DE60132190T2 - Mutierte version der arginin deiminase - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Mutationen der Arginin-Deiminase zur wirksameren Herstellung und Verarbeitung und damit zur verbesserten Behandlung von Krebs und anderen Krankheitszuständen gerichtet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es wird derzeit angenommen, dass die Aminosäure Arginin eine wichtige Rolle beim Vermitteln bestimmter Krankheitszustände spielen kann. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Tumore, wie Melanome, Hepatome, Sarkome und Leukämie zum Wachstum Arginin benötigen. Sugimura et al., Melanoma Res. 2: 191–196 (1992); Takaku et al., Int. J. Cancer 51: 244–249 (1992); Miyazaki et al., Cancer Res. 50: 4522–4527 (1990); J. B. Jones, "The Effect of Arginine Deiminase an Murine Leukemic Lymphoblasts", Ph. D. Dissertation, The University of Oklahoma, Seiten 1–165 (1981). Malignes Melanom (Stufe 3) und Hepatom stellen tödliche Erkrankungen dar, welche die meisten Patienten innerhalb eines Jahres der Diagnose töten. In den Vereinigten Staaten sterben ungefähr 16.000 Menschen jährlich an diesen Erkrankungen. Das Auftreten des Melanoms steigt in den Vereinigten Staaten schnell an, und ist in anderen Ländern, wie Australien, noch höher. Das Auftreten des Hepatoms ist in Teilen der Welt, in denen Hepatitis endmisch ist, noch größer. Zum Beispiel stellt das Hepatom eine der Hauptformen des Krebses in Japan und Taiwan dar.
  • Es wurde ebenfalls berichtet, dass viele Protozoen Arginin für das Wachstum benötigen, und daher kann Arginin eine wichtige Rolle in vielen parasitischen Erkrankungen spielen. van Wagtendonk et al., "Nitrogen Metabolism in Protozoa", in Comparative Biochemistry of Nitrogen Metabolism, Seiten 1–56 (J. W. Campbell Hrsg. 1970). Für Arginin (aus dem Kreislauf abgeleitet) wurde ebenfalls gezeigt, dass es eine Quelle für Stickoxid darstellt, welches eine wichtige Rolle beim Vermitteln eines septischen Schocks spielen kann. Chang et al., Am. J. Physiol. 274: H342–H348 (1998); McDonald et al., J. Biol. Chem. 272: 31213–31216 (1997). Wirksame Behandlungen für diese Erkrankungen werden dringend benötigt.
  • Es wurde berichtet, dass Enzyme, welche nicht essenzielle Aminosäuren, wie Arginin, abbauen, ein wirksames Mittel zum Kontrollieren einiger Krebsformen darstellen können. Zum Beispiel wurde aus Pseudomonas pudita isolierte Arginin-Deiminase von J. B. Jones, "The Effect of Arginine Deiminase an Murine Leukemic Lymphoblasts", Ph. D. Dissertation, The University of Oklahoma, Seiten 1–165 (1981) beschrieben. Da Arginin-Deiminase die Umwandlung von Arginin in Citrullin katalysiert, was somit hilft, das Arginin aus dem Kreislauf von Tieren zu entfernen, wird angenommen, dass Arginin-Deiminase als eine wirksame Therapie für Krebs und andere Krankheitszustände, in denen Arginin eine Rolle spielt, verwendet werden kann. Obwohl Arginin-Deiminase in Säugetieren nicht hergestellt wird, wird es in einer Vielzahl von Bakterien, Pilzen und Mycoplasma gefunden. Arginin-Deiminase kann daher aus jenen Organismen, welche sie herstellen, isoliert werden, oder das Enzym kann alternativ unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden. Misawa et al., J. Biotechnol. 36: 145–155 (1994).
  • Es zeigte sich, dass bestimmte Nachteile mit der Isolierung von Arginin-Deiminase aus Organismen verbunden sind. Obwohl sie wirksam beim Töten von Tumorzellen in vitro war, versagte die Arginin-Deiminase, die aus Pseudomonas putida isoliert wurde, eine Wirksamkeit in vivo aufzuweisen, da sie eine geringe Enzymaktivität bei einem neutralen pH-Wert aufwies und schnell aus dem Kreislauf der Versuchstiere entfernt wurde. Aus Mycoplasma arginini abgeleitete Arginin-Deiminase (Sequenz ID NR: 5) wird zum Beispiel von Takaku et al., Int. Cancer, 51: 244–249 (1992) und dem US Patent Nr. 5,474,928 beschrieben. Ein mit der therapeutischen Verwendung eines solchen heterologen Proteins verbundenes Problem stellt seine Antigenizität dar. Die chemische Modifikation der Arginin-Deiminase aus Mycoplasma arginini über eine Cyanurchlorid-Verbindungsgruppe mit Polyethylenglycol wurde von Takaku et al., Int. J. Cancer Res., 84: 1195–1200 1993) beschrieben. Das modifizierte Protein war aufgrund der Freisetzung des Cyanids aus der Cyanurchlorid-Verbindungsgruppe toxisch, wenn es metabolisiert wurde.
  • Die Herstellung von Arginin-Deiminase über rekombinante DNA-Techniken sorgte ebenfalls für bestimmte Nachteile. Zum Beispiel ist Arginin-Deiminase, die in Escherichia coli hergestellt wurde, enzymatisch inaktiv und muss daher denaturiert und anschließend korrekt renaturiert werden, damit sie enzymatisch aktiv wird. Das gewöhnliche Verfahren zum Renaturieren von in E. coli hergestellter Arginin-Deiminase ist, das inaktive Enzym zu isolieren, es in Guanidiniumhydrochlorid zu lösen und es durch schnelle Verdünnung in einem Puffer mit niedriger Ionenstärke zu renaturieren. Dieser letzte Schritt erfordert sehr große Volumina Puffer, was die Herstellung von Arginin-Deiminase daher sowohl teuer als auch zeitaufwändig gestaltet. Dennoch weist die rekombinante Technologie bestimmte Vorteile auf. Zum Beispiel können Organismen, die zugänglicher für eine Fermentation sind, als Wirte verwendet werden. Zusätzlich sind diese Fermentationswirte im Allgemeinen viel weniger pathogen, und es können größere Mengen Arginin-Deiminase erhalten werden. Es wurde gezeigt, dass E. coli große Mengen Mycoplasma-Arginin-Deiminase herstellen kann.
  • Ein anderes Problem, welches mit der Arginin-Deiminase verbunden ist, liegt darin, dass das Enzym hoch antigenisch ist und daher schnell aus dem Kreislauf verschwindet. Folglich muss die Arginin-Deiminase korrekt formuliert werden, bevor sie als therapeutisches Mittel verwendet wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Begriff Formulierung als die chemische Modifikation irgendeiner Arginin-Deiminase für Zwecke des Reduzierens der Antigenizität des Enzyms definiert werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Formulierung mehrerer Proteine, einschließlich Arginin-Deiminase, mit Polyethylenglycol, d. h. eine Pegylierung, die Antigenizität des Proteins reduzieren und seine Kreislauf-Halbwertszeit stark erhöhen kann. Bedauerlicherweise inaktiviert die Formulierung der Arginin-Deiminase mit Polyethylenglycol häufig das Enzym.
  • Es gibt einen Bedarf für Verfahren und Verbindungen, welche diese Probleme, die mit dem Stand der Technik verbunden sind, angehen. Die vorliegende Erfindung ist auf diese, sowie andere wichtige Ziele gerichtet.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Arginin-Deiminase-Enzym, welches zu einer wirksameren Herstellung und Verarbeitung in der Lage ist, und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche das Enzym umfassen.
  • Die Zusammensetzungen können verwendet werden, um Krebs zu behandeln, sowie, um die Metastase von Tumorzellen zu behandeln und/oder zu inhibieren. Die Zusammensetzungen können ebenfalls verwendet werden, um eine parasitische Erkrankung, einen septischen Schock und andere Krankheitszustände zu behandeln.
  • Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung erläutert werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt die Aminosäuresequenz der Arginin-Deiminase dar, welche aus Wildtyp Mycoplasma hominis kloniert wurde (Sequenz ID NR: 1).
  • 2 stellt die Aminosäuresequenz der modifizierten Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar (Sequenz ID NR: 4).
  • Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Modifikationen von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Aminosäurerest/e der Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis ein Enzym bereitstellen können, welches einfacher renaturiert und formuliert wird, wodurch vorhandene Techniken zur Herstellung von Arginin-Deiminase und von therapeutischen Zusammensetzungen, welche dieselbe umfassen, verbessert werden. Die therapeutischen Zusammensetzungen umfassen ebenfalls biokompatible Träger oder Verdünnungsmittel, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen werden einfach sterilisiert und sind nicht pyrogen. Solche verbesserten Techniken und Zusammensetzungen sind für die wirksame Behandlung von Krebs und anderen Krankheitszuständen nötig.
  • So wie hier verwendet, kann der Begriff "Melanom" einen malignen oder gutartigen Tumor darstellen, welcher aus dem melanozytischen System der Haut und anderen Organen entsteht, einschließlich der Mundhöhle, des Ösophagus, des Analkanals, der Vagina, der weichen Hirnhäute und/oder der Bindehäute oder des Auges. Der Begriff "Melanom" schließt zum Beispiel akrallentiginöses Melanom, amelanotisches Melanom, gutartiges juveniles Melanom, Lentigo-maligna-Melanom, malignes Melanom, noduläres Melanom, subunguales Melanom und oberflächlich spreitendes Melanom ein.
  • "Hepatom" kann einen malignen oder gutartigen Tumor der Leber darstellen, einschließlich von zum Beispiel heptozellulärem Karzinom.
  • "Patient" betrifft ein Tier, vorzugsweise ein Säugertier, weiter bevorzugt einen Menschen.
  • "Biokompatibel" betrifft Materialien oder Verbindungen, die im Allgemeinen nicht schädlich für biologische Funktionen sind und die nicht zu irgendeinem Grad inakzeptabler Toxizität führen werden, einschließlich allergenen und Krankheitszuständen.
  • "Polyethylenglycol" oder "PEG" betrifft Gemische aus Kondensationspolymeren aus Ethylenoxid und Wasser in einer verzweigten oder geraden Kette, dargestellt durch die allgemeine Formel H(OCH2CH2)nOH, wobei n mindestens 4 ist. Es ist bevorzugt, dass das Polyethylenglycol eine gerade Kette darstellt. Im Allgemeinen vermindert ein Erhöhen des Molekulargewichts des Polyethylenglycols die Immunogenizität von Arginin-Deiminase. Das Polyethylenglycol kann zusammen mit Arginin-Deiminase und gegebenenfalls einer biokompatiblen Verbindungsgruppe verwendet werden, um Krebs zu behandeln, einschließlich von zum Beispiel Melanomen, Hepatomen und Sarkomen, vorzugsweise von Melanomen.
  • Normale Zellen benötigen kein Arginin zum Wachstum, da sie Arginin aus Citrullin in einem Zweistufen-Verfahren synthetisieren können, welches durch Arginosuccinatsynthase und Arginosuccinatlyase katalysiert wird. Im Gegensatz dazu exprimieren Melanome, Hepatome und einige Sarkome keine Arginosuccinatsynthase, sie sind daher auxotroph für Arginin, d. h. sie benötigen Arginin zum Wachstum. Dieser metabolische Unterschied kann ausgenutzt werden, um eine sichere und wirksame Therapie zu entwickeln, um diese Krebsformen zu behandeln. Die Arginin-Deiminase katalysiert die Umwandlung von Arginin zu Citrullin und kann verwendet werden, um Arginin zu entfernen. Daher kann Arginin-Deiminase als eine Behandlung für Melanome, Hepatome, einige Sarkome und andere Krankheitszustände verwendet werden.
  • Die Aminosäuresequenzen der Arginin-Deiminase aus dem Mycoplasma hominis-Gen wird durch die 1 (Sequenz ID NR: 1) oder 2 (Sequenz ID NR: 4) offenbart. Eine chemische und genetische Modifikation des Arginin-Deiminase-Enzyms kann seine biologischen Aktivitäten beeinflussen. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Arginin-Deiminase typischerweise antigenisch ist und schnell aus dem Kreislauf eines Patienten entfernt wird. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass die Formulierung von Arginin-Deiminase mit Polyethylenglycol die Antigenizität reduziert und die Kreislauf-Halbwertszeit des Enzyms erhöht. Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7: 175–186 (1984); Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252: 3582–3586 (1977). Insbesondere kann Arginin-Deiminase kovalent mit Polyethylenglycol modifiziert werden. Arginin-Deiminase, die kovalent mit Polyethylenglycol modifiziert ist (mit oder ohne Verbindungsgruppe), kann nachfolgend als "ADI-PEG" bezeichnet werden. In der U.S. Patentanmeldung Seriennr. 09/023,809, beschreibt Clark verbesserte Modifikationen von Arginin-Deiminase mit Polyethylenglycol. Wenn es mit nativer Arginin-Deiminase verglichen wird, behält ADI-PEG den größten Teil ihrer enzymatischen Aktivität, ist viel weniger antigenisch, weist eine stark verlängerte Kreislauf-Halbwertszeit auf und ist viel wirksamer bei der Behandlung von Tumoren. Für erfindungsgemäße Zwecke kann die Modifikation von Arginin-Deiminase mit Polyethylenglycol als Pegylierung bezeichnet werden.
  • Es ist jedoch nötig, die Arginin-Deiminase mit der maximalen Menge Polyethylenglycol zu modifizieren, um die Antigenizität zu vermindern. Zum Beispiel kann Arginin-Deiminase mit der maximalen Menge Succinimidylsuccinatpolyethylenglycol (SS-PEG) formuliert werden. Das SS-PEG heftet sich während des Pegylierungsverfahrens an primäre Amine auf den Proteinen (den N-Terminus und die Lysine) an. Bedauerlicherweise wurde gezeigt, dass das Pegylierungsverfahren die Arginin-Deiminase inaktivieren kann, wenn es bis zum Abschluss durchgeführt wird. Während nicht beabsichtigt ist, dass es die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt, wird derzeit angenommen, dass die Arginin-Deiminase inaktiviert wird, weil das Polyethylenglycol sich an Stellen auf dem Enzym anheftet, welche mit der Fähigkeit des Enzyms interferieren, eine Reaktion zu katalysieren. Daher war es herkömmlicherweise nötig, das genaue Verhältnis von SS-PEG zu Enzym, die Konzentration des Reaktanten und die Zeit der Reaktion sorgfältig zu bestimmen, um eine Inaktivierung zu verhindern, während die Antigenizität vermindert wird (d. h. eine optimale Pegylierung). Zusätzlich wird es zunehmend schwierig, die Pegylierungsreaktionen zu kontrollieren, wenn der Herstellungsmaßstab steigt, und es ist häufig nötig, das SS-PEG vor dem Entfernen von überschüssigem Polyethylenglycol zu inaktivieren.
  • Es wurde ebenfalls gezeigt, dass durch rekombinante Technologie hergestellte Arginin-Deiminase, insbesondere in Escherichia coli-Zellen hergestellte Arginin-Deiminase, anfänglich inaktiv ist. Es war daher nötig, die rekombinante Arginin- Deiminase durch Denaturieren und anschließendes sorgfältiges Renaturieren des Enzyms zu aktivieren. Typischerweise wurde das inaktive Enzym isoliert, in Guanidiniumhydrochlorid gelöst und anschließend über eine schnelle Verdünnung mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke renaturiert. Es werden jedoch große Volumina Puffer benötigt, was die Herstellung der rekombinanten Arginin-Deiminase sowohl teuer als auch zeitaufwändig macht.
  • Es wurde nun entdeckt, dass bestimmte Modifikationen der Arginin-Deiminase sowohl die Renaturierung, als auch die Formulierung (d. h. die Pegylierung) des Enzyms vereinfachen können, wodurch die Herstellungsverfahren verbessert werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung, dass bestimmte Aminosäureänderungen in der Arginin-Deiminase hervorragende Ergebnisse bei der rekombinanten Herstellung und Formulierung des Enzyms bereitstellen. Die Herstellung der Arginin-Deiminase war herkömmlicherweise aufgrund von Schwierigkeiten, die mit der rekombinanten Herstellung und Formulierung verbunden sind, teuer und zeitaufwändig. Die vorliegende Erfindung offenbart daher eine modifizierte Arginin-Deiminase, welche verbesserte Renaturierungs- und Formulierungsverfahren bereitstellt, während die Fähigkeit beibehalten wird, Arginin in Citrullin umzuwandeln. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann modifizierte Arginin-Deiminase als eine aus Mycoplasma hominis isolierte Arginin-Deiminase, umfassend die Aminosäuresequenz aus Sequenz ID NR: 1, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren mindestens eines Lysins bei Rest 112, 374, 405 oder 408 von Sequenz ID NR: 1 modifiziert wurde, definiert werden. Es soll verstanden werden, dass modifizierte Arginin-Deiminase eine Arginin-Deiminase einschließen kann, welche eine einzelne Aminosäuresubstitution oder eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen aufweist. Ebenfalls offenbart wird eine DNA-Sequenz, welche die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase kodiert. Die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase kann hervorragende Ergebnisse bei der Behandlung bestimmter Krebstypen, ein Inhibieren der Metastase des Krebses und ein Behandeln anderer Krankheitszustände bereitstellen.
  • Es soll verstanden werden, dass die Erfindung auf der Entdeckung basiert, dass bestimmte Pegylierungsstellen, die mit der Arginin-Deiminase verbunden sind, an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms liegen können. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Begriff "Pegylierungsstelle" als irgendeine Stelle oder Position auf der Arginin-Deiminase definiert werden, welche kovalent mit Polyethylenglycol modifiziert werden kann. Eine "Pegylierungsstelle" kann als an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms liegend angesehen werden, wo eine Pegylierung der Stelle zu einer wesentlichen Reduktion der katalytischen Aktivität des Enzyms führt. Die Pegylierung solcher Stellen führte herkömmlicherweise zur Inaktivierung des Enzyms. Zum Beispiel weist Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis ein Lysin an der Position 112 auf, von welcher angenommen wird, dass sie an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms liegt. Die Anheftung von Polyethylenglycol an dieses Lysin an der Position 112 kann das Enzym inaktivieren. Zusätzlich weist Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis ein Cystein an der Position 397 auf, von welcher angenommen wird, dass sie an der oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms liegt. Die Bedeutung dieses Cysteins wurde gezeigt, da nun entdeckt wurde, dass Aminosäuresubstitutionen des Cysteins an Position 397 das Enzym inaktivieren können. Insbesondere wurde gezeigt, dass ein Substituieren des Cysteins an der Position 397 mit Alanin, Histidin, Arginin, Serin, Lysin oder Tyrosin zu einem Verlust der gesamten nachweisbaren Enzymaktivität führt. Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis weist ebenfalls drei Lysine auf, welche in der Nähe dieses konservierten Cysteins liegen, insbesondere Lys374, Lys405 und Lys408. Es wird angenommen, dass die Anheftung von Polyethylenglycol an Lys374, Lys405, Lys408 oder Kombinationen davon das Enzym inaktiviert.
  • Es soll verstanden werden, dass von anderen Organismen abgeleitete Arginin-Deiminase ebenfalls Pegylierungsstellen aufweisen kann, welche der Position 112 der Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis entsprechen. Zum Beispiel weist Arginin-Deiminase aus Streptococcus pyrogenes ein Lysin an Position 104 auf, Arginin-Deiminase aus Mycoplasma pneumoniae weist ein Lysin an der Position 106 auf, und Arginin-Deiminase aus Giardia intestinalis weist ein Lysin an der Po sition 114 auf. Zusätzlich kann Arginin-Deiminase aus einigen Organismen Lysine aufweisen, welche derselben allgemeinen Lage wie der Position 112 der Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis entsprechen. Die Lage des Lysins in der Arginin-Deiminase aus solchen Organismen kann wie folgt dargestellt werden: Tabelle 1. Pegylierungsstellen der Arginin-Deiminase aus verschiedenen Organismen
    Organismen, die Arginin-Deiminase herstellen Position von Lysin in der Arginin-Deiminase
    Mycoplasma hominis (Sequenz ID NR: 1) 112
    Mycoplasma arginini (Sequenz ID NR: 5) 111
    Clostridium perfringens 105
    Bacillus licheniformis 97, 108
    Borrelia burgdorferi 102, 111
    Borrelia afzelii 101
    Enterococcus faecalis 102, 110
    Streptococcus pyogenes 104
    Streptococcus pneumoniae 103
    Lactobacillus sakei 97, 106
    Giardia intestinalis 114, 116
  • Es wird derzeit angenommen, dass die Anheftung von Polyethylenglycol an solche Lysine oder Kombinationen davon das Enzym inaktivieren kann. Es wird derzeit angenommen, dass Aminosäuresubstitutionen solcher Lysine zu einem Protein führen können, welches bei einer Pegylierung weniger seiner Enzymaktivität verliert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher bestimmte Aminosäuresubstitutionen in der Polypeptidkette der Arginin-Deiminase bereit. Diese Aminosäuresubstitutionen stellen eine modifizierte Arginin-Deiminase bereit, welche weniger Aktivität bei einer Pegylierung verliert, d. h. bei einer Pegylierung beträgt die Reduktion der Enzymaktivität, welche der Pegylierung in der modifizierten Arginin-Deiminase folgt, weniger, als die Reduktion der Enzymaktivität, welche der Pegylierung der unmodifizierten Arginin-Deiminase folgt. Durch ein Entfernen von Pegylierungsstellen an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms kann eine optimale Pegylierung ohne den herkömmlichen Verlust der Aktivität erreicht werden. Wie oben diskutiert, weist Arginin-Deiminase aus bestimmten Organismen Pegylierungsstellen auf, welche an verschiedenen Positionen auf der Peptidkette liegen. Es wird derzeit angenommen, dass die Arginin-Deiminase die Aminosäure Lysin aufweisen kann, welche an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms liegt, und dass eine Pegylierung dieser Stellen das Enzym inaktivieren kann. Durch Entfernen von mindestens einer dieser Pegylierungsstellen, kann eine Pegylierung erreicht und mehr Enzymaktivität beibehalten werden. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass Lysin mit Glutaminsäure, Valin, Asparaginsäure, Alanin, Isoleucin, Leucin oder Kombinationen davon substituiert wird. Weiter bevorzugt ist, dass Lysin mit Glutaminsäure substituiert wird. Die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis weist eine Aminosäuresubstitution an Lys112, Lys374 Lys405, Lys408 oder Kombinationen davon auf. Vorzugsweise weist modifizierte Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis eine Aminosäuresubstitution von Lys112 zu Glu112, Lys374 zu Glu374, Lys405 zu Glu405, Lys408 zu Glu408 oder Kombinationen davon auf. Weiter bevorzugt ist, dass modifizierte Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis ein Lysin an Position 112 aufweist, welches mit Glutaminsäure substituiert ist (Sequenz ID NR: 2).
  • Es soll verstanden werden, dass andere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung auf der Entdeckung basieren, dass bestimmte strukturelle Eigenschaften der Arginin-Deiminase die sorgfältige und schnelle Renaturierung der Arginin-Deiminase verhindern können oder mit ihr interferieren können, wenn sie durch rekombinante Technologie hergestellt wird. Insbesondere stören oder verhindern diese strukturellen Eigenschaften, dass das Enzym eine aktive Konformation während der rekombinanten Herstellung annimmt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Begriff "aktive Konformation" als eine dreidimensionale Struktur definiert werden, welche eine enzymatische Aktivität der unmodifizierten oder modifizierten Arginin-Deiminase zulässt. Die aktive Konformation kann insbeson dere notwendig für das Katalysieren der Umwandlung von Arginin in Citrullin sein. Der Begriff "strukturelle Eigenschaft" kann als irgendein Merkmal, eine Qualität oder eine Eigenschaft der Polypeptidkette definiert werden, welche sich aus einer bestimmten Aminosäure oder Kombination von Aminosäuren ergibt. Zum Beispiel kann Arginin-Deiminase eine Aminosäure enthalten, welche zu einer Krümmung oder einem Knick in der normalen Peptidkette führt und so das Enzym daran hindert, eine aktive Konformation während der Renaturierung des Enzyms anzunehmen. Insbesondere weist Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis ein Prolin an Position 210 auf, welches zu einer Krümmung oder einem Knick in der Peptidkette führen kann, was es schwieriger macht, das Enzym während der rekombinanten Herstellung zu renaturieren. Es soll verstanden werden, dass aus anderen Organismen abgeleitete Arginin-Deiminase ebenfalls Stellen aufweisen kann, welche der Position 210 der Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis entsprechen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher wiederum bestimmte Aminosäuresubstitutionen in der Polypeptidkette der Arginin-Deiminase bereit. Solche Aminosäuresubstitutionen können die problematischen strukturellen Eigenschaften in der Peptidkette der Arginin-Deiminase entfernen. Solche Aminosäuresubstitutionen stellen eine verbesserte Renaturierung der modifizierten Arginin-Deiminase bereit. Diese Aminosäuresubstitutionen machen eine schnelle Renaturierung der modifizierten Arginin-Deiminase unter Verwendung verminderter Puffermengen möglich. Diese Aminosäuresubstitutionen können ebenfalls erhöhte Ausbeuten der renaturierten modifizierten Arginin-Deiminase bereitstellen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass die modifizierte Arginin-Deiminase eine einzelne Aminosäuresubstitution an Pro210 aufweist. Wie oben erwähnt, weist die Arginin-Deiminase, welche aus Mycoplasma hominis abgeleitet ist, die Aminosäure Prolin auf, welche an der Position 210 liegt. Während es die vorliegende Erfindung nicht beschränkt, wird derzeit angenommen, dass die Anwesenheit der Aminosäure Prolin an Position 210 zu einer Krümmung oder einem Knick in der normalen Polypeptidkette führt, welche/r die Schwierigkeit des Renaturierens (d. h. des Rückfaltens) der Arginin-Deiminase erhöht. Substitutionen des Prolins an Position 210 ermöglichen die schnelle Renaturierung der modifizierten Arginin-Deiminase unter Verwendung reduzierter Puffermengen. Substitutionen des Prolins an Position 210 können ebenfalls erhöhte Ausbeuten der renaturierten modifizierten Arginin-Deiminase bereitstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Prolin an Position 210 mit Serin substituiert (Sequenz ID NR: 3). Es soll verstanden werden, dass gemäß diesem Aspekt der Erfindung andere Substitutionen an Position 210 vorgenommen werden können. Beispiele für bevorzugte Substitutionen schließen Pro210 zu Thr210, Pro210 zu Arg210, Pro210 zu Asn210, Pro210 zu Gln210 oder Pro210 zu Met210 ein. Durch Entfernen dieser strukturellen Eigenschaften, welche mit der Aminosäure der Position 210 der Wildtyp-Arginin-Deiminase verbunden sind, kann eine korrekte Rückfaltung des Enzyms erreicht werden.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist es bevorzugt, dass die modifizierte Arginin-Deiminase mehrere Aminosäuresubstitutionen aufweist. Die modifizierte Arginin-Deiminase kann mindestens eine Aminosäuresubstitution aufweisen, welche Pegylierungsstellen an oder benachbart zu der katalytischen Region des Enzyms entfernt. Die modifizierte Arginin-Deiminase kann ebenfalls mindestens eine Aminosäuresubstitution aufweisen, welche jene strukturellen Eigenschaften entfernt, die mit der Renaturierung des Enzyms interferieren. Die Aminosäuresubstitutionen können daher eine erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase bereitstellen. Die Aminosäuresubstitutionen können die Pegylierung der modifizierten Arginin-Deiminase ohne einen Verlust der enzymatischen Aktivität bereitstellen. Die Aminosäuresubstitutionen können eine modifizierte Arginin-Deiminase bereitstellen, welche schnell unter Verwendung reduzierter Puffermengen renaturiert werden kann. Die Aminosäuresubstitutionen können ebenfalls erhöhte Ausbeuten der renaturierten modifizierten Arginin-Deiminase bereitstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die modifizierte Arginin-Deiminase, welche von Mycoplasma hominis abgeleitet ist, das Prolin an Position 210, welches mit Serin substituiert ist, und das Lysin an Position 112, welches mit Glutaminsäure substituiert ist (Sequenz ID NR: 4), ein. Wie oben diskutiert, soll jedoch verstanden werden, dass die modifizierte Arginin-Deiminase andere bevorzugte Substitutionen einschließen kann.
  • Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis abgeleitet wird. Erfindungsgemäß soll jedoch vom Fachmann verstanden werden, dass modifizierte Arginin-Deiminase von anderen Organismen abgeleitet werden kann. Zum Beispiel kann, wie oben diskutiert, erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase von Streptococcus pyrogenes, Mycoplasma pneumoniae, Giardia intestinalis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arginini, Clostridium perfringens, Bacillus licheniformis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Enterococccus faecalis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus sakei abgeleitet werden. Es soll verstanden werden, dass die modifizierte Arginin-Deiminase eine oder mehrere Aminosäuresubstitution/en aufweisen kann, gemäß den verschiedenen Aspekten der Erfindung.
  • Es soll verstanden werden, dass die modifizierte Arginin-Deiminase in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Polyethylenglycol formuliert werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt die Anheftung von Polyethylenglycol an modifizierte Arginin-Deiminase zum Erhöhen der Kreislauf-Halbwertszeit ohne die herkömmliche Inaktivierung des Enzyms bereit. Herkömmlicherweise wurde die Auswahl der Anheftungsstelle des Polyethylenglycols an die Arginin-Deiminase durch die Rolle jeder der Stellen innerhalb der aktiven Domäne des Proteins bestimmt, wie es dem Fachmann bekannt sein würde. Erfindungsgemäß kann Polyethylenglycol an ein primäres Amin der modifizierten Arginin-Deiminase angeheftet werden. Die vorliegende Erfindung stellt die Anheftung von Polyethylenglycol an die primären Amine der Arginin-Deiminase ohne einen erheblichen Verlust der Enzymaktivität bereit. Zum Beispiel enthält modifizierte Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis Lysin-Aminosäuren, welche mit Polyethylenglycol modifiziert werden können. Mit anderen Worten, stellen diese Lysine alle möglichen Punkte dar, an welchen die modifizierte Arginin-Deiminase an Polyethylenglycol angeheftet werden kann. Es soll jedoch verstanden werden, dass Polyethylenglycol auch an andere Stellen auf der modifizierten Arginin-Deiminase angeheftet werden kann, wie dem Fachmann offensichtlich sein würde. Ein Erhöhen der Anzahl der Polyethylenglycol-Einheiten an der modifizierten Arginin-Deiminase erhöht die Kreislauf-Halbwertszeit des Enzyms ohne die herkömmliche Abnahme der spezifischen Aktivität des Enzyms.
  • Die Verbindungsgruppe, welche verwendet wird, um das Polyethylenglycol kovalent an die modifizierte Arginin-Deiminase anzuheften, kann irgendeine biokompatible Verbindungsgruppe sein. Wie oben diskutiert, weist "biokompatibel" darauf hin, dass die Verbindung oder Gruppe nicht toxisch ist und in vitro oder in vivo verwendet werden kann, ohne Schaden, Übelkeit, Erkrankung oder Tod zu verursachen. Polyethylenglycol kann an die Verbindungsgruppe zum Beispiel über eine Etherbindung, eine Esterbindung, eine Thiolbindung oder eine Amidbindung gebunden werden. Geeignete biokompatible Verbindungsgruppen schließen zum Beispiel eine Estergruppe, eine Amidgruppe, eine Imidgruppe, eine Carbamatgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, ein Kohlenwasserstoff, eine Maleimidgruppe (einschließlich von zum Beispiel Succinimidylsuccinat (SS), Succinimidylpropionat (SPA), Succinimidylcarboxymethylat (SCM), Succinimidylsuccinamid (SSA) oder N-Hydroxysuccinimid (NHS)), eine Epoxidgruppe, eine Oxycarbonylimidazolgruppe (einschließlich von zum Beispiel Carbonyldimidazol (CDI)), eine Nitrophenylgruppe (einschließlich von zum Beispiel Nitrophenylcarbonat (NPC) oder Trichlorphenylcarbonat (TPC)), eine Trisylatgruppe, eine Aldehydgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Vinylsulfongruppe, eine Tyrosingruppe, eine Cysteingruppe, eine Histidingruppe oder ein primäres Amin ein. Vorzugsweise ist die biokompatible Verbindungsgruppe eine Estergruppe und/oder eine Maleimidgruppe. Weiter bevorzugt ist die Verbindungsgruppe SS, SPA, SCM, SSA oder NHS, wobei SS, SPA oder NHS weiter bevorzugt sind und SS oder SPA am meisten bevorzugt sind.
  • Alternativ kann Polyethylenglycol direkt an modifizierte Arginin-Deiminase (d. h. ohne eine Verbindungsgruppe) über eine Aminogruppe, eine Sulfhydralgruppe, eine Hydroxylgruppe oder eine Carboxylgruppe gekoppelt werden. Polyethylenglycol kann kovalent an modifizierte Arginin-Deiminase über eine biokompatible Verbindungsgruppe gebunden werden, unter Verwendung von Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel von Park et al., Cancer Res. 33: 3–14 (1973) und Zaplipsky und Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Hrsg., Plenum Press, NY, Kapitel 21 (1992) beschrieben werden.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls rekombinante DNA-Moleküle, welche die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase kodieren. Es ist bevorzugt, dass die DNA-Moleküle, welche die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle umfassen, von irgendeinem Mycoplasma hominis-Stamm unter Verwendung bekannter Techniken abgeleitet werden, z. B. Isolieren des Gens aus einer Genbank, Herstellen von komplementären oder cDNAs aus einer mRNA-Matrize oder über die Polymerase-Kettenreaktion (siehe U.S. Patent Nr. 4,800,159 ) oder aus Isolaten klinischer Proben. Alternativ können solche rekombinanten DNA-Moleküle durch Standard-DNA-Synthesetechniken synthetisiert werden. Verschiedene Mycoplasma hominis-Stämme sind ebenfalls öffentlich von kommerziellen Hinterlegungsstellen verfügbar, z. B. von der American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, MD, USA.
  • Die hier offenbarten DNA-Moleküle können zusätzlich DNA-Sequenzen umfassen, einschließlich von zum Beispiel einem regulatorischen Element, einem oder mehreren selektierbaren Marker/n und Sequenzen, welche die Replikation und die Aufrechterhaltungsfunktionen kodieren. Die regulatorische Region enthält typischerweise einen Promotor, welcher strangaufwärts von der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz gefunden wird, welcher in der Bindung der RNA-Polymerase und der Initiation der RNA-Transkription fungiert. Mit anderen Worten, das regulatorische Element oder die Region kann funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz verbunden sein. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass die Auswahl der regulatorischen Regionen von der eingesetzten Wirtszelle abhängen wird.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls rekombinante Vektoren, insbesondere rekombinante Plasmide, die Sequenzen umfassen, welche die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase kodieren.
  • Ebenfalls hier offenbart wird eine Wirtszelle, welche mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Eine solche Wirtszelle ist in der Lage zum Wachstum in einem geeigneten Kulturmedium und zum Exprimieren der erfindungsgemäßen kodierenden Sequenz. Eine solche Wirtszelle kann durch hier offenbarte Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Transformieren einer gewünschten Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Plasmid. Eine solche Transformation kann durch Verwendung gängiger Transformationstechniken erreicht werden. Weiterhin kann das hier offenbarte rekombinante DNA-Molekül in das Genom der Wirtszelle durch gängige Techniken, z. B. homologe Rekombination, integriert werden. Diese Wirtszellen schließen Säugetierzellen, Insektenzellen, Hefe- und andere Bakterienzellen, z. B. Streptomyces, Bacillus und Salmonella, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist bevorzugt, dass die Wirtszellen jene einschließen, welche zu der Art E. coli gehören. Die Erfindung und das Produkt davon sind nicht auf irgendeine spezifische Wirtszelle beschränkt. Es ist bevorzugt, dass die modifizierte Arginin-Deiminase durch die hier offenbarte transformierte Wirtszelle hergestellt wird, aber ein solches Enzym kann durch gängige Peptidsynthese-Techniken hergestellt werden.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft auch Verfahren zum Herstellen des Enzyms, welches durch das erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül kodiert wird, was das Kultivieren des erfindungsgemäßen transformierten Wirts in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung eines solchen Enzyms umfasst. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann der Begriff "geeignetes Kulturmedium" als das Medium definiert werden, welches einen solchen Wirt beim Exprimieren rekombinanter DNA-Moleküle, welche die erfindungsgemäße modifizierte Arginin-Deiminase kodieren, unterstützt. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass das geeignete Kulturmedium von der verwendeten Wirtszelle abhängen wird. Die Isolierung des so hergestellten Enzyms kann aus einem Kulturlysat des Wirts erreicht werden, oder wenn geeignet, direkt aus dem Kulturmedium des Wirts, und eine solche Isolierung wird durch gängige Proteinisolationstechniken durchgeführt.
  • Die DNA-kodierende Sequenz der erfindungsgemäßen modifizierten Arginin-Deiminase kann in einer transformierten Mycoplasma hominis-Wirtszelle exprimiert werden. Vorzugsweise ist die Mycoplasma hominis-Zelle Arginin-Deiminase defizient und benötigt daher eine Ergänzung. In solchen Systemen liegen Sequenzen, welche die modifizierte Arginin-Deiminase kodieren, typischerweise auf einem Vektor. Solche Vektoren enthalten eine ausreichende Menge bakterieller DNA, um den Vektor in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt zu vermehren. Ein solcher Vektor enthält ebenfalls eine ausreichende Menge Mycoplasma hominis-DNA, welche die Enzym kodierende Sequenz flankiert, um eine Rekombination zwischen einem Mycoplasma hominis-Wirt, welchem das Arginin-Deiminase-Gen fehlt, und dem heterologen modifizierten Arginin-Deiminase-Gen zu erlauben. Es soll vom Fachmann verstanden werden, dass es nicht wesentlich ist, einen Mycoplasma hominis-Wirt zu verwenden, welchem das modifizierte Arginin-Deiminase-Gen fehlt, aber dass die Abwesenheit des Gens in dem Wirt vor der Rekombination das Screenen und die Isolierung von rekombinanten Wirten, welche das Gen von Interesse aufgenommen haben, vereinfachen wird. Das rekombinante Mycoplasma hominis, welches aus einer solchen homologen Rekombination entsteht, kann anschließend durch Standardtechniken, wie sie dem Fachmann bekannt sind, selektiert werden.
  • Die erfindungsgemäße Arginin-Deiminase kann zur Behandlung von Krebs und/oder anderen Krankheitszuständen durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Eine therapeutisch wirksame Menge einer der erfindungsgemäßen Verbindungen ist eine Menge, welche beim Reduzieren des Auftretens des Krankheitszustands wirksam ist. Wenn der Krankheitszustand Krebs ist, kann eine therapeutisch wirksame Menge einer der erfindungsgemäßen Verbindungen eine Menge darstellen, welche wirksam ist, um ein Tumorwachstum zu inhibieren. Im Allgemeinen wird eine Behandlung mit kleinen Dosierungen begonnen, welche durch kleine Steigerungen erhöht werden können, bis die optimale Wirkung unter den Umständen erreicht ist. Im Allgemeinen kann eine therapeutische Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen von ungefähr 1 bis ungefähr 200 mg/kg zwei mal pro Woche bis ungefähr einmal alle zwei Wochen betragen. Zum Beispiel kann die Dosierung ungefähr 1 mg/kg einmal die Woche als eine 2 ml intravenöse Injektion bis ungefähr 20 mg/kg einmal alle drei Tage betragen. PEG-ADI kann mit einer Phosphat gepufferten Salzlösung oder irgendeiner anderen geeigneten Lösung, welche dem Fachmann bekannt ist, vor der Injektion gemischt werden. Die PEG-ADI-Formulierung kann als ein Feststoff (Lyophilisat) oder als eine flüssige Formulierung verabreicht werden, wie gewünscht.
  • Die Verfahren können entweder in vitro oder in vivo Anwendungen umfassen. Im Fall von in vitro Anwendungen, einschließlich von Zellkulturanwendungen, können die hier beschriebenen Verbindungen zu den Zellen in den Kulturen hinzugefügt und anschließend inkubiert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch verwendet werden, um die Herstellung von monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern unter Verwendung von Antikörper-Herstellungstechniken, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, zu unterstützen. Die monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörper können anschließend in einer weiten Vielzahl von diagnostischen Anwendungen verwendet werden, wie dem Fachmann offensichtlich sein würde.
  • Die in vivo-Mittel der Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden abhängig von der beabsichtigten Anwendung variieren. Wie der Fachmann erkennen wird, kann eine Verabreichung der erfindungsgemäßen PEG-ADI-Zusammensetzung zum Beispiel oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenös, intralymphatisch, intratumoral, intramuskulär, interstitiell, intraarteriell, subkutan, intraokular, intrasynovial, transepithelial und transdermal durchgeführt werden.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen dargestellt, welche für den Zweck der Darstellung sind und nicht beabsichtigen, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
  • Beispiel 1: Klonierung und Stellen- bzw. Seiten-gerichtete Mutagenese von ADI
  • Die Kulturen von Mycoplasma hominis (ATCC 23114) wurden von der American Type Culture, Bethesda, MD bezogen. Die DNA wurde extrahiert, und das Gen, welches die Arginin-Deiminase kodiert, wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion isoliert.
  • Das Arginin-Deiminase-Gen wurde in pGEM-t und den E. coli-Stamm JM101 subkloniert. Die Stellen-gerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung des Altered Sites II Kits (Promega, Madison, Wisconsin) durchgeführt.
  • Die modifizierte Arginin-Deiminase wurde in JM101-Zellen wie kürzlich von Takaku et al., supra beschrieben, exprimiert. Die modifizierte Arginin-Deiminase schloss Glutaminsäure an der Position 112 und Serin an der Position 210 ein. Die Aminosäuresequenz der modifizierten Arginin-Deiminase aus Mycoplasma hominis wird in 2 (Sequenz ID NR: 4) beschrieben.
  • Beispiel 2: Renaturierung und Reinigung von enzymatisch aktiver ADI
  • Die modifizierte Arginin-Deiminase (Sequenz ID NR: 4) wurde wie kürzlich von Takaku et al., supra beschrieben, isoliert und gereinigt. Es wurden jedoch mehrere Verbesserungen beobachtet. Tabelle 2. Renaturierung der Arginin-Deiminase
    Verbindung Zeit (°C) Verdünnungsverhältnis Ausbeute
    Arginin-Deiminase (Sequenz ID NR: 1) 90 Stunden (15°C) 1:200 70 mg/l
    modifizierte Arginin-Deiminase (Sequenz ID NR: 4) 6–12 Stunden (Raumtemp.) 1:50 500 mg/l
  • Wie in Tabelle 2 oben dargestellt, wurde die Renaturierung der modifizierten Arginin-Deiminase bei Raumtemperatur in ungefähr 6 bis 12 Stunden unter Verwendung eines Verdünnungsverhältnisses von 1:50 von Guanidiniumhydrochlorid-Einschlusskörpern in Puffer abgeschlossen. Im Gegensatz dazu berichteten Takaku et al., dass die Renaturierung 90 Stunden bei 15°C unter Verwendung eines Verdünnungsverhältnisses von 1:200 erforderte. Zusätzlich betrug die Ausbeute der modifizierten Arginin-Deiminase routinemäßig ungefähr 500 mg pro Liter Fermentation, während Takaku et al. Ausbeuten von ungefähr 70 mg pro l Fermentation berichteten.
  • Beispiel 3: Formulierung von modifizierter ADI mit PEG
  • Modifizierte Arginin-Deiminase (Sequenz ID NR: 4) wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von SS-PEG formuliert. Das Pegylierungsverfahren wurde für über 4 Stunden ungeprüft laufen gelassen, ohne dass die modifizierte Arginin-Deiminase inaktiviert wurde. Außerdem war es nicht nötig, das Pegylierungsverfahren durch das Hinzufügen von Glycin abzustoppen. Unter Bezugnahme auf Tabelle 3 wurden ungefähr 70–80% der enzymatischen Aktivität der modifizierten Arginin-Deiminase erhalten. Tabelle 3: Spezifische Enzymaktivität (IU/mg Protein)
    Ohne Pegylierung Pegyliert
    Wildtyp-ADI (Sequenz ID NR: 1) 20–21 5–8
    modifizierte ADI (Sequenz ID NR: 4) 20–21 12–16
  • Dies weist darauf hin, dass die modifizierte Arginin-Deiminase beständigere Formulierungen zulässt. Außerdem erlaubt die modifizierte Arginin-Deiminase ein Heraufsetzen des Maßstabs des Herstellungsverfahrens, verglichen mit der Wildtyp-Arginin-Deiminase.
  • Verschiedene erfindungsgemäße Modifikationen zusätzlich zu jenen, welche hier beschrieben wurden, werden dem Fachmann beim Betrachten der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen ebenfalls in den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00230001
    Figure 00240001
    Figure 00250001
    Figure 00260001
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    Figure 00290001

Claims (12)

  1. Eine aus Mycoplasma hominis isolierte Arginin-Deiminase, umfassend die Aminosäuresequenz nach Sequenz ID NR: 1, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren mindestens eines Lysins bei Rest 112, 374, 405 oder 408 von Sequenz ID NR: 1 modifiziert wurde.
  2. Arginin-Deiminase nach Anspruch 1, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren mindestens eines Lysins bei Rest 112, 374, 405 oder 408 von Sequenz ID NR: 1 durch Glutaminsäure, Valin, Asparaginsäure, Alanin, Isoleucin, oder Leucin modifiziert wurde.
  3. Arginin-Deiminase nach Anspruch 2, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren des Lysins bei Rest 112 von Sequenz ID NR: 1 durch Glutaminsäure, Valin, Asparaginsäure, Alanin, Isoleucin, oder Leucin modifiziert wurde.
  4. Arginin-Deiminase nach Anspruch 3, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren des Lysins bei Rest 112 von Sequenz ID NR: 1 durch Glutaminsäure modifiziert wurde.
  5. Arginin-Deiminase nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz von Sequenz ID NR: 2.
  6. Arginin-Deiminase nach Anspruch 1, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren des Prolins bei Rest 210 von Sequenz ID NR: 1 modifiziert wurde.
  7. Arginin-Deiminase nach Anspruch 6, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren des Prolins bei Rest 112 von Sequenz ID NR: 1 durch Serin, Threonin, Arginin, Asparagin, Glutamin, oder Methionin modifiziert wurde.
  8. Arginin-Deiminase nach Anspruch 7, wobei die Arginin-Deiminase durch Substituieren des Prolins bei Rest 112 von Sequenz ID NR: 1 durch Serin modifiziert wurde.
  9. Arginin-Deiminase nach Anspruch 6, welche eine Aminosäuresequenz umfassend Sequenz ID NR: 4 aufweist.
  10. Arginin-Deiminase nach Anspruch 1, welche kovalent an Polyethylenglycol gebunden ist.
  11. Arginin-Deiminase nach Anspruch 10, wobei die Arginin-Deiminase kovalent an das Polyethylenglycol über eine Verbindungsgruppe gebunden ist.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Arginin-Deiminase nach einem der vorherigen Ansprüche und mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE505201T1 (de) 2002-02-14 2011-04-15 Univ Leland Stanford Junior Enzymbehandlung von nahrungsmitteln für zöliakie- sprue
US8143210B2 (en) 2002-02-14 2012-03-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue
US7776545B2 (en) 2002-11-20 2010-08-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic method for Celiac Sprue
AU2003282883B2 (en) * 2002-11-18 2008-12-04 Polaris Group Methods for inhibiting viral replication in vivo
US7579313B2 (en) 2003-11-18 2009-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof
CN101002945B (zh) * 2006-01-20 2012-09-05 清华大学 一种用于肿瘤治疗的新型复合物
MX2009009780A (es) * 2007-03-16 2010-05-20 Univ Leland Stanford Junior Terapia de enzima de combinacion para la digestion de gluten dietetico.
WO2008115428A2 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University A scaleable manufacturing process for cysteine endoprotease b, isoform 2
EP2295560A1 (de) 2009-09-14 2011-03-16 RWTH Aachen University Zielgerichtete Evolution von Arginindeiminase zur erhöhten Aktivität im physiologischen pH
US10118754B2 (en) * 2011-11-22 2018-11-06 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method of folding pant-like disposable absorbent garments in a chute
US11123230B2 (en) * 2011-11-22 2021-09-21 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method of folding pant-like disposable absorbent garments in a chute
US9918881B2 (en) 2011-11-22 2018-03-20 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method of folding pant-like disposable absorbent garments in a trough
AU2012330497B2 (en) 2012-04-04 2016-08-04 Polaris Group Methods of treating with arginine deiminase
EP3744341A1 (de) * 2013-03-15 2020-12-02 TDW Group Arginin-deiminase mit verminderter kreuzreaktivität gegenüber adi-peg-20-antikörpern zur krebsbehandlung
TWI676683B (zh) * 2014-03-14 2019-11-11 開曼群島商瑞華藥業集團 用於癌症治療之對ａｄｉ－ｐｅｇ２０抗體交叉反應性降低之精胺酸去亞胺酶
WO2015143006A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Tdw Group Engineered chimeric pegylated adi and methods of use
CN114522225A (zh) 2014-09-16 2022-05-24 瑞华药业集团 用于癌症治疗的对adi-peg20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶
CN104726478A (zh) * 2015-03-09 2015-06-24 武汉远大弘元股份有限公司 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用
US10435682B2 (en) 2016-02-19 2019-10-08 University Of South Florida Arginine deiminase gene therapy for disordered proteins
CN108265044B (zh) * 2016-12-31 2021-05-11 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用
CN112442496B (zh) * 2019-08-28 2023-05-12 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
JP2900279B2 (ja) 1989-08-02 1999-06-02 株式会社ジャパンエナジー 新規なアルギニンデイミナーゼ、その製造法及び該酵素を有効成分とする制癌剤
JP2736145B2 (ja) 1990-01-11 1998-04-02 関東電化工業株式会社 パーハロゲン化エチレンの製造法
JP3209338B2 (ja) 1990-09-10 2001-09-17 株式会社ジャパンエナジー ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法
US5372942A (en) 1992-02-10 1994-12-13 Coriell Institute For Medical Research Protease K resistant arginine deiminase, its method of preparation and its use as an anti-neoplastic agent
US5804183A (en) 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
CN1246891A (zh) * 1997-02-06 2000-03-08 诺沃挪第克公司 添加和/或除去了连接基团的多肽－聚合物偶联物
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US6180387B1 (en) 1997-08-11 2001-01-30 Smithkline Beecham Corporation Arginine deiminase

Also Published As

Publication number Publication date
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