DE3851225T2

DE3851225T2 - Blutersatz.

Info

Publication number: DE3851225T2
Application number: DE3851225T
Authority: DE
Inventors: Stephen Hoffman; Kiyoshi Nagai
Original assignee: Medical Research Council; Somatogenetics International Inc
Current assignee: Baxter Biotech Technology SARL
Priority date: 1987-05-16
Filing date: 1988-05-13
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2008-05-14
Also published as: AU614525B2; SG26593G; WO1988009179A1; EP0358708A1; EP0358708B1; ATE110276T1; DE3851225D1; CA1341286C; AU1796788A; EP0358708A4; JPH02503509A; GB8711614D0; HU211989A9; GB2234749B; GB8925769D0; JP3034529B2; US5028588A; GB2234749A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Zubereitungen zur Unterstützung der Sauerstofftransportkapazität im Blut eines Patienten
Es ist nicht immer zweckmäßig, einem Patienten Transfusionen mit Spenderblut zu verabreichen. In diesen Situationen muß ein Ersatz für die roten Blutkörperchen eingesetzt werden. Das Produkt muß, gerade so wie es rote Blutkörperchen tun, effizient O&sub2; transportieren. ("Plasmaexpander" wie Dextran oder Albumin transportieren keinen Sauerstoff.) Die bislang am intensivsten untersuchten beiden Typen von Ersatzstoffen sind Hämoglobinlösungen und Fluorkohlenwasserstoffemulsionen.
Hämoglobin (Hb) ist der sauerstofftransportierende Bestandteil des Blutes. Hämoglobin zirkuliert im Blutstrom eingeschlossen in kleine, kernlose Zellen, die Erythrozyten (rote Blutkörperchen) genannt werden. Hb ist ein aus vier miteinander assoziierten Polypeptidketten aufgebautes Protein, welches als Häme bekannte, prosthetische Gruppen trägt. Die Erythrozyten helfen dabei, das Hämoglobin in seiner funktionsfähigen, reduzierten Form zu halten. Das Hämeisenatom neigt zur Oxidation, kann aber mit Hilfe von einem oder zwei Enzymsystemen im Erythrozyten, dem Cytochrom b&sub5;- und dem Glutathionreduktionssystem, wieder reduziert werden.
Hämoglobin zeigt eine kooperative Bindung von Sauerstoff durch die vier Untereinheiten des Hämoglobinmoleküls (zwei α-Globine und zwei β-Globine im Fall von HbA), wobei diese Kooperativität den effizienten Sauerstofftransport sehr erleichtert. Die durch die sogenannte Häm-Häm-Wechselwirkung erzielte Kooperativität gestattet es dem Hämoglobin, seine Affinität für Sauerstoff zu variieren. Hämoglobin bindet reversibel bis zu vier Mol Sauerstoff pro Mol Hb. Bei hohen Sauerstoffkonzentrationen, wie in der Lunge, ist seine Sauerstoffaffinität hoch und das Hämoglobin ist nahezu mit Sauerstoff gesättigt. Bei nur geringen Sauerstoffkonzentrationen, wie bei den in aktiv atmendem Gewebe gefundenen, ist die Sauerstoffaffinität gesenkt und Sauerstoff wird abgegeben.
Sauerstofftragende Verbindungen werden oft mit Hilfe einer Einrichtung, die als Sauerstoffdissoziationskurve bekannt ist, miteinander verglichen. Diese Kurve wird erhalten, wenn für einen gegebenen Sauerstoffträger die Sauerstoffsättigung gegen den Sauerstoffpartialdruck aufgetragen wird. Die prozentuale Sättigung steigt mit dem Partialdruck an, wobei sie einer sigmoiden Beziehung folgt. Der P&sub5;&sub0; ist derjenige Partialdruck, bei dem die sauerstofftransportierende Lösung halb mit Sauerstoff gesättigt ist. Er stellt somit ein Maß für die Sauerstoffbindungsaffinität dar; je höher der P&sub5;&sub0;, desto lockerer wird der Sauerstoff gebunden.
Wenn die Sauerstoffdissoziationskurve einer sauerstofftransportierenden Lösung so verläuft, daß der P&sub5;&sub0; kleiner als der von Vollblut ist, wird sie als nach "links verschoben" bezeichnet.
Die Sauerstoffaffinität von Hämoglobin wird durch Anwesenheit von 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG) sowie von Chlorid- und Wasserstoffionen gesenkt. Atmendes Gewebe setzt Kohlendioxid ins Blut frei und erniedrigt dessen pH (d. h. es erhöht die Konzentration an Wasserstoffionen); dadurch wird die Dissoziation des Sauerstoffes vom Hämoglobin verursacht und ermöglicht, daß dieser in die einzelnen Zellen diffundieren kann.
Die Fähigkeit des Hämoglobin, seine Sauerstoffaffinität zu verändern, welche die Effizienz des Sauerstofftransportes im Körper erhöht, hängt vom Vorhandensein des Metaboliten 2,3-BPG ab. Innerhalb der Erythrozyten liegt 2,3-BPG in einer Konzentration vor, die nahezu so hoch ist wie diejenige des Hämoglobins selbst. In Abwesenheit von 2,3-BPG bindet "normales" Hämoglobin Sauerstoff sehr fest und würde wenig Sauerstoff an das atmende Gewebe abgeben.
Alternde Erythrozyten entlassen kleine Mengen freien Hämoglobins in das Blutplasma, wo es schnell von dem auffangenden Protein Haptoglobin gebunden wird. Der Hämoglobin-Haptoglobinkomplex wird aus dem Blut entfernt und von Milz und Leber abgebaut.
Aus den obigen Betrachtungen ist ersichtlich, daß direkt in den Blutstrom injiziertes, freies Hämoglobin einen effizienten Sauerstofftransport im Körper nicht unterstützen würde. Der essentielle, allosterische Regulator 2,3-BPG liegt im Blutplasma nicht in ausreichender Konzentration vor, um bei venöser Sauerstoffspannung dem Hämoglobin die Abgabe von viel Sauerstoff zu ermöglichen, und freies Hämoglobin würde als Sauerstofftransporteur durch die Eigenoxidation des Hämeisens schnell inaktiviert.
Nichtsdestotrotz sind Lösungen normalen Hämoglobins als Ersatz für rote Blutkörperchen verwendet worden. Das klassische Verfahren zur Herstellung von Hämoglobinlösungen verwendet Blut mit abgelaufenem Haltbarkeitsdatum. Die roten Blutkörperchen werden lysiert und die Zelltrümmer entfernt, wobei das zurückbleibt, was hoffnungsvoll "stroma-freies Hämoglobin" (SFH) genannt wird.
Bei diesem Versuch sind zahlreiche, grundsätzliche Probleme beobachtet worden. Die Lösung muß von jeglichen toxischen Bestandteilen der Erythrozytenmembran befreit werden, ohne zu zu mühsamen und aufwendigen Verfahren Zuflucht zu nehmen, die von der Herstellung in großem Maßstab abhalten würden; DeVenuto, "Appraisal of Hemoglobin Solution as Blood Substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics, 149, 5.417-436 (1979).
Zweitens sind solche Lösungen, wie erwartet, im Vergleich mit Vollblut nach "links verschoben" (verringerter P&sub5;&sub0;); Gould et al., "The Development of Polymerized Pyridoxylated Hemoglobin Solution as a Red Blood Cell Substitute", Ann. Emerg. Med., 15, S. 1416-1419 (Dez. 1986).
Drittens hat das SFH in der Blutzirkulation lediglich eine Lebenshalbwertszeit von etwa 2-4 Stunden. Dies beruht darauf, daß das oxyHb teilweise zu einem Dimer dissoziiert, welches klein genug ist, um von der Niere ausfiltriert zu werden.
Schließlich weist das SFH einen hohen kolloidosmotischen Druck (COP) auf. Daher ist eine Gabe von SFH in einer Dosis, welche dieselbe Sauerstofftransportkapazität wie eine Einheit von Erythrozyten in Rollen aufweisen würde, nicht ratsam, da der hohe osmotische Druck einen massiven Einstrom von Wasser aus den Zellen in den Blutstrom verursachen würde, wodurch das Gewebe des Patienten dehydriert würde. Diese Überlegungen begrenzen die Dosierung von SFH auf etwa 6-8 g Hb/dl.
Bei einem Versuch, den gewünschten P&sub5;&sub0; wiederherzustellen, fügten die Forscher der Hämoglobinlösung 2,3-BPG hinzu. Leider wurde das 2,3-BPG schnell aus der Zirkulation entfernt. Die Wissenschaffler gingen anschließend auf andere anorganische Phosphate, insbesondere Pyridoxalphosphat, über. Wie auch 2,3-BPG stabilisieren diese Verbindungen den "T-Zustand" des Hb, indem sie Salzbrücken zwischen den N-terminalen Enden beider β-Ketten bilden. Das pyridoxylierte Hämoglobin weist im Vergleich mit 10 Torr für SFH und 28 Torr für Vollblut einen P&sub5;&sub0; von 20-22 Torr auf. Obwohl dies eine Verbesserung gegenüber SFH darstellt, bleibt das pyridoxylierte Hb relativ zu Vollblut "hoch affin".
Hämoglobin ist chemisch modifiziert worden (durch intra- und intermolekulares Quervernetzen), um seine Verweilzeit in den Gefäßen zu steigern und den osmotischen Druck zu senken. Leider verursacht die Polymerisation außerdem eine Verschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve des Moleküls "nach links". Der P&sub5;&sub0; des pyridoxylierten, polymerisierten Hb liegt infolgedessen bei ungefähr 18 Torr.
Zu den chemischen Modifikationen vergleiche:
Iwashita, US-A-4 412 989 und 4 301144 (mit Polyalkylenglykol);
Iwasaki, US-A-4 670 417 (mit Polyalkylenoxid), (mit Polysaccharid);
Nicolau, US-A-4 321 259 und 4 473 563 (mit Inositolphosphat);
Wong, US-A-4 710 488 und 4 650 786 (mit Inositolphosphat und einem Polysaccharid); Bonhard, US-A-4 336 248 ( mit anderen Proteinen oder Gelatinederivaten);
Walder, US-A-4 598 064 und 4 600 531 (intramolekulär quervernetztes Hämoglobin)
und Ajisaka, US-A-4 377 512 (mit Inulin).
Die menschlichen α- und β-Globingene sind sowohl kloniert als auch sequenziert worden; Liebhaber et al., P.N.A.S. (USA) 77, S.7054-58 (1980) (genomische DNA des α-Globins); Marotta et al., J.Biol. Chem. 252, S. 5040-53 (1977) (β-Globin cDNA).
Nagai und Thorgerson (Nature 309 : 810-812, 1984) exprimierten ein Hybridprotein in E.Coli, welches aus den 31 aminoterminalen Resten des Lambda cII-Proteins, einem Linker aus Ile-Glu-Gly-Arg und der vollständigen Kette des Humanβ-Globins bestand. Sie spalteten das Hybridprotein mit dem Blutgerinnungsfaktor Xa am einzigen Arginin und setzten so die β-Kette frei.
Später nahmen Nagai et al., P.N.A.S. (USA) 82, S. 7252-55 (1985) das von der rDNA abgeleitete Human-β-Globin, ein natürliches Human-α-Globin sowie eine Hämquelle und konnten erfolgreich aktives menschliches Hämoglobin herstellen. Weiterhin stellten sie zwei semiartifizielle Analoga der in der Natur auftretenden Hämoglobinmutanten Hb Nympheas und Hb Daphne mit Hilfe der spezifischen Mutagenese (site directed mutagenesis) des klonierten β-Globingenes, der Expression des modifizierten Gens und der Kombination der von der rDNA abgeleiteten β-Kette mit der natürlichen α-Kette und einer Hämquelle her. Wie die natürlich auftretenden Mutanten wiesen diese semiartifiziellen Analoga eine im Vergleich mit "normalem" Hämoglobin erhöhte Sauerstoffaffinität auf. In anschließenden Untersuchungen wurde die strukturelle Ursache für die Veränderungen bei der Sauerstoffbindung festgestellt; Luisi und Nagai, Nature 320, S. 555-556 (1986) sowie Nagai et al., Nature 329, S. 858-60 (Okt. 1987) (gleichzeitig auch Herstellung von Hämoglobinmutanten durch Austausch von Val(67
Bezugszeichenliste
)E1 1).
Überraschenderweise ist bisher nichts über die Expression des menschlichen α-Globingenes in heterologen Zellen bekannt geworden. Tatsächlich führt der Ersatz des β-Globingenes durch das α-Globingen im E. Coli-Expressionssystem von Nagai et al. zu vernachlässigbar geringer Expression des Lambda cII-Protein/β-Globin-Fusionsproduktes. Anscheinend ist die mRNA-Sequenz des nativen α-Globins mit einer Eigenschaft behaftet, welche die effiziente Translation in einem Wirtsbakterium stört.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines zellfreien, mutierten Hämoglobins zur Herstellung einer nicht-toxischen Zubereitung zur Verabreichung an einen Patienten, um die Sauerstofftransportfähigkeit seines Blutes zu unterstützen, zur Verfügung.
Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, daß die Nachteile von Hämoglobinlösungen als Blutersatz dadurch überwunden werden können, daß eine mutierte Hämoglobinspezies ausgewählt wird, die in einer typischen zellfreien Blutersatzlösung dieser Lösung einen P&sub5;&sub0; verleiht, der demjenigen von nichtmutiertem Hämoglobin in, in den roten Blutkörperchen gebundenem Zustand, vergleichbar ist. In der Natur auftretende Hämoglobinmutanten, welche in der Umgebung des Erythrozyten diesem einen höheren P&sub5;&sub0; als dem normalen Wert für Vollblut (28 Torr) verleihen würden, sind von besonderem Interesse, sowohl aus ihrer eigenen Berechtigung heraus als auch in bezug auf die Tatsachen, die sie über die strukturellen Grundlagen der Sauerstoffaffinität erkennen lassen. Es ist anzunehmen, daß viele solcher "nach rechts" verschobenen Spezies außerhalb der Umgebung des Erythrozyten (und damit außerhalb des "nach rechts verschiebenden" Einflusses von 2,3-BPG), einen P&sub5;&sub0; annehmen, der vergleichbar mit oder größer als der normale P&sub5;&sub0; für Vollblut ist.
Im Rahmen der Erfindung wird unter dem Ausdruck "übliches Hämoglobin A" diejenige Spezies von HbA verstanden, deren α- und β-Ketten die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz haben. Diese entspricht der Spezies, welche am häufigsten in menschlichen Erythrozyten gefunden wird und die diesen Erythrozyten einen P&sub5;&sub0; von ungefahr 28 Torr verleiht. Als "Hämoglobin A-Mutante" wird jede Spezies des Hämoglobin A definiert, deren α- oder β-Kette eine andere als die in Abbildung 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. Eine Hämoglobin A-Mutante "niedriger Affinität" ist eine Mutante, welche einen mindestens 10% höheren P&sub5;&sub0; als das "übliche Hämoglobin A" in derselben Umgebung aufweist. Ein P&sub5;&sub0;, der in Abwesenheit von 2,3-BPG mindestens das Doppelte des P&sub5;&sub0; von üblichem (Wildtyp) Hämoglobin A beträgt, ist besonders erstrebenswert. Ein "rekombinantes" Hämoglobin ist ein Hämoglobin, welches aus einem α-Globin und einem β-Globin zusammengesetzt ist, von denen mindestens eines mittels Expression eines von einem rekombinanten DNA-Molekül getragenen Globingenes erhalten wird, unabhängig davon, ob das Hämoglobin ein übliches Hämoglobin ist oder einer mutierten Spezies angehört.
Es ist eine große Anzahl natürlich auftretender HbA-Mutanten niedriger Affinität bekannt (vgl. Tabelle 1). Die Mutationen können sowohl in der α- als auch in der β- Kette des Moleküls (oder natürlich auch in beiden) auftreten. So ist das Hb Hazebrouck eine β-Mutante (38(C4): Thr → Pro)), deren P&sub5;&sub0; 36 beträgt (in Vollblut), wobei der P&sub5;&sub0; in vitro auf 27-29 Torr absinkt.
Um eine adäquate Versorgung mit diesen Mutanten niedriger Affinität bereitzustellen, kann man offensichtlich nicht auf die Natur angewiesen sein. Infolgedessen wird man die mutierten Polypeptidketten üblicherweise synthetisch hergestellen, entweder mittels direkter Polypeptidsynthese oder bevorzugt mittels in vivo Expression des entsprechenden, mutierten Genes in einer geeigneten Wirtszelle. Dieses Gen kann direkt aus dem Genom einer mutierten Erythrozytenvorläuferzelle (ein ausgereifter Erythrozyt enthält keine DNA), aus komplementären DNA (cDNA), die aus der mRNA der mutierten Erythrozytenvorläuferzelle transcribiert wurde, mit Hilfe direkter Polynukleotidsynthese oder vorzugsweise mit Hilfe der in vitro Mutagenese des das übliche Hämoglobin kodierenden Genes erhalten werden.
Ist eine der Ketten mit derjenigen des "üblichen" Hämoglobins identisch, kann sie entweder natürlich oder synthetisch erhalten werden. Zur Erzeugung des funktionsfähigen Hämoglobinmoleküls ist es außerdem erforderlich, die prosthetischen Hämgruppen zur Verfügung zu stellen und die α- und β-Ketten miteinander zu verbinden.
In den Schutzbereich der Erfindung wird auch die Herstellung und Verwendung nicht in der Natur auftretender Mutanten niedriger Affinität durch geeignete Modifikation und Expression der α- und β-Globingene und anschließendes Zusammensetzen eines rekombinanten Hämoglobins miteinbezogen. Verfahren zur Auswahl geeigneter Sequenzen als Kandidaten und die Bewertung ihrer Brauchbarkeit zur Verwendung in einem Blutersatzprodukt sind nachstehend beschrieben.
Wir haben auch entdeckt, daß ein menschliches α-Globin aus einem Wirtsbakterium erhalten werden kann, indem man (1) ein Fusionsgen konstruiert, welches nicht nur das α-Globingen, sondern auch mindestens einen Teil des β-Globingenes enthält, wobei diese durch einen DNA-Linker, welcher eine Schnittstelle für eine selektive Protease kodiert, getrennt sind, (2) das Fusionsgen in Form des Fusionsproteins exprimiert und (3) das Fusionsprotein an der oben genannten Schnittstelle spaltet, um das menschliche α-Globin freizusetzen.
Ein Ergebnis dieser Entdeckung ist die Möglichkeit, ein vollständig artifizielles Humannämoglobin, d. h. ein Hämoglobin, bei dem sowohl die α-Kette als auch die β- Kette in anderen Zellen als menschlichen Erythrozyten gebildet werden, herzustellen. Ein solches artifizielles Hämoglobin ist für die Verwendung in Blutersatzlösungen ideal.
Selbstverständlich können semiartifizielle Hämoglobine (eine Kette wurde aus einer Nichterythrozytenquelle erhalten) dennoch verwendet werden.
Wenn extrahiertes, natürliches Hämoglobin als Blutersatz verwendet wird, muß die Toxizität der Bestandteile der Erythrozytenmembran, die das Produkt kontaminieren können, berücksichtigt werden. Es ist bekannt, daß das Erythrozytenstroma Atemstörungen (Dyspnoe), Bronchospasmen, Hypotonie, Arrythinien, verstreute intravasculäre Koagulation, die Aktivierung des Komplementsystems sowie Veränderungen an Niere, Myocard und Leber, die mit Ischämie und akuten Entzündungen assoziiert sind, verursachen kann; vgl. Feola, Surgery, Gynecology & Obstetrics, 166, S. 21 1-222 (März 1988); MacDonald et al., F.A.S.E.B. J. 2(6), Abstr. 8217 (1988); Stone et al., Surgery, Gynecvology & Obstetrics, 149, S. 874-76 (1979); Rabiner et al., J.Exp.Med. 126, S. 1127-42 (1967). Obwohl gereinigte Präparationen von natürlichem Hämoglobin bekannt sind (das sogenannte "stroma-freie Hämoglobin"), meint Feola dazu, daß "eine wirklich reine Hämoglobinlösung noch nicht hergestellt worden ist."
Ein weiteres Problem bei natürlichem Hämoglobin stellen die über das Blut übertragenen infektiösen Agenzien dar. Bove, Progr. Hematol., 14, S. 123-45 (1986), beschreibt, daß Hepatitisviren, der Cytomegalovirus, das Epstein-Barr-Virus, Serumparvoviren, Syphilis, Malaria, Filariasis, Trypanosomiasis, Babesiosis sowie zahlreiche infektiöse Bakterien und AIDS alle durch Bluttransfusionen übertragen werden. MDS ist sogar durch Bluttransfusionen übertragen worden, die mit negativem Ergebnis auf HW- Antikörper getestet wurden (Ward et al., New Engl.J.Med. 318, S. 473-78 (1988)).
Das erfindungsgemäße α-Globin kann in bezug auf die Sequenz mit dem natürlichen normalen Human-α-Globin oder einer natürlich auftretenden Hämoglobinmutante identisch sein oder es kann eine α-Globinmutante sein, die in der Natur unbekannt ist.
Mutierte Hämoglobine, sowohl mit verringerter als auch mit erhöhter Sauerstoffaffinität, können für die Veränderung von O&sub2;-Konzentrationen in Zellkulturen oder für die Extraktion von O&sub2; aus Fluiden wertvoll sein.
Die beigefügten Ansprüche werden hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung zur Angabe der bevorzugten Ausführungsformen eingeschlossen.
Abbildung 1 stellt die Aminosäuresequenz (a) der α-Kette und (b) der β-Kette des üblichen Humanhämoglobins A sowie die diese Ketten kodierenden Nukleotidsequenzen dar.
Abbildung 2 zeigt ausgewählte DNA-Sequenzen und Karten der Schnittstellen von Restriktionsenzymen von (a) M13 mp1 IFX, (b) pLcIIFXβ und pLcIIβ sowie (c) pLcIIFXβFXα. Es ist anzumerken, daß pLcIIFXα dasjenige Codon fehlt, welches für β His 2 in Abbildung 2(b) kodiert.
Abbildung 3 zeigt eine Kurve der Sauerstoffgleichgewichtsbindung für artifizielles, übliches Humanhämoglobin und für das mutierte Humanhämoglobin, das die Struktur von Hb Kansas hat.
Bei Ausführung der Erfindung kann die Erfindung angewandt werden, die in unserer parallelen Anmeldung EP 93 103 633.9 beschrieben und beansprucht ist, welche die Klonierung und Expression eines exogenen α-Globingenes in einem geeigneten Wirt beschreibt und beansprucht. Der Wirt kann eine procaryotische Zelle (wie E.Coli) oder eine eucaryotische Zelle (wie eine Hefe- oder eine Säugerzelle) sein. Das α-Globingen wird üblicherweise bei der Expression ein Polypeptid kodieren, welches einem natürlich auftretenden Human-α-Globin, normal oder nicht normal, entspricht, kann aber auch einem nichtmenschlichen α-Globin oder tatsächlich einem nicht in der Natur vorkommenden Analogon eines bekannten α-Globins entsprechen. Vorzugsweise wird ein mutiertes α-Globin hergestellt und zu einer Hämoglobinmutante niedriger Affinität zur Verwendung in einer Blutersatzzubereitung zusammengesetzt.
Das α-Globingen wird als Teil eines Fusionsgenes exprimiert, welches bei der Expression gleichzeitig mindestens einen Teil des β-Globingens kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die α- und β-Globinsequenzen durch eine Spacer- DNA voreinandergetrennt, die eine Schnittstelle einer selektiven Protease kodiert, insbesondere eine Schnittstelle, die durch den Faktor Xa spezifisch gespalten werden kann.
Vorzugsweise schließt das obige Fusionsgen eine Teilsequenz ein, die bei der Expression die 20 aminoterminalen Aminosäuren des β-Globins kodiert.
Wie schon oben angemerkt, wird das α-Globin vorteilhafterweise mit einem von einer rDNA abgeleiteten β-Globin und einer Hämquelle vereint, um ein gänzlich artifizielles Hämoglobin zu erhalten (dieses stammt vollständig aus anderen Quellen als Blut). Solche Hämoglobine und insbesondere Hämoglobinmutanten mit niedriger Sauerstoffaffinität, die mit Hilfe des Einsatzes von selektiv modifizierten α- und/oder β- Globingenen hergestellt wurden, sind als Blutersatz wertvoll. Semiartifizielle Hämoglobine, in denen nur die Kette, die aus einer Nichterythrozytenquelle erhalten wurde, eine mutierte Sequenz aufweist und bei denen die Mutation dem Molekül eine verringerte Sauerstoffaffinität verleiht, werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt und können genauso als Blutersatzprodukte verwendet werden. Solange nichts anderes angemerkt ist, erfaßt der Ausdruck "artifiziell" sowohl die vollständige als auch die semiartifizielle Form.
Um mögliche Strategien zum Design von α- oder β-Hämoglobinutanten niedriger Affinität zur Verwendung als Blutersatz zu entwickeln, ist es erforderlich, die Struktur des Hämoglobinmoleküls zu verstehen.
Die Struktur des üblichen Hämoglobins ist gut bekannt. Der gesamten Text von Bunn und Forget, als Herausgeber, Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects (W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA: 1986) sowie von Fermi und Perutz, "Hemoglobin and Myoglobin", in Phillips and Richards, Atlas of Molecular Structures in Biology (Clarendon Press: 1981) wird hiermit als Referenz eingeschlossen.
Die Primärstruktur eines Polypeptids wird durch seine Aminosäuresequenz und durch Identifizierung jeder Modifikation der Seitenketten der einzelnen Aminosäuren definiert.
Ungefahr 92% des Hämolysates eines normalen erwachsenen Menschen besteht aus HbA (bezeichnet mit α2 β2, da es zwei α- und zwei β-Ketten umfaßt). Die α-Kette besteht aus 141 Aminosäuren (vgl. Abbildung 1). Das Eisenatom der Hämgruppe (Ferroprotoporphyrin IX) ist covalent an das Imidazol von His 87 (dem "proximalen Histidin") gebunden. Die β-Kette ist 146 Reste lang (vgl. Abbildung 1) und das Häm ist über das His 92 an sie gebunden.
Andere bekannte Hämoglobinspezies sind HbA&sub2;, HbA1a, HbA1b und HbA1csowie die seltenen Spezies HbF, HbF&sub1;, Hb Gower-1, Hb Gower-2, Hb Portland, HbH und Hb Bart. Sie unterscheiden sich von HbA durch eine andere Auswahl der Polypeptidketten.
Segmente von Polypeptidketten können durch Faltung in eine von zwei üblichen Konformationen, die α-Helix und das β-Faltblatt, stabilisiert werden. Diese Faltung ist als Sekundärstruktur bekannt. In nativem Zustand liegen ungefahr 75% des Hämoglobinmoleküls in Form der α-Helix vor. Die α-helikalen Segmente sind durch Segmente voneinander getrennt, in denen die Kette weniger geordnet ist. Der Konvention entsprechend werden die α-helikalen Segmente jeder Kette mit Hilfe von Buchstaben identifiziert, z. B. ist das proximale Histidin der α-Kette F8 (Rest 8 der Helix F). Die nichthelikalen Segmente werden mit Hilfe von Buchstabenpaaren identifiziert, die anzeigen, mit welchen Segmenten sie in Berührung stehen. So liegt das nichthelikale Segment BC zwischen Helix B und Helix C. Beim Vergleich zweier Varianten einer speziellen Hämoglobinkette kann der Ansatz erhellend sein, die Helixsegmente bei der Suche von Strukturhomologien nebeneinander zu legen. In bezug auf die Aminosäuresequenz und die Benennung der helikalen Reste der üblichen Hämoglobin Ao α- und β- Ketten vergleiche Tabelle 4.
Die Tertiärstruktur des Hämoglobinmoleküls betrifft die sterischen Beziehungen der Aminosäurereste, die in der linearen Sequenz weit voneinander entfernt sind, während die Quartärstruktur die Art und Weise betrifft, in der die Untereinheiten (Ketten) zusammengepackt sind. Die Tertiär- und die Quartärstruktur des Hämoglobinmoleküls sind mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse von Hämoglobinkristallen untersucht worden, wodurch man die Position eines jeden Atoms im dreidimensionalen Raum berechnen kann.
In seiner nichtoxygenierten ("desoxy" oder "T" für "geschlossen") Form bilden die Hämoglobinuntereinheiten (α1, α2, β1 und β2) einen Tetraeder mit einer doppelten Symmetrieachse. Diese Achse verläuft durch einen mit Wasser gefüllten zentralen Hohlraum". Die Untereinheiten interagieren über van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen (sowie über Salzbrücken im Fall von Desoxyhämoglobin). Die α1β1- und α2β2-Grenzflächen bleiben bei der Oxygenierung relativ unverändert. Im Gegensatz dazu besteht eine relative Beweglichkeit an der α1β2- (und der α2β1-) Grenzfläche. Im oxygenierten Zustand ("oxy" oder "R" für "entspannt") sind die Abstände zwischen den Untereinheiten vergrößert.
Die Desoxykonformation wird durch zahlreiche Wechselwirkungen stabilisiert, die beispielsweise die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Tyr 42 α und Asp 99 β einschließen im oxygenierten Zustand wird diese Bindung gebrochen und eine neue Zahlreiche verschiedene Ansätze der Modifikation von Hämoglobin können angewandt werden. In jedem Fall wird eine Mutante als Kandidat ausgewählt, von der auf Basis der verfügbaren Kenntnisse angenommen wird, daß sie eine geringere Affinität für Sauerstoff hat als übliches Hämoglobin.
Bei dieser Auswahl können nicht nur die bekannten Auswirkungen verschiedener Mutationen des Humanhämoglobins, sondern auch die Sauerstoffbindungskapazitäten bekannter Formen von tierischem Hämoglobin und verwandter Verbindungen wie Carboxyhämoglobin, Methämoglobin, Myoglobin usw. berücksichtigt werden.

Mutanten der α-Kette

Dank unseres Erfolges bei der Überwindung der Probleme in Zusammenhang mit der Expression des α-Globingenes in einem heterologen System ist es nun möglich, auf bequeme Weise α-Globinmutanten herzustellen.
Zahlreiche Mutanten der Hämoglobin-α-Kette mit niedriger Sauerstoffaffinität sind bereits bekannt. Davon sind Hb Titusville (α94 Asp → Asn), Hb Setif (α94 Asp → Tyr), Hb Torino (α43 Phe → Val), Hb Hirosaki (α43 Phe → Val) und Hb Moabit (α86 Leu → Arg) besonders interessant.
α-Globine werden leichter oxidiert als β-Globine, da die Bindung des His (F8) an O&sub2; auf der α-Kette etwas stärker ist als auf der β-Kette, so daß leichter ein Elektron durch den Sauerstoff verloren geht. α-Globine könnten, beispielsweise durch den Austausch α43 His → Gln oder Val, modifiziert werden, um sie weniger leicht oxidierbar zu machen.
Chloridionen binden durch Brückenbildung zwischen dem N-terminalen NH&sub3;+ und der Hydroxylgruppe des α131 Ser an die α-Kette. Die Auswirkung der Chloridbindung ist eine leichte Erhöhung des P&sub5;&sub0;. Es wird angenommen, daß durch einen Austausch von α131 in Glu, Asp oder Asn dieselbe Wirkung ohne den Rückgriff auf Chlorid erzielen werden könnte. Alternativ dazu könnte der pK, des N-Terminus erhöht werden. Der natürliche Human-N-Terminus ist Valin mit einem pKa von 9,72. Dieses könnte durch Ile (9,76), Pro (10,60) oder Thr (10,43) ersetzt werden.
Es werden im folgenden β-Globinmutanten sowie außerdem α-Globinmutanten, die vermutlich eine verringerte Sauerstoffaffinität verleihen, diskutiert.
Stabilizierung des T-Zustandes
Es ist nicht möglich, die Plasmakonzentration an 2,3-BPG in ausreichender Weise zu erhöhen, um die Sauerstofftransporteffizienz von freiem üblichen Hämoglobin im Blut zu maximieren. Dieses Problem kann über die Stabilisierung des T-Zustandes mit zusätzlichen, mit Hilfe der Proteintechnologie eingeführten Salzbrücken oder Wasserstoffbrückenbindungen überwunden werden. Die Quervernetzung des Hämoglobins selbst kann in gewissem Ausmaß den T-Zustand stabilisieren.
Wasserstoffbrückenbindungen sowie ionische Salzbrücken sind die vorherrschenden, stabilisierenden Kräfte auf der Oberfläche von Proteinen. Wasserstoffbrückenbindungen sind schwache, nichtionische Bindungen, die zwischen elektionegativen Atomen (z. B. Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel) und kovalent an andere elektronegative Atome gebundenen Protonen gebildet werden. Einzelne Wasserstoffbrückenbindungen sind schwach; in einem Protein existieren jedoch Hunderte bis Tausende von Wasserstoffbrücken, die zusammengenommen eine starke, stabilisierende Kraft darstellen. Ein Beispiel einer für die Hämoglobinstruktur wichtigen Wasserstoffbrücke ist die zwischen α Asp 94 und β Asn 102 im oxy-Zustand gebildete Brücke. Wird einer dieser Reste zu einem Rest mutiert, der diese Wasserstoffbrücke nicht mehr ausbilden kann, wird der oxy-Zustand destabilisiert; das Molekül hat eine stark verringerte O&sub2;-Affinität. Die Hämoglobine Hb Kansas (β Thr 102), Hb Beth Israel (β Ser 102), Hb Richmond (β Lys 102), Hb St.Mande (β Tyr 102), Hb Titusville (α Asn 94) und Setif (α Tyr 102) stellen jeweils Beispiele für die Bedeutung dieser Wasserstoffbrückenbindung dar. Andere nicht natürliche Mutanten, die vermutlich dieselbe Wirkung erzielen, sind β Asp 102, β Glu 102, β Arg 102, β His 102, β Gly 102, und β Cys 102 sowie α Gln94, α Thr 94, α Ser 94, α Lys 94, α Gly 94 und α Arg 94.
Ionische Wechselwirkungen sind zwischen benachbarten Resten mit entgegengesetzter Ladung gebildete Salzbrücken. Diese Wechselwirkungen sind pro Mol viel stärker als es Wasserstoffbrückenbindungen pro Mol sind. Ein Beispiel für die Anziehung ungleicher Ladungen wäre die Wechselwirkung zwischen einem Lys und einem Asp-Rest; bei physiologischem pH sind beide Reste geladen (positiv bzw. negativ). Die Abstoßung zwischen zwei benachbarten positiven oder zwei negativen Ladungen kann ebenfalls auftreten; solche Wechselwirkungen sind destabilisierend.
Die Stabilisierung des Desoxyzustandes des Hb durch 2,3-BPG ist ein Beispiel ionischer Wechselwirkungen. Das 2,3-BPG-Molekül ist bei neutralem pH stark geladen (5 negative Ladungen) und geht Wechselwirkungen mit 8 Resten in der 2,3-BPG-Tasche ein, die jeweils positiv geladen sind. Rein gefühlsmäßig sollte das 2,3-BPG durch Einbauen von mehr positiven Ladungen in diese Bindungstasche fester an das veränderte Hb als an HbA binden. Ein anderes Beispiel ist die α1/β1-Grenzfläche, wo α Asp 94 über eine Wasserstoffbrücke an das β Asn 102 bindet. Ein Ersatz des β Asn 102 durch eine negativ geladene Gruppe wie Asp oder Glu wird aufgrund der Abstoßung des gleichgeladenen α Asp 94 mit der Stabilisierung des Oxyzustandes interferieren.
Insofern kann der Austausch bestimmter Aminosäurereste die Bildung gewünschter Wasserstoffbrückenbindungen und Salzbrücken erleichtern.
Die T-Konformation kann auch mit Hilfe des Einbaus von Cys anstelle anderer Reste stabilisiert werden.
Cysteinreste können über Disulfidbindungen quervernetzt werden. Das Studium der veröffentlichten Röntgenstrukturdaten von Myoglobin legen die α1/β1-Grenzfläche als logischen Ort für die Plazierung der Disulfidbrücke nahe. Passenderweise gibt es zwei -Ala-Reste, G17 und G18 (Ala ist Cys sterisch ähnlich) in der Nahe des β-G14 Cys. Daher ist die Idee naheliegend, daß α G17 oder G18 geeignete Punkte für einzufügende Cys-Reste wären. Die weitere Strategie zu Anordnung von Disulfiden kann sich nach der Anleitung von Thornton, J.M., J.Mol.Biol. 151, S. 261-287, 1981, richten. Die Oxidation von Cysteinen zu Disulfidbindungen (Cystinen) kann mittels Behandlung mit O&sub2; durchgeführt oder von Thioredoxin (Pigiet, V., Am.Biotech.Lab. 6, S. 48-52, 1988) katalysiert werden.
Modifikation von Resten in der Nähe der Sauerstoffbindungsstelle Häm (Haem) ist die prosthetische Gruppe von Hämoglobin, Myoglobin, Katalase, Peroxidase und Cytochrom b. Das Häm ist in eine Spalte zwischen der E und der F-Helix eingefügt. Das Hämeisen ist kovalent an den Imidazolstickstoff des "proximalen" F8 Histidins gebunden. Das "distale" E11 Valin scheint den Zugang von Sauerstoff zu der Hämtasche zu kontrollieren.
Val-E11 und His-E7 sind hochkonservierte Reste, die in van-der-Waals-Kontakt mit dem als Ligand des Hämeisenatoms von Hämoglobin gebundenen Sauerstoffmoleküls stehen; durch Austausch dieser Reste kann die intrinsische Sauerstoffaffinität des Hämoglobins geändert werden. Val-E11 ist durch Ile, Leu, Ala und Met ersetzt worden. Die Sauerstoffaffinität der Ma-E11-β-Mutante war höher als die von HbA, diejenige der Ile-E11-β-Mutante geringer. Die Röntgenkristalluntersuchung der letzteren Mutante ergab, daß die 8-Methylgruppe der Ile-Seitenkette auf die Seite geschoben werden muß, wenn Sauerstoff an das Eisenatom binden soll.
Eine weitere, von uns ausgeführte Veränderung ist der Austausch His 63 → Phe. Diese Mutante hat eine außerordentlich geringe Sauerstoffaffinität (vgl. Tabelle 3).
Damit ist belegt worden, daß die Sauerstoffaffinität nach Wunsch geändert werden kann, indem man Reste in der Nähe der Sauerstoffbindungsstelle austauscht. Durch Einstellung der Sauerstoffaffinität auf diese Weise kann die Effizienz des Sauerstofftransportes in Abwesenheit des allosterischen Effektors 2,3-BPG maximiert werden.
Die folgenden Reste des menschlichen Desoxyhämoglobins liegen, auf einer Basis des kürzesten Abstandes von Atom zu Atom, innerhalb von 4 Ångström in bezug auf den Hämanteil:

Alpha

B13(D)Met, C7(E)Tyr, CE1(D)Phe, CE3(E)His, CE4(D)Phe, E7(D)His, E10(D)Lys, E11(D)Val, E14(D)Ala, F4(P)Leu, F7(P)Leu, F8(P)His, FG3(P)Leu, FG5(P)Val, G4(P)Asn, G5(P)Phe, G8(D)Leu, H15(P)Val, und H19(P)Leu

Beta

B13(D)Leu, C7(E)Phe, CD1(D)Phe, CD3(E)His, CD4(D)Phe, E7(D)His, E10(D)Lys, E11(D)Val, E14(D)Ala, F4(P)Leu, F7(P)Leu, F8(P)His, FG3(P)Leu, FG5(P)Val, G4(P)Asn, G5(P)Phe, G8(D)Leu, H15(P)Val und H19(P)Leu; vgl. Fermi et al., J.Mol.Biol. 175, S. 159-74 (1984); (in der obigen Liste steht "P" für "proximal", "D" für "distal" und "E" für "kantenständig").
Diese Reste sind demnach Kandidaten für Modifikationen. Ebenso sollten vermittels gebundener Wassermoleküle miteinander in Kontakt stehende Paare berücksichtigt werden, vgl. Ladner et al., Mol.Biol. 114, S. 385-414 (1977).
Mutationen der β-Reste 42 (CD1), 45 (CD4) und 70 (E14) sind besonders interessant. Andere β-Reste von Interesse umfassen 43 (CE1), 46 (CE4), 58 (E7), 61 (E10) und 62 (E11). Interessante u-Reste umfassen 43 (CE1), 46 (CE4), 58 (E7), 61 (E10) und 62 (E11).
Im allgemeinen sind Mutationen um die Häm-O&sub2;-Bindungsstelle herum auch aufgrund ihrer Eigenschaft der niedrigen Affinität der O&sub2;-Bindung erwünscht. Der Austausch von Resten in der Nähe der Oberfläche des Häms, welches O&sub2; bindet, kann zu einer verringerten Affinität führen. Eine natürlich vorkommende Mutante mit niedriger Affinität ist beschrieben worden, Hb Bristol (β 67 Val → Asp). Andere wünschenswerte Mutanten sind das hier beschriebene β Ile 67, β Asp 67 und β Glu 67. Andere Reste befinden sich ebenfalls in der Nähe der O&sub2;-Bindungsstelle. Histidin E7 (β His 63) kann durch Phe ersetzt werden, was zu einer sehr niedrigen O&sub2;-Affinität führt. Der andere, für eine Mutation in Frage kommende Rest ist β Phe 42; ein Ersatz durch Trp sollte zu einer geringen O&sub2;-Affinität führen. Die entsprechenden Reste der α-Kette können anstelle der oder zusätzlich zu diesen bevorzugten Mutationen der β-Kette verändert werden.

Ersetzen von Resten in der α1β2-Kontatfläche und im zentralen Hohlraum

Die Sauerstoffaffinität und die Kooperativität des Hämoglobins hängen beide von der relativen Stabilität des T- (niedrige Affinität) und des R-(hohe Affinität)-Quartärzustandes ab. Diese beiden Zustände befinden sich untereinander im Gleichgewicht; ein Zustand kann jedoch durch Mutationen in der α1β2-Kontaktfläche oder im zentralen Hohlraum bevorzugt eingenommen werden. Es gibt viele natürlich vorkommende Mutationen an diesen Stellen und ihre sorgfältige Untersuchung sollte für das Design eines Hämoglobinmoleküls mit den gewünschten Eigenschaften von Wert sein.
So befinden sich die α1-Reste 37(C2)Pro, 38(C3)Thr, 40(C5)Lys, 41(C6)Thr, 42(C7)Tyr, 44(CD2)Pro, 88(F9)Ala, 91 (FG3)Leu, 92(FG4)Arg, 94(Gl)Asp, 95(G2)Pro, 96(G3)Val, 97(G4)Asn, 140(HC2)Tyr und 141(HC3)Arg bekanntermaßen alle innerhalb von 4 Ångström von mindestens einem Rest der β2-Kette des menschlichen Desoxyhämoglobins. Gleichermaßen liegen die β2-Reste 146(HC3)His, 145(HC2)Tyr, 105(G7)Leu, 102(G4)Asn, 101(G3)Glu, 100(G2)Pro, 99(G1)Asp, 98(FG5)Val, 97(FG4)His, 43(CD2)Glu, 41 (C7)Phe, 40(C6)Arg, 37(C3)Trp, 36(C2)Pro, 35(CI)Tyr und 34(B16)Val auf der anderen Seite der α1β2-Grenzfläche des Humandesoxyhämoglobins.
Die Mutation des β 102 (G4)Asn ist besonders bevorzugt. Hb Kansas ist als Mutante mit niedriger Affinität bekannt, in der dieser Rest in Thr abgeändert ist. Wie oben bereits erwähnt, wird der Oxyzustand durch eine Wasserstoffbrücke zwischen β Asn 102 und α Asp 94 stabilisiert. Die bevorzugte Mutation würde diese Wasserstoffbrücke aufbrechen.
Eine andere bevorzugte Mutation an dieser Stelle ist diejenige zu β Asp 102. Die Abstoßung der negativen Ladungen zwischen dieser Gruppe und dem α Asp 94 würde den Oxyzustand weiter destabilisieren.
Weitere, bevorzugte Mutationen am β 102 wären diejenigen zu Ser (Hb Beth Israel), Lys (Hb Richmond) und Tyr (Hb St.Mande).

Erhöhung der Stabilität von Hämoglobin

Im Erythrozyten dienen das Cytochrom b&sub5; und das Glutathionsystem dazu, das Hämoglobin in der aktiven Eisen-II-Form zu halten. Freies Hb wird im Blutstrom schnell mindestens teilweise in den Eisen-III-Zustand oxidiert, da außerhalb der roten Blutkörperchen keine solchen Hilfmittel vorhanden sind, um es in der reduzierten Form zu halten. Die Eisen-II-Form kann stabilisiert werden, indem man den Val-E11-Rest durch eine große aliphatische Aminosäure wie Ile oder Leu ersetzt. Eine lange Seitenkette in dieser Position hindert Elektronendonoren daran, das Eisenatom zu erreichen, und verlangsamt so die Rate der Autoxidation.
Die His63 → Phe-Mutante ist ebenfalls von Interesse.
Ist das Hämoglobin sowohl intermolekular zur Bildung von Aggregaten mit höherem Molekulargewicht als auch intramolekular zur Verhinderung der Dissoziation in Dimere vernetzt, wird es weder mit Haptoglobin reagieren noch die Glomerulusmembranen in der Niere passieren. Wenn die Sauerstoffbindungseigenschaften des Hämoglobins nicht beeinflußt werden sollen, ist es wichtig, daß die Quervernetzung die Konformationsänderung des Proteins nicht verhindert, weil die Wechselwirkung der Häme untereinander durch den reversiblen Übergang zwischen zwei Quartärstrukturen entsteht: dem T-Zustand mit niedriger Sauerstoffaffinität und dem R-Zustand mit hoher Sauerstoffaffinität. Diese beiden Strukturen unterscheiden sich im Hinblick auf den Kontakt zwischen den α1- und den β2-Untereinheiten. Deshalb sollte dieser Kontakt die Konformationsänderungen durchlaufen können, welche die Sauerstoffassoziation und -dissoziation begleiten.
Die spezifische Mutation kann eingesetzt werden, um bestimmte Oberflächenreste des Hämoglobins durch Cysteinreste zu ersetzen. Verfahren zum Verändern von Proteinen, die den zur Einführung von neuen Disulfidbrücken in Lysozym, Subtilisin und Dihydrofolatreduktase verwendeten ähnlich sind, können angewandt werden. Solche SH-Gruppen tragende Hämoglobinmoleküle können mit Hilfe von Disulfidbrücken oder über bifunktionelle Thiolreagenzien quervernetzt werden. Es bleibt anzumerken, daß es eine natürliche Mutante (Hb Ranier) gibt, in der das His 143 β durch Cys ersetzt ist und in der dieses neu eingeführte Cystein in vivo eine Disulfidbrücke mit Cys 93 β bildet. Diese Mutante ist stabiler als das native Hämoglobin.
Tabelle 2 enthält eine Liste von potentiellen, nicht natürlich vorkommenden Hämoglobinen, von denen erwartet wird, daß sie eine geringere Affinität für Sauerstoff aufweisen als übliches Hämoglobin.
Nach der Bestimmung der Aminosäuresequenzveränderungen, die das erwünschte Hämoglobin von üblichem Hb unterscheiden, muß der Expressionsvektor hergestellt werden. Der geeignetste Ausgangspunkt ist eine Nukleotidsequenz, die bei der Expression für ein übliches Hämoglobin kodiert. Diese Sequenz kann dann mittels spezifischer Mutagenese modifiziert werden.
Verfahren der spezifischen Mutagenese (site-directed mutagenesis) sind bekannt, wobei die Erfindung auf keine bestimmte Methode beschränkt ist. Die beiden wichtigsten Verfahren sind das Verfahren der Doppelhelix mit Lücken (McCrackem, M.M., Kruse, K.B., Brown, J.L., BioTechniques 6, S. 338-339, 1988) sowie die M13-Technik (Zoller, M.J., und Smith, M., Meth.Enz. 100, S. 468-500, 1987).
Alternativ kann eine Teilsequenz mit der gewünschten Mutation synthetisiert werden und anschließend zum Erhalt des erwünschten Moleküls an andere Teilsequenzen ligiert werden.
Das Gen muß unter die Kontrolle eines Promotors gestellt werden. Es kann entweder ein konstitutiver oder ein induzierbarer Promotor eingesetzt werden; die Vorzüge und Nachteile von beiden sind in der Molekularbiologie wohlbekannt. Es muß ein im Wirt funktionsfähiger Promotor gewählt werden. Infolgedessen wird man einen bakteriellen Promotor wählen, wenn der Expressionsvektor in ein Wirtsbakterium eingebracht werden soll, einen Hefepromotor im Falle einer Hefe und einen Säugerpromotor im Falle einer Säugerzelle als Wirt. Selbstverständlich kann genauso der Promotor eines viralen Genes eines Virus, der die gewählte Wirtszelle infiziert, gewählt werden. Die Erfindung hängt weder von der Auswahl des Wirtes noch des Promotors ab. Es ist jedoch wünschenswert, den Wirt so zu wählen, daß die anschließende Reinigung des mutierten Hämoglobins nicht übermäßig verkompliziert wird.
Aus demselben Grund ist es bevorzugt, aber nicht erforderlich, daß das mutierte Protein als Teil eines Fusionsproteins exprimiert wird. Versuche, die α-Kette anders als in Form eines Fusionsproteins zu exprimieren, waren weitgehend erfolglos. Die gesamte Sequenz der u-Kette kann jedoch als Teil eines Fusionsproteins exprimiert werden, welches einen Teil der β-Kette umfaßt, wobei die Sequenz von diesem mittels eines Spacers getrennt ist, der eine selektive Schnittstelle zur Verfügung stellt. Das Hämoglobin wird dadurch erhalten, daß man das sekretierte Fusionsprotein lediglich in eine für die Spaltung geeignete Umgebung bringt. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Kombinationen von Fusionsprotein und Spaltungssystem bekannt.
Nach der Expression, Gewinnung und Aufreinigung des mutierten Hämoglobins wird dessen P&sub5;&sub0; nach dem im Bezugsbeispiel angegebenen Versuchsprotokoll gemessen. Vorzugsweise ist sein P&sub5;&sub0; mindestens 10% höher als derjenige des üblichen Hämohlobins, wenn er in derselben Umgebung gemessen wird.
Während es nicht zweckmäßig ist, ein übliches, stroma-freies Hämoglobin mit ausreichend 2,3-BPG zur Wiederherstellung seines P&sub5;&sub0; auf intraerythrozytärem Niveau zu vereinen, kann es möglich sein, ein nur leicht nach "rechts verschobenes", mutiertes Hämoglobin mit einer kleinen Menge 2,3-BPO oder einem funktionell ähnlichen, organischen Phosphat (z. B. Pyridoxalphosphat oder ATP-Dialdehyd) zu kombinieren, um die Sauerstofftransportkapazität von Vollblut nachzuahmen. Die Halbwertszeit des organischen Phosphates kann durch Verkapselung des organischen Phosphates und des mutierten Hämoglobins in einem Liposom zum Erhalt eines "simulierten Erythrozyten" oder durch kovalente Bindung der organischen Phosphatgruppe an das Hämoglobin verlängert werden.

Bezugsbeispiel

Unser bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung des P&sub5;&sub0; gereinigter Hämoglobinlösungen im Sinne der angefügten Ansprüche ist wie folgt
Hämoglobin-Sauerstoff-Gleichgewichtsdaten werden unter Verwendung eines Dünnschichtverfahrens (Imai, K., Meth.Enz. 76, S. 438-449, 1981) gemessen. Eine Hämoglobinprobe (0,6 mM) wird in Puffer (50 mM Bis-Tris oder 100 mM HEPES), pH 7,4, 0,1 mM NaCl, in eine Meßzelle eingebracht und dann bei 25ºC äquilibriert. Das Hämoglobin wird mit Hilfe eines Luft- oder Luft/O&sub2;-Stromes gesättigt, falls das Hämoglobin eine niedrige O&sub2;-Affinität hat oder der lokale Barometerluftdruck es verhindert, daß der Umgebungssauerstoff einen Partialdruck erreicht, bei dem das Molekül gesättigt ist. Die Desoxygenierung wird durch Abschotten der Meßzelle gegen den O&sub2;-Strom und Spülen der Zelle mit N2 (> 99,98% Reinheit) erreicht. Die Sauerstoffgleichgewichtskurve wird erhalten, indem man die Absorptionsänderung bei 560 nm gegen den O&sub2;- Druck in der Meßzelle aufträgt. Die prozentuale Sättigung wird bestimmt, indem man A&sup5;&sup6;&sup0;bei einem gegebenen Partialdruck (i) geteilt durch den A&sup5;&sup6;&sup0;der antinglichen vollständig gesättigten Hämoglobinlösung bestimmt:
[A&sup5;&sup6;&sup0;(i)/A&sup5;&sup6;&sup0;(10O%)·100 = % Sättigung].
Der P&sub5;&sub0; ist als derjenige O&sub2;-Partialdruck (i) definiert, der benötigt wird, um 50% Sättigung der O&sub2;-Bindungsstellen herbeizuführen.
Der P&sub5;&sub0; kann auch unter anderen Bedingungen gemessen werden; es sollte dabei aber beachtet werden, daß viele Faktoren aus der Umgebung die Sauerstoffaffinität des Hämoglobins beeinflussen. Die Auswirkungen von pH, CO&sub2;, anorganischen Ionen, organischen Phosphaten und der Temperatur werden in Bunn und Forget, siehe oben, diskutiert.
Da viele Bestimmungen der Sauerstoffbindungskurven von Vollblut unter physiologischen Standardbedingungen (37ºC, pH 7,4, pCO&sub2; = 40 mm Hg) ausgeführt werden, kann es notwendig sein, die Zahlenwerte aus der Literatur entsprechend anzupassen. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß ein Temperaturanstieg um 10ºC zu einem Anstieg des P&sub5;&sub0; auf nahezu den doppelten Wert führt, während sich die Abhängigkeit des P&sub5;&sub0; vom pH ungefähr mit Δ log P&sub5;&sub0; / Δ log pH = -0,5 angeben läßt.
Der Vergleich von P&sub5;&sub0;-Werten gereinigter Hämoglobinlösungen mit P&sub5;&sub0;-Werten von Vollblut kann problematisch sein. Vollblut oder isolierte rote Blutkörperchen enthalten viele Komponenten, die auf natürliche Weise die Form der Sauerstoffbindungskurve des Hämoglobins modulieren. Die roten Blutkörperchen schließen Hämoglobin in Anwesenheit hoher Konzentrationen des Effektormoleküls 2,3-BPG ein, einem Molekül, welches zu einer drastisch erniedrigten O&sub2;-Affinität des Hämoglobins führt. Andere Komponenten im Erythrozyten beeinflussen die Form der Bindungskurve ebenfalls: ATP, Cl&supmin;, CO&sub2;, H&spplus;, Orthophosphat, Methämoglobin und Carboxyhämoglobin. Diese Substanzen sind in gereinigten Hämoglobinlösungen normalerweise nicht vorhanden und infolgedessen ist der P&sub5;&sub0; der gereinigten Hämoglobins niedriger als der in Vollblut gemessene.
Ein sehr wichtiger Modulator der Hämoglobin-Sauerstoffaffinität sind Cl&supmin;-Ionen. Außerhalb des Erythrozyten im Blutserum finden sich Cl&supmin;-Ionen mit einer physiologischen Konzentration von annähernd 0,15 M. Da Cl&supmin; eine verringerte O&sub2;-Affinität verursacht, kann eine Hämoglobinlösung mit einem in vitro gemessenen P&sub5;&sub0; eine sehr viel geringere O&sub2;-Affinität haben, wenn sie in den Blutstrom infundiert wird. Ein weiteres Problem bei der Messung der O&sub2;-Bindung von Vollblut ist, daß rote Blutkörperchen relativ fragil sind und daß es während dem Einbringen der Erythrozyten in das Meßinstrument zur Messung der O&sub2;-Bindung nicht zu vermeiden ist, daß mindestens ein kleiner Teil der roten Blutkörperchen unvermeidlich lysiert wird. Lysierte rote Blutkörperchen setzen Hb in das umgebende Medium frei, wo sie von 2,3-BPG abgeschnitten sind. Da freies Hb eine höhere Affinität als Hb in den Erythrozyten hat, werden die lysierten roten Blutkörperchen eine höhere O&sub2;-Affinität aufweisen und daher einen fälschlich niedrigen P&sub5;&sub0; bei Bestimmungen des P&sub5;&sub0; von Vollblut vortäuschen. Nach weitgehend akzeptiert Ansicht wird davon ausgegangen, daß Vollblut unter physiologischen Bedingungen einen P&sub5;&sub0; von 26-28 mm Hg hat. Wenn das Hb aus dem Vollblut isoliert wird, liegt der gemessene P&sub5;&sub0; jedoch in der Größenordnung von 1-10 mm Hg, je nach den experimentellen Bedingungen des Untersuchenden. Aus diesem Grunde ist es am genauesten, Hb-Sauerstoffgleichgewichte unter exakten Bedingungen in bezug auf Puffer, pH und Salzkonzentration zu messen. Leider gibt es keine für alle Forscher allgemeingültigen "Standards" zur Messung der Hb-Sauerstoffbindung bei in vitro-Systemen.
Da dennoch viele mutierte Hämoglobine zunächst in Vollblut von Patienten identifiziert werden, besteht ein Bedürfnis, die relativen Affinitäten von nativem und mutiertem Hb für O&sub2; von Vollblut und gereinigten Hämoglobinpräparationen miteinander vergleichen zu können. Ein Beispiel dafür ist Hb Chico (β Lys 66 → Thr) (Tabelle 1). Würde man nur den P&sub5;&sub0;-Wert der gereinigten Hämoglobinmutante (10, 1 mm Hg) untersuchen, ließe sich erkennen, daß dieses Hb einen P&sub5;&sub0; unterhalb desjenigen von Vollblut (27,2 mm Hg) hat. Wenn das Hämoglobin in roten Blutkörperchen unter physiologischen Bedingungen gemessen wird, tritt dennoch zu Tage, daß es einen höheren P&sub5;&sub0; als normales Vollblut hat (38 mm Hg). Das Ausmaß, in dem sich der P&sub5;&sub0; beim Übergang von Vollblut Chico zu einem gereinigten Hb Chico ändert, wenn es als Blutersatz in den Blutstrom injiziert wird, läßt sich nicht vorhersagen. Man kann jedoch folgern, daß der P&sub5;&sub0; höher als in seiner gereinigten Form sein wird und daß der P&sub5;&sub0; durch die Reaktion des mutierten Hb mit organischen Phosphaten sogar noch höher sein wird.
Es bleibt anzumerken, daß die Sauerstoffbindungskurven für Vollblut üblicherweise unter physiologischen Standardbedingungen (37ºC, pH 7,4, pCO&sub2; = 40 mm Hg) bestimmt werden und daß der Gehalt der roten Blutkörperchen an 2,3-BPG mit dem Alter, dem Geschlecht und dem Gesamtzustand variiert und so den P&sub5;&sub0; beeinflussen kann.

Beispiel 1

Herstellung von artifiziellem üblichen Hämoglobin

Konstruktion des M13 mp11FX

M13 mp1 1FX kodiert eine Sequenz (Ile-Glu-Gly-Arg), die die Erkennungsstelle für den Faktor Xa einschließt. Dieser M13-Abkömmling kann zur Verknüpfung jeder kodierenden Sequenz mit der Erkennungssequenz des Faktors Xa verwendet werden, vgl. Nagai, EP-A-0 161 937 (CELLTECH LTD.). Diese Erfindung ist jedoch weder auf die Verwendung von M13 noch auf das Faktor Xa-Spaltsystem eingeschränkt.
Alle DNA-Manipulationen wurden im wesentlichen, wie von Maniatis et al. beschrieben, durchgeführt ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbor, New York, 1982). Der temperaturempfindliche, lysogene Stamm MZ-1 (galKam 8attL BamN&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 Hl, his&supmin;. ilv&supmin;, bio§Ä N&spplus;, ein Geschenk von Dr.K. McKenney und auf Anfrage vom Medical Research Counsil zu beziehen) wurde als Wirtsstamm für Plasmide verwendet, welche den Lambda PL-Promotor enthielten, wobei die Transformation mit Hilfe des Verfahrens von Remaut et al (Gene 15, S. 81-93 (1981)) durchgeführt wurde. Es hätten aber auch andere Promotoren sowie Wirtsstämme verwendet werden können.
T4-DNA-Ligase wurde aus dem Stamm NM989 hergestellt (Murray et al., J.Molec. Biol. 132, S. 493-505 (1979) und Tait et al., J.Biol.Chem. 255, S. 813-15 (1980)). Restriktionsenzyme wurden von New England BioLabs bezogen.
Zwei Oligonukleotide, dTACCCTCGATGGATC und dCATCGAGGGTAGGCC, wurden mit Hilfe eines Phosphotriesterverfahrens auf einem kontrollierten Glasträger hergestellt (Sproat et al., Tetrahedron Lett. 24, S. 5771-74 (1983)) und mittels HPLC gereinigt (Gait et al., Nucleic Acid Research 10, S. 6243-54 (1982)). Diese Oligonukleotide kodieren die für Peptidsequenz (Gly)-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg- in einem BamH1- Stu1-Linker. Nach der Phosphorylierung mit T4-Polynukleotidkinase (P-L Biochemicals) und r[γ³²P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham) wurden die Oligonukleotide annelliert und zur Bildung von Konkatameren ligiert. Die DNA wurde anschließend mit BamH1 angedaut und in die dephosphorylierte BamH1 Schnittstelle von M 13 mp11 (Vieira et al., Gene 19, S. 259-68 (1982)) zum Erhalt von M13 mp1 1FX, wie in Abbildung 1 gezeigt, kloniert, der in Anwesenheit von Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid (Sigma) blaue Plaques bildet.

Konstruktion des mp1 1FX-α-Globins

40 ug geklonte cDNA des menschlichen α-Globins wurde mit den Restrik:tionsenzymen Nco I und Apa I angedaut. Die Einzelstrangenden des ausgeschnittenen α-Globinfragmentes wurden mittels 10-minütiger Inkubation bei 0ºC mit 200 Einheiten Mungobohnen-Nuklease (P-L Biochemicals) in 30 mM Natriumacetat, pH 4,6, 50 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkchlorid, 5% Glycerin, getrimmt. Die α-Globinsequenz wurde dann in die oben beschriebene Stu I-Schnittstelle von M13 mp1 1FX (Nagai & Thogersen, Nature 309, S. 81 10-12) kloniert. Die DNA-Sequenzen einiger Klone wurden bestimmt (Sänger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, S. 5463-67 (1977)); der Klon, in dem das erste Valin-Codon des α-Globingenes an die für die Faktor Xa Schnittstelle (Ile-Glu- Gly-Arg) kodierende DNA-Sequenz angebunden war, wurde mp1 1FX-α-Globin genannt.

Konstruktion von pLcIIβ und pLcIIFXβ

Die Plasmide pLcIIFXβ und pLcIIβ leiten die effiziente Herstellung eines Hybridproteins, welches aus den 31 aminoterminalen Aminosäuren des Lambda cII-Proteins und dem vollständigen Human-β-Globin, mit bzw. ohne die Faktor Xa-Schnittstelle, besteht.
Das die Mehrfachrestrittionsstellen enthaltende Eco-Hind III-Fragment wurde aus M13 mp10 (Vieira et al, vgl. oben) ausgeschnitten und zum Erhalt von pLmp10 an dem mit Eco RI-Hind III geschnittenen pLc245 (Remaut et al., vgl. oben) ligiert. Das 319 Bp lange Alu I-Fragment, welches die nutR- und tR1-Stellen enthält, und ein Teil der cII- Gens wurde aus pGK1805 (McKenney, K., PhD Dissertation, The John Hopkins University (1982)) geschnitten und in die Sma I-Schnittstelle von M13 mp10 in derselben Orientierung wie das β-Galaktosidase α-Peptid-Gen kloniert. Das die Lambda-DNA- Sequenz enthaltende Eco R1-Hind III-Fragment wurde anschließend herausgeschnitten und in die Eco R1-Hind II-Schnittstelle von pLmp10 zum Erhalt von pLcII kloniert.
Eine vollständige Human-β-Globin-cDNA-Sequenz wurde rekonstruiert, indem man die aus einem unvollständigen cDNA-Klon (pJW102) (Wilson et al., Nucleic Acids Research 5, S. 563-81 (1978)) stammenden Restriktionsfragmente und einen genomischen DNA-KIon (Lawson et al., Cell 21, S. 647-651 (1980)) miteinander verband und in die Sma I-Hind III-Schnittstelle von M13 mp9 klonierte. Die so erhaltene M13 mp9β cDNA wurde an der Nco I-Schnittstelle geöffnet, die am Initiationscodon liegt und mit Klenow-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in Anwesenheit von 100 uM 4dNTP zum Erhalt von glatten Enden behandelt. Die β-Globin cDNA-Sequenz wurde anschließend mit Hind III ausgeschnitten und in die Bam H1-(eingefüllte)-Hind III-Schnittstelle von pLcII solchermaßen einkloniert, daß das β-Globingen mit dem Lambda cII-Gen in Phase über eine kleine, von M13 stammende Linker-DNA fusioniert wurde.
Um pLcIIFXβ herzustellen, wurde M13 mp9β cDNA mit Nco I geöffnet und 40 ug DNA mit 200 Einheiten Mungobohnen-Nuklease (P-L Biochemicals) in 30 mM Na- Acetat, pH 4,6, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCl&sub2; und 5% Glycerin 10 Minuten lang bei 0ºC zur Entfernung des überhängenden 5'-Endes behandelt. Die β-Globin cDNA- Sequenz wurde mit Hind III ausgeschnitten und in den mit Stu I-Hind III geschnittenen M13 mp1 1FX kloniert. Die DNA-Sequenz wurde mit Hilfe des Didesoxykettenabbruchverfahrens (Sanger et al., PNAS (USA) 74, S. 5463-67 (1977)) bestimmt, um sicher zustellen, daß dem ersten Valin-Codon des β-Globingenes die für Ile-Glu-Gly-Arg kodierende DNA-Sequenz vorangestellt war. Anschließend wurde das einen Teil der β- Globinsequenz enthaltende Bam H1-Fragment ausgeschnitten und zum Erhalt von pLcIIFXβ in das mit Bam H1 zerschnittene pLcIIβ kloniert, wie in Abbildung 1b dargestellt.

Konstruktion von pLcIIFXβFXα

M13 mp1 1FX-β-Globin-DNA wurde in einzelsträngiger Form hergestellt und eine BglII-Schnittstelle wurde in die β-Globinsequenz unter Verwendung eines mutagenen Oligodesoxynukleotids, dACCAACTTCAGATCTGTTACCTTG, genannt KN83, zum Erhalt von mp1 1cIIFXβFX eingeführt. Die Replika dieses mutierten Klons wurde mit Sac I und Hind III angedaut und das erhaltene cIIFXβFX-Fragment in das min Sac 11 Hind III geschnittene pLmpII zum Erhalt von pLcIIFXβFX einkloniert. Dieses rekombinante Plasmid wurde mit BglII verdaut und die Phosphatgruppen am 5'-Ende der linearen DNA mit alkaliner Phosphatase aus Kalbsdarm entfernt. Die replikative Form von mp1 1Fx-α-Globin wurde mit Bam H1 angedaut und das FX-α-Globin enthaltende Fragment wurde mit dem linearisierten pLcIIFXBFX ligiert, um pLcIIFXβFXα zu erhalten. Dieses Plasmid kodiert ein Fusionsprotein, welches aus den 31 aminoterminalen Resten des cII-Proteins des Phagen Lambda, dem Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg, den 20 aminotermianlen Resten des Human-β-Globins, wiederum dem Tetrapeptid Ile-Glu- Gly-Arg und dem Human-α-Globin am Carboxylende besteht. Die Transkription der Fusionsproteins wird am Lembda PL-Ikomotor gestartet und vom Lambda-Repressor reguliert.

Expression des rekombinanten, üblichen α- und β-Globins

Der durch Lambdaphagen lysogene Stamm von E.Coli-Mangelmutanten QY13 (ein Geschenk von S. Brenner, und auf Anfrage vom Medical Research Counsil zu beziehen), der die Plasmide pLcIIFXβFX-α-Globin oder pLcIIFXβ-Globin trägt, wurde bei 30ºC in Anwesenheit von Ampicillin (25 ug/l) in 2·YT-Medium (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid pro Liter) kultiviert. Nach Erreichen einer optischen Dichte (600 um) von 1,5-1,6 wurde die Temperatur rasch erhöht und für 15 Minuten bei 42ºC gehalten, gefolgt von Inkubation bei 37ºC für 3-4 Stunden. Die Zellen wurden geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Die Zellen (100 g) wurden aufgetaut, in 80 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0/25% Saccharose (w/v)/1 mM EDTA) suspendiert und durch Zugabe von Lysozym (200 mg) lysiert. Anschließend wurden MgCl&sub2;, MnCl&sub2; und DNase I bis zu einer Endkonzentration von jeweils 10 mM, 1 mM bzw. 10 ug/ml zugefügt. Nach 30 minütiger Inkubation wurde dem Lysat 200 ml einer Lösung aus 0,2 M NaCl/1% Desoxycholinsäure/1,6 % Nonidet P-40 (v/v)/20 mM Tris-HCl (pH 7,5)1 2 mM EDTA zugesetzt wonach das Lysat bei 5000·g für 10 Minuten zentrifugiert wurde. Anschließend wurde das Pellet in 0,5% Triton-X-100/1 mM EDTA suspendiert und zentrifugiert. Dieses Vorgehen wurde solange wiederholt, bis ein dichtes Pellet erhalten wurde. Letztlich wurde das Proteinpellet in Fall des cIIFXβ-Globin-Fusionsproteins in 8 M Harnstoff/25 mM Tris-HOAc (pH 5,0)11 mM EDTA/1 mM Dithiotreitol gelöst. Im Fall des cIIFXα-Olobin-Fusionsprotems wurde das Pellet in 6 M Guanidinhydrochlorid/25 mM Tris-HOAc (pH 5,0)11 mM EDTA 1 mM Dithiotreitol gelöst.
Die Lösung des Fusionsproteins wurde danach auf eine 4·10 cm CM-Sepharose-Säule (Pharmacia), die mit demselben Puffer äquilibriert war, aufgebracht. Das Fusionsprotein wurde mit einem linearen Gradienten eluiert, der aus 500 ml einer Lösung aus 8 M Harnstoff/25 mM Tris-HOAc (pH 5,0)11 mM EDTA/1 mM Dithiotreitol und 500 ml desselben Puffers mit 0,2 M NaCl geformt wurde. Das Fusionsprotein wurde auf einer 5·60 cm mit 5 M Guanidin-HCl/50 mM Tris-HCl/1 mM EDTA/1 mM Ditniotreitol äquilibrierten Sephacryl S-200-Säule weiter aufgereinigt, um jede Spur von Verunreinigungen zu entfernen. Die vereinigten Fraktionen wurden exzessiv gegen 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)/5 M Harnstoff/1 mM CaCl&sub2; dialysiert.
Das cIIFXβFXα-Globin- oder cIIFXβ-Globin-Fusionsprotein wurde bei 0ºC mit dem Blutgerinnnungsfaktor Xa inkubiert, der zuvor mit auf cyanogenbromidaktivierter Sepharose-6B immobilisiertem Viperngift nach Russel aktiviert worden war. Nach Intervallen von 2, 5, 15, 30, 60 und 120 Minuten wurden 100 ul aliquote Anteile entnommen. Jedem Aliquot wurden 100 ul Proteinprobenpuffer (Laemmli, U.K., Nature 227, S. 680-85 (1970)) und 1 ul 100 mM DTT zugesetzt, wonach vor dem Auftragen auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgekocht wurde. Das Schneiden des cIIFXβ- FXα-Fusionsproteins mit Faktor Xa ergibt eine Anzahl von Polypeptidprodukten. Dies beruht auf dem Vorhandensein von zwei Erkennungsstellen im Protein. Vollständiger Abbau setzt drei Polypeptide frei, ein cII-Proteinfragment und ein β-Globinfragment, beide jeweils mit dem Tetrapeptid Ile-Glu-Gly-Arg am Carboxylende, sowie das gewünschte α-Globin. Ein teilweiser Abbau des Fusionsproteins läßt zwei weitere Produkte entstehen.
Die Spaltung von cIIFXβ mit Faktor Xa ergibt zwei Produkte, ein cII-Fragment und das erwünschte β-Globin.
Herstellung von semiartifiziellem Hb mit in E.Coli produziertem α-Globin
25 mg Hämin-Cl wurde in 2,5 ml 0, 1 N KOH gelöst und mit 20 ml Wasser und 2,5 ml 1 M KCN verdünnt. Die native β-Kette wurde in 20 mM K-Phosphatpuffer, pH 5,7, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiotreitol (DTT) verdünnt und mit CO durchperlt. In E.Coli produziertes α-Globin wurde in 8 M Harnstoff/50 mM Tris-Cl pH 8/1 mM EDTA/1 mM DTT in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei Raumtemperatur 3 Stunden lang inkubiert. Die Lösung des α-Globins wurde anschließend tropfenweise zum 20-fachen Volumen an 30 mM K-Phosphatpuffer, pH 5,7, 1 mM EDTA, 1 mM DTT unter leichten Rühren zugesetzt. Die Hämin-Dicyanid-Lösung (1,2 Äquivalente in bezug auf α-Globin) wurde tropfenweise zu der α-Globiniösung zugefügt und die β- Kette in leichtem Überschuß zugegeben. Das semiartifizielle Hb wurde über Nacht gegen 0,1 M K-Phosphat, pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 mM KCN dialysiert.
Herstellung von semiartifiziellem Hb mit in E.Coli produziertem β-Globin β-Globin (100 mg) wurde in 8 M Harnstoff, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Die β-Globiniösung wurde tropfenweise zu 16 Volumina einer α-Globinlösung (entweder aus HbA isoliert oder über Rekombinationsverfahren hergestellt) (3,2 mg/ml in 10 mM Tris-Cl, pH 8,0) zugegeben. Die Hämindicyanidlösung (1,2 Äquivalente bezogen auf β-Globin) wurde unter leichtem Rühren zugetropft. Das semiartifizielle Hb wurde bei zweimaligem Austausch gegen 0, 1 M K-Phosphat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM KCN dialysiert.

Herstellung von gänzlich artifiziellem Hämoglobin

Die lyophilisierten, rekombinanten α- und β-Globine wurden in 8 M Harnstoff/ 50 mM Tris-Cl, pH 8,0/1 mM EDTA/1 mM DTT gelöst, auf eine Konzentration von 5 mg/ml verdünnt und 3 bis 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das α- Globin wurde danach mit einer gekühlten Lösung von 20 mM K&sub2;HPO&sub4;, pH 5,7/1 mM EDTA/1 mM DTT auf 0,3 mg/ml herunterverdünnt. Hämin (25 mg) wurde in 2,4 mg 0, 1 M KOH gelöst und mit einem gleichen Volumen an 1 M KCN verdünnt. Diese Lösung wurde dann mit einer Phosphatpufferstammlösung auf 0, 1 mg/ml Hämin und 20 mM K&sub2;HPO&sub4;, pH 6,7, eingestellt. Hämin aus dieser Lösung wurde bis zum 2,8- fachen Überschuß dem gekühlten α-Globin zugefügt und eine äquimolare Menge an β- Globin zugegeben; die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC gegen 0,1 M K&sub2;HPO&sub4;, pH 7,6/1 mM EDTA/1 mM KCN dialysiert.

Aufreinigung des semi- oder gänzlich artifiziellen Hb

Das artifizielle Hb wurde mit Hilfe der Ultrafiltration unter Einsatz einer Diaflo PM- 10-Membran (Amicon) konzentriert und in ein 200 ml-Testgefäß mit Schraubverschluß und Gummidichtung verbracht. Die Hämoglobinlösung wurde durch Evaporieren und Spülen mit N&sub2; desoxygeniert und anschließend mit CO&sub2; gesättigt. Unter anaeroben Bedingungen wurde eine 100 mM Natriumdithionit-Lösung in einem 20 mi-Schraubdekke1geüäß mit Gummiseptum hergestellt. Mit einer Spritze wurden 4,5 Äquivalente Dithionit in die Hämoglobinlösung injiziert und die Mischung 15 Minuten lang auf Eis inkubiert.
Die Hämoglobinlösung wurde auf einer 4·40 cm Sephadex G-25-Säule (fein) gegen 10 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,0, gelfiltriert. Anschließend wurde das Hb auf eine mit demselben Puffer äquilibrierte, 2·10 cm CM-52-Säule (Whatman) aufgebracht und die Chromatographle mit einem linearen Gradienten aus 500 ml 10 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,0, und 500 ml 70 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,9, entwickelt. Durch Photolyse unter einem Sauerstoffstrom wurde das CO aus dem Hb entfernt. Dieses Hb weist native Sauerstoffbindungseigenschaften auf.
Ein gänzlich artifizielles Hämoglobin kann durch Kombination von α- und β-Globinen, die beide in E.Coli oder einem anderen, von Erythrozyten verschiedenen Wirt produziert sind, zusammen mit einer Hämquelle hergestellt werden.

Beispiel 2

Herstellung von Hämoglobinmutanten mit niedriger Affinität

Konstruktion und Mutagenese von pLcIIFXβ-Globin (Thr 102)

Ein synthetisches Oligonukleotid der Sequenz dGGAGCCTGAAAGTCTCAGGA wurde aus veröffentlichen Informationen zur mRNA-Sequenz konstruiert (Bunn & Forget als Herausgeber) und auf einem kontrollierten Glasträger synthetisiert. Das Oligonukleotid wurde über ein Gel gereinigt (Llyod et al., BioTechniques 4, S. 8-10 (1986)) und als Primer für die spezifische Mutagenese von M13 mp10cIIFXβ-Globin mit Hilfe des Verfahrens von Zoller und Smith eingesetzt (Methods in Enzymology 100, Academic Press, New York, S. 468-500 (1983)).
Das mutagene Oligonukleotid ist der Sequenz des Strukturgenes der β-Kette komplementär, die das Wildtypcodon für Asn 102 flankiert, und um dieses Codon zentriert. An diesem Triplett wurde ein spezifischer Basenaustausch in dem Oligonukleotid vorgenommen, um ACT-Thr 102 zu spezifizieren, jene Aminosäuresequenzveränderung, die für die β-Globinmutante Kansas charakteristisch ist (Bonaventura δ Riggs, J.Biol.Chem. 243, S. 980-991 (1968)). Das für diese Substitution verwendete Thr- Codon wird, obwohl es von dem des ursprünglich isolierten Kansas abweicht (Bonaventura & Riggs), vorzugsweise in stark exprimierten E.Coli-Genen verwendet (Grantham et al., Nucleic Acid Res. 9, S. r43-r74 (1981)).

Herstellung des mutierten β-Globins

Die Produkte der in-vitro-Mutagenese wurden in kompetente E.Coli MZ-1 (gaIKam 8attL BamN&sub7;N&sub5;&sub3;cI857 Hl, his&supmin; ilv&supmin;, bio&supmin;, N&spplus;, ein Geschenk von Dr.K.McKenney und auf Anfrage vom Medical Research Counsil zu beziehen) mit Hilfe des Standard-CaCl&sub2;- Schockverfahrens transformiert (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, S. 250-251 (1982)).
Die Transformanten, welche die mutierten M13-Bakteriophagenkonstrukte tragen, wurden anschließend durch Screenen auf differentielle Plaquehybridisierungen mit hoher Trennschärfe unter Verwendung von am Ende gamma(³²P)-markierten Oligonukleotiden als Sonden identifiziert.
Die zur Herstellung jeder der phosphorylierten Hybridisierungsproben verwendeten Reagenzien waren 300 pM (2 ug) Oligonukleotid, 100 pM (0,7 mCi) gamma(³²P)-ATP (spez. Aktivität etwa 6000 Ci/mM) sowie T4-Polynukleotidklnase in einem Gesamtreaktionsgemisch von 50 ul. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37ºC wurden die am Ende markierten Oligonukleotide aus dem Orthophosphat und dem nichteingebauten Vorläufernukleotiden unter Verwendung eines Umkehrphasen-C18 Sep-paks (Waters Associates Milford, MA) heraus gereinigt. Das letztere Verfahren umfaßt das Auftragen des Reaktionsgemisches der Phosphorylierung in einer wäßrigen Salzlösung auf die C18- Kartusche, die Eluierung von Orthophosphat und nichteingebautem ATP mit Wasser, gefolgt von 10% Methanol und anschließende Eluierung des gereinigten Oligonukleotids mit 60% Methanol. Die zum Vergleich über differentielle Hybridisierungsanalyse eingesetzten Sonden waren das mutagene Oligonukleotid sowie ein weiteres 20-mer (dGGAGCCTGAAGTTCTCAGGA), welches zu der DNA-Sequenz der Wildtyp-β- Kette in derselben kodierenden Region perfekt komplementär ist.
Nach der Identifikation und Aufreinignng der Plaques (Zoller & Smith, vgl. oben) von zahlreichen gewünschten M13-Phagenkonstrukten, wurde für eine der erhaltenen Thr 102-Mutanten, M13 mp10cIIFXβ-Globin (Thr 102) genannt, mit Hilfe der DNA- Sequenaanalyse (Sanger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, S. 5463-67 (1977)) darüber hinaus bestätigt, daß sie die gewünschte Mutation am Codon 102 und nur diese spezielle Aminosäuresequenzveränderung in der kodierenden Sequenz des β-Kettenstrukturgenes enthielt.
Die Herstellung von M13 mp10cIIFXβ-Globin (Thr 102) RF DNA in großem Maßstab wurde wie folgt ausgeführt (Recinos, PhD Dissertation, Vanderbilt University (1987)): Der Wirt E.Coli wurde über Nacht bei 37ºC in Minimalmedium M) (Maniatis et al., vgl. oben) mit 2 ug/ml Thiamin kultiviert. 0,3 ml dieser Zellkultur wurden danach mit 14,7 ml 2·YT-Medium (1 : 50) verdünnt und das Wachstum bei 37ºC für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Diese Kultur wurde wiederum auf ein Endvolumen von 150 ml 2·YT (1 : 10) verdünnt und die Zellösung mit dem aus dem Plaque gereinigten M13- Phagenkonstrukt in einer Infektionshäufigkeit von annähernd 1 beimpft. Die Phageninfektionskultur wurde dann 14 Stunden lang bei 37ºC heftig gerüttelt und die Zellen für die RF-Präparation mit Hilfe der Zentrifugation (5000·g; 10 min, 4ºC) geerntet. Der Überstand mit mutierten Phagen wurde zur Verwendung in Versionen größeren Maßstabs gemäß Versuchsprotokollen zur Phagenreinigung und Herstellung von Einzelstrangtemplates (Zoller & Smith, siehe oben) bei -20 ºC gelagert.
Doppelstrang-RF-DNA wurde aus den Zellpellets wie folgt gereinigt: Die Pellets wurden in einem Alkohol/Trockeneis-Bad 10 Minuten lang eingefroren, bei 20ºC aufgetaut und auf Eis in 10 ml 25% Saccharose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) vollständig resuspendiert. Lysozym wurde in einer Endkonzentration von 4 mg/ml zugegeben und die Inkubation auf Eis für 5 Minuten fortgesetzt. Anschließend wurde EDTA in einer Endkonzentration von 80 mM, und nach weiteren 5 Minuten auf Eis ein gleiches Volumen an 0,5% Triton-X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 62,5 mM EDTA zugegeben. Diese Lösung wurde für weitere 15 Minuten auf Eis gehalten und danach 5 M NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugesetzt. Diese Lösung wurde in Gefäße für eine Beckmann Rotor von Typ 70 Ti gefüllt und nach weiterem Inkubieren für 3 Stunden auf Eis 75 min mit 40000 UpM bei 15ºC zentrifugiert. Die RF-DNA wurde mit dem Überstand dekantiert und bei -20ºC in 20 min durch Zugabe eines gleichen Volumens an Isopropanol ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wurde in die Form eines Pellets gebracht, in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl resuspendiert und bei 37ºC 2 Stunden lang mit RNAse (Endkonzentration 100 ug/ml) behandelt. Diese Lösung wurde mit Phenol und Chloroform extrahiert (je einmal), die DNA mit Ethanol ausgefällt und in 30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA resuspendiert. Die DNAs wurden zweimal mittels Gleichgewichtszentrifugation im CsCl- Ethidiumbromid-Dichtegradienten in Banden aufgespalten. Die Form I-DNA-Banden wurden zur Entfernung des Ethidiumbromids 4 mal mit CsCl-gesättigtem Isdopropanol extrahiert und die DNA und CsCl mit Ethanol ausgefällt. Das CsCl wurde durch Resuspendieren in und Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM EDTA von der DNA abgetrennt. Eine letzte Ethanolfallung und anschließendes Resuspendieren in 0,5 ml Tris-HCl (pH 8,0) ergab 150 ug gereinigte M13 mp10cIIFXβ-Globin (Thr 102)-RF- DNA, welche zur Subklonierung des mutierten β-Globinstrukturgenes im β-Globinexpressionskonstrukt verwendet wurde.
Die mutierte β-Kettensequenz wurde in den β-Kettenexpressionsvektor' pLcIIFXβ- Globin(nic&supmin;) mit Hilfe folgender Verfahren eingebracht. Der mutierte Mon RF (50 ug) wurde mit den Restriktionsenzymen Sac I und Hind III angedaut und das erhaltene cIIFXβ-Globin (Thr-102)-Fragment aus einem 1%igen präparativen Agarosegel isoliert (Maniatis et al., s. o.) und über ein "freeze-thaw"-Verfahren (Benson, BioTechniques 2, S. 77-78 (1984)) gelgereinigt. Etwa 200 ug Expressionsvektor-DNA wurden aus Pellets von transformierten E.Coli QY13-Zellen über Verfahren isoliert und gereinigt, die mit den oben für die RF-Präparation beschriebenen nahezu identisch sind. Diese Plasmid-DNA (20 ug) wurde gleichermaßen mit Sac I und Hind III geschnitten und darüber hinaus mit bakterieller alkaliner Phosphatase (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, wie angegeben) zur Entfernung der 5'-Phosphate von der Vektor- DNA behandelt; dadurch kann der Rezyklisierung ohne Einbau von DNA bei den anschließenden Ligierungsreaktionen vorgebeugt werden.
Das gereinigte, mutierte DNA-Fragment als Insert wurde dann wieder in das Expressionskonstrukt bei gemäßigten Insertendkonzentrationen ligiert, wobei es darin die zuvor für das Wildtypprotein kodierenden Sequenzen ersetzte. Die Reaktionsbedingungen der Ligation (Abwandlung des Verfahrens von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) lauteten wie folgt:
11 ug Vektor-DNA und 2,1 ug gereinigte Insert-DNA in 500 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl&sub2;, 6 mM ATP, 2 mM Dithiotreitol, Gesamtreaktionsvolumen = 125 ul; die Inkubation zur Ligierung dauerte 10 Std. bei 16ºC; das fertige Ligationsreaktionsgemisch wurde zur Transformation kompetenter E.Coli QY13-Zellen unter Selektion auf Ampicillinresistenz verwendet. Transformanten, welche das gewünschte Plasmidkonstrukt zur Expression der mutierten β-Kette tragen, wurden durch differentielles Screening auf Koloniehybridisierung (Grunstein & Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, S. 3961-65 (1975), mit Abwandlungen) unter Verwendung des am Ende marklerten, mutagenen sowie des Wildtyp-Oligonukleotids, wie oben beschrieben, identifiziert. Das richtige Plasmidkonstrukt wurde außerdem mit Hilfe der Restriktionsanalyse und durch seine Expression eines Proteins bestätigt, welches sich bei der HPLC vom Wildtyp-cIIFXβ-Globin-Fusionsprodnkt unterscheidet. Das mutierte β-Globin wurde produziert, gereinigt und, wie für das native β-Globin beschrieben, mit α-Globin kombiniert.

Konstruktion und Mutagenese von pLcllFXβ-Globin (Ile 67)

Die Mutation des Val 67-Codons wurde wie oben unter Verwendung des mutagenen Primers (dGCACCGAGOATTTTCTTGCC) in die Sequenz der β-Globln cDNA in M13 mp10cIIFXβ-Globin eingeführt. Das mutierte β-Globin wurde, wie für das native β- Globin beschrieben, hergestellt, gereinigt und mit α-Olobin zum Erhalt eines mutierten Hämoglobins kombiniert.

Konstruktion und Mutagenese von pLcIIFXβ-Globin (Phe 63)

Die Mutation des His 63-Codons wurde wie oben unter Verwendung des mutagenen Primers (dTTCTTGCCAAAGCCTTCA) in die Sequenz der β-Globin cDNA in M13 mp10cllFXβ-Globin eingeführt. Das mutierte β-Globin wurde, wie für das native β- Globin beschrieben, hergestellt, gereinigt und mit α-Globin zum Erhalt eines mutierten Hämoglobins kombiniert.

Charakterisierung von mutiertem Hämoglobin

Untersuchungen zum Sauerstoffgleichgewicht wurden für Hbβ Phe 63 und Hbβ Ile 67 in 0,05 M Bis-Tris, pH 7,4 sowie 0,1 M NaCl bei 25ºC unter Verwendung des automatischen Aufzeichnungsgerätes von K.Imai (Meth. Enz. 76, S. 438-449, 1981) und für Hbβ Thr 102 in 0,1 M HEPES, pH 7,4 sowie 0,1 M NaCl unter Verwendung einer optischen Zelle im Dünnschichtformat (Gill, S. L., Meth. Enz. 76, S. 427-438, 1981) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Beispiel 3

Das gereinigte Hämoglobin wird in eine physiologisch geeignete Blutersatzlösung eingearbeitet. Eine bevorzugte Lösung umfaßt die folgenden Komponenten:
Hb (g/l) 60-120
Natrium (mÄq/l) 135-145
Kalium (mÄq/l) 3,5-4,5
Chlorid (mÄq/l) 90-110
Vorzugsweise hat die Lösung einen pH-Wert von 7,3-7,5, eine Osmolalität von 280-310 und einen onkotischen Druck von 20-30 mm Hg. Die Osmolalität wird durch die Konzentrationen von Hb und den Elektrolyten sowie durch den möglichen Bestandteil Glukose (vorzugsweise 0-30 g/l) eingestellt. Der onkotische Druck wird durch die Hb-Konzentration sowie durch dessen Quervernetzungsgrad gesteuert. Hilfsmittel wie Albumin (0-70 g/l), Dextran (0-100 g/l) und Polyethylenglykoll (0-25 g/l) können zur Erhöhung des onkotischen Druckes zugesetzt werden. Außerdem können, um das Ausmaß der Methämoglobinbildung zu verringern, ein Antioxidans oder Radikalanger wie Mannit (0-20 g/l), Glutathion (0-4 g/l), Ascorbinsäure (0-0,3 g/l) und Vitamin E (0-100 IE/l (IE = Internationale Einheiten)) zur Verfügung gestellt werden.
Falls eine Hämoglobinmutante mit niedriger Sauerstoffaffinität verwendet wird, kann es erwünscht oder notwendig sein, den P&sub5;&sub0; der Lösung auf das bevorzugte Niveau durch die geeignete Auswahl von Elektrolyten, pH und anderen Eigenschaften der Zubereitung einzustellen. Vorzugsweise hat die fertige Lösung unter physiologischen Standardbedingungen einen P&sub5;&sub0; von 24-32 Torr. Tabelle 1 Natürliche Hämoglobinmutanten mit niedriger Affinität Haemoglobin α-Mutante frei von roten Blutkörperchen Vollblut Ort der Mutation Referenz Hirosaki Häm Torino Moabit Titusville β-Mutante Raleigh DPG-Bindungsstelle Connecticut B-E Helices Moscva Rothschild Hazebrouck Hammersmith Louisville Häm Sendagi Cheverley Okaloosa Bologna C-D Helices Cairo Häm Chico Bristol Seattle Vancouver Korle-Bu Mobile Rahere Pyrgos Roseau-Pointe Agenogi DPG-Bindungsstelle Außen Caribbean Häm Kansas Beth Israel Saint Mande Richmond Burke Yoshizuka Presbyterian Peterborough New York G-Helix Hope Häm Himeji DPG-Bindungsstelle * Die Worte in Klammern gegen den vom Erfinder gemessenen P&sub5;&sub0; für übliches HbA in Erythrocytenfreiem oder gebundenen Zustand, wie angegeben, an.

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Tabelle 2

Kandidaten für nicht in der Natur vorkommende Hämoglobinmutanten niedriger Affinität

α-kette

46 phe→thr
46 phe→ser
46 phe→ala
58 his→phe
58 his→trp
61 lys→thr
61 lys→ser
61 lys→met
61 lys→asn
62 val→leu
62 val→ile
62 val→phe
62 val→trp
65 val→asp
94 asp→gln
94 asp→thr
94 asp→ser
94 asp→lys
94 asp→gly
94 asp→arg

β-Kette

21 asp→ala
21 asp→ser
45 phe→ala
45 phe→thr
45 phe→val
63 his→phe
63 his→trp
66 lys→ser
66 lys→asn
67 val→phe
67 val→trp
67 val→trp
70 ala→qlu
70 ala→ser
70 ala→thr
96 leu→phe
96 leu→his
96 leu→lys
98 val→trp
98 val→phe
102 asn→asp
102 asn→glu
102 asn→arg
102 asn→his
102 asn→gly
108 asn→arg
108 asn→qlu Tabelle 3 Werte der Säuerstoffaffinität für Hämoglobinmutanten Hämoglobinrnutante P&sub5;&sub0; (mmHg) P&sub5;&sub0; Mutane/P&sub5;&sub0; Wildtyp Hbg (beta phe&sup6;³) Hgb (beta ile &sup6;&sup7;) Hgb (beta thr¹&sup0;²)

Claims

1. Verwendung eines zellfreien, mutierten Hämoglobins zur Herstellung einer nichttoxischen Zubereitung zur Verabreichung an einen Patienten, um die Sauerstofftransportfähigkeit seines Blutes zu unterstützen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das mutierte Hämoglobin ein natürlich vorkommendes Hämoglobin ist.

3. Verwendung gemaß Anspruch 1, bei der das Hämoglobin ein nicht in der Natur vorkommendes Hämoglobin ist.

4. Verwendung gemaß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das zellfreie, mutierte Hämoglobin einen P&sub5;&sub0; aufweist, der als der Sauerstoffpartialdruck definiert ist, bei dem das in der Lösung befindliche Hämoglobin halbgesättigt mit Sauerstoff ist, wobei der P&sub5;&sub0; mindestens um 10% größer ist als derjenige von zellfreiem, normalen Hämoglobin unter denselben Bedingungen.

5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der das zellfreie, mutierte Hämoglobin einen P&sub5;&sub0; hat, der mindestens das Doppelte desjenigen von normalem, zellfreien Hämoglobin unter denselben Bedingungen beträgt.

6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der das mutierte Hämoglobin ein in der α-Kette mutiertes Hämoglobin ist.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der das mutierte Hämoglobin eine Mutation beinhaltet, die das Gleichgewicht zwischen dem R-Zustand und dem T-Zustand des Hämoglobinmoleküls beeinflußt.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das Hämoglobin eine Mutation des β- Asn¹&sup0;²-(G4)-Restes enthält.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, bei der das Hämoglobin die Mutation des β-Asn¹&sup0;²- (G4)→Thr enthält.

10. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das mutierte Hämoglobin eine His&sup6;³-Phe- Mutation enthält.

11. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das mutierte Hämoglobin eine Mutation eines ersten Aminosäurerestes innerhalb von 4·10&supmin;¹&sup0; m (4 Ångström) um das Häm herum aufweist, bestimmt anhand des Abstands von nächstgelegenem Atom zu nächstgelegenem Atom.

12. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das mutierte Hämoglobin eine Mutation eines ersten Aminosäurerestes in einer ersten Kette innerhalb von 4·10&supmin;¹&sup0; m (4 Ångström) um einen zweiten Rest auf einer zweiten, unterschiedlichen Kette aufweist, bestimmt anhand des Abstands von nächstgelegenem Atom zu nächstgelegenem Atom, wobei der erste und der zweite Rest einen Teil der α&sub1;β&sub2; oder α&sub2;β&sub1;-Grenzfläche darstellen.

13. Verwendung gemäß Anspruch 12, bei dem das mutierte Hämoglobin eine Mutation des β-45-Restes (CD4) enthält.

14. Verwendung gemäß Anspruch 12, bei dem das mutierte Hämoglobin eine Mutation des β-70-Restes (E14) enthält.

15. Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das mutierte Hämoglobin eine Mutation des β-67-Val enthält.

16. Verwendung gemäß Anspruch 15, bei der das mutierte Hämoglobin die Mutation β-67-Val→Ile enthält.

17. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei der die Zubereitung zusätzlich ein den T-Zustand des Hämoglobins stabilisierendes organisches Phosphat enthält.

18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, bei der das mutierte Hämoglobin eine Mutation aufweist, bei der ein weiterer Aminosäurerest in Cystein umgewandelt ist und bei der dieses Cystein mit einem anderen Cystein quervernetzt ist.

19. Verwendung gemäß Anspruch 2, bei der das mutierte Hämoglobin die Struktur einer natürlichen Hämoglobinmutante niedriger Affinität hat, ausgewählt aus der Gruppe, die in der folgenden Tabelle 1 angegeben ist:

α-Mutanten

43(CD1)Phe → Leu 86(F7)Leu → Arg

43(CD1) Phe → Val 94(G1) Asp → Asn

β-Mutanten

1 Val → Acetyl-Ala 73(E17) Asp → Val

21(B3) Asp → Gly 82(EF6) Lys → Thr

24(B6) Gly → Asp 83(EF7) Gly → Asp

37(C3) Trp → Arg 90(F6) Glu → Gly

38(C4) Thr → Pro 90(F6) Glu → Lys

42(CD1)Phe → Ser 91(F7)Leu → Arg

42(CD1) Phe → Leu 102(G4) Asn → Thr

42(CD1) Phe → Val 102(G4) Asn → Ser

45(CD4) Phe → Ser 102(G4) Asn → Tyr

48(CD7) Leu → Arg 102(G4) Asn → Lys

61(E5) Lys → Met 107(G9) Gly → Arg

65(E9) Lys → Gin 108(G10) Asn → Asp

66(E10)Lys → Thr 108(G10)Asn → Lys

67(E11) Val → Asp 111(G13) Val → Phe

70(E14)Ala → Asp 113(G15)Val → Glu

73(E17) Asp → Tyr 136(H14) Gly → Asp

73(E17) Asp → Asn 140(H18) Ala → Asp

20. Verwendung gemäß Anspruch 3, bei der das mutierte Hämoglobin eine Hämoglobinmutante niedriger Affmität, ausgewählt aus der Gruppe ist, die aus Mutanten mit den in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Mutationen und Kombinationen derselben besteht:

α-Kette

46Phe → Thr 62 Val → Ile

46Phe → Ser 62Val → Phe

46Phe → Ala 62Val → Trp

58His → Phe 65Ala → Asp

58 His → Trp 94 Asp → GIn

61 Lys → Thr 94 Asp → Thr

61 Lys → Ser 94 Asp → Ser

61 Lys → Met 94 Asp → Lys

61 Lys → Asn 94 Asp → Gly

62 Val → Leu 94Asp → Arg

β-Kette

21 Asp → Ala 70 Ala → Thr

21 Asp → Ser 96 Leu → Phe

45Phe → Ala 96Leu → His

45 Phe → Thr 96 Leu → Lys

45 Phe → Val 98 Val → Trp

63 His → Phe 98 Val → Phe

63 His → Trp 102 Asn → Asp

66 Lys → Ser 102 Asn → Glu

66 Lys → Asn 102 Asn → Arg

67 Val → Phe 102 Asn → His

67 Val → Trp 102 Asn → Gly

67 Val → Ile 108 Asn → Arg 70 Ala → Glu 108 Asn → Glu

70A la → Ser

21. Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei der sowohl die α- als auch die β-Kette des mutierten Hämoglobins rekombinante Polypeptide sind.