des Bestimmungspuffers (50 mM Tris, 15 mM CaCl- und 5 mg/ml Rinderserumalbumin, pH 7,6) inkubiert. Die Röhrchen enthielten ¹²⁵I-bGH (20000 Zerfälle/Minute zur Herstellung von 30 bis 60 μci/μg),150 - 250 μg Lebermembranprotein und entweder natürliches bGH (1 - 100 ng) oder Extrak-.

te von bakteriellem bGH. Das Ergebnis zeigte, daß die bGH-Aktivi,tät des bGH-Analogen vergleichbar ist mit der von natürlichem bGH.

3. Tibia-Test

. ·

Die Bioaktivität von mit pRO12 hergestelltem bGH-Analogen , das entsprechend dem Beispiel 5 aus bakteriellen Zellen gewonnen wurde, wurde mit dem Tibia-Test bestimmt (Parlow, A. F. et al, Endocrinology '(1965) , Band 25

77, S. 1126). 28 bis 30 Tagen alten Ratten wurde die Hypophyse entfernt, worauf sie 10 bis 14 Tage ohne Behandlung gehalten wurden. Rinderwachstumshormon, das von Rinderhypophysen oder von rekombiniertem

E. coli stammte, wurde in 0,15 M NaCl + 0,01 M Borat, ~

pH 10,0 gelöst. Ratten (4 - 7 je Gruppe) erhielten täglich subkutane Injektionen von bGH-Lösungen (5 125 μg/Tag in 0,2 ml) für 5 Tage, wobei sie eine normale Diät erhielten (Purina Rat-Chow und Wasser ad-

libitum). Die Tiere wurden am 6. Tag getötet, ihre 35

Vorderbein-Knieknochen wurden herausgenommen, der Länge nach geschnitten, mit Aceton fixiert und mit 2% AgNO.., angefärbt. Die Breite der_ epiphysialen

27. 8.35- "77996

/α

Platten wurde durch Beobachtung mit einem Sezierstereomikroskop (Nikon) bestimmt. Mittelwerte (40 Bestimmungen je Ratte) wurden zur Erstellung von

Langdosis-Empfindlichkeitskurven verwendet. Die Er-5

gebnisse zeigten, daß die bGH-Aktivität des mit

pSAL-170/ΊΟ hergestellten bGH-Analogen vergleichbar -ist mit der von natürlichem bGH.

Beispiel *

Die Ausbeute und Aktivität von menschlicher Superoxid-Dismutase, die mit den SOD-Wirt-Vektor-Systemen her-. gestellt wird, die in Beispiel 3 beschrieben sind, kann durch Modifizierung der Wachstumsbedinungen der Wirt-Vektor-Systeme verbessert werden. Die nachstehenden ₍ Daten demonstrieren für die Ergänzung des Wachstumsmediums für das Wirt-Vektor-System mit Cu und/oder Zn zu einer größeren Ausbeute des Enzyms in der aktiven

dimeren Form.· 20

Wachstum von pSODßiTI1-enthaltenden Bakterien I. Vorratkulturen

Vorratkulturen von pSODß1T11 wurden auf einem Kaseinmedium (s. Impfmaterial) wachsen gelassen, dann mit Gefriermedium zweifach verdünnt und bei -8 0⁰C gelagert. Das Gefriermedium enthält:

K₃HPO₄ 6,3 gr

KH₃PO₄ 1 ,,8 gr

Na-Citrat 0,4 5 gr

MgSO₄-7 H₂O 0,09 gr

(NH₄)₂SO₄ 0,9 gr

Glycerin 4-4 gr

pro 50 0 ml

27. 8.8'ü- 277996

II. Impfmaterial

Das Impfmaterial wurde in 20 g/l Kaseinhydrolysat, 10 g/l

Hefeextrakt und 2 g/l NaCl gezüchtet. Ein steriles 5

Medium i'n einem Schüttelkolben wird mit der Vorratkultur geimpft und 15 Stunden auf einer-.Schütteleinrichtung bei 3O⁰C .bei etwa 200 Umdrehungen /Minute irikubiert. Falls erforderlich, werden die anschließenden

Stufen der Impfmaterialzüchtung in bewegten, belüfteten 10

Fermentoren durchgeführt. Ein steriles Medium wird mit

2 bis 10% Kolbenkulturen geimpft und 15 Stunden bei 30⁰C,

pH 7+. 0,5, inkubiert, und zwar unter einer Bewegung

und einer Belüftung, daß der gelöste Sauerstoffgehalt oberhalb 2 0% Luftsättigung liegt.

III. Produktion

Das Produktionsmedium enthält: 20

Kaseinhydrolysat	20 g/l
Hefeextrakt	10 g/l
K2HPO4	2,5 g/l
MgSO4'7H2O	1 g/l
NaCl	5 g/l
Biotin	0,1 mg/1
Thiamin	1 mg/1
Spurenelementlösung	3 ml/1
Tetracyclin	12,5 mg/1

Bei einigen Versuchen wurde zugesetzt:

CuSO₄-5H₂O 0,8 g/l

ZnSO₄-7H₂O 10 mg/1

Biotin, Thiamin und Tetracyclin wurden separat in konzentrierten Lösungen einer Filtiersterilisation unterworfen und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Impfen

Π 8.85- 277996

25/ 7 8 7·

-138-

zugesetzt. Eine sterile Glukoselösung wurde zu Beginn zugegeben, um 10 g/l zu erreichen. Beim Induktionsschritt wurden weitere 10 g/l Glukose zugesetzt.

Die Spurenelementlösung enthält:

FeCl3	4H2O	1	6 g/l
ZnCl2-	6 H2O	2	g/i
CoCl2-	4" 2	2	g/i
Na2MoO	2H2O	2	g/i
CaCl2-		1	g/i
CuCl2		1	g/i
H3BO3	HCl	0	,5 g/l
Cone.	1	00 ml/1

Das Medium wurde mit 0,3 bis 10% Impfmaterialkultur geeirnpf t und bei 30⁰C inkubiert. Die Bewegungs- und Belüftungsraten wurden so eingestellt, daß ein gelöster

Sauerstoffgehalt über 2 0% Luftsättigung aufrechterhalten 20

wurde. Der pH wird mit NH₃ auf 7+ 0,2 eingestellt. Sobald die Zellkonzentration etwa 3,5 g/l (OD,,,_n = 10) erreicht,

DbU

wird.die Induktion gestartet.

Die Temperatur wird auf 42⁰C erhöht und bei 42⁰C 1 bis 25

5 Stunden gehalten. Die Kultur wird dann abgekühlt und die Zellen werden durch Zentrifugieren zur Enzymreinigung gewonnen.

Gewinnung von SOD ^a

Eineinhalb Kilogramm bakterielle Zelle (nasser Kuchen) werden in 12 1 5OnM Natriumphosphat (pH 7,8) in einem Polytron-(Kinematica)-Mischer suspendiert, wobei die

Geschwindigkeit so kontrolliert wird, daß eine minimale 35

Schaumbildung auftritt. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch einen Dynomill-Zelldisruptor KD5 (Willy, A. Bachofen, Basel) geschickt. Die homogene

Π R ίΚ . ο -₇ -r _n „ _Λ

251 7 ρ

Suspension von aufgebrochenen Zellen wird unter Verwendung einer kontinuierlichen Durchflußzelle einer Schallbehandlung unterworfen und mit einer CEPA 101-Zentrifuge zentrifugiert. Der überstand wird 2 Stunden auf 65⁰C erwärmt, gekühlt, und wie vorstehend angegeben, zentrifugiert. Der klare überstand wird auf einen Liter mit einem Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationsgerät unter Verwendung von Kassetten (Typ PTGC), die _; ein Molekulargewicht von 10000 abschneiden, konzentriert Die konzentrierte Proteinlösung wird durch eine DEAE-Sephacel-Säule (2 kg DEAE-Sephacel) geschickt, welche mit 150 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,8) eingestelltworden ist. Die durchgeflossene Lösung wird gesammelt, konzentriert und mit einer Pellicon-Ultrafiltrationseinrichtung gegen 20 'mM Tris-HCl, pH 7,8 dialysiert und dann auf eine QAE-Sepharose-Säule gegeben, die mit 20 mM Tris-HCl-Puffer eingestellt worden· ist. Die Säule wird mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,8 und einem Salzgradienten (0 - 200 mM NaCl) entwickelt. Die SOD-haltigen Fraktionen werden gesammelt, unter Verwendung einer Pellicon-Ultrafiltrationseinrichtung konzentriert, gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann auf 100 mM Nätriumacetat gebracht, indem 1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,8, zugesetzt wurde. Die Proteinlösung wird dann weiter mit einer CM-Sepharose-Säule getrennt, die mit 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,7, eingestellt worden ist. Die Säule wird unter Verwendung des gleichen Puffers und mit einem Salzgradienten (100 - 500 mM NaCl) entwickelt. Die SOD-haltigen

° Fraktionen werden gesammelt, konzentriert unter Verwendung einer Pellicon-Ultrafiltrationseinrichtung und lyophilisiert.

9 7

51

-140-Beispiel 27

Enzymatische Aktivität von mit Bakterien erzeugtem SOD

Das gereinigte Human-SOD (hSOD), das mit den Bakterien gemäß dem Beispiel 26 unter Standardwachstumsbedingungen (d. h. ohne Zugabe von zusätzlichem CuSO.) hergestellt worden ist, besitzt eine enzymatische Aktivität von lediglich 5% verglichen mit dem Rinder-Cu/Zn-SOD· Eine Analyse des Metallgehalts ergibt, daß das Enzym wenig Cu enthält, nämlich lediglich 8% des erwarteten Wertes. Es hat weiterhin den Anschein, daß die meisten der Cu Stellen durch Zn-Ionen ersetzt sind, da das Protein fast das Doppelte des erforderlichen Zn enthält. Ein völlig metallfreies Apoprotein, das aus dem bakteriell erzeugtem hSOD hergestellt worden ist, gewinnt jedoch im wesentlichen die volle enzymatische Aktivität nach Rekonstitution in Lösung zurück. Die Lösung enthält sowohl Cu wie Zn , und zwar jeweils mit einer Konzentrati von 1,2 Mol Ionen pro Mol aktive Stelle (Tabelle IV) .

Die oben wiedergegebenen Daten legen es nahe, daß die intrazelluläre Konzentration von Cu zu begrenzt und unzureichend ist, um das hergestellte hSOD abzusättigen.

Eine Serie von Versuchen zeigte, daß erhöhte Cu -Konzentrationen in dem Wachstumsmedium eine Erhöhung der spezifischen Aktivität von hSÖD, hervorriefen. E^ coli, der in Kaseinhydrolysat (Beispiel 26) wachsen gelassen wurde, das mit 200 ppm Cu versetzt worden war, produ-

ßO zierte in der Tat nach der Induktion vollaktives hSOD mit der natürlichen Zusammensetzung der Metalle bei voller enzymatischer Aktivität (Tabelle IV) . Zusätzliche > Versuche zeigten den gleichen Effekt, wenn die Menge des zugesetzten exogenen Cu zwischen 50 und 250 ppm betr Ein ähnlicher Effekt wurde mit einem LB (Luria Nährlösung) -Medium worden sind.

zugesetzten exogenen Cu zwischen 50 und 250 ppm betrug,

(L sung) -Medium festgestellt, dem 7 5 ppm Cu zugesetzt

27. 8.85-, 277996

I / ö

-141-

TABELLE IV Aktivität und Metallgehalt von SOD-Präparationen

Mol/Subeinheit Aktivität

Protein	Cu	Zn	u./mg
hSOD1	0,07	1 ,62	167
Apoenzym	0,01	0,02	0
Rekonstituiertes SOD	0,81	0,88	2931
hSOD2	0,88	0,90	2730
Rinder-SOD	0,97	1 ,01	2805
hSOD (Sigma)			1606

hSOD, hergestellt wie im Beispiel 26 beschrieben. Das

verwendete Medium enthielt kein zugesetztes Cu und Zn

hSOD, hergestellt wie in Beispiel 2 6 beschrieben. Das Medium enthielt zuaesetztes Cu und Zn

Die SOD-Konzentrationen wurden nach der Methode von Lowry bestimmt (Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. und Randall, R. J., J. Biol. Chem., Bd. 193, S.

265 - 275 (1951)), wobei Rinderserumalbumin als Standard verwendet wurde. Aktivitätsmessungen durch Überwachung der Inhibierung der Reduktion von Ferricytochrome-c wurden durchgeführt, wie von McCord und Fridovich beschrieben (McCord, J. M. and Fridovich, I., J. Biol.

Chem., Bd. 244, S. 6049 - 6055 (1969)). Der Cu- und Zn-Gehalt in den reinen SOD-Präparationen wurde durch Atomabsorption bestimmt. SOD-Apoenzym wurde hergestellt nach Weser und Hartmann (Weser, U. und Hartmann, H. J., FEBS Lett. , Bd. 17, S. 78 - 80 (1971)) und durch gleichzeitige Zugabe von Cu und Zn rekonstituiert ( Jewett, S. L., Latrenta, G. S. und Beck, C. M., Are. Biochern. Biophys. , Bd. 215, S. 116 128 (1982)) .

27 885- 277996

25 178

Beispiel 28 Aminoterminale Sequenz von bakteriell erzeugtem hSOD

Die Sequenz der 5 Aminosäuren an dem Aminoterminus von gereinigtem SOD, das entsprechend dem Beispiel 26 hergestellt worden ist, wurde durch Edmann-Abbau bestimmt. Die Aminosäuresequenz ist identisch mit dem N-Terminus von humanem Cu/Zn-SOD, d. h. sie ist Ala-Thr-Lys-Ala-Val. Dies bestätigt die Authentizität des bakteriellen Produkts Es erscheint deshalb, daß das lösliche hSOD zu E. coli steuernden Enzymen Zugang hat, welche das N-terminale Methionin entfernen

Diskussion

Wir haben gezeigt, daß Bakterien, welche induziert wer-•den, um große Menge von hSOD zu erzeugen, wenn sie auf LB- oder Kaseinhydrolysatmedien wachsen, ein enzymatisch inaktives Protein erzeugen. Das so hergestellte Protein kann'aktiviert werden, durch Rekonstitution und Rückgabe der fehlenden Cu - und Zn -Ionen. Die Bakterien können unerwarteterweise induziert werden, um enzymatisch aktives P hSOD zu erzeugen, wenn sie auf Medien wachsen, denen Cu zugesetzt worden ist. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, daß bestimmte Komponenten des reichen Mediums (wie LB und Kaseinhydrolysat) das meiste des verfügbaren Kupfer chelatisieren, so daß

^ou für die Bakterien nicht genügend freies Kupfer zur Verfügung steht, um alle Stellen der SOD-Moleküle aufzufüllen, welche mit erhöhtem Niveau gebildet werden. Der Zusatz von 50 bis 250 ppm von Cu -Ionen zu dem Medium erhöht offensichtlich die Cu -Konzentration in den Bakterien auf ein Niveau, welches ausreicht, um das gesamte Cu zu liefern, das SOD erforderlich ist.

Cu zu liefern, das für ein überproduziertes Human-Cu/Zn-

27S35- 277996

I 7Bj

-143-Beispiel 29

Reduktion bei der Reperfusionsverletzung mit rekombinierter Human-Superoxid-Dismutase nach globaler Ischämie

Human-Superoxid-Dismutase, die mit dem Wirt-Vektor-System pSODß1T11 in E. coli A1645 gemäß dem Beispiel 3 hergestellt und unter den in Beispiel 26 beschriebenen Bedingungen wachsen gelassen und.gereinigt wurde/ zeigte, daß die Reperfusionsverletzung nach globaler Ischämie herabgesetzt wurde.

Isolierte, einer Perfusion unterworfene Kaninchenherzpräparation

Weibliche, weiße Neuseelandkaninchen, 1,2 bis 2,0,wurden heparinisiert und anäthestisiert, ihre Herzen wurden entfernt und schnell in .eine kalte (4⁰C) Perfusionslösung

²^ gegeben. Die aufsteigende Aorta wurde mit einer Kanüle versehen und die Herzen wurden unter konstantem Druck (110 cm Wasser) mit einer modifizierten Krebs-Ringers-· Bikarbonatpufferlösung, welche 117 mM Natriumchlorid, 6 mM Kaliumchlorid, 3,0 mM Kalziumchlorid,.1,0 mM Magne-

²^ siumsulfat, 0,5 mM EDTA und 16,7 mM Glukose mit einem End-pH, der durch Zugabe von etwa 24 mM Natriumbikarbonat auf 7,40 eingestellt wurde, einer Perfusion unterworfen. In die Perfusionslösung oder das Perfusat wurden 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid kontinuierlich eingeblasen

³^ Die Koronarströmung wurde aus dem NMR-Proberöhrchen durch Anlegen eines Vakuums entfernt. Die Herzen wurden mit 175 Schlägen pro Minute durch rechte Ventrikularschrittmachung geschlagen, und zwar mit einem Docht, der in gesättigtes Natriumchlorid getaucht ist, eingeschlossen in einem Polyethylenschlauch und angeschlossen an einen Grass SD-9 Simulator. Um die linke Ventrikularkontraktilfunktion zu messen, wurde ein Latex-Gummiballon an das

/. 8.85- P77QQR

ί

Ende eines 100 cm langen PE 190-Schlauchs angebunden, der sorgfältig mit Luftblasen gespült wurde und über ein Drei-Wege-Ventil und einen Statham P2 3Db-Wandler angeschlossen ist. Ein volumengleicher Druck wurde mit einem ° Brush-Zweikanal-Direktschreiber aufgezeichnet. Der Ballon wurde ursprünglich aufgeblasen mit einer Spritze mit einem physiologischen Salzlösungsvolumen, das ausreicht, einen diastolischen Enddruck von 10 mmHg zu erzeugen. Sämtliche anschließenden Messungen wurden mit diesem diastolischen Endvolumen durchgeführt. Sämtliche Herzen wurden 30 Minuten einer globalen Ischämie unterworfen, während der die auf 37⁰C gehaltenen Herzen einer Strömung von warmen Perfusat um das Herz ausgesetzt wurden. Eine totale Unterbrechung eines Einströmens in der Aorta

!5 wurde durch Abklemmen der Perfusionsleitung erreicht.

45 Minuten einer normothermischen Reperfusion (37± 2⁰C) folgte die Periode der Ischämie. Die Rückgewinnung des linksventrikular erzeugten Drucks wurde als ein Prozentsatz der präischämischen Kontrolle berechnet.

· Bei den Sätzen der Ischämie wurde der Ballon entleert und der Schrittmacher abgespalten. Nach erneutem Einsetzen der Strömung wurde der Ballon nach 15 Minuten erneut aufgeblasen, kurz vor der ersten Messung der Funktion mit dem gleichen Volumen, das beim Einsetzen der Ischämie entfernt worden ist. Die koronare Blutströmung wurde vor der Ischämie volumetrisch durch Vakuumanlegen gemessen, 5 Minuten nach der erneuten Strömung und nach 15, 30 und 45 Minuten der Reperfusion.

Kernmagnetisehe Resonanzverfahren

Das Phosphor-31-NMR-Sektrum wurde mit einem Brucker WH 180-Spektrometer bei 4,23 Telsa mit einem supraleitenden Magneten großer Bohrung erhalten. Bei dieser FeIdstärke zeigt Phosphor eine Resonanz bei 72,89 MHz. Der Durchmesser der Phosphorsonde beträgt 25 mm. Dieses Instrument wird nach der Impuls-Fourier-Transformations-

? S S5- 277996

Methode betrieben und ist an einen Nocolet 1280-Cornputer angeschlossen, dessen Daten von Magnetplatten hoher Dichte gesammelt werden. Wegen der Feldstabilität des supraleitenden Magneten ist·eine Feld/Frequenz-Sperre nicht erforderlich. Es wurden entkoppelte 5-Minuten-Proton-Spektreri der Einschwingvorgänge gesammelt, gefolgt von 45°-Impulsen, die in 2-Sekunden-Intervallen geliefert wurden, und zwar unter bereits beschriebenen Bedingungen, um eine minimale spektrale Sättigung zu erhalten. Die . Daten wurden mit einer 2K-Tafel bei einer Spektralbreite von 3000 Hz gesammelt.

Bestimmung des intrazellulären Gewebe-pHs aufgrund der NMR-Sepktren

Die Messung des intrazellulären pH wurde aufgrund der chemischen Verschiebung ( ) des anorganischen Phosphat-' Maximums nach folgender Gleichung bestimmt:

pH = pK - log J*2—" ^bB

- °o

„._ Um die Inhomogenitätseffekte des Gewebes zu minimieren, wurden die chemischen Verschiebungswerte gegenüber der Resonanz von Phosphocreatin gemessen, welches relativ pH-unabhängig ist über den Bereich des pH der bei diesen Untersuchungen (pK = 4,6) angetroffen wird. Die verwendeten Konstanten in dieser Gleichung sind pK = 6,90, £. = 3290 PPM und L₃ = 5805 PPM, wie bereits beschrieben.

Quantitative Bestimmung der Metaboliten aufgrund der NMR-Sepktren

Bestimmungen des Gewebephospocreatins (PCr), Adenosintriphosphats (ATP), sowie von anorganischem Phosphat (Pi) wurden durch planimetrische Messungen der Flächen unter

nr

I /8

-146-

den einzelnen Maxima oder Peaks erhalten, um eine für eine Rechenanlage bestimmte Normalisationskonstante oder einen Skalenfaktor zu erhalten. Es wurde eine Hewlett-Packard-Digitalisiereinrichtung verwendet, um die Flächenintegration durchzuführen. Die so für PCr, ATP und Pi erhaltenen Daten wurden in Prozent des präischämischen Kontrollgehalts ausgedrückt.

Versuchsprotokoll

Siebzehn Herzen wurden in zwei Gruppen geteilt:

Gruppe I (n=8) Die Herzen dieser Gruppe wurden mit 60000 Einheiten von rekombinierter Human-Superoxid-Dismutase (hSOD , spezifische

Aktivität 3200 IU/mg) behandelt, das als

. 10 ml-Bolus kurz vor der erneuten Strömung

verabreicht wurde, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion von 60000 Einheiten während der ersten 15 Minuten der erneuten Strömung;

hSOD wurde in einem warmen 37⁰C-Krebs-Ringers-Bikarbonat-Perfusat gelöst.

Gruppe II (n=9) Die Herzen dieser Gruppe erhielten einen . io ml-Bolus des Perfusats kurz vor der erneuten

Strömung, gefolgt von einer normothermischen Reperfusion.

Ergebnisse

Wiederherstellung der linken ventrikularen Funktion

Das experimentelle ischämische Modell, das bei der vorliegenden Untersuchung angewandt wurde, wurde speziell ausgewählt, gefolgt von einer Serie von vorherigen Untersuchungen, um Herzen zu ergeben, welche eine mittelschwere

0 7 7 η η

25t

irreversible.Verletzung erlitten haben, jedoch noch die Möglichkeit einer Verbesserung durch einen therapeutischen Eingriff besitzen. 45 Minuten nach der erneuten Strömung, betrug die Wiederherstellung der linken ventrikularen ° Funktion (bestimmt durch prozentuale Rückgewinnung des entwickelten Kontrolldrucks) 47ⁱ5% der Kontrollgruppe mit einem diastolischen Enddruck von 48Ϊ7 mmHg (verglichen mit dem präischämischen Kontrollwert von 10 mmHg). Diese Parameter ändern sich nicht wesentlich während 30 bis 45 Minuten der Reperfusion, was nahe legt, daß ein relativ stetiger Zustand der Wiederherstellung erreicht worden ist. Die Verabreichung von hSOD kurz vor der erneuten Strömung und während der ersten 15 Minuten der Reperfusion führte zu einer erheblich verbesserten Preservation der Herzfunktion und zu einer geringen Vergrößerung des diastolischen Enddrucks, verglichen mit den Kontrollherzen; hSOD-behandelte Herzen, die 71±6%

des entwickelten Kontrolldrucks als diastolischen End-P^.0,01 gegenüber der Kontrolle) .

druck von lediglich 27Ϊ4 mmHg wieder erlangten (beide

Myokardialer Metabolismus während einer Ischämie und nachfolgender Reperfusion

Myokardiale Hochenergie-Phosphatgehalte wurden in Serie während einer Ischämie und einer nachfolgenden Reperfusion sowohl bei Kontroll- wie bei hSOD-behandelten Herzen gemessen. Während der 30 Minuten langen ischämischen Periode wurde eine progressive Herabsetzung des myokardialen Creatinphosphat- und ATP-Gehalts beobachtet. Der Phosphocreatingehalt fiel am Ende der ischämischen Periode auf 8ί3% des präischämischen Grundwertes der Kontrollherzen und auf 10Ϊ5% der Kontrolle jener Herzen, welche anschließend mit hSOD behandelt worden sind; der ATP-Gehalt erreicht 36-6% des Grundwertes in den Kontrollherzen und 3 3ί6% in den hSOD-behandelten Herzen. Diese Werte veranschaulichen klar, daß beide Gruppen von Herzen einer

"335- 277996

* gleich schweren Ischämie ausgesetzt worden sind. Diese Daten schließen auch die Möglichkeit aus, daß die Herzen, die hSOD empfangen, eine bessere funktioneile Wiederherstellung aufgrund einer besseren Preservation des zellu- ° lären Metabolismuses während der ischämischen Periode durch irgendwelche nicht kontrollierten Mechanismen zeigte am Ende von 4 5 Minuten der Periode der erneuten Strömung zeigten die hSOD-behandelten Herzen einen annähernd normalen Gehalt an Phosphocreatin (93*9% der

¹^ Kontrolle), während die Kontrollherzen lediglich 69±7% des Ursprungswertes (P<0,05) wiedererlangten. Am Ende der Periode der erneuten Strömung war der ATP-Gehalt bei beiden Gruppen von Herzen gleich (4ΐί4% Kontrolle gegenüber 42±5% der hSOD-behandelten Herzen). Dieses letztere Ergebnis verdeutlicht den erhöhten Energiebedarf von Herzen, die eine bessere linke ventrikulare Funktion zurückerlangen, in Gegenwart einer begrenzten Fähigkeit, die Raten einer Hochenergie-Phosphatproduktion zu erhöhen. Im Gegensatz dazu, würde eine schlechtere Wiederaufnahme der Funktion der Kontrollherzen zu einem geringeren Verbrauch von hochenergetischen Phosphatmetaboliten führen, wobei möglicherweise eine noch stärkere Begrenzung der Energieproduktion maskiert wird.

2"· Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß in Herzen, die einer mäßig schweren ischämischen Verletzung und einer anschließenden Reperfusion unterworfen werden, die Zufuhr von hSOD kurz vor und während der frühen Reperfusion zu einer besseren Wiederherstellung der systolischen und der diastolischen Funktion führt, sowie zu einem höheren myokardialen Gehalt an Phosphokreatin. Diese Daten weisen auch darauf hin, daß die Reperfusion des ischämischen Myokardiums zu einer Komponente der strukturellen und/oder funktioneilen Beschädigung führt, welche vermieden oder verhindert werden kann durch Verabreichung eines freie Sauerstoffradikale einfangenden Mittels, wie hSOD zur Zeit der Reperfusion. Durch Begrenzung dieser Komponente

Π 8.85- 277996

i / O

dieser Verletzung durch erneute Strömung, die von der Reoxygenxerung der vorher ischämischen Myokardiums herrührt, kann so hSOD eine wertvolle Ergänzung der thrombolytischen Therapie und/oder koronaren Angioplastie von Patienten sein, die früh nach einer akuten myokardialen Infarktion behandelt werden.

Beispiel 30

Reduktion der experimentellen Infarktgröße durch Verabreichung rekombinierter Human-Superoxid-Dismutase während der Reperfusion

Human-Superoxid-Dismutase, welche durch das Wirt-Vektor-System pSODß1Ti1 in E. coli A1645, wie in Beispiel 3 beschrieben, erzeugt und unter den in Beispiel 26 beschriebenen Bedingungen gereinigt worden ist, zeigte eine Herabsetzung der Infarktgröße in Herzen.

Rechtzeitige Reperfusion des ischämischen Myokardiums setzt die Infarktgröße (IS) herab. Dieser vorteilhafte Effekt kann jedoch durch gleichzeitiges Auftreten der durch erneute Strömung auftretenden Verletzung abgeschwächt werden, und zwar mit Hilfe der Bildung von toxischen freien Sauerstoffradikalen. Um zu untersuchen, ob das Einfangen freier Radikale durch rekombinierte Human-Superoxid-Dismutase (hSOD) zu einer Herabsetzung von IS führen kann, verglichen mit der Reperfusion allein, wurde 'bei 16 anästhesierten Hunden die umgebogenen Herzarterie vor irgendeiner marginalen Abzweigung 90 Minuten verschlossen. Während der Reperfusion wurde den Tieren entweder hSOD (400000 Einheiten als ein Bolus in das linke Atrium, gefolgt von 300000 Einheiten als einstündige i. v. Infusion; n=8) oder eine ähnliche Menge physiologische Salzlösung (Kontrollen, n=8) injiziert. Die Brust wurde dann geschlossen und die Tiere konnten sich erholen. Nach 48 Stunden wurden die Hunde getötet und ihre Herzen nach eine Blindprozedur aufgearbeitet, um

278.85- 27799G

2 5 1 7 S

die IS pathologisch und anhand des Risikobereichs durch postmortem Angiographie zu bestimmen. Die proximale Occlusion der umgebogenen Arterie führte zu einer Ischämie von 40,8+2,3% der linken Ventrikels (LV) bei den Kontrollen und von 41,8+2,0% bei den behandelten Hunden. Bei den Kontrollhunden war die Reperfusion mit einer Infarktion von 52,2 + 7% des Risikobereichs verbunden. Die hSOD-Behandlung führte jedoch zu einer signifikanten Reduktion der Nekrosis, wobei IS 33,6+2,1% des Risikobereichs (P< 0,05) beträgt. Die Kontrolltiere entwickelten zusammenwachsende, nicht-transmurale Infarkte, die sich über das meiste des Risikogebietes erstreckten, während bei den behandelten Hunden die Infarkte mehr stellenweise und nicht zusammenwachsend auftraten. Das Einfangen freier Radikale durch Verabreichung von hSOD während der Reperfusion .setzt also das Ausmaß der Nekrosis deutlich herab, möglicherweise durch eine Verhinderung der Verletzung durch erneute Strömung.

Beispiel 31 . .

Die Rolle freier Sauerstoffradikale bei der Reperfusionsverletzung von kalten konservierten ischämischen Nieren

Nach einer neuen Indikation kann Human-Superoxid-Dismutase die Reperfusionsverletzung nach der Transplantation von Organen herabsetzen. Das folgende Beispiel demonstriert, daß Superoxid-Dismutase die Verletzung durch Reperfusion nach der Transplantation einer Niere verbessert. Die in diesem Beispiel verwendete Human-Superoxid-Dismutase

Die in diesem Beispiel verwendeten Abkürzungen sind:.

C--,: Crestininbeseitigung; ATP: Adenosintriphosphat;

ADP: Adenosindiphosphat; AMP: Adenosinmonophosphat

ASS- 277996

25 ί 7δτ

wurde mit dem Wirt-Vektor-System pSODßiTi1 mit E. coli A1645 gernäß dem Beispiel 3 hergestellt und gebildet und unter den Bedingungen gereinigt, die im Beispiel 26

beschrieben sind

5

Die in Paranthese gesetzten arabischen Zahlen dieses Beispiels beziehen sich auf die Veröffentlichungen, die in der Bibliographie am Ende dieses Beispiels angegeben sind

10

Modell der renalen Konservierungs- und Transplantationsischämie beim Schwein

Weibliche, fremdgezüchtete Schweine mit einem Gewicht von ^ 1.5 bis 18 kg wurden mit Azepromazin und Atropin einer Premedikation unterworfen und mit Ketamin und Halothan anästhesiert. Bei den Donorschweinen wurde 30 Minuten vor der Entnahme eine Diuresis durch intravenöse Verabreichung von 1500 ml Ringer's Lactat, Furosemid (.20 mg) und Mannitoi{12,5 g) durchgeführt. Phenoxybenzamin (50 mg) wurde intravenös verabreicht, um einen renalen Vasopassmus zu verhindern, der bei Schweinen häufig auftreten kann. Durch einen abdomalen Mittellinienschnitt wurde die distale Aorta und die Vena cava ganz in der Nähe ihrer Abzweigung

mobilisiert. Die Harnleiter wurden seziert und in Höhe der Blase geteilt. Ein Zuströmkatheter wurde in der Aorta kurz oberhalb der Abzweigung angeordnet, und ein Abflußkatheter in der unteren Vena cava. Heparin (5 000 Einheiten) wurde intravenös verabreicht und es wurde eine kontinuier-

³^ liehe Spülung mit Euro-Collins-Lösung von 4⁰C durch die distale Aorta initiiert, gleichzeitig mit dem Abklemmen der Aorta kurz oberhalb der renalen Arterie. Nachdem die Nieren in situ gekühlt worden sind, ,wurden sie als Ganzes entfernt. Die Nieren wurden dann getrennt, wobei eine

³^ für die Kontrolle bestimmt war und die andere als Testniere, um so einen paärweisen Versuchsaufbau zu erleichtern, Jede Niere wurde dann wiederum mit 4°C-Euro-Collins-Lösung

3 85- 2 779 96

25 1 7Β7'

gespült. Wenn sie nach dem Protokoll verlangt werden, wurden Testsubstanzen zu der Konservierungsflüssigkeit der zweiten Niere zu dieser Zeit gegeben. Beide Nieren

wurden steril verpackt und bei 4⁰C über Nacht aufbewahrt. 5

Nach 24 Stunden kalter Ischämie wurde ein frisches Empfängertier anästhesiert und die konservierten Nieren wurden in dessen Iliumgefäße transplantiert. Die für jede Anastomose erforderliche Zeit betrug 25 bis 30 Minuten. Die (unbehandelte) Kontrollniere wurde immer zuerst transplantiert und die Testniere danach. Die Reperfusion der Testniere wurde deshalb immer um insgesamt eine Stunde nach der Rerperfusion der Kontrollniere durchgeführt. Dies.bedeutet, daß die Kontrollnieren 23 Stunden einer kalten Ischämie unterworfen waren, die Testnieren 24 Stunden. Das SOD-Analoge wurde intraarteriell verabreicht, und zwar beginnend eine Stunde nach der Reperfusion der Kontrollniere zu Zeitpunkt der Reperfusion der Test- : niere. Die Kontrollniere wurde also den toxischen Effek-

²^ ten des Wiedererwärmens und der Reperfusion eine Stunde vor der Einwirkung irgendwelcher Effekte von Mitteln, welche der Testniere zugeführt wurden, ausgesetzt. • ί Nach der Reperfusion der zweiten Niere wurden die nativen

Nieren des Empfängerschweins entfernt. Vor der Reper-' ²^ fusion wurde zunächst der Kontroll- und dann wiederum der Testniere eine zusätzliche Dosis (10 g) Mannitol verabreicht, um die klinische Praxis nachzuahmen. Dadurch wird eine Bestimmung des Effekts der freie Radikale modifizierenden Mittel, die sich den optimalen konventionellen Konservierungs- und Transplantationstechniken überlagern, ermöglicht. Der Harnleiter jeder Niere wurde durch kutane Ureterostemie separat herausgenommen.

Zwei Tage nach der Transplantation wurde der Empfänger etwas anästhesiert, und es wurde der Urin jeder Niere (Ureterostomie) eine Stunde gesammelt und hinsichtlich des Volumens und der Creatininkonzentration überprüft.

7-RPs. Q 77 QQC.

25 1 -7 S

-153-

Das Serum Creatinin wurde ebenfalls bestimmt, wodurch die Berechnung der Creatininentfernung allein durch jede Niere ermöglicht wird.

Alle Ergebnisse sind als mittlerer ±SEM-Wert dargestellt. Die Daten wurden während des Studenten-t-Tests (zweiendig) analysiert. In den meisten Fällen konnte ein paarweiser Test angewendet werden aufgrund des paarweisen Versuchsaufbaus

10

Versuchsprotokoll· Superoxid-Dismutase (SQD) und-Katalase

Rinderblut-Superoxid-Dismutase von Sigma, ein Fänger freier Sauerstoffradikale, wurde den Testnieren von 4 Schweinen verabreicht. Ein 5 mg-Bolus wurde der renalen Arterie unmittelbar vor der Reperfusion verabreicht, wobei eine Konstante intraarterielle Infusion von 1 mg/Minute während der ersten 15 Minuten der Reperfusion aufrechterhalten wurde. Dies ergab eine Gesamtdosis von 20 mg SOD. In einer zweiten Gruppe von 4 Schweinen erhielten die Testnieren Katalase (Sigma Co.) nach der gleichen Dosierung und zusätzlich zu SOD. Die andere Niere jedes der Schweine wurde nicht behandelt, und diente so als Kontrolle.

Dosisempfindlichkeit gegenüber SOD

Um die minimale Dosis für einen maximalen Schutz zu bestimmen, wurde die Dosis/Empfindlichkeitsbeziehung untersucht. Bei Revaskularisation erhielt eine Niere eine Infusion der niedrigeren von zwei Dosen SOD und die andere die nächst höhere Dosis. Humanes rekombiniertes SOD, das gemäß dem Beispiel 9 hergestellt worden ist, wurde wie oben angegeben verabreicht. Zwei Vergleichsversuche wurden mit jedem Dosisbereich durchgeführt. Bei dem

27. 8.85- 277996

ersten wurde 0,2 mg SOD mit einer Salzlösung als Kontrolle verglichen. Stufenweise wurden 0,2 mg mit 2 mg, 2 mg mit 20 mg und schließlich 20 mg mit 100 mg verglichen. In jedem Fall wurde die Niere, die die niedrigere Dosis empfängt, zuerst transplantiert, um das mögliche Problem einer SOD-Retention in dem Kreislauf zum Zeitpunkt der zweiten Transplantation zu vermeiden.

Ergebnisse 10

Der Effekt von Rinder-SOD und Katalase

Die Creatininbeseitigung einer normalen einzigen Niere in Schweinen der verwendeten Größe betrug unter den oben angegebenen Bedingungen der Anästhesie und der Hydration 25,5+6,3 ml/Minute (n=8). Die Verabreichung von SOD mit einer Dosis von 20 mg in die renale Arterie während der ersten 15 Minuten der Reperfusion verbesserte im wesentlichen die renale funktionelle Beeinträchtigung nach der kalten Ischämie. Die 4 Nieren, die lediglich mit SOD behandelt wurden, wiesen eine mittlere Creatininentfernung von 22,2l4,5 ml/Minute auf, beinahe das 3-fache dessen der Kontrollnieren (8,4-1,7 ml/Minute, , p<0,05). Eine Kombination von SOD und Katalase führte zu einem ähnlichen, jedoch nicht größeren Schutz

i I

(C_CR=19,0±4,5 ml/Minute). Bei früheren Pilotexperiment$n wurde eine separate Gruppe von 4 Schweinen einer Transplantation während anastomotischen Zeiten von mehr als 40 Minuten unterworfen. Obgleich die renale Funktion signifikant durch SOD und Katalase erhöht wurde, wiesen bei diesen Tieren sowohl die behandelten wie die Kontrollnieren eine sehr schlechte Funktion auf (C,., =4,8Ϊ0,8 gegenüber 1,6-0,4 ml/Minute). Bei diesen Nieren, die vermutlich einer schwereren Verletzung während der Ischämie per se vor der Reperfusion unterworfen wurden, war die Modifikation der freien Radikalverletzung nicht in der Lage, die normale renale Funktion wiederherzustellen.

27. 885- 277998

- ; 25 ί 78

Beziehunq der Empfindlichkeit und Dosis des Human-SOD-Analogen

Infusionen des Human-SOD-Analogen (0,2 mg und 2 mg) führten zu keiner Verbesserung der renalen Funktion, verglichen mit den Kontrollen. Die mittlere Creatininbeseitigung der Nieren, die 20 mg SOD-Analoges erhielten, war jedoch 14,2+1,1 ml/Minute und damit erheblich besser als die der Paare, welche 2 mg Infusionen (7,7±1,0 ml/Minute, p-^0.05) erhielten. Keine weitere Verbesserung wurde mit 100 mg SOD-Analogem (C =16,ΐίΐ,2 ml/Minute) erzielt. Die minimal wirksame Dosis des SOD-Analogen ergab sich also als mehr als 2 und weniger als 20 mg, wenn eine Verabreichung in dieser Art und Weise erfolgte. Das Human-SOD-Analoge war ebenso wirksam wie das Rinder-SOD.

Diskussion

Der paarweise Versuchsaufbau wurde angewendet, um die ^^u Unterschiede aufgrund der angewandten Behandlungsweisen zu maximieren und zur Kontrolle mitwirkender Variablen, die sich auf das spezielle Donor- oder Empfängertier beziehen. Er dient ebenfalls einer paarweisen statistischen Analyse der Ergebnisse, welche einen optimalen Einsatz

nc · I

einer kleinen Anzahl von relativ preiswerten Versuchstieren erlaubt.

Die überraschende Feststellung dieser Untersuchungen bestand in der Größe der Besserung durch Beseitigung einer

durch freie Radikale vermittelten Reperfusionsverletzung. Trotz der Tatsache, daß die Kontrollnieren die Vorteile der optimalen konventionellen Methoden der Organkonservierung empfingen, einschließlich gesunder Donornieren und Empfängertiere, Hydration, alphaadrenergische Blockie-

^JO rung, Antikoagulation und die Diurese, zeigten sie eine schwere funktionelle Verletzung, wobei die Creatininbeseitigungsniveaus auf Werte von weniger als einem Drittel des

27. 8.85- 277996

Normalen fielen. Diese 24 Stunden lange ischämische Konservierung, wie sie unter ähnlichen klinischen Umständen häufig vorkommt, übertrifft die konventionellen

Organkonservierungsmöglichkeiteru Die Behandlung mit 5

wirksamen Dosen von Rinder-SOD- oder Human-SOD-Analogen führt zu einer dramatischen Veränderung dieser Verletzung, wobei die renale Funktion bei fast normalem Niveau konserviert wird. Es gibt in der Tat keine einzige Niere, die auf diese Weise behandelt worden ist, die nicht eine Creatininbeseitigung von wenigstens dem Doppelten seines unbehandelten Kontrollpaares aufweist, wenn sie 48 Stunden nach der Transplantation gemessen wird. Die Größe dieses Vorteils wurde deshalb quantitativ größer als die, die von anderen nach 4 5 bis 60 Minuten einer warmen Ischämie

festgestellt wurde. Es ist deshalb anzunehmen, daß mit den optimalen konventionellen Konservierungstechniken die Verletzung aufgrund der Ischämie per se minimiert werden, wodurch die Verletzung dominieren kann, die durch die die Reperfusion erzeugt wird. Diese Interpretation

wird weiter durch Untersuchungen mit Nieren gestützt, die 18 Stunden vor der Reperfusion konserviert wurden. Bei diesen Nieren war die Funktion sowohl bei der Kontrollgruppe wie der behandelnden Gruppe hervorragend, was darauf schließen läßt, daß noch keine hinreichende Zeit

I

' verstrichen ist, um eine Ansammlung von genügend Metabo-

j liten zu ermöglichen, um Bedingungen zu bilden, die die freie Radikalbildung bei der Reperfusion begünstigen. Wenn andererseits die Nieren einem schwereren Grad der Ischämie per se unterworfen worden sind, wie bei den

früheren Pilotversuchen mit verlängerten anastomotischen Zeiten (d. h., warme Ischämie), war SOD nicht in der Lage, eine Funktion von annähernd normalem Niveau zurückzuerlangen, obgleich eine erhebliche Verbesserung trotzdem festzustellen war. Diese Nieren sind daher mehr jenen analog, welche nach kürzeren Perioden einer warmen Ischämie (7, 8, 9) untersucht worden sind. Wie bei anderen Organen stehen die Besserungen durch Verhinderung der freien

Tl 8.85- 277996

/' Q

Radikalbildung in erster Linie in Beziehung zu dem relativen Anteil der Verletzung aufgrund der Ischämie selbst, verglichen mit der aufgrund der Reperfusion.

° Dieser Anteil der Besserung scheint ferner entweder ganz oder überhaupt nicht erhalten zu werden. Die Dosis/Empfindlichkeitsuntersuchungen mit SOD zeigten entweder einen maximalen Schutz oder überhaupt keinen Schutz. Katalase führte zu keiner zusätzlichen Verbesserung, wenn sie SOD allein zugesetzt wurde. Innerhalb der quantitative Grenzen der Genauigkeit dieser Untersuchung scheint die Verhinderung einer Reperfusionsverletzung ein "Alles oder Nichts"-Phänomen zu sein.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung scheinen jedoch insbesondere für die klinische Anwendung relevant zu sein. Die gewählt 24-Stunden-Periode der kalten Ischämie entspricht gut den Perioden der Konservierung des Tr„ahsplantats eines Toten, wie sie unter klinischen Umständen erforderlich ist. Weiterhin zeigen diese Untersuchungen die Wirksamkeit der freien Radikalperfusionsverletzungsbeseitigung bei optimalen konventionellen Konservierungsund Transplantationsmethoden. Dies schließt die Verwendung von Mannitol mit ein, das selbst ein potenter Hydroxylradikalfanger ist. Diese Untersuchungen lassen daher darauf schließen, daß ein ähnlicher Grad der Besserung erhalten 'werden kann, wenn bei der gegenwärtigen klinischen Praxis freie Radikale verhindert werden können. Da SOD eine nicht-toxische Verbindung ist, erscheint dieser weg vielversprechend.

27. 8.85- T77996

251 7

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27.8.35- 277996

«1787

-161-Beispiel 32

Überleben der isolierten Kaninchenhornhaut und freie

Radikalfänger 5

Human-Superoxid-Dismutase, die mit dem Wirt-Vektor-System pSODß1T11 mit E. coli A1645 gemäß dem Beispiel 3 erzeugt und gemäß dem Beispiel 26 vermehrt und gereinigt' wird, zeigte eine Verlängerung der Überlebensperiode von abgetrennter isolierter Hornhaut.

Die in Paranthese gesetzten arabischen Zahlen dieses Beispiels beziehen sich auf Veröffentlichungen, die in der Bibliographie am Ende dieses Beispiels angegeben sind. 15

Bisherige Untersuchungen zeigten den vorteilhaften Effekt von niedrigen Konzentrationen von Adenosin auf die korneale Endothelpumpe von Kaninchen in vitro (1). Die Aktivierung der Flüssigkeitspumpe wurde erzielt durch Perfusion der isolierten Hornhaut mit physiologischen Konzentrationen von Glukose (5 rtiM) und Adenosin (10 M) in einer ausgeglichenen Salzlösung. Die Überlebenszeit betrug etwa 7 Stunden. Das nächste Ziel war eine Erhöhung der Überlebenszeit. Superoxid-Dismutase (SOD)

(2) fängt die freien Superoxid-Radikale ein durch Katalyse der Reaktion

°2~ ⁺ °2*~ ^{+ 2H+} * ^H2°2⁺ °2

Es ist bekannt, daß eine Verabreichung von SOD das Überleben von ischämischen Geweben nach partieller Anoxie erhöht (3).

Ein wesentliches Ausmaß der Gewebebeschädigung rührt von 35

der Ischämie her, die-während der Periode der Reperfusion und der Reoxigenierung der isolierten Gewebe auftritt. Das meiste dieser Verletzung erfolgt durch das Super-

27.

8.35- 277996

* oxidradikal und dessen Verwandte. Der Grund der vorliegenden Untersuchung besteht darin, zu bestimmen, : ob Superoxid-Dismutase (SOD) oder Katalase in der Lage sind, das Überleben der isolierten Hornhaut zu verlängern. · .

Es wurden die Hornhaut von Albinokaninchen mit einem Gewicht von 2,0 bis 3,0 kg isoliert. Die Einzelheiten der angewendeten Technik sind bereits beschrieben worden (1). Kurz gesagt, werden dabei die Augen entfernt und das korneale Epithel wird abgeschabt, worauf die Hornhaut, wie beschrieben, isoliert und einer Perfusion unterworfen wird.

Ergebnisse 15

Die Zugabe von 2μ/πι1 von SOD-Analogem zu einer Grundsalzlösung, die 5 mM Glukose und 1μ Adenosin enthält, verlängerte die Überlebenszeit der isolierten Hornhaut um 7 bis 14 Stunden. Falls Adenosin eliminiert wird, wird die Überlebenszeit um lediglich 12 Stunden verlängert,

Das SOD-Analoge erweist sich also als geeignet zur Verlängerung der Überlebenszeit der isolierten j Hornhaut. Das SOD-Analoge kann auch wesentlich für die Verlängerung der Überlebenszeit anderer isolierter Organe sein.

ι Γ

Ähnliche Daten unter Verwendung von Rinder-SOD sind in "Experimental Eye Research", Bd. 4, S. 153 -Ί54 (1985) veröffentlicht.

η ul· 2_77q

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27 8.8h- 277996

5! 787

-164-Beispiel 33

Aufbau von p9200 und Herstellung von bGH unter Verwendung von p9200 in E. col.i A16 45 und A4255

Der Aufbau von p9200 ist in Fig. 26 widergegeben und in der Beschreibung der Figuren erörtert. pHG44 wurde mit CIaI und Pstl gespalten, unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I "aufgefüllt" und dann das große DNA-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde an ein DNA-Fragment gebunden, welches das tetracyclinresistente Gen von pBR322 aufweist, welches isoliert wurde durch Spaltung von pBR32 2 mit RI und Aval und

anschließendem "Auffüllen" unterVerwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I. Das gebildete Plasmid p9200 wurde bei ATCC unter der Zugangsnr. ATCC 53215 hinterlegt.

Das Plasmid p9200 ist pHG44 (Fig. 6) ähnlich, jedoch verleiht das Plasmid Tetracyclinresistenz anstelle von Ampicillinresistenz. Das Plasmid p9200 wurde in die

E. coli-Stämme A1645 und A4255 durch Transformation ' unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Methoden

eingeführt. Diese Stämme erzeugten nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges des Rinderwachstumshormons (bGH) mit einer Aminosäuresequenz met-asp-gln, die an den Aminoterminus der Phenylalaninform von authentischen bGH addiert ist. Die Menge des bGH-Analo-

gen, das durch diese Stämme erzeugt wird, ist etwa derjenigen äquivalent, die mit pHG44 erzeugt wird.

Die verwendeten Methoden zum Wachstums des Stamms Ai645/p9200 (Wirtstamm A1645, transformiert mit p9200), zur Gewinnung des bGH-Analogen und zur Reinigung des bGH-Analogen sind identisch mit denen, die in Beispiel 13 für pHG44 beschrieben sind, außer daß 12,5 mg/1

27 8.35- /77996

251 7

Tetracyclin anstelle von 100 mg/1 Ampicillin zugegeben wurden.

(. Die angewendeten Methoden zum Wachstum und zur Induzierung des Stammes A4255/p9200, welches als A4320 bezeichnet wird, sind im Beispiel 36 beschrieben. Die angewendeten Methoden zur Reinigung des bGH-Analogen sind mit denjenigen identisch, die für pHG44 im Beispiel 13 beschrieben

ίο ^sind·

Der Stamm A4320 (Wirtstamm A4255, transformiert mit Plasmid p9200) wurde bei ATCC unter der Zugangsnr. ATCC 5 3215 hinterlegt.

Der Ersatz des Ampicillingens durch das Tetracyclirigen ist von Vorteil, da Ampicillin von dem Produktionsprozess eliminiert werden kann, wodurch mögliche Kontaminierungen des Endproduktes durch Ampicillin vermieden werden, das ernsthafte allergische Reaktionen hervorrufen kann.

Beispiel 34 Herstellung des Human met-leu-leu-leu-met-ApoE-Analogen

Plasmid pTVR279-8 bestimmt die Expression eines neuen Apolipoprotein E3-Analogen. Die .N-terminale Sequenz dieses Analogen ist met-leu-leu-leu-met, gefolgt von der Sequenz von reifem Apolipoprotein E3.

Aufbau von pTVR 2 79-8

„ Der Aufbau von pTVR 279-8 ist in Fig. 25 dargestellt _o_ und in der Beschreibung der Fig. erläutert. Das Plasmid

pTVR 279-8 ist bei ATCC unter der Zugangsnr. 53216 hinterlegt worden.

.35- 27799G

25ί 7Bi

Plasmid pTV 190 (Fig. 21) wurde teilweise umgesetzt mit Aval unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I "aufgefüllt", verbunden und in E. coli transformiert. Das gebildete Plasmid, bei dem die 3'-AvaI-Stelle eliminiert ist und das als pTV 264-45 bezeichnet wird, wird zur Vervollständigung mit Ndel umgesetzt und mit folgenden synthetischen Oligonukleotiden verbunden:

#1217 5'-TATGCTGCTGCT # 1218 ACGACGACGAAT-S'

Das gebildete Plasmid, das als pTVR 279-8 bezeichnet

._ wird, wurde in E. coli A1645 transformiert unter Verb

Wendung von einem Fachmann geläufigen Methoden. Zellen, die das Plasmid enthalten, wurden durch Kolonie-Hybridi-

32 ' sation identifiziert unter Verwendung P-markierten Oligonukleotid 1218 als Sonde; Die Identität des Plasmids wurde durch DNA-Sequenzbestimmung bestätigt. Der Stamm

A1645, der pApoE Ex2 enthält, wurde bei ATCC unter der Zugangsnr. 39787 hinterlegt.

pTVR2 7 9-8 erzeugt nach dem Wachstum und der Induktion ein Analoges von Human-Apolipoprotein E3 mit der Amino-

ÄO j

säuresequenz met-leu-leu-leu-met addiert an den N-Terminus

i von natürlichem Ajpolipoprotein E3. Die angewendeten Methoden zum Wachstum des Stamms sind identisch mit jenen, die für pTV 170 im Beispiel 17 beschrieben sind, abgesehen davon, daß die Induktionsperiode bei 42⁰C 1 bis 5 Stunden anstelle von 15 Minuten-betrug.

pTVR 279-8 erzeugt ein ApoE3-Analoges, das gegenüber Bakterien weniger toxisch ist, als das met-ApoE3-Analoge, das mit pTV 170 und pTV 190 hergestellt wird. Das met-leu-leu-leu-met-ApoE3-Analoge bildet sich in der Zelle weiter selbst nach 60 Minuten der Induktion bei 42⁰C, wobei es ein Niveau von 400 bis 600 mg/1 Kultur erreicht.

27 8.05- 277996

251 7

Beispiel 35

Herstellung von menschlichem Wachstumshormon-Analogen Aufbau von pTV 300

Der Aufbau von pTV 300 ist in Fig. 27 dargestellt und in der Beschreibung der Figuren erläutert. Das Plasmid wird aufgebaut durch Einführung des hGH-Gens, das von dem Plasmid pTV 18(1) stammt, in die Ndel-Stelle von p579 (Fig. 19). Der Aufbau von pTV 18(1) ist in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0131843 A1 , veröffentlicht am 23. Januar 1985, sowie in der korrespondierenden US-Patentanmeldung Nr. 514188, eingereicht ° am 15· Juli 1983, offenbart, auf die hier Bezug genommen wird.

Synthese des hGH-Analogen prp_V 300 kann in den E. coli-Stamm A1645 durch Transformation eingeführt werden unter Verwendung von einem Fachmann geläufigen Methoden. Der Stamm erzeugt nach dem Wachstum und der Induktion ein -Analoges des menschlichen Wachstumshormons, bei dem die ersten 13 Aminosäuren des natürlichen Wachstumshormons weggelassen sind. Die Methoden, die zum Wachsen des Stamms und zur Reinigung des hGH-Analogen verwendet werden, sind die gleichen wie diejenigen, die in Beispiel 13 beschrieben werden.

Beispiel 36

Aufbau der prototrophischen Stämme und Produktion von . bGH unter Verwendung prototrophi'scher Wirte

³^ Prototrophische Stämme von E. coli werden hergestellt, welche eine Proteinexpression mit hohem Niveau durch viele der vorstehend beschriebenen Plasmide ermöglichen,

277996

2SI78?

selbst wenn sie in einem minimalen Medium wachsen. Die Vorteile eines bakteriellen Wachstumsprotokolls unter Verwendung minimaler Medien sind:

a) die Bakterien können sich zu einer höheren Zelldichte

vermehren;

b) es ist leichter, die Wachstumsbedingungen zu duplizieren, da die Medienbestandteile "einfacher" sind und deshalb eine höhere Qualität aufweisen; und

c) das Medium ist wirtschaftlicher.

Bevorzugte prototrophische Stämme dieser Erfindung werden bezeichnet als A4200, A4255, und A4346. Der Stamm A4255, der das Plasmid p9200 enthält, ist bei ATCC unter der Zugangsnr. 53215 hinterlegt worden und wird als A4320 bezeichnet. /

Auswahl und Aufbau der prototrophischen Stämme

Die folgenden Stämme wurden einem Screening hinsichtlich hoher Wachstumsraten bei minimalem Medium sowie Sensiti-

vität gegenüber dem Phagen λ, 14 34 und Phagen P1 unter-25

worfen:

Stamm

1.	ATCC	12435
2.	ATCC	23716
3.	ATCC	27662
4.	ATCC	25404
5.	ATCC	11775
6.	ATCC	25254
7.	HfrC=A4134
8.	W3350=A2509
9.	A1645

27 8.85- 277996

ZO

Aufgrund der Ergebnisse dieser Untersuchungen wurde das Augenmerk auf die Entwicklung eines prototrophischen Stamms gerichtet, der auf den Stämmen ATCC 124 35 und ATCC 25404 beruht, welche gegenüber den vorstehend angegebenen Phagen empfindlich sind und überlegene Wachstumsraten zeigen. Unter Verwendung dieser beiden Stämme wurden neue Stämme aufgebaut, welche den /(cl857-Repressor enthalten, indem sie mit—P-i—das Acl857 AHlABam Hl:Tn10 enthält, transduziert wurden. Tetracyclinresistente Kolonien wurde gereinigt und, falls erforderlich, von P1 geheilt.

Die gebildeten Stämme und deren Genotypen sind: A4200 = ATCC 12439 Qcl852 ΔΗ1 ABam Hl):ThlO A4206 = ATCC 25404 (XcI857 ΔΗ1 ABam Hl):TnlO

Beide Stämme werden mit pHG4 4 transformiert, wodurch der Stamm A4202 bzw. 4207 erhalten wird.

Vermehrung und Induktion

Die Stämme A4202 und A4207 wurden unter folgenden Bedingungen wachsen gelassen und induziert sowie für die Produktion des Rinderwachstumshormon-Analogen über-•prüft.

Medium

Komponenten Konzentration

KH₂PO₄ 13,6 g/l

(NH₄)₂SO₄ 2 g/l

MgSO₄'7H₂O 0,2 g/l

CaCl₂ 0,01 g/l

FeSO₄-7H₂O 0,5 g/l

pH 7,4

Π. 8.3^ζ- "77996

251 7

Zusätze

Glukose 20%-Lösung 25 ml/1

Ampicillin 20 mg/ml-Lösung T ml/1

B1 0,3%-Lösung 1 ml/1

Biotin 0,3%-Lösung 1 ml/1

Sowohl A4202 wie A4207 wachsen in dem minimalen Medium gut, jedoch erreicht nur A4202 das signifikante Expressionsniveau des bGH-Analogen. A4202 gibt das bGH-Analoge mit etwa dem gleichen Niveau wieder wie pHG44, das in einem reichem Medium wächst, wie im Beispiel 13 beschrieben.

Eliminierung der Tetracyclinresistenz von A4200 15

Um den prototrophischen Stamm A4.2 00 mit Plasmiden zu verwenden, welche lediglich eine Tetracyclinresistenzmarkierung aufweisen, wurde ein Stamm, der von der Tn10-Markierung geheilt war, hergestellt. Der Stamm A4200 wurde auf MacConky-Galaktose-Platten gestrichen, wobei GaI Revertanten selektiert und hinsichtlich der Sensivität gegenüber Tetracyclin und der Immunität des ,\_Phagen überprüft wurden. Dieser Stamm wurde als A4255 bezeichnet.

Aufbau von biotinunabhängigen prototrophischen Stämmen

Sämtliche vorstehend angegebenen prototrophischen Stämme enthalten das lambda cI857 delta H1 delta Bam H1-defektive Prophagen. Die Delta-H1-Entfernung erstreckt sich zu der

Bio-uvr-B-Region unter Entfernung des biosynthetischen Biotin-Operons. Die Stämme erfordern daher die Addition von Biotin zu dem Wachstumsmedium.

Um das Biotinerfordernis der von A4200 und A4255 abgeleiteten Stämme zu eliminieren, wurde ein F'-Episom vom Stamm A89 in diese Stämme eingeführt.

Π 8.85-. 277996

-171-

Der Stamm A89. trägt ein F'-gal-Plasmid. Es wurde demonstriert, daß dieses Plasmid sämtliche Gene trägt, die für eine endogene Synthese von Biotin notwendig sind. Einige Eigenschaften machen dieses Plasmid zu einer geeigneten Quelle für die Bio-Operone:

1. F'-gal ist ein Einheitsvervielfältigungsplasmid.

2. Das Plasmid ist außerordentlich stabil in E. coli.

3. F'-Plasmide sind kompatibel mit dem colEl-Plasmid,

auf dem unsere Expressionsvektoren beruhen. "

4. F'-gal ist ein konjugatives Plasmid. Es kann daher

leicht von Zelle zu Zelle transferiert werden.

5. Man kann den biotinunabhängigen Stamm leicht durch Screening ermitteln.

Der Stamm A4202 wurde 30 Minuten mit A89'konjugiert, wobei die biotinunabhängigen Kolonien selektiert wurden. Der erhaltene Stamm A4346 ergibt ein hohes Niveau an Rinderwachstumshormon-Analogem nach der Induktion in einem minimalen Glukosemedium in Abwesenheit von Biotin,

Keine anderen Wachstumsfaktoren sind erforderlich.

A4346 kann von pGH4 4 geheilt werden, indem Standardmethoden angewendet werden, die einem Fachmann bekannt sind. Der gebildete prototrophische Wirtsstamm kann

transformiert werden mit allen den Plasmiden, die in dieser Anmeldung beschrieben sind.

Minimales Medium

Das minimale Medium, das standardmäßig zu Produktionszwecken bei prototrophischen Stämmen verwendet wurde,

97 8.85- 277996

	6	g/i
	4	g/i
	1	g/i
O	,2	g/i
O	,1	ml/l
	1	ml/1

-172-1 war:

Bei Fermentoren Bei Schüttelkolben

K₂HPO₄ 6.g/l

KH₃PO₄ 4 g/l

NH₄Cl 1 g/l

MgSO₄-7H₂O 3 g/l

10 10% FeNH₄-

Citrat 0,3 ml/1

Spurenelement-Lösung 3 ml/1

Antischaummittel,

Silikon 0,5 ml/1

15 '

τ Autoklav

Ampicillin (100 mg/1) oder Tetracyclin (12,5 mg/1) können zu dem Medium zugegeben werden, abhängig davon, ob der Stamm ampicillin-bzw. tetracyclinresistent ist.

5 0%-ige Glukose wurde im Autoklaven separat behandelt und auf 2 0 g/l gebracht. 50%-ige Glukose wurde während der Fermentierung mit einer Geschwindigkeit von 1,08 g/ Glukose pro O.D.-Einheit der Stämme ohne dem F'-Episom oder mit einer Geschwindigkeit von'1,8 g/Glukose per . 2,0-Einheit des Stammes A4346 zugegeben. Der pH wurde eingestellt, indem 25% NH₄ zugegeben wurde. Das Anti-

schaummittel wurde in der erforderlichen Weise zugegeben, Biotin wurde mit 15 g/l bei den Stämmen zugegeben, die auf A4200, A4255 und A4206 basieren. Die Spurenelement-Lösung enthält (Biotechnol. Bioeng. Bd. 16, S. 933-941 (1974)):

; ? Q .Q" - r-77 QC Fi

25ί 78

-173-

l/l

H₃BO₃

CuCl₂ TCuSO₄.5H₂O) CaCl₂.2H₂O MnSO₄.4H₂O Na₂MoO₄.2H₂O CaCl₂.6H₂O ZnCl₂.4H₂O (ZnSO₄.7H₂O) konzentrierte HCl

0,57 1,0 (0,04) 1,0 0,81 2_f0 •2,0 2,0 (2,78) 100 ml

Die Verbindungen in Parenthese stellen alternative Verbindungen dar, die anstelle der vor ihnen angegebenen Verbindungen verwendet werden können. Die in Parenthese angegebenen Mengen beziehen sich auf ungefähre Mengen derartiger alternativer Verbindungen. Viele der vorstehend beschriebenen Plasmide sind in die prototrophen A4200 und A4255 eingeführt worden. Eine teilweise Liste dieser Stämme ist in der nachstehenden Tabelle wiedergegeben:

Stammbezeichnung

A4202 A4256 A4320 Z1803 A4500 A4346

Wirtsstamm/Plasmid

A4200/pHG44 A4255/pHG44 A4255/p9200 A4255/pSOD A4255/pTV A4200/pHG44, F¹GaI

27 8.35- 277996

. 25 ί 78 7

Beispiel 37

Aufbau von lytischen Wirten und Herstellung von bGH unter Verwendung dieser lytischer Wirte

1. Aufbau der Stämme 4048 und A3111

Der Stamm W3350 wird in großem Umfang zum Wachstum der ^q \Phagen verwendet (s. beispielsweise Oppenheim und Salomon (1970), 41 Virology, S. 151-159). Der Stamm A2509, ein prototrophisches Derivat von W3350, wurde durch Plclts, gewachsen auf A1637, transduziert und ebenso transduziert mit einem ^cl857ÄH1ÄBamHl-defektiven Prophagen, das die ]_5 Tn 10-Markierung trägt. Der gebildete Stamm A4048 wurde als tetracyclinresistenter Klon selektiert, der das defektive Prophagen Acl857£HiABamHi trägt. Dieser Stamm trägt auch ein Plclts-Plasmid. Dieser Stamm wurde mit pHG44 transformiert, um den Stamm A3111 zu ergeben.

In ähnlicher Weise wurde der Stamm A4085 aus A2509 durch Einführung von y\cl857AHiABam H1 , Entfernung des Tn10-Transposons und Reifen des Plclts-Plasmids vor der Transformation mit pHG44 aufgebaut. Der Stamm A4085 trägt das defektive Prophagen Acl857^Hl^Bam H1 und dient als Kontrolle¹zu Messpng der bGH-Produktion und der

ι Autolyse, die ohne jdie Gegenwart des Pl-Plasmid auftritt. Der Stamm A3111 ist bei ATCC unter der Zugangsnr. 5 3217 hinterlegt worden.

2. Synthese von Rinderwachstumshormon (bGH)

Vorratskulturen: Vorratskulturen des Stamms A3111 (pHG44 in A4048-Zellen) wurden über Nacht bei 30⁰C in einem 3g LB-Medium, das 50μg/l Ampicillin (Amp) enthält, wachsen gelassen. Die Kulturen wurden um das 2-fache mit 50%-igem Glycerin verdünnt und bei -2O⁰C aufbewahrt.

27.8.35- 2.77996

2 517 8?

Impfmaterial: Das Impfmaterial wurde von einer einzigen Kolonie von A3111 erhalten, die auf einer LB-Agar-Platte gewachsen ist, die 100 μ9/Ίη1 Amp enthält. Die LB-Platten wurden ihrerseits mit einem Material besprüht, das den Vorratskulturen .entnommen wurde.

3 ml steriles LB-Medium, das 50 μg/l Amp enthält, wurde mit einer einzigen Kolonie von A3111 geimpft und 18 Stunden

bei 3O⁰C in einem Schüttelkolben wachsen gelassen. 10

Produktion: Die Produktion von bGH wurde in einem BHI-Medium (37 -μς/l Hirn-Herz-Aufguß (Difco) ) durchgeführt, welches 50 μg/ml Amp enthält. Das Impfmaterial "wurde auf 1:100 in einem Kolben verdünnt, welcher frisches BHI + 50 μg/ml Amp enthält, und in einem Schüttelbad bei 3O⁰C wachsen gelassen, bis die Zellkonzentra-

tion etwa 4x10 Zellen/ml (OD,₆₀₀=0,5) erreichte.

Zur Induktion der bGH-Produktion wurde der Kolben in ²^ ein Schüttelbad übergeführt, das auf 42⁰C eingestellt war. In Zeitabständen von 0 bis 90 Minuten nach dem Beginn der Induktion wurden Zellproben entnommen.

Analyse der bGH-Produktion: 25

Die bGH-Produktion wurde mit einem 10 bis 26%-Gradient Acrylamidgel analysiert. Die Zellproben wurden mit einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, der überstand wurde entfernt und der Kuchen wurde in einem Probepuffer gelöst (2% SDS, 50 mM Tris, pH 7,0, 3%Sukrose, 5% ß-Mercaptoethanol) und auf das Gel gegeben. Nach einer 2-1/2- stündigen Elektrophorese 'bei 200 V wurden die Gele mit Coomassie-Blau angefärbt und die Menge des bGH wurde durch Ablesen mit

einem Gel-Scanner bestimmt

35

Nach 90 Minuten der Induktion bei 42⁰C umfaßt das bGH etwa 20% des gesamten Proteins von A3111.

27. 8.85- 277996

-176-3. Autolyse

Der Stamm A3111 trägt pHG4 4, das defektive Prophagen

/\cI857AiilA.Bam H1 sowie ein stabiles Plclts-Plasmid. Nach 5

einer verlängerten Induktion bei 42 ⁰C tritt eine Lyse..

der Zelle auf aufgrund der Produktion von Endolysin durch Pl. Eine komplette Lyse der Kultur wird nach 2,5-3 Stunden erreicht.

Kontrollierter Autolysetest

5 ml der A3111-Kultur wurden entnommen vor und nach der Induktion bei 42°C (90 Minuten) und mit einer Sorvall-Zentrifuge mit 7000 Umdrehungen / Minute 7 Minuten zentrifugiert. Der überstand wurde entfernt und der Kuchen wurde über Nacht bei -20⁰C eingefroren. Der Kuchen wurde dann in 0,5 ml T. E. Puffer (1OmM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert, und 0,1 ml wurden 1:10 mit T. E. verdünnt

und der OD ,^_n bestimmt

Λ U

Als Kontrolle für diesen Versuch wurde der Stamm A4085 verwendet, der ähnlich A3111 pHG44 und das defektive Prophagen Acl857£HlABamH1 enthält, jedoch kein Plclts-Plasmid trägt

25

Die Ergebnisse eines derartigen Versuchs sind in der Tabelle V widergegeben, welche zeigt, daß Zellen, die das Plclts-Plasmid (A3111) enthalten, unmittelbar nach dem Auftauen eine Lyse erfahren. Eine Überprüfung der

^QW aufgetauten Mischung zeigte, daß über 95% der Zellen eine Lyse erfuhren, wenn diese Behandlung angewendet wurde.

11 HS- ?7799fi

251 7$

-177-

Tabelle V

^OD.600

Stamm Plclts vor dem Gefrieren nach dem Auftauen Prozentverlust

A4085 - 0,980 . 0,851 14

A3111 + 0,543 0,08 86

Die Lyse-Prozedur vereinfacht die Extraktion von bGH aus dem induzierten Zellen, ohne die bGH-Produktion zu __n beeinträchtigen'. "

Beispiel 38 or Biologische Aktivität des Met-ApoE3-Analogen

II'

Es wurden Bakterien pTV 194 wachsen gelassen, wie in Beispiel 17 beschrieben.

__ Die Zahlen in Parenthese beziehen sich auf die Veröffentlichungen, die am Ende dieses Beispiels angegeben sind.

Analyse von bakteriellen Extrakten

_o_ Bakterielle Zellen wurden durch Zentrifugieren und Suspendieren in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, der 5 mM EDTA und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthält, geerntet. Aliquots wurden einer Lyse in dem 1,5-fachen

? 7 R R ¹J - ')77nnr

Probenpuffer (15% Glycerin, 4,5% NaDodSO, 1 mM ß-Mercaptoethanol, 93,5 mM Tris*HCl, 0,25% Bromphenolblau, pH 6,8) unterworfen, 10 Minuten auf 100⁰C erwärmt und die Proteine wurden mit einem 10% NaDOdSO₄ -Polyacrylamidgel analysiert (26). Die auf Polyacrylamidgelen getrennten Proteine wurden entweder mit Coomasie-Brilliantblau angefärbt oder wurden elektrophoretisch auf Nitrocellu-

125

losefolien übergeführt (27) und mit I-markiertem Anti-Human-ApoE-monoklonalem oder polyklonalem IgG umgesetzt. Die Immunoblots wurden gewaschen, an der Luft getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.

Isolierung von ApoE

Authentisches ApoE wurde isoliert aus den d 41,02 Plasmalipoproteinen einer Hypertriglyceridemischen Person (E3/3-Phänotyp) durch Chromatographie mit einer Sephacryl-S-300 Säule wie bereits beschrieben (14). Die E3-Isoform wurde durch präparative isoelektrische Fokussierung mit Immobilin (LKB Instruments, Bromma, Schweden, pH-Bereich 4,9 bis 5,9) erhalten (28).

Das ApoE-Analoge wurde aus 33.g lyophilisierter Zellen

isoliert, welche die Zellmasse aus 5 1 Fermentation 25

darstellen. Die Zellen wurden zu einem feinen Pulver mit Hilfe von .22 g Aluminiumoxid gemahlen (Buehler Ltd., Evanston, Illinois) und zwar in einem auf 4⁰C gekühlten Mörser mit einem Pistill. Die zerkleinerten Zellen wurden mit 300 ml 6 M Harnstoff (frisch deionisiert), extrahiert, der 0,1 M NH₄HCO₃, 2 mM PMSF, 0,1% Trasylol (Mobay Chemical Corp., NewYork, NY) (pH 7,8) enthält. Der unlösliche zelluläre Rückstand wird durch Ultraznetirfugieren bei 4⁰C in einem Beckman SW28 Rotor

(25000 Umdrehungen, 50 Minuten) sedimentiert und mit 35

200 ml 6 M Harnstoffpuffer extrahiert. Die vereinigten Überstandfraktionen werden gegen dreimal ausgetauschten 2 M Harnstoff dialysiert, der 25 mM NH₄HCO₃, 2 mM PMSF,

97 im- 977QQR

st I / Q / . -179-

2 itiM EDTA, 0,1% Trasylol, 0,1% ß-Mercaptoethanol (pH 7,4).

Nach der Dialyse wird der Extraktüberstand zu etwa 200 ml Heparinsepharose gegeben, welche, wie beschrieben (29), _ hergestellt wurde und mit dem 2 M Harnstoffpuffer eingestellt wurde. Das Gel-Überstand-Gemisch wurde über Nacht bei 4⁰C auf einer rotierenden Platte inkubiert und dann in eine Glassäule (4,0 χ 3,5 cm, Kontes-Glass, Vineland, New Jersey) gepackt. Das nicht an die Heparin-Sepharose gebundene Material wurde von der Säule durch Proben von etwa 300 ml des 2 M Harnstoffpuffers mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/h durch die Säule entfernt. Das gebundene Material wurde dann von der Säule mit 50 ml 1,0 M NH₄HCO₃ in 2 M Harnstoff eluiert und dann gegen 5 mM NH.HCO,

._ dialysiert und lyophilisiert. Dieses halbgereinigte .ApoE Io

wurde in 15 ml 6 M Guanidin, das 0,1 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1,0% ß-Mercaptoethanol (pH 7,4) enthält, gelöst und auf eine Sephacryl-S-300 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)-Säule (2,5 χ 300 cm) gegeben, die mit 4 M Guanidin, 0,1 Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1% ß-Mercaptoethanol (pH 7,4)

eingestellt ist. Die Fraktionen, die ApoE enthalten, wurden vereinigt, erschöpfend gegen 5 mM NH.HCO, dialysiert und lyophilisiert.. Eine endgültige Reinigung wurde durch präparative isoelektrische Fokussierung auf einem

Immobilingel erreicht (28)

25

i t

I Strukturelle Charakterisierung des ApoE-Analogen

Protein oder Peptidproben für eine Aminosäureanalyse

wurden in 6 N HCl 20 Stunden bei 11O⁰C in verschlossenen, 30

evakuierten Röhrchen hydrolysiert. Die Analyse wurde mit einem Beckman 121 MB-Analysator durchgeführt, der mit einem Modell 126 Data System versehen ist.

Die Peptide für die Aminosäuren- und die Sequenzanalysen 5

wurden erzeugt, indem 3 mg von mit der Sephacryl-S-300-Säule gereinigtem ApoE mit 90 mg CNBr in 600 μΐ 70%-ige HCOOH 30 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt wurden. Die

v 7 a R s - 9 7 7 q 9 G

1 "?

s γ

-180-

gebildeten Peptide wurden mit einer Sephadex-G-50-Säule getrennt, wie bereits für authentisches ApoE beschrieben (4).

Mit einem modernisierten Beckman-SSOC-Sequenzermittlungsgerät wurden Sequenzanalysen durchgeführt, wobei ein Standart 0,1 M Quadrolprogramm verwendet wurde. Die intakten Proteine wurden in Gegenwart von 3 mg Polypren und 0,5% NaDodSO. abgebaut. Peptide wurden lediglich in Gegenwart von Polypren abgebaut. Die Phenylthiohydantoinsäuren wurden identifiziert und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie quantifiziert, wie bereits beschrieben (14) .

Es wurde eine analytische isoelektrische Fokussierung und eine NaDodSO.-Polyacrylamidgel-Elektrophorese durchgeführt (14). Es wurde eine Ladungsmodifikation mit Cysteamin (ß-Mercaptoethanolamin) durchgeführt (14).

Biologische Charakterisierung des ApoE-Analogen '

Es wurden Phospholipidkomplexe des ApoE-Analogen und Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) hergestellt und isoliert, wie bereits beschrieben (30). Es wurden Lipoproteinrezeptorbindungsbestimmungen durchgeführt,

• ' wie für Fibroplaste (31) und hepatische Membranen (32) beschrieben. Es wurde eine Iodierung von ApoE in 0,10 M NH₄HCO₃ mit Iodperlen (Pierce) nach den Vorschriften des Herstellers durchgeführt.

Für in vivo Untersuchungen an Kaninchen und Ratten wurde iodiertes authentisches und iodiertes ApoE-Analoges (jeweils 90 μg) 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 ml Kaninchen- oder Rattenplasma vor der Injektion in männliehe weiße Neuseelandratten inkubiert. Die Plasmaradioaktivität wird als TCA-prezipitierbares Protein angegeben, und zwar unter Verwendung einer bereits beschriebe-

27 S

25 J 7

. nen Präzipitationsmethode (33). Die Berechnung des Prozentsatzes der injizierten Dosis, die in dem Plasma nach unterschiedlichen Zeitabständen verbleibt, wurde auf eine Plasmavolumenbestimmung von 4,5% der Körpermasse 'bezogen.

Ergebnisse und Diskussion Expression von Human-ApoE

Nach der Induktion von Zellen, die einer Transfektion mit pTV 194 unterworfen worden sind, wurde ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht, das mit dem von ApoE identisch ist, spezifisch induziert. Dieses induzierte Protein reagierte mit Antihuman-ApoE-Antikörpern ( nicht dargestellt).

Bei Induktionsperioden von 30 Minuten oder mehr wurde eine Lyse der Zellen beobachtet (Fig. 28). Diese Zellyse war mit einer intrazellulären Akkumulation von ApoE verbunden. Nicht induzierte Zellen, die auf 30⁰C gehalten wurden, waren stabil (Fig. 28). Diese zelluläre Toxizitätslyse war kein allgemeines Merkmal dieses Expressionsvektors, da das gleiche Expressionssystem, das ein menschliches Wachstumshormon cDNA enthält, diesen Effekt nicht zeigt. ApoE wurde durch Proteolyse nach der Zellyse zerstört. Das Problem der Toxizität, das durch eine ApoE-Akkumulation hervorgerufen wird, wurde überwunden, indem die Zellen eine kurze Zeitspanne (ca. 20 Minuten) induziert und dann durch Zusatz von Eis zu dem Fermentor gekühlt wurden.

Wie durch Festphasenradioimmunoassay bestimmt, sind die ApoE-Gehalte in Zellen, die für kurze Zeitperioden induziert worden sind, etwa 1% des löslichen zellulären Proteins. Das ApoE wurde aus den Zellextrakten isoliert und gereinigt durch Chromatographie mit Heparin-Sepharose

97.3.35- 277996

25/ 78

und Sephacryl-S-300. Dieses zweistufige Verfahren führt zu einer ApoE-Präparation, die mehr als 90% rein ist, wobei die Ausbeute etwa 2 0% des ApoE beträgt, das in dem Zellextrakt vorhanden ist. Eine endgültige Reinigung zur Charakterisierung wurde durchgeführt durch präparative isoelektrische Immobilinfokussierung. Das für diese Untersuchungen verwendete Reinigungsschema wurde für die . Gesamtgewinnung nicht optimiert, sondern war darauf abgestellt, reines Material zur Charakterisierung zu erhalten. 10

Strukturelle Charakterisierung des ApoE-Analogen

Das immobilin-gereinigte ApoE-Analoge wandert als ein einziges Band auf SDS-Gelen mit einem scheinbaren M , das demjenigen von authentischem ApoE entspricht. Auf isoelektrischen Fokussierungsgelen wurde das biomanipulierte ApoE bei einem einzigen Hauptband mit einem PI fokussiert, der mit von Immobilin gereinigtem ApoE3 identisch ist. In Übereinstimmung mit der Gegenwart eines Cysteinrestes wurde das ApoE-Analoge eine Ladungs-' einheit weiter zur Anode nach der Cysteaminmodifizierung • bewegt. Die Aminosäureanalyse des immobilin-gereinigten Produkts wurde mit authentischem Humari-ApoE verglichen, das nach der gleichen Methode gereinigt wurde. Wie in Tabelle VI dargestellt, waren die Analysen des ApoE-Analogen und von authentischem ApoE nahezu identisch gegenüber einander und gegenüber der theoretischen Zusammensetzung, welche sich von der bisherigen Sequenzanalyse von Human-ApoE ableitet. Die Analysen weisen jedoch darauf hin, daß das ApoE-analoge Produkt einen zusätzlichen Methioninrest enthält, verglichen mit authentischem ApoE. Darüber hinaus wurde die Gegenwart eines Cysteinrestes aufgrund der Cysteamxnbehandlung bestätigt.

Sequenzanalysen von intaktem ApoE-Analogen, (ca. 6 nM) zeigten, daß der zusätzliche Methioninrest an dem NH_- terminus des Proteins sich befand und eine einzige Sequenz ergab von Met-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg-Gln-Gln-. Die.Sequenz, die dem Methionin

97 aas- 977996

ί 7

-183-

folgt, entspricht den Resten 1-17 von Human-ApoE. Diese Ergebnisse zeigen, daß das synthetische Oligonucleotid, das zum Wiederaufbau des NH„-terminalen Kodierungsabschnitts von ApoE verwendet wurde, zu korrekten Translationen führt und daß das zusätzliche Methionin (dessen Kodon zur zusätzlichen bakteriellen Translationsiniitiierung zugesetzt wurde) durch keinen Verfahrensschritt entfernt wurde. Die ursprüngliche Ausbeute der Sequenzanalyse war unerwartet niedrig (ca. 20%), jedoch ist dies wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß ein Teil des NH„-terminalen Methionin formyliert ist, da das formylierte Protein einen pi aufweist, der sich deutlich von dem nicht-formylierten Polypeptid (und von authentischem ApoE) unterscheidet, was jedoch nicht beobachtet

wurde.

Es wurden mehrere CNBr-Peptide hinsichtlich ihrer Aminösäurenzusammensetzung charakterisiert,' wobei sich herausstellte, daß sie sich nicht von jener des authentischen ' ApoE (nicht dargestellt) unterscheiden. Sequenzanalysen von CB4 (Reste 10 9-125 in authentischem ApoE) und partielle Sequenzanalysen von CB5 (aufgrund des Restes, der der Position 164 von ApoE entspricht) zeigten, daß die Sequenz des ApoE-Analogen identisch war mit der von authentischem ApoE3 in dem wesentlichen Rezeptorbindungsbereich. Alle diese Daten zeigen, daß, außer dem zusätzlichen Methionin am NH^-Terminus, das ApoE-Analoge eine identische Struktur wie authentisches ApoE3 aufweist.

Metabolischein vitro und in vivo Charakterisierung des ApoE-Analogen

Ein Vergleich der Rezeptorbindung der ApoE.DMPC-Komplexe zeigte, daß das ApoE-Analoge Bindungseigenschaften aufweist, die mit denen von authentischem ApoE identisch

1 25 sind. Bei kompetitiven Untersuchungen mit I-LDL zur Bindung an ApoB, E (LDL)-Rezeptoren auf gezüchteten Fibro-

Π. 3.85- 2.77936

25!

plasten, betrug die 50%-ige Austauschkonzentration für das ApoE-Analoge 0,019 μg/ml, verglichen mit 0,024 μg/ml für authentisches ApoE (Fig. 29). Bei direkten Bindungsuntersuchungen an Fibroplasten zeigten beide ApoE-Präpara- tionen eine ähnliche Bindung (Fig. 29). Eine Streuungsanalyse der direkten Bindungsdaten zeigte, daß das Kds und die maximale Menge, die durch biomanipuliertes und authentisches ApoE gebunden wird, 0,39 bzw. 0,96 χ 10 M und 29, 4 bzw. 34,2 μg/Ing Zellprotein beträgt. Darüberhinaus binden beide ApoE-Präparationen in ähnlicher Weise und wirksam ApoE-Rezeptoren an hepatische Hundemembranen (Fig. 30) .

Ein Vergleich der metabolischen in vivo Eigenschaften des ApoE-Analogen und von authentischem ApoE zeigten auch, daß beide Präparationen sich in identischer Weise verhielten.. Wenn I-ApoE-Analoges und I-ApoE-vermischt und normalen Kaninchenplasma inkubiert werden und dann das Gemisch in ein normales Kaninchen injiziert wird, werden beide Markierungen durch einen Kreislauf mit identischer Kinetik entfernt (Fig. 31). Eine Beseitigung von 50% der injizierten Dosis beider Markierungen tritt etwa 20 Minuten nach der Injektion auf. Identische Ergebnisse werden mit reziprok markierten Proteinen erhalten, ferner, wenn Umsatzstudien mit Ratten durchgeführt werden (nicht dargestellt). Das biomanipulierte wie das authentische ApoE zeigen also sowohl bei in vitro wie bei in vivo Studien ähnliche Eigenschaften und verhalten sich im wesentlichen identischerweise.

Die strukturelle Charakterisierung des isolierten ApoE-Analogen zeigt daher, daß mit Ausnahme des zusätzlichen Methioninrestes von dem Aminoterminus die Struktur des ApoE-Analogen mit der von authentischem ApoE identisch ist.

Darüber hinaus sind sowohl die metabolischen in vitro wie in vivo Eigenschaften des ApoE-Analogen und des authentischen ApoE identisch.

η 8.85- 277996

-185-

Tabelle VI

Aminosäurezusammensetzung des ApoE-Analogen und von

authentischem ApoE3 5

ApoE3-Analoges Authentisches ApoE3-Sequenz

ApoE3

Ly s	12,1	12,0	12
His	2,0	•2,0	2
Arg	33,3	33,3	34
Cys	0,8	0,8	1
Asp	12,3	12,4	12
Thr	10,5	10f5	11
Ser	12,7	12,6	14
GIu	72/0	71,9	71
Pro	.8,5	8f4	8
GIy	17,3	17,3	17
AIa	35,6	35,5	• 35
VaI	21,9	22,3	22
Met	7,7	6,5	7
He		1,9	2
Leu	37,0	37,3	3 7
Ty r	3,8	3,9	4
Phe	3,2	3,2	3
Trp	η .b.	n. b.	7

1 Die Ergebnisse sind Doppelbestimmungen und geben die Reste

30 pro Molekül wider. Cystein wurde separat nach Oxidation mit Perameisensäure bestimmt. Die Threonin- und Serinwerte wurden hinsichtlich des hydrolytischen Verlustes nicht korrigiert. Tryptophan wurde nicht bestimmt. Die ApoE3-Sequenz stammt aus der Veröffentlichung

Π US- 977996

25178?

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85- 277996

Beispiel 39 Biologische Aktivität des met-asp-gln-bGH-Analogen

Eine kürzliche Untersuchung (P. J. Eppard und D. E. Baumann, Proceedings of 1984 Cornell Nutrition Conference for Feed Manufacturers, S. 5-12) zeigt, daß die kontinuierliche Zufuhr von Methionyl-Rinderwachstumshormon über einen Zeitraum von 12 Wochen die Milchausbeute um 10 - 40% erhöht, verglichen mit Kontrollversuchen. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung des met-asp-gln-bGH-Analogen, kodiert mit dem pGH44-Plasmid, nach dem Wachstum, der Gewinnung und Reinigung, wie

im Beispiel 13 beschrieben, erhalten. 15

Beispiel 40 Biologische Aktivität des met-pGH-Analogen

Kürzliche Untersuchungen (S. A. Spence et al., Zusammenfassung mit dem Titel "Effect of Exogenous Growth Hormone on Fetal Energy Storage and Lactation. Performance in Sows" des "Annual Meeting of The American Society of Animal Science",University of Missouri, 7. - 10. August 1984) zeigen, daß die Verabreichung von aus der Hypophyse gewonnenem Schweinewachstumshormon die Milchbildung der Muttersau und das überleben des Ferkelwurfes erhöht. Bei einer Untersuchung der Milchbildungsleistung führte eine Verabreichung des met-pGH-Analogen an trächtige

Sauen zu einer Erhöhung der Milchbildung des Mutterschweines und des Überlebens des Ferkelwurfes.

Beispiel 41

Verwendung von rekombiniertem SOD bei der Behandlung der Rückenmarkischämie

Anästhesierte Hunde wurden an ein Potentiale hervor-

9] yu- 277996

rufendes System, Nicolet Compact 4, angeschlossen, wobei eine Grundlinie SEP (Sömatosenorisch hervorgerufene Potentiale) erhalten wurde,, in dem 250 Stimuli

hintereinander mit einer Geschwindigkeit von 4,7 5

Stimuli pro Sekunde auf den Nerv des hinteren Schienbeins ausgeübt wurden. Das von 250 Stimuli hervorgerufene Potential wurde mit 2 Elektroden über Fpz und Cz (zwei bestimmte Punkte auf der Schädeldecke) aufgezeich-

'net, gemittelt mit einem Signalmittler, um das Signal/ 10

Untergrund/Verhältnis herabzusetzen, wobei der SEP auf einem Bildschirm dargestellt wurde.

Es wurde dann eine linke Thoraktomie durchgeführt, wobei

die Aorta unmittelbar distal zu der linken Subclavian- 15

arterie seziert und zum Anlegen einer Klemme isoliert wurde. Ein Faden wurde nahe der zum Abklemmen der Aorta vorgeschlagenen Stelle eingeführt und eine 20iger Kanüle eingeführt, um den ungefähren Aortadruck zu überwachen und zur Infusion der Medikation, wie in der·

·

experimentellen Gruppe. Eine 14-Kanüle wurde in die rechte Femoralarterie zur BP(Blutdruck)-Überwachung und zur Blutentfernung eingeführt, um den BP nach der Abklemmung der Aorta zu kontrollieren. Es wurden seriell

Blutgasproben entnommen und der Respirator wurde so 25

eingestellt, daß sich die Blutgase in normalen Grenzen hielten. Die Aortaklemme wurde dann unmittelbar distal an der linken Subclavianarterie angebracht. Die SED werden in 1-Minuten-Intervallen wiederholt. Die ungefähre

Aortahypertension wurde kontrolliert, indem Blut von der ·

Femoralarterie entnommen wurde, um einen mittleren BP von 90 - 110 mmHg aufrechtzuerhalten. Die Aortaklemme wurde 10 weitere Minuten nach dem Verschwinden des SEP aufrechterhalten. Ein Verschwinden der SEP-Spur weist darauf hin, daß die Ischämie in dem Rückenmark, die durch

das Abklemmen der Thoraxaorta erfolgt, ernsthaft genug ist, um eine Leitung der Empfindungsnerv-Impulse im Rückenmark der Wirbelsäule zu erzeugen. Die Klemme wurde

)7 RRS- 977996

10 Minuten nach dem Verschwinden des SEP entfernt. Die Hunde wurden hypotensiv, wobei sie auf eine Infusion von Blut, Ringer's Lactat und Natriumbikarbonat reagierten

.

Bei den Kontrollhunden (n=8) erhielten-.die Tiere ein rekombiniertes SOD. Bei den Versuchstieren erhielt eine Gruppe (n=8) einen Bolus von 25000 Einheiten rekombiniertem SOD vor dem Entfernen der Klemme, gefolgt von 5000 Einheiten pro Minute während 10 Minuten; die zweite experimentelle Gruppe (n=7) erhielt 5000 Einheiten von rekombiniertem SOD vor der Entfernung der Klemme, gefolgt von 10000 Einheiten pro Minute während 10 Minuten.

Der neurologische Zustand der Hinterhand wurde post-

operativ nach dem Tarlov-Kriteriumbestimmt: 0 = Keine Bewegung.

der Hinterhand; 1 = leichte Bewegung der Hinterhand; 2 = gute Bewegung der Hinterhand, jedoch nicht in der Lage zu stehen; 3 = fähig zu stehen, aber nicht normal; und 4 = vollständige Wiederherstellung. Am 7. postopera-

tiven Tag wurde der SEP wiederholt und zum Vergleich mit der Grundlinie aufgezeichnet. Die Tiere wurden dann getötet.

Die Ergebnisse sind: 25

Neurologischer Zustand am 7. postoperativen Tag (POD):

Kontrolltiere (n=8) - 4 Tiere hatten die Note 0

- 4 Tiere hatten entweder die Note 2 oder 3

Versuchstiere (I) - 25000 Einheiten SOD-Bolus und

5000 Einheiten/Minute χ 10 Minuten

- 6 Tiere zeigten eine völlige Wiederherstellung

- 2 Tiere erhielten entweder die Note 2 oder 3.

8.55- 277996

5 1 7 8

-192-

Versuchstiere (II) 50000 Einheiten SOD-Bolus und

10000 Einheiten/Minute χ 10 Minuten

- alle 7 Tiere zeigten eine vollständige Wiederherstellung

Die Zeit für das Verschwinden des SEP nach der Anwendung der Aortaklemme variierte zwischen 12 und 19 Minuten. Da die Klemme 10 weitere Minuten nach dem Verschwinden des SEP angewendet wurde, war die gesamte Abklemmzeit mehr 20 Minuten.

In der unmittelbaren postoperativen Zeit nach dem Schliessen der Thoraktomiewunde wurde erneut SEP genommen. Bei den Kontrolltieren war keine SEP-Spurenbildung erkennbar, im Gegensatz zu den behandelten Tieren, welche eine Wiederkehr der SEP-Spurenbildung mit Verzögerurig mit einer Latenz einer Wellenform zeigten.

Das rekombinierte SOD erweist sich also als nützlich bei der Verhinderung neurologischer Verletzungen aufgrund von Rückenmarkischämie. Dieses Behandlungsverfahren ist insbesondere bei-der Operation von Aneurismen der Thoraxaorta wichtig.

. I

W- 277996

Claims (97)

1. PATENTANSPRÜCHE

   "1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Analogen desselben/ dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirt-Vektor-System mit einem Plasmid, enthaltend

   a) einen Vektor, der bei Einführung in eine geeignete bakterielle Wirtszelle, die einen thermolabilen

   Repressor C auf v/eist, die Wirtszelle in die Lage j. * .

   versetzt, nach Erhöhung der Temperatur der Wirtszelle auf eine Temperatur, bei welcher der Repressor inaktiviert wird, die Expression eines in den Vektor eingeführten gewünschten Gens sowie die Produktion von Polypeptiden, die durch dieses Gen kodiert werden, zu bewirken, mit

   1) einem doppelsträngigen DNA-Molekül, welches in der Reihenfolge 5' bis 3' ,

   eine DNA-Sequenz mit dem Promotor und Operator P_T0_T einen ABakteriophagen,

   eine N-Nutzungsstelle zur Bindung eines Antiterminator-N-Proteins,

   eine erste den Austausch der DNA-Sequenz mit der folgenden ribosomalen Bindungsstelle gestaltende

   Restriktonsenzymstelle,

   eine DNA-Sequenz mit einer ribosomalan Bindungsstelle, die die mRNA des gewünschten Gens zur

   Bindung an Ribosome in der Wirtszelle befähigt, 35

   >J !

   ein ATG-Initiierungs-Kodon oder eine DNA-Sequenz,

   die bei Einführung des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiierungs-Kodon umgewandelt wird, und

   eine zweite Restriktionsenzymstelle zur Einführung des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiierungs-Kodon

   enthält sowie

   2) darüber hinaus einer' DNA-Sequenz mit einem

   Replikationsstart aus einem zur autonomen Replikation in der Wirtszelle fähigen bakteriellen Plasmid und einem Selektionsmittel in Form von DNA-Sequenzen mit einem Gen mit selektierbarem

   oder identifizierbarem Phänotypusmerkmal, welches sich bei Anwesenheit des Vektors in der

   Wirtszelle manifestiert/ oder von DNA-Sequenzen

   434
   mit dem als el bezeichneten Fragment, welches

   das Gen für das el -Repressorprotein und dessen assoziierte Promotor- und Operatorsequenz beinhaltet, wobei der Abstand zwischen dem 3'-Ende der P_T O₇.-Promotor- und Operatorsequenz und dem 5'-Ende der N-Ausnutzungsstelle geringer als etwa

   _O[_ 80 Basenpaare und der Abstand zwischen dem 3'-

   Ende der N-Ausnutzungsstelle und dem 5'-Ende der ribosomalen Bindungsstelle weniger als etwa 300 Basenpaare beträgt, umfaßt, und

   b) ein Gen, das ein Polypeptid oder ein Analoges des-30

   selben kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle, eingefügt ist, in einem geeigneten E. coli-Wirt, unter die Produktion des Polypeptids oder von dessen Analogen erlaubenden geeigneten Bedingungen

   wachsen gelassen und das erhaltene Pol'ypeptid oder 35

   dessen Analoges abgetrennt wird.

   435
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Selektionsmittel eine DNA-Sequenz mit einem Gen mit selektierbarem oder identifizierbarem Phänotypusmerkmal ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Phänotypusmerkmal eine Arzneimittelresistenz darstellt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

   daß die Arzneimittelresistenz eine Resistenz gegen-. über Ampicillin oder Tetracyclin ist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichet, daß der Vektor weiterhin eine DNA-Sequenz mit einer T..T,>-rRNA-Sequenz, die 3¹ von der zweiten Restriktionsenzymstelle angeordnet ist, enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die T.Tp-rRNA-Transkriptions-Terminierungssequenz weniger als etwa 100 Basenpaare von dem 3¹-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle entfernt ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Τ..Τρ-rRNA-Transkriptions-Terminierungssequenz weniger als etwa 20 Basenpaare von dem 3'-Ende der zweiten Restriktionsenzymstelle entfernt ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Selektionsmittel eine DNA-Sequenz mit dem als

   434
   el bezeichnete Fragment ist.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß

   414
   das el -Fragment nach dem 3'-Ende der i^i^-rRNA-Transkriptions-Terminierungssequenz angeordnet ist.

   ζ a ι /&
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationsstart von pB3 22 (ATCC-Zugangsnr. 3 7017) herrührt
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationsstart von einem bakteriellen Plasmid herrührt, das zur autonomen Reproduktion in der Wirtszelle und zur Produktion von wenigstens 400 konstitutiven Kopien des Vektors in der Lage ist.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11,- dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationsstart von CoIEl herrührt.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikationsstart ρΟΡΙΔβ ist.
14. 14. Verfahren nach' Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor eine dritte Restriktionsstelle aufweist, die zwischen der DNA-Sequenz, die die ribosomale Bindungsstelle enthält, und dem ATG-Initiierungs-Kodon angeordnet ist.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Restriktionsenzymstelle eine einmalige Stelle in dem Vektor darstellt.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die erste.einmalige Restriktionsenzymstelle EcoRI ^ist·
17. 17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Restriktionsenzymstelle eine einmalige Stelle in dem Vektor ist.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite einmalige Restriktionsenzymstelle Ndel, Bgl2 oder Smal ist.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ribosomale Bindungsstelle C_1x eines ^Bakteriophagen ist und folgende Sequenz aufweist:

    TAAGGAAATACTTACAT
    ATTCCTTTATGAATGTA
20. 20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ribosomale Bindungsstelle eine Mutante von C eines Bakteriophagen ist und folgende Sequenz aufweist:

    TAAGGAAGTACTTACAT
    ATTCCTTCATGAATGTA
21. 21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ribosomale Bindungsstelle eine natürliche (o-Lactamase ribosomale Bindungsstelle ist, die von pBR322 (ATCC-Zugangsnr. 37017) abstammt.
22. 22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ribosomale Bindungsstelle ein synthetisches Oligonucleotid mit folgender Sequenz ist:

    AATTCGAGCGCAAGGAAACAGGCTCA GCTCGCGTTCCTTTGTCCGAGTAT
23. 23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch-gekennzeichnet, daß die ribosomale Bindungsstelle ein synthetisches Oligonucleotid mit folgender Sequenz ist:

    - '

    AATTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAG

    GTTATTATAACTTTTTCCTTCTCAT
24. 24. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pJH200 bezeichneter Vektor mit der in Fig. 2 dargestellten Restriktionskarte, der unter der ATCC-Zugangsnr. 39 783 hinterlegt worden ist, verwendet wird.
25. 25. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pRO21.1 bezeichneter Vektor mit der in Fig. 2 dargestellten Restriktionskarte verwendet

    wird. '
26. 26. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p579 bezeichneter Vektor mit der in Fig. 19 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
27. 27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,

    daß der Vektor außerdem eine DNA-Sequenz umfaßt,

    434
    welche das el

    Stelle aufweist.

    434
    welche das el -Fragment geklont in die CIaI-
28. 28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektor, der sich durch Entfernung des metphe-bGH-Gens von dem Plasmid p8300-10A (ATCC-Zugangsnr. 39785) ableitet und die Restriktionskarte gemäß Fig. 7 aufweist, verwendet wird.
29. 29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektor, der sich durch Entfernung des recbGH-Gens von dem Plasmid pSAL-170/10 ableitet und die in Fig. 8 dargestellte Restriktionskarte aufweist, verwendet wird.
30. 30. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vektor, der sich durch Entfernung des rec-

    bGH-Gens von dem Plasmid pSAL-210/4 ableitet und die

    in Fig. 9 dargestellte Restriktionskarte aufweist, verwendet wird.
31. 31. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid verwendet, das neben dem in Anspruch 1 gekennzeichneten Vektor ein ein PoIypeptid oder ein Analoges davon kodierendes und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingefügtes Gen enthält.
32. 32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von Rinder-Wachstumshormon oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches Rinder-Wachstumshormon oder ein Analoges davon kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
33. 33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pR012 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 2 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
34. 34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL 5200-6 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 3 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
35. 35. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pHG44 vezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte^s das unter der ATCC-Zugangsnr. 39806 hinterlegt ist, verwendet wird.
36. 36. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL 5600-2 bezeichnetes Plasmid mit
    der in Fig. 10 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
37. 37. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p7200-22 bezeichnetes Plasmid mit der
    in Fig. 7 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
38. 38. Verfahren nach Anspruch 3 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pHG50 bezeichnetes Plasmit mit der in
    Fig. 6 dargestellten Restriktionskarte, das unter
    der ATCC-Zugangsnr. 39805 hinterlegt ist, verwendet wird.
39. 39. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL-210/4 bezeichnetes Plasmid mit
    der in Fig. 9 dargestellten Restriktionskarte ver-

    wendet wird.
40. 40. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p8300-10A bezeichnetes Plasmid mit der
    in Fig. 7 dargestellten Restriktionskarte, das

    unter der ATCC-Zugangsnr. 39 785 hinterlegt ist,
    verwendet wird.
41. 41. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL-130/5 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 8 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
42. 42. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL-170/10 bezeichnetes Plasmid mit

    der in Fig. 8 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.

    43- Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p9200 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 26 dargestellten Restriktionskarte, das als A43 20 unter der ATCC-Zugangsnr. 53 215 hinterlegt ist, verwendet wird.
43. 44. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von menschlichem Wachstumshormon oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches

    « -

    menschliches Wachstumshormon oder ein Analoges davon kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
44. 45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV300 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 27 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
45. 46. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von Superoxid-Dismutase oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches Superoxid-Dismutase oder ein Analoges davon kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
46. 47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSODc.2 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 13 dargestellten Restriktionskarte, das unter der ATCC-Zugangsnr. 39786 hinterlegt ist, verwendet wird.
47. 48. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSODßi bezeichnetes Plasmid mit der in

    201 25 178?

    Fig. 14 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
48. 49. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein als PSODP₁T₁₁ bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 15 dargestellten. Restriktionskarte verwendet wird.
49. 50. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSODß -BA2 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 17 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
50. 51. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSODß TT-1 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. T6 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
51. 52. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von Schweine-Wachstumshormon oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches · Schweine-Wachstumshormon oder ein Analoges davon kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
52. 53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p3008 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 4 dargestellten Restriktionskarte, das unter der ATCC-Zugangsnr. 39804 hinterlegt ist, verwendet wird.
53. 54. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p3009 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 11 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
54. 55. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von Hühner-Wachstumshormon oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches

    Hühner-Wachstumshormon oder ein Analoges kodiert

    und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
55. 56. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p5002 bezeichnetes Plasmid mit der in

    Fig. 5 dargestellten Restriktionskarte verwendet
    wird.
56. 57. Verfahren nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß ein als p5003 bezeichnetes Plasmid die in Fig.

    dargestellte Restriktionskarte, das unter der ATCC-Zugangsnr. 39 79 2 hinterlegt ist, verwendet wird.
57. 58. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 31, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Plasmid zur Herstellung von menschlichem Apolipoprotein E oder eines Analogen davon vorgesehen ist und ein Gen enthält, welches
    ein menschliches Apolipoprotein E oder ein Analoges davon kodiert und in die zweite Restriktionsenzymstelle eingeführt ist.
58. 59. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-188 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 18 dargestellten Restriktionskarte verwendet

    wird.
59. 60. Verfahren nach Anspruch 5,8, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pSAL 16 0-5 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 23 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.

    "V ί

    2OH
60. 61. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-170 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 20 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
61. 62. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-190 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 21 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
62. 63. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-194 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 22 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
63. 64. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-214 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 24 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird.
64. 65. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-264-4 5 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 25 dargestellten Restriktionskarte verwendet wird. ·
65. 66. Verfahren nach Anspruch¹ 58, dadurch gekennzeichnet, daß ein als pTV-279-8 bezeichnetes Plasmid mit der in Fig. 25 dargestellten Restriktionskarte, das unter der ATCC-Zugangsnr. 53 216 hinterlegt ist, verwendet wird.
66. 67. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein E. coli-Stamm A1637 (ATCC-Zugangsnr. 39335, enthaltend Plasmid pREC 2/3) ist.

    105
67. 68. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 67, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein E. coli-Stamm A1645 (ATCC-Zugangsnr. 39787, enthaltend ein Plasmid pApoE-Ex2) ist.
68. 69. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 67, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein E. coli-Stamm A209 7 (ATCC-Zugangsnr. 39786, enthaltend ein Plasmid pSODa.2) ist.
69. 70. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 67, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein E. coli-Stamm vom Phänotyp SA500 his~ile~gal⁺A 8 (Ασΐ857Δ Η1ΔΒΑΜ N⁺) oder SA500 his"~ile~gal⁺&8 lacZ" A21 (|cl857 int2 xisl

    ist.
70. 71. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 67, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein E. coli-Stamm A1645 (Äi434cl mini Tn10) (ATCC-Zugangsnr. 39805, enthaltend pHG50) und das verwende

    enthält.

    434 verwendete Plasmid zusätzlich das el -Fragment
71. 72. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt des verwendeten Wirt-Vektor-Systems ein Prototroph ist.
72. 73. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 72, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Wirt ein E. coli-Stamm A4200 (ATCC-Zugangsnr. 53218, enthaltend pGH44 und das F'-gal-Plasmid und als A4346 bezeichnet) ist.
73. 74. Verfahren nach. Ansprüchen 1 und 72, dadurch ge-

    251

    kennzeichnet, daß der verwendete Wirt ein E. coli-Stamm A4255 (ATCC-Zugangsnr. 53215, enthaltend p9200 und als A4320 bezeichnet) ist.

    75- Verfahren nach Ansprüchen . 1 und 72, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Wirt biotinunabhängig ist.·
74. 76. Verfahren nach Anspruch'1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Wirt ein geeigneter lytischer Stamm ist.
75. 77. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 76, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Wirt ein Stamm A4048 (ATCC-Zugangsnr. 53217, enthaltend pGH44 und als A3111 bezeichnet) ist.
76. 78. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit.einem in Anspruch 3 2 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.
77. 79. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit einem in Anspruch 44 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.
78. 80. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit einem in Anspruch 52 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.
79. 81. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit einem in Anspruch 55 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.

    ιοί
80. 82. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit einem in Anspruch 4 6 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.
81. 83. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Wirt-Vektor-System mit einem in Anspruch 58 gekennzeichneten Plasmid durchgeführt wird.
82. 84. Verfahren nach Anspruch 1 ,. dadurch gekennzeichnet, daß es der Gewinnung von Rinderwachstumshormon . dient und mit dem in Anspruch 78 gekennzeichneten VJirt-Vektor-System unter eine Produktion des Rinder-Wachstumshormons oder eines Analogen davon erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
83. 85. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung von menschlichem Wachstumshormon oder einem Analogen davon dient und unter Verwendung des in Anspruch 79 gekennzeichneten Wirt-Vektor-Systems unter die Produktion von menschlichem Wachstumshormon oder eines Analogen davon erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
84. 86. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung von Schweinewachstumshormon dient und unter Verwendung des in Anspruch 80 gekennzeichneten Wirt-Vektor-Systems unter die Produktion von Schweinewachstumshormon oder eines Analogen davon erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
85. 87. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung von Hühnerwachstumshormon oder eines Analogen davon dient und unter Verwendung

    2OS

    des in Anspruch 81 gekennzeichneten Wirt-Vektor-Systems unter die Produktion von Hühnerwachstumshormon oder eines Analogen davon erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
86. 88. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung von Superoxid-Dismutase oder eines Analogen davon dient und unter Verwendung des in Anspruch 8 2 gekennzeichneten Wirt-Vektor-Systems unter die Produktion von Superoxid-Dismutase oder eines Analogen davon erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
87. 9.. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es zur Herstellung von menschlichem Apolipoprotein E dient und unter Verwendung des' in Anspruch 83 gekennzeichneten Wirt-Vektor-Systems unter die Produktion von menschlichem Apolipoprotein E erlaubenden Bedingungen durchgeführt wird.
88. 90. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirt-Vektor-System eine geeignete Zeit lang in einem geeigneten Medium bei 42 C wachsen gelassen wird.
89. 91. Verfahren nach Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirt-Vektor-System etwa 1 - 5 h lang bei 42 C wachsen gelassen wird.
90. 92. Verfahren nach Anspruch 90, dadurch gekennzeichnet, daß als geeignetes Medium ein Kaseinhydrolysat verwendet wird.
91. 93. Verfahren nach Anspruch 88, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung eines menschlichen Superoxid-

    Z03

    Dismutase-Analogen, nämlich der nicht-acetylierten oder nicht glykosylierten Form von natürlicher menschlicher Superoxid-Dismutase oder eines Analogen derselben, dient.

    *
92. 94. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es der Herstellung enzymatisch aktiver eukaryotischer Superoxid-Dismutase oder eines Analogen davon dient, wobei eine bakterielle Zelle mit einer DNA-Sequenz mit Kodierung für die Superoxid-Dismutase oder dessen Analoges und der Fähigkeit zum Ausdruck derselben unter geeigneten Bedingungen und in einem

    J L.

    geeigneten Produktionsmedium, dem soviel Cu zugesetzt wird, daß die Cu -Konzentration in dem Medium mehr als etwa 2 ppm beträgt, gehalten wird.
93. 95. Verfahren nach Anspruch 94, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Zelle eine Escherichia coli-

    * Zelle ist.
    20
94. 96. Verfahren nach Anspruch 94, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Zelle ein Plasmid mit einer eingefügten, die Superoxid-Dismutase oder dessen Analoges kodierenden DNA-Sequenz enthält.
95. 97. Verfahren nach Anspruch 94, dadurch gekennzeichnet, daß dem Produktionsmedium weiterhin soviel Zn zugesetzt wird, daß die Konzentration des Zn

    in dem Medium größer als "etwa 2 ppm ist. 30
96. 98. Verfahren nach Anspruch 94, dadurch gekennzeichnet, daß als enzymatisch aktive eukaryotische Superoxid-Dismutase menschliche Superoxid-Dismutase oder ein Analoges davon hergestellt wird.

    110
97. 99. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 94, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reinigung der gebildeten Superoxid-Dismutase oder von dessen Analogem die bakteriellen Zellen von dem Produktionsmedium isoliert werden, die bakteriellen Zellen in einer geeigneten Lösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 suspendiert werden, die Zellwände der suspendierten bakteriellen Zellen aufgebrochen werden, die gebildete homogene Suspension unter geeigneten Bedingungen einer , Schallbehandlung unterworfen- wird, das gebildete, einer Schallbehandlung unterworfene Produkt unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert wird, der Überstand etwa 2 Stunden bei etwa 65⁰C erwärmt wird, der überstand gekühlt und unter geeigneten Bedingungen zentrifugiert wird, um eine klare überstehende Proteinlösung zu erhalten, der gebildete überstand auf ein geeignetes Volumen konzentriert wird, die konzentrierte Proteinlösung einer Ionenaustauscher-Chromatographie mit einem geeigneten Anionenaustauscher, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt ist, unterworfen wird, die gebildete. Lösung, die die Superoxid-Dismutase oder ein Analoges enthält, gesammelt, auf ein geeignetes Volumen konzentriert und dialysiert wird gegen eine Pufferlösung mit einem pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0, die konzentrierte' Lösung einer Ionenaustauscherchromatographie mit einem geeigneten Anionenaustauscher, der auf einen pH von etwa 7,0 bis etwa 8,0 eingestellt ist, unterworfen wird, das an den Anionenaustauscher gebundene Protein einem geeigneten Salzgradienten ausgesetzt wird, die gebildeten Fraktionen, welche die Superoxid-Dismutase oder ein Analoges·enthalten, gesammelt, auf ein geeignetes Volumen konzentriert und dialysiert werden, gegen destilliertes Wasser,

    der pH der interessierenden Lösung mit einem geeigneten Puffer auf einen pH von etwa 4,0 bis etwa 5,0 eingestellt wird, die gepufferte Lösung einer Ionenaustauscherchromatographie mit einem geeigneten Kationenaustauscher, der auf einen pH von etwa 4,0 bis etwa 5,0 eingestellt ist, unterworfen wird, das an den Kationenaustauscher gebundene Protein einem geeigneten Salzgradienten ausgesetzt wird und die gebildeten Fraktionen, welche die gereinigte Superoxid-Dismutase oder ein Analoges enthalten, gesammelt werden.

    /

    ^hietB