JP2001258565A

JP2001258565A - 遺伝子の発現を促進させ得る核酸

Info

Publication number: JP2001258565A
Application number: JP2000078897A
Authority: JP
Inventors: Toshio Hara; 敏夫原
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2000-03-21
Publication date: 2001-09-25

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子の発現を誘導又は促進し得る核酸を提
供する。【解決手段】本発明は、遺伝子の発現を誘導又は促進
し得る核酸に関し、この核酸は、ニワトリリゾチームの
分泌シグナル配列、ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１２０の分
泌シグナル配列である。ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０は固
有のシグナル配列を備えている場合には、人工的に遺伝
子を発現させることが困難であったが、この固有のシグ
ナル配列を上記二つの分泌シグナル配列に置換すること
により、その発現を誘導することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現の上
昇に関与する核酸に関し、特に、遺伝子から転写産物の
生成を促進し、翻訳産物の生成を促進させ得る核酸に関
する。また、本発明は、この核酸を用いて発現されたＳ
Ｆ２型ＨＩＶｇｐ１２０の発現ベクターなどに関する。
さらに、本発明は、このような遺伝子の発現を促進し得
る核酸を検出するための方法及びシステムに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子は、ゲノムの複製という形で生物
個体の遺伝形質を次世代に保存するのみならず、遺伝子
自身がもつ情報をそれ自身が含むプログラムに従ってＲ
ＮＡや蛋白質という機能性のある遺伝子産物を表現して
いる。この遺伝子からの遺伝子産物の表現が遺伝子発現
であり、主として、遺伝子からＲＮＡを作り出す転写
と、ＲＮＡから蛋白質が作り出される翻訳とが含まれ
る。こうした遺伝子発現によって、生体における様々な
分子複合体、細胞小器官、細胞、組織等の形成や組織化
が実現され、また、生体を多様な環境に適応させること
を可能としている。

【０００３】この遺伝子発現は、時間、環境等により高
度に制御されている。例えば、転写における制御因子に
は、遺伝子上に存在するプロモータ、オペレータなどの
シス因子、このシス因子と親和性を有するアクチベータ
などのトランス因子などがある。同様に、翻訳過程で、
翻訳の促進、抑制を行う因子なども存在する。こうした
遺伝子発現における制御因子は、in vitro、in vivoで
遺伝子を発現させ、人為的に発現産物を生成させる際な
どに有用である。そのため、これら遺伝子発現の制御因
子について種々研究が進められ、多くの制御因子が検出
されている。

【０００４】一方、上述した制御下で最終的に発現され
る蛋白質は、組織形成などのために生体内の必要な場所
に移行する必要がある。蛋白質の移行に関与する因子と
して、従来からシグナルペプチドの存在が知られてい
る。このシグナルペプチドは、プレ蛋白質のN末端に形
成される。そして、このシグナルペプチドによって、最
終的な蛋白質は、細胞外への分泌、膜への結合、核内へ
の移行というように適切な場所に誘導される。

【０００５】例えば、ミツバチのメルチンシグナルペプ
チドでは、これを蛋白質に導入することにより細胞内で
生成された該蛋白質の分泌を促進させることができるこ
とが示され（GENE 98：177-183（1991））、これを利
用した蛋白質合成システムが実用化されている（「ｐＭ
ｅｌＢａｃ」高レベル分泌型発現ベクター、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ社）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、シグナ
ルペプチドによる蛋白質の分泌促進が報告されているの
は、ハチ毒のシグナルペプチドだけであり、その他のシ
グナルペプチドが同様の活性を有するかは明らかになっ
ていなかった。

【０００７】また、従来のハチ毒のシグナルペプチド
は、蛋白質の分泌を促進させると考えられていた。すな
わち、従来、このような遺伝子の発現調節は、転写調節
因子は転写過程を、翻訳調節因子は翻訳過程を調節し、
さらに、シグナルペプチドは最終産物の移行を誘導する
と考えられており、シグナルペプチドをコードする遺伝
子（以下、シグナル配列）が翻訳後の修飾、蛋白質の移
行以外の活性を有するとは考えられていなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願発明者は、ニワトリ
リゾチームの分泌シグナル、ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１
２０の分泌シグナルを用いた研究を進めていく過程で、
これら分泌シグナルも蛋白質の分泌を促進し得ることを
発見した。さらにこれら分泌シグナル配列は、転写をも
調節し得ることを見出し、本願発明に至った。

【０００９】すなわち、本願発明は、第一の側面は、上
記シグナル配列を遺伝子の発現を実行又は促進させるた
めに利用することである。

【００１０】具体的には、プロモータに発現可能に連結
される任意の構造遺伝子の上流に挿入され、前記プロモ
ータからの前記構造遺伝子の発現を実行又は促進させ得
る核酸であって、前記核酸が、ニワトリリゾチームの分
泌シグナル配列又はＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウ
イルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列である
ことを特徴とする。

【００１１】本発明によれば、遺伝子発現がほとんど観
察されないか又は発現レベルが低いものであっても、上
記シグナル配列を目的の構造遺伝子の上流に連結するこ
とにより、その遺伝子発現の実行を可能にするか又はそ
の発現レベルを促進させることが可能となる。

【００１２】ここで、「遺伝子発現」とは、転写、翻
訳、翻訳後の修飾および修飾後の蛋白質の分泌を含む。

【００１３】また、上記ニワトリリゾチームの分泌シグ
ナル配列は、例えば、配列番号１に示す配列であり、ま
た、前記ＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウイルス（Ｈ
ＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列は、例えば、配列
番号１１に示す配列である。

【００１４】本発明は、構造遺伝子の発現を実行又は促
進させるための発現カセットであって、前記構造遺伝子
に発現可能に接続されるプロモータと、前記構造遺伝子
の上流に配置され、前記プロモータから前記構造遺伝子
と一体的に発現される分泌シグナル配列と、前記構造遺
伝子の下流に配置される３'ＵＴＲと、を備え、前記分
泌シグナル配列が、ニワトリリゾチームの分泌シグナル
配列又はＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウイルス（Ｈ
ＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列であることを特徴
とする。

【００１５】このように発現カセットとして提供し、所
望の構造遺伝子を接続することにより、容易に遺伝子産
物、例えば、転写産物であるｍＲＮＡ、翻訳産物である
蛋白質を得ることが可能となる。

【００１６】上記発現カセットにおいて、前記プロモー
タ及び前記３'ＵＴＲとして、バキュロウイルスのポリ
ヘドリン由来のものを好適に用いることができる。バキ
ュロウイルスのポリヘドリン由来のプロモータを用いる
ことにより、転写活性を高めることができる。

【００１７】また、上記発現カセットは、ベクターに担
持させ発現ベクターとして提供することも好適である。

【００１８】このように発現カセットをベクターに担持
させることにより、自己複製能を持たせることが可能と
なる。そのため、構造遺伝子が挿入された発現ベクター
を適当な宿主細胞に導入保持させることにより、遺伝子
発現を安定して行わせることができる。

【００１９】このベクターとしては、例えばバキュロウ
イルスベクターを用いることができる。そして、このバ
キュロウイルスベクターを用いた発現ベクターの場合に
は、宿主細胞である昆虫細胞とともに提供することによ
り、所望の遺伝子産物、ｍＲＮＡ、蛋白質等の生成を一
層容易に行うことが可能となる。

【００２０】また、本発明の第二の側面は、従来、発現
が困難であったＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０を、上記分泌
シグナル配列を用いて、その発現を実行、促進させるこ
とである。

【００２１】具体的には、前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２
０と、前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０の上流に連結され
た分泌シグナル配列と、前記分泌シグナル配列が連結さ
れたＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０を発現させ得るように、
前記分泌シグナル配列を挟んで前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ
１２０の上流に接続されたプロモータと、前記ＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０の下流に接続された３'ＵＴＲと、を
有し、前記分泌シグナル配列が、ニワトリリゾチームの
分泌シグナル配列又はＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群
ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列であ
ることを特徴とする。

【００２２】ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０は、この遺伝子
に固有のシグナル配列を備えた発現ベクターに接続して
もｇｐ１２０の発現が観察されないが、上記分泌シグナ
ル配列に置換することにより、その発現を実行、促進さ
せることが可能となる。

【００２３】また、上記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現
カセットは、ベクターに担持したＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１
２０発現ベクターとして提供することができる。さら
に、ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現カセット又はベクタ
ーに担持したＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現ベクターを
細胞、好適には、昆虫細胞内に導入して、ＳＦ２型ＨＩ
Ｖｇｐ１２０発現細胞として提供することができる。

【００２４】これら構成により、ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１
２０蛋白質の生成を容易にし、また、この発現細胞など
から発現されたＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質は、天
然のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質と同様の生物活
性、ＣＤ４⁺Ｔ細胞との結合能を有することから、ワク
チンの開発、抗体の開発に寄与することが期待できる。

【００２５】本発明の第三の側面は、既知の分泌シグナ
ル配列には、遺伝子の発現を促進させ得る活性を有する
ものがあり、特に、これらの遺伝子発現の促進活性は、
少なくとも転写レベルの促進に起因するとの発見を利用
したものである。

【００２６】すなわち、本発明は、被験体である分泌シ
グナル配列がモニタ遺伝子の発現を実行又は上昇させ得
るかを判定する方法であって、ベクター上のプロモータ
と３'ＵＴＲとの間に、前記分泌シグナル配列が上流に
連結されたモニタ遺伝子を前記プロモータから発現され
得るように接続して発現ベクターを調製する発現ベクタ
ー調製工程と、前記発現ベクターを細胞に導入する細胞
導入工程と、前記細胞における前記モニタ遺伝子の発現
量を測定する測定工程と、を含み、前記測定工程におい
て、前記モニタ遺伝子の転写産物を測定することによ
り、前記発現量が測定されることを特徴とする。

【００２７】また、本発明は、被験体である分泌シグナ
ル配列がモニタ遺伝子の発現を上昇させ得るかを判定す
るための判定システムであって、プロモータと３'ＵＴ
Ｒとを備え、前記プロモータから発現可能に、前記分泌
シグナル配列が上流に連結された前記モニタ遺伝子を接
続させる発現ベクターと、前記モニタ遺伝子が接続され
た前記発現ベクターを導入して前記モニタ遺伝子を発現
させる細胞と、を含み、前記細胞における前記モニタ遺
伝子の発現量に基づき、前記被験体である核酸がモニタ
遺伝子の発現を上昇させ得るかが判定されることを特徴
とする。

【００２８】一般に、細胞分泌液などから特定の蛋白質
を検出するためには、抗体を利用しなければならない。
また、この抗体作製には、生成時間及びコストを要す
る。一方、転写産物の検出は、合成ＤＮＡなどの比較的
入手、作成が容易なものを用いて実施することが可能と
なる。そのため、上記構成によれば、被検体である分泌
シグナル配列における遺伝子発現促進活性を簡便に判定
することが可能となる。

【００２９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態を
説明する。

【００３０】[第一の実施形態] 遺伝子発現を促進させ
得る核酸本実施の形態における遺伝子発現を促進させ得る核酸
は、翻訳後の修飾、蛋白質の輸送に関与する分泌シグナ
ル配列であり、具体的には、ニワトリリゾチームの分泌
シグナル配列、ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１２０の分泌シ
グナル配列である。

【００３１】これら分泌シグナル配列は、翻訳後の修飾
やプロセシングなど、翻訳以降の工程に関与すると考え
られていたが、本願発明者は、遺伝子の転写の過程をも
調節し、その実行、促進を行うことができることを見い
だした。

【００３２】従って、本実施形態の核酸は、蛋白質を生
成するための翻訳の過程を実行、促進させるのみなら
ず、ＲＮＡを生成するための転写過程を実行、促進させ
るために使用することもできる。

【００３３】また、本実施形態の核酸は、分泌シグナル
配列であり、翻訳により生成された蛋白質を細胞外に分
泌させる目的で使用することもできる。このように、蛋
白質を細胞外に分泌させることにより、蛋白質の精製を
簡易にすることができる。

【００３４】上記ニワトリリゾチームの分泌シグナル配
列を、配列番号１に示し、その分泌シグナルペプチドを
配列番号２に示す。また、ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１２
０の分泌シグナル配列を配列番号１１に示し、その分泌
シグナルペプチドを配列番号１２に示す。

【００３５】これら配列は、上記遺伝子の発現活性を維
持し得る範囲で改変することができる。この改変とし
て、置換、削除、付加などを含めることができる。こう
して改変された核酸配列は、遺伝子発現の実行、促進活
性を有する限り、本発明における「遺伝子発現を実行、
促進させ得る核酸」に包含される。

【００３６】上記ニワトリリゾチームの分泌シグナル配
列の生成は、ニワトリの染色体から直接得てもよく、ま
た、簡便には、上記配列番号１に基づいてＤＮＡ合成機
により合成することもできる。

【００３７】ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１２０の分泌シグ
ナル配列も同様に、ＳＦ１６２型ＨＩＶの染色体遺伝子
より得てもよく、また、簡便には、上記配列番号１１に
基づいて合成ＤＮＡにより合成することもできる。

【００３８】また、これら分泌シグナル配列を用いて遺
伝子の発現を実行、促進させるためには、これら分泌シ
グナル配列を目的の構造遺伝子の上流に連結する。この
連結の際には、プロモータからの転写の際に、分泌シグ
ナル配列の読み枠が構造遺伝子の読み枠と同一となり、
かつ、構造遺伝子と一体に転写されるように実行する。

【００３９】このように分泌シグナル配列を利用して構
造遺伝子の発現を実行、促進させるためには、この分泌
シグナルを備えた発現カセットを構成することができ
る。

【００４０】発現カセットの構成としては、分泌シグナ
ル配列を所望の構造遺伝子の上流に連結し、これをプロ
モータの下流に配置する。さらに、構造遺伝子の下流に
は、３'ＵＴＲを配置することができる。

【００４１】この発現カセットに用いられるプロモータ
は、特に限定はなく、この発現カセットが導入される宿
主細胞においてプロモータとして機能するものであれば
任意に選択して用いることができる。また、このプロモ
ータには、発現レベルの高いプロモータを用いることが
好適である。また、ＵＴＲは、例えば、プロモータと同
一の由来のものを用いることができる。

【００４２】例えば、昆虫細胞で機能するプロモータ、
ＵＴＲとしては、バキュロウイルスのポリヘドリンプロ
モータ（配列番号１６）などを用いることができる。

【００４３】また、上記発現カセットのフランキング領
域には、上記構造遺伝子の発現の実行、促進に影響のな
い範囲で、他の核酸配列を備えることができる。例え
ば、フランキング領域にベクター配列を備えて、発現ベ
クターとして構成することも好適である。

【００４４】ベクター配列を備えることにより、自己複
製能を付与することができるため、発現カセットの増幅
や宿主細胞への導入に有利となる。また、宿主細胞で複
製し得るベクターを用いることにより、発現カセットに
つながれている構造遺伝子の発現を宿主細胞内で安定的
又は継続的に実行させることができる。

【００４５】ここで用いるベクターは、特に限定はな
く、原核生物において自己複製能を有するベクターを用
いても良い。このように原核生物において自己複製能を
有するベクターを用いることにより、原核生物内で発現
カセットを簡易にかつ迅速に複製させることが可能とな
る。このようなベクターとしては、例えば、ｐＲＢ３２
２、ｐＵＣなどのプラスミドベクターのほか、ファージ
ベクターを用いることもできる。

【００４６】また、真核生物におけるベクターとして
は、例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのウイル
スベクターなどを用いることができる。好適には、この
発現ベクターが導入される宿主細胞において複製能を有
するベクターを選択する。例えば、昆虫細胞を宿主細胞
とする場合には、バキュロウイルスベクターを用いるこ
とができる。また、このように発現ベクターを宿主細胞
とともに、発現用キットとして、提供することもでき
る。この発現ベクターに備えられた分泌シグナル配列の
下流に構造遺伝子をつなぐことにより、遺伝子発現を一
層簡易に実行させ、この結果、発現産物を容易に得るこ
とが可能となる。

【００４７】[第二の実施形態] ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１
２０の発現１．２.ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現核酸ＳＦ２型ＨＩＶは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に指向性を有するＨ
ＩＶであり、一方、上述したＳＦ１６２型ＨＩＶは、マ
クロファージに指向性を有するＨＩＶである。（J. Vio
l., Vol. 64, p4390-4398 (1990)、Nature, Vol.349,
p167-169 (1991)）。

【００４８】このような標的細胞への指向性は、ＨＩＶ
の糖蛋白質１２０（ｇｐ１２０）が関与することが明か
になっている。従って、このＨＩＶｇｐ１２０蛋白質
は、ＨＩＶに対する防御として有効な材料になることが
予想される。

【００４９】しかし、ＳＦ２型ＨＩＶのｇｐ１２０蛋白
質を人工的に発現させることが困難であるため、ｇｐ１
２０蛋白質を人工的に産生させることができなかった。

【００５０】そのため、上述したニワトリリゾチームの
分泌シグナル配列、ＳＦ１６２型ＨＩＶｇｐ１２０の分
泌シグナル配列を、ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現の実
行、促進のために用いることができる。

【００５１】上記分泌シグナル配列を用いて、ＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０発現を実行、促進させるためには、Ｓ
Ｆ２型ＨＩＶｇｐ１２０の上流に備えられている固有の
分泌シグナル配列を上記ニワトリ由来、ＳＦ１６２型の
分泌シグナル配列に置換することができる。なお、配列
番号１３には固有の分泌シグナル配列が備えられたＳＦ
２型ＨＩＶｇｐ１２０のｃＤＮＡ配列を示す。また、配
列番号１４には、固有のシグナル配列が除かれたＳＦ２
型ＨＩＶｇｐ１２０のｃＤＮＡ配列を、配列番号１５に
は、そのアミノ酸配列を示す。

【００５２】従って、シグナル配列が除かれたＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０の上流に、配列番号１又は配列番号１
１に示すニワトリリゾチーム由来又はＳＦ１６２型ＨＩ
Ｖｇｐ１２０の分泌シグナル配列を備えることができ
る。

【００５３】このように分泌シグナル配列が置換された
ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０を実際に発現させるために
は、発現ベクターに上記構成を挿入することができる。

【００５４】このベクターは、特に限定はなく、目的に
応じて選択することができる。例えば、ｇｐ１２０は糖
蛋白質であることから、糖鎖修飾可能な宿主細胞で複製
可能なベクターを用いることができる。このような宿主
細胞としては、例えば、昆虫細胞ＳＦ２１などを用いる
ことができ、昆虫細胞を宿主として選択した場合には、
ベクターとしては、バキュロウイルスベクターを用いる
ことができる。

【００５５】また、発現ベクター上には、プロモータ、
ＵＴＲなどが備えられるが、このプロモータ、ＵＴＲな
どは、ベクターと同様に宿主細胞で機能し得るものを選
択することができる。例えば、上記昆虫細胞を宿主とし
て用いる場合には、発現活性の高いバキュロウイルスポ
リヘドリンプロモータを好適に用いることができる。ま
た、これに対応して、ＵＴＲもポリヘドリン由来のもの
を用いることができる。

【００５６】これらポリヘドリンプロモータ、ＵＴＲを
備えたバキュロウイルスベクターは、「ｐＶＬ１３９
２」、「ｐＶＬ１３９３」（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ
社）として市販されており、これを用いることができ
る。このｐＶＬ１３９２又は１３９３には、ポリヘドリ
ンプロモータの下流にマルチクローニングサイトが備え
られている。そのため、このクローニングサイトに、上
記ニワトリリゾチーム由来又はＳＦ１６２型ＨＩＶの分
泌シグナル配列を備えたＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０を挿
入することにより発現ベクターを生成することができ
る。

【００５７】２.ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現細胞ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０を安定的又は継続的に発現さ
せて、ｇｐ１２０発現産物を得るためには、上記発現ベ
クターを宿主細胞に導入し発現細胞を創生することが好
ましい。

【００５８】例えば、上述したバキュロウイルスベクタ
ーを用いた発現ベクターでは、この発現ベクターをリポ
フェクチン法などによりバキュロウイルスに導入し、組
換えウイルスを作成する。そして、この組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させることにより、上記発現ベクター
を昆虫細胞に導入することができる。

【００５９】そして、創製された発現細胞内では、ＳＦ
２型ＨＩＶｇｐ１２０ｍＲＮＡが生成される。また、細
胞外には、天然のＳＦ２型ｇｐ１２０が有するＣＤ４⁺
Ｔ細胞へ結合能を保持したＳＦ２型ｇｐ１２０糖蛋白質
を分泌させることができる。

【００６０】従って、この発現細胞を用いることによ
り、ＳＦ２型ｇｐ１２０の大量生成が可能となり、ＨＩ
Ｖｇｐ１２０のワクチンなどのＨＩＶを防御するための
材料として用いることが可能となる。

【００６１】[第三の実施形態] 分泌シグナル配列にお
ける遺伝子発現促進活性の判定方法本願発明者は、分泌シグナル配列により遺伝子の転写が
実行、促進されて、遺伝子の発現が実行、促進されるこ
とを発見している。そのため、分泌シグナル配列を備え
た遺伝子の転写レベルをモニターすることにより、その
分泌シグナル配列が、転写、翻訳などを含めた遺伝子の
発現を実行、促進させるか否かを判定することができ
る。

【００６２】１．発現ベクターの調製先ず判定を行うためには、被検体である分泌シグナル配
列を、モニタ遺伝子の上流の連結し、これを発現ベクタ
ー上のプロモータと３'ＵＴＲとの間に挿入して、発現
ベクターを構築する。

【００６３】ここで、モニタ遺伝子には、遺伝子発現が
実行されない又はされ難い遺伝子、例えば、第二の実施
形態に示したＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０のｃＤＮＡ（配
列番号１４などを用いることができる。

【００６４】また、このベクターとしては、例えば、ポ
リヘドリンプロモータ及び３'ＵＴＲを備えたバキュロ
ウイルスを用いることができるが、このベクターに限定
されるものではない。

【００６５】本判定方法の陽性対照としては、ＳＦ１６
２型ＨＩＶｇｐ１２０の分泌シグナル配列又はニワトリ
リゾチームの分泌シグナルを用いることができる。一
方、陰性対照としては、ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０の分
泌シグナル配列を用いることができる。

【００６６】このように、被検体の分泌シグナル、対照
の分泌シグナル配列をそれぞれモニタ遺伝子の上流に連
結し、これを上記発現ベクターのプロモータの下流に発
現可能に接続して、検体、対照の発現ベクターが構築さ
れる。

【００６７】２．発現ベクターの細胞への導入発現ベクターの構築後、発現ベクターを細胞に導入す
る。

【００６８】この発現ベクターの細胞への導入は、ベク
ターや細胞の種類により適切な方法を用いることができ
る。例えば、上記バキュロウイルスベクターの場合に
は、発現ベクターをリポフェクチン法などによりバキュ
ロウイルスに導入する。そして、この組換えバキュロウ
イルスを昆虫細胞、例えばＳＦ２１細胞に感染導入す
る。

【００６９】３．発現量の測定発現ベクターが導入された細胞において、上記モニタ遺
伝子の発現量を測定する。この発現量の測定は、翻訳産
物である蛋白質の産生量に基づいて測定することもで
き、また、転写産物であるｍＲＮＡの産生量に基づいて
測定することもできる。

【００７０】さらに、これを組み合わせて、先ず、転写
産物の産生量を測定し、次に、翻訳産物の産生量を測定
してもよい。例えば、転写産物の産生量に基づき、分泌
シグナル配列の上記活性を測定し、さらに翻訳産物に基
づき、細胞外に分泌されているか等を判定してもよい。

【００７１】この転写産物の産生量を測定するために
は、各発現ベクターが導入された細胞から核酸を抽出す
る。そして、抽出核酸中に、モニタ遺伝子に対するｍＲ
ＮＡをノーザンブロッティング法により検出することが
できる。なお、この核酸の抽出、ノーザンブロッティン
グ法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕ
ｒＰｒｅｓｓ）のなどの方法を用いて行うことができ
る。

【００７２】また、翻訳産物は、免疫学的方法、例え
ば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどのよう
に、翻訳産物（蛋白質）に特異的な抗体を用いて検出す
ることができる。

【００７３】本実施形態のように、転写産物の産生量に
より分泌シグナル配列における遺伝子発現促進活性を測
定可能にすることにより、翻訳産物である蛋白質に特異
的な抗体を有していない場合などでも、上記活性の判定
を行うことが可能となる。また、一般に特異抗体を有し
ている場合でも、このようなコストのかかる材料を用い
ることなく、上記分泌シグナル配列における遺伝子発現
促進活性を測定することができる。

【００７４】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明す
るが、本発明は、これに限定されるものではない。

【００７５】[実施例１]ニワトリリゾチームの発現上昇プラスミドｐＶＬ１３９３ＬｙｚＩは、ｐＶＬ１３９３
（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を骨格とし、そこにニワトリ
由来のリゾチーム遺伝子とその上流に酵母のインベルタ
ーゼ由来シグナル配列（配列番号５）が挿入されてい
る。このシグナル配列を有するリゾチーム遺伝子は、大
腸菌及び酵母において、発現させ得るが、発現された蛋
白質が分泌せずに封入体を形成した。そこで、上記プラ
スミドを用いて、昆虫細胞で発現及びその分泌を試みた
が、蛋白質は分泌されず、また発現も非常に低いことが
わかった。

【００７６】そのため、このプラスミド上のシグナル配
列を各種のシグナル配列に置き換えて、その発現活性及
び分泌能の有無を調べた。

【００７７】なお、ここで用いたシグナル配列を表１に
示し、またこれらのシグナル配列及びシグナルペプチド
を配列表（配列番号１，２：ニワトリリゾチームシグナ
ル配列/ペプチド、配列番号３：バチルスブレビスＣＷ
Ｐシグナル配列／ペプチド、配列番号４：ショウジョウ
バエリゾチームシグナル配列／ペプチド、配列番号６：
Ｌ８ＬＰシグナル配列／ペプチド、配列番号７、８：ハ
チ毒シグナル配列／ペプチド）に示した。さらに、これ
らシグナル配列の置換手順を図１に示した。

【表１】

【００７８】図１に示すように、ｐＶＬ１３９３Ｌｙｚ
ＩをＢａｍＨＩとＮｈｅＩで消化し、酵母インベルター
ゼのシグナル配列及びリゾチーム遺伝子の上流を削除し
た。一方で、シグナル配列を有するリゾチームの上流配
列をＰＣＲによりそれぞれ合成した。各合成産物を上記
消化後のｐＶＬ１３９３ＬｙｚＩに接続し、シグナル配
列が置換されたプラスミドを構築した。

【００７９】ここで、得られたプラスミドを昆虫細胞に
導入し、細胞内での発現量及び細胞外への分泌量をそれ
ぞれ細胞内及び細胞外のリゾチーム活性に基づいて測定
した。測定結果を図２に示す。なお、図２では、細胞内
でのリゾチームを活性（Ａ）と、細胞外のリゾチーム活
性を（Ｂ）それぞれ別のグラフとして表示した。

【００８０】図２（Ａ）に示すように、細胞内のリゾチ
ーム活性は、酵母インベルターゼ由来のシグナル配列を
有するもの（図において「Ｉ」で表示）では、ほとんど
活性が認められなかった。しかし、ニワトリリゾチーム
シグナル配列（「Ｃ」）、ショウジョウバエリゾチーム
シグナル配列（「Ｆ」）では、陽性のコントロールとし
て用いたハチ毒メルチンシグナル配列（「Ｍ」）と同程
度の活性がみとめられ、その活性の消長も経時的に低下
する同様のパターンを示した。また、バチルスブレビス
ＣＷＰ（「Ｂ」）及びＬ８ＬＰシグナル配列（「Ｌ」）
は弱いながらも細胞内のリゾチーム活性が見られた。

【００８１】一方、細胞外のリゾチーム活性は、ニワト
リリゾチームシグナル配列、ショウジョウバエリゾチー
ムシグナル配列では、ハチ毒メルチンシグナル配列
（「Ｍ」）と同様に高い活性が示され、またその活性は
時間の経過とともに上昇し、細胞内の活性と対称的であ
ることが示された。このことから、ニワトリリゾチーム
シグナル配列、ショウジョウバエリゾチームシグナル配
列も、ハチメルチンシグナル配列と同様に蛋白質の発現
量を上昇させ、さらに蛋白質を細胞外に分泌させ得るこ
とが示された。

【００８２】[実施例２] ＨＩＶ糖蛋白質（ｇｐ１２
０）の発現分泌を調べるための材料以下の実施例においては、発現分泌量が著しく低いこと
が見出されているＨＩＶ-１ＳＦ２ｒｇｐ１２０のシグ
ナル配列を置換し、発現分泌量を上昇させ得るかを調べ
る。そのため、本実施例では、この解析を行うための材
料を調製した。

【００８３】（１）ベクターの調製先ず、ＨＩＶ-１ＳＦ２ｒｇｐ１２０は、バキュロウイ
ルスベクターを骨格とし、ＨＩＶ−１株のｇｐ１２０と
その上流にＳＦ２のシグナル配列（配列番号９、１０）
とが担持されている。また、このＳＦ２シグナル配列と
置換するシグナル配列を表２に示した。

【００８４】

【表２】すなわち、シグナル配列は、上記実施例１において、発
現及び分泌促進が観察されたシグナル配列のうちニワト
リリゾチーム由来シグナル配列（配列番号１）、新たに
ＳＦ１６２型ＨＩＶのシグナル配列（配列番号１１）を
準備した。また陽性コントロールとして、上記ハチ毒メ
ルチンのシグナル配列（配列番号７）を用いた。

【００８５】なお、ＳＦ２型ＨＩＶはＴ細胞に指向し、
ＳＦ１６２型ＨＩＶはマクロファージに指向する。

【００８６】ＨＩＶ-１ＳＦ２ｇｐ１２０の構成及び、
上記各シグナル配列への置換の手順を図３に示した。

【００８７】図３に示すように、ＳＦ２のシグナル配列
を有する組換えｇｐ１２０（ＳＦ２−ｒｇｐ１２０）を
出発材料として用いた。このＳＦ２−ｒｇｐ１２０は、
ｇｐ１２０配列上に２塩基のサイレント変異が挿入され
ている。この変異をＰＣＲによる変異法により、変異し
ている塩基を元に戻しＳＦ２−ｇｐ１２０（配列番号１
３、ｇｐ１２０のみを配列番号１４に示す）とするとと
もに、ＨｉｎｄIII部位を形成させた（Ｓ０１）。

【００８８】その後、ＳＦ２−ｇｐ１２０をＨｉｎｄII
I及びＥｃｏＲＩにより消化し、一部上流配列を欠いた
ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｄｅｌ）を取り出し、シグナル
配列を除去した（Ｓ０２）。また、このｇｐ１２０ｄｅ
ｌを回収するために、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで消
化したｐＢＲ３２２を調製した（Ｓ０３）。ここで調製
されたｐＢＲ３２２にｇｐ１２０ｄｅｌを接続し、ｐＢ
Ｒ３２２-ｇｐ１２０ｄｅｌを得た。

【００８９】一方、ｇｐ１２０の上流に各シグナル配列
を挿入するために、上記各シグナル配列とｇｐ１２０の
上流配列にＳＦ２シグナル配列が備えられたＤＮＡを市
販のＤＮＡ合成器を用いて合成した。ここで合成された
ＤＮＡに、さらにＰＣＲを行いて、上流末端にＢａｍＨ
Ｉサイトを、下流末端にＨｉｎｄIIIサイトを付加した
（Ｓ０５）。

【００９０】このＰＣＲ断片は、次いでＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｄIIIとにより消化した上記ｐＢＲ３２２−ｇｐ１
２０ｄｅｌに挿入され、ｐＢＲ３２２ＳＦ２−ｇｐ１２
０が生成された（Ｓ０６）。

【００９１】最終的に、昆虫細胞内での発現を観察する
ために、ｐＢＲ３２２からバキュロウイルスベクター
（ｐＶＬ１３９３）につなぎ換えられ、ｐＶＬ１３９３
ＳＦ２−ｇｐ１２０が構築された（Ｓ０７）。

【００９２】同様の操作により、ＳＦ１６２のシグナル
配列を有するｐＶＬ１３９３ＳＦ１６２−ｇｐ１２０、
ニワトリリゾチームのシグナル配列を有するｐＶＬ１３
９３ｃＬ−ｇｐ１２０、さらには陽性コントロールであ
るハチ毒シグナル配列を有するｐＶＬ１３９３ＨＭＳＦ
２−ｇｐ１２０を構築した。

【００９３】なお、上記ｐＶＬ１３９３には、バキュロ
ウイルス・ポリヘドリンのプロモータ（配列番号１６）
が担持されており、このプロモータにより各シグナル配
列を有するｇｐ１２０が発現される。

【００９４】（２）組換えバキュロウイルスの調製野生型バキュロウイルスの多核体遺伝子部位のＬａｃＺ
遺伝子が導入されたＡｃＰＲ２３ＬａｃＺに上記各ベク
ターをリポフェクチン法により導入し、組換えバキュロ
ウイルスを作成した。

【００９５】昆虫細胞のＳｆ２１細胞（Invtorgen社）
(１．０〜１．５ｘ１０⁶個/ｍｌ)２ｍｌを３５ｍｍ径シ
ャーレにまき、２７度で静置し、細胞をシャーレ底面に
付着させた。

【００９６】マイクロチューブにＡｃＰＲ２３ＬａｃＺ
／Ｂｓｕ３６Ｉ１００ｎｇ及び上記各ベクターＤＮＡ
１μｇを注入し、蒸留水で総容量２０μｌとしてウイル
ス/ＤＮＡ混合液をそれぞれ調製した。次いで、リポフ
ェクチン試薬４μｌと蒸留水４μｌとを混合し、１５分
間静置後、上記各ウイルス/ＤＮＡ混合液に滴下した。

【００９７】上記シャーレ内の細胞を、血清非添加ＩＰ
Ｌ−４１培地で２回洗浄した。洗浄後、上記リポフェク
チンが添加された各ウイルス／ＤＮＡ混合液をそれぞれ
異なるシャーレに滴下し、２７℃で５〜一晩インキュベ
ートした。各シャーレに１ｍｌの１０％牛胎児血清含有
ＩＰＬ−４１培地を加えて、さらに３〜４日インキュベ
ートした。

【００９８】インキュベート後の培地をチューブに回収
し、２０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清である粗ウイ
ルス液をそれぞれ新しいマイクロチューブに移し、４℃
で保存した。

【００９９】これら粗ウイルス液から目的のウイルス
（ＬａｃＺ欠損ウイルス）をプラークアッセイ法により
純化した。

【０１００】ＳＦ２１細胞が付着した６０ｍｍ径シャー
レを複数準備し、１０−３〜１０−９程度まで段階希釈
した租ウイルス液をそれぞれ異なるシャーレに添加す
る。添加後、感染が均一に行われるように１０分間毎に
シャーレを揺らしながら、１時間感染させた。

【０１０１】感染後、上清を完全に除き、ＩＰＬ−４１
寒天培地（アガロースとＩＰＬ−４１培地とを等量混
合）を注入し固めて、３〜５日間培養した。培養後、さ
らにＸ―ｇａｌが添加されたＩＰＬ−４１寒天培地（寒
天培地２ｍｌあたり、ジメチルスルホキシドに溶解した
Ｘｇａｌ液（２０ｍｇ/ｍｌ）３０μｌ添加）をシャー
レに注入し固める。その後、２〜３日間培養して、プラ
ークの出現を確認した。

【０１０２】出現したプラークのうち、目的のウイルス
によるプラークはＬａｃＺ欠損により白色を呈すること
から、白色プラークをチューブに回収した。このチュー
ブに血清非添加ＩＰＬ−４１培地を注入し、激しく攪拌
して寒天からウイルスを溶出させ、純化ウイルス液を得
た。さらに、ＰＣＲにより純化された組換えウイルス中
にそれぞれ目的のＤＮＡが導入されているかを確認し
た。

【０１０３】[実施例３] ｇｐ１２０の発現分泌上記実施例２において調製された組換えウイルスを用い
て、ｇｐ１２０の発現分泌がシグナル配列の相違により
影響があるかを調べた。

【０１０４】上記組換えウイルスを同様の条件で昆虫細
胞Ｓｆ２１にに感染させ、各シグナル配列を有するｇｐ
１２０をそれぞれ発現させた。ウイルス感染４日後、細
胞培養液を試験管などに移し、２０００ｒｐｍ、５分間
遠心分離を行い、上清を回収した。この上清を用いてＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）、ウエスタンブロッティング法を実施し、各ｇｐ１
２０蛋白質の発現を確認した。

【０１０５】なお、ＳＤＳポリアクリルアミドは濃縮ゲ
ルを１０％とし、分離ゲルを７．５％として、常法に従
って行った。またウエスタンブロッティング法における
一次抗体には、抗ＨＩＶｒｇｐ１２０ヒツジ抗体（Inte
rnationalEnzymes社）を用い、また二次抗体には、ＨＲ
Ｐ標識化抗ヒツジＩｇＧウサギ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を
用い、常法に従って行った。

【０１０６】ウエスタンブロッティングの結果を図４に
示す。図４に示す通り、ＳＦ２シグナル配列を有するｇ
ｐ１２０では、発現が観察されないが、ニワトリリゾチ
ーム（ｃＬ）、ハチ毒（ＨＭ）、ＳＦ１６２のｇｐ１２
０から由来するシグナル配列に置換することにより、ｇ
ｐ１２０の発現及び分泌が可能となることが示された。
また、これらの発現分泌促進活性は、陽性のコントロー
ルとして用いたハチ毒由来シグナル配列よりも、ニワト
リリゾチーム由来シグナル配列がより高いことが示さ
れ、ＳＦ１６２のｇｐ１２０由来シグナル配列は、陽性
コントロールの半分程度の活性が示された。

【０１０７】なお、図４において、ＳＦ１６２−ｒｇｐ
１２０は、ＳＦ１６２ｇｐ１２０のシグナル配列の下流
に、ＳＦ１６２由来の組換えｇｐ１２０が接続されてい
たベクターを用いた結果を示す。また「ｍｏｃｋ」とし
て示したレーンは、ベクターが導入されていない親ウイ
ルス（ＡｃＰＲ２３ＬａｃＺ）を用いた陰性のコントロ
ールを示す。

【０１０８】[実施例４] ＧＰ１２０蛋白質における糖
鎖付加の確認ＧＰ１２０蛋白質は、本来糖蛋白質であるが、上記実施
例３において、発現分泌されたＧＰ１２０蛋白質が、糖
鎖が付加されているか否かを調べた。

【０１０９】ｇｐ１２０蛋白質に糖鎖が付加されている
かを調べるために、糖鎖を根元から切断するＮ-グルコ
シダーゼＦを用いて、脱糖鎖処理を行った。この脱糖鎖
処理は、具体的には以下のとおり行った。

【０１１０】上記実施例３に従って得られたｇｐ１２０
蛋白質を含む培養上清（４μｌ）に、０．５％ＳＤＳ−
０．２Ｍ２メルカプトエタノール（４μｌ）を混合し、
１００℃、３分間加熱した。

【０１１１】加熱後の混合液に、Ｎグルコシダーゼ反応
液（１２μｌ）を添加し、総量２０μｌとした。このＮ
グルコシダーゼ反応液の組成は、０．５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８．５）（４μｌ）、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）（０．８μｌ）、１/４希釈ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００(０．８μｌ)、Ｎ−グルコシダーゼＦ（２０Ｕ/
１００μｌ）（２μｌ）、蒸留水（４．４μｌ）であ
る。

【０１１２】上記Ｎグルコシダーゼ反応液を添加後、３
７℃、２４時間インキュベートし、脱糖鎖処理を行っ
た。脱糖鎖処理後、反応液を１０％ポリアクリルアミド
ゲルを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、陰性の
コントロールとして、Ｎ―グルコシダーゼ反応液からＮ
グルコシダーゼを除いて、同様の処理を行った。

【０１１３】このＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ゲルを
染色した際の結果を図５に示す。図５において、「−」
レーンは、Ｎ−グルコシダーゼを除いて処理した非脱糖
鎖処理サンプルを泳動し、「＋」レーンは、脱糖鎖処理
を行ったサンプルを泳動した。また、「ＣＨＯ」と記し
たレーンには、ＳＦ２型ＨＩＶを感染させたＣＨＯ細胞
から得られた天然のＳＦ２ｇｐ１２０糖蛋白質を泳動
し、糖鎖を有するＳＦ２由来ｇｐ１２０の陽性コントロ
ールとした。

【０１１４】図５に示す通り、ＳＦ２由来のｇｐ１２０
蛋白質（ＳＦ２−ｒｇｐ１２０）は、ニワトリリゾチー
ムのシグナル配列（ｃＬ）、ハチ毒のシグナル配列（Ｈ
Ｍ）、ＳＦ１６２のシグナル配を有する場合のいずれに
おいても、脱糖鎖処理を行うことにより、非脱糖鎖処理
サンプルのバンドにして分子量の小さい側にシフトして
いる。すなわち、脱糖鎖処理により分子量が小さくなっ
たことが示された。この脱糖鎖処理を行った際のバンド
シフトの程度は、陽性コントロールである感染ＣＨＯ細
胞から得られた天然のＳＦ２−ｇｐ１２０とほぼ同様の
パターンを示した。

【０１１５】このことから、これらニワトリリゾチー
ム、ＳＦ１６２、ハチ毒のシグナル配列をＳＦ２由来ｇ
ｐ１２０遺伝子に付加することにより、ＳＦ２由来ｇｐ
１２０蛋白質の発現分泌を可能又は上昇させるだけでな
く、天然の糖蛋白質と同様の糖鎖を付加させ得ることが
示された。

【０１１６】このことから、上記ニワトリリゾチーム、
ハチ毒、ＳＦ１６２のシグナル配列を有する発現系で
は、天然の蛋白質と同様に糖鎖を付加させ得ることが示
された。

【０１１７】[実施例５] 各シグナル配列が付加された
ＳＦ２型ｇｐ１２０蛋白質の生物活性ＳＦ２型ＨＩＶはＣＤ４⁺Ｔ細胞に指向し、結合してＣ
Ｄ４⁺Ｔ細胞を侵すウイルスである。また、天然のＳＦ
２型ｇｐ１２０蛋白質は、ＣＤ４との結合能を有してい
る。

【０１１８】ここでは上述の通り、各シグナルペプチド
を付加することにより得られたＳＦ２由来ｇｐ１２０蛋
白質が、天然のＳＦ２型ｇｐ１２０蛋白質と同様にＣＤ
４との結合能を有するかを、フローサイトメトリーを用
いた解析により調べた。

【０１１９】先ず、組換えＣＤ４（ｒＣＤ４）を発現さ
せたＨｅＬａ細胞（１〜５×１０⁵細胞）に、上記実施
例３において得られたｇｐ１２０蛋白質を含む培養上清
（１００μｌ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。インキュベート後、ＰＢＳを用いて２回洗浄
した。

【０１２０】ＰＥ（phycoerythrin）コンジュゲートＯ
ＫＴ４及び抗ＨＩＶヒトＩｇＧを添加し、４℃で１時間
インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳで２回
洗浄した。

【０１２１】さらに、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧを添加
し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベー
ト後、ＰＢＳで２回洗浄した。

【０１２２】洗浄後、フロサイトメトリーにかけて、Ｆ
ＩＴＣによる蛍光を発する細胞と、蛍光を発しない細胞
との細胞分布を調べ、各シグナルペプチドで置換された
ＳＦ２型ｇｐ１２０蛋白質のＣＤ４に対する結合能を解
析した。すなわち、各シグナルペプチドに置換されたＳ
Ｆ２−ｇｐ１２０蛋白質が、ＣＤ４発現細胞と結合すれ
ば、上記ＨＩＶヒト抗体が、ｇｐ１２０蛋白質を介し
て、細胞に結合する。そして、抗ＨＩＶヒト抗体には、
ＦＩＴＣ標識ヒトＩｇＧ抗体が結合して、細胞は蛍光を
発する。従って、蛍光を発する細胞の分布を調べれば、
ＣＤ４との結合能を解析することができる。フローサイ
トメリーの結果を図６に示す。

【０１２３】なお、この解析における陰性コントロール
には、実施例３においてｇｐ１２０蛋白質の発現が見ら
れなかったＳＦ２−ｒｇｐ１２０（ＳＦ２のシグナル配
列を有するＳＦ２由来ｇｐ１２０）が導入された細胞の
培養上清（図６において、ＳＦ２−ｒｇｐ１２０として
示す）、ベクターが導入されていない昆虫細胞の培養上
清（図６において「Ｍｏｃｋ」として示す）を用いた。
また、陽性コントロールとして、ＳＦ１６２のシグナル
配列を有するＳＦ１６２由来のｇｐ１２０を用いた。

【０１２４】図６に示す通り、陰性コントロールでは、
ほとんどの細胞の蛍光強度は低い（１０⁰から１０¹）。
一方、ニワトリリゾチームのシグナル配列、ハチ毒のシ
グナル配列、ＳＦ１６２のシグナル配列に置換されたＳ
Ｆ２−ｇｐ１２０では、陽性のコントロールと同様に、
細胞の蛍光強度が増強された（１０²から１０³）。この
ことから、上記シグナル配列に置換することにより発現
分泌されたｇｐ１２０蛋白質は、天然のｇｐ１２０蛋白
質の生物活性を有することが示された。

【０１２５】このことから、上記ニワトリリゾチーム、
ハチ毒、ＳＦ１６２のシグナル配列を有する発現系は、
機能性を有する蛋白質を発現分泌し得ることが示され
た。このことは、本発現系が、蛋白製剤、ワクチン製造
などに使用し得る蛋白質の生産に有効であることを意味
する。特に、生物活性を有するＳＦ２由来ｇｐ１２０蛋
白質の生成は、ＨＩＶワクチンの開発、生産などに大き
く寄与する。

【０１２６】[実施例６] ｍＲＮＡ発現への影響上述した実施例では、上記ニワトリリゾチーム由来、ハ
チ毒由来、又はＳＦ１６２型ＨＩＶ由来のシグナル配列
をＳＦ２由来ｇｐ１２０の遺伝子に付加することによ
り、ｇｐ１２０蛋白質の発現分泌促進が示されたが、本
実施例では、この発現分泌の促進が、ｍＲＮＡから蛋白
質への翻訳過程促進に依存したものであるか、それとも
ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写活性促進に依存するもので
あるかを調べた。

【０１２７】この解析に当たって、上記実施例３におい
て組換えウイルスが感染された昆虫細胞を用いた。な
お、この組換えウイルスは、実施例２において詳述した
通り、バキュロウイルスベクターのポリヘドリンプロモ
ータ下流にニワトリリゾチーム由来（ｃＬ）、ハチ毒由
来（ＨＭ）又はＳＦ１６２型ＨＩＶ由来（ＳＦ１６２）
のシグナル配列が付加されたＳＦ２由来ｇｐ１２０の遺
伝子が挿入されている。

【０１２８】これら各昆虫細胞から、ＡＧＰＡ法により
ｍＲＮＡを回収した。

【０１２９】具体的には、培養した昆虫細胞を回収し、
−８０℃で凍結させ、その後、氷上に移した。細胞にＳ
ｏｌｕｔｉｏｎＤ（グアニジン（イソ）チオシアネート
１２５ｍｌ、０．７５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
７）８．８ｍｌ、１０％サルコシル１３．２ｍｌを蒸留
水１４６．５ｍｌを加えて総容量２５０ｍｌにして調
整する）８００μｌを加えて、直ちにホモジナイザーに
よって細胞を粉砕した。

【０１３０】細胞粉砕後、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０）８０μｌ、続いてフェノール８００μｌ及びク
ロロホルム１６０μｌを添加して、１０秒間攪拌する。
攪拌後、氷上にて１５分間静置した。氷上での静置後、
４℃にて遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間）を行っ
た。このうち、水相を新しいチューブに移し、核酸を回
収した。

【０１３１】回収した核酸を精製するために、回収後の
水相にイソプロパノールを添加混合して、−２０℃で１
時間以上放置し、遠心分離により、沈さを回収した。回
収された沈さをＳｏｌｕｔｉｏｎＤを加えて完全に溶解
する。その後、このイソプロパノール沈殿を繰り返し
た。

【０１３２】遠心分離後、回収した沈さを風乾させた
後、純水４００μｌを添加し完全に溶解する。この溶解
液をフェノール／クロロホルム溶液にて精製処理を行っ
た。最終的にエタノール沈殿を行い、沈さを純粋に溶解
してＲＮＡサンプルとした。

【０１３３】ここで得られたＲＮＡサンプル中のＲＮＡ
を確認するために、電気泳動及びノーザンハイブリダイ
ゼーションを行った。

【０１３４】電気泳動を行う前に、上記サンプルを５５
℃、１０分間熱変性させ、その後、氷上に３分間放置し
た。また電気泳動用ゲルに、アガロースをＭＯＰＳ緩衝
液により溶解した５％アガロースゲルを用いた。

【０１３５】電気泳動後、泳動後のゲルをブロッティン
グ膜に密着させて、ゲル中のＲＮＡを膜に転写する。転
写後、ｇｐ１２０ｍＲＮＡを鋳型として生成した標識プ
ローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行っ
た。ノーザンブロッティングの結果を図７に示す。

【０１３６】図７に示すように、ＳＦ２由来シグナル配
列を有するＳＦ２−ｇｐ１２０（レーン１）では、ｍＲ
ＮＡの発現が全く観察されなかった。一方、ＳＦ１６２
由来シグナル配列（レーン２）、ハチ毒由来シグナル配
列（レーン３）、ニワトリリゾチーム由来シグナル配列
（ＣＬ）を有するＳＦ２−ｇｐ１２０では、それぞれｍ
ＲＮＡの発現が観察された。

【０１３７】このように、これらＳＦ１６２由来シグナ
ル配列、ハチ毒由来シグナル配列、ニワトリリゾチーム
由来シグナル配列をＳＦ２由来ｇｐ１２０遺伝子に付加
することにより、ＳＦ２由来のシグナル配列を備えたＳ
Ｆ２由来ｇｐ１２０遺伝子におけるｍＲＮＡの発現を可
能又は促進させることが示された。

【０１３８】よって、この結果より、これらシグナル配
列によるｇｐ１２０蛋白質の発現分泌促進は、ｍＲＮＡ
の転写レベルの促進が一つの起因になっていることが示
された。

【０１３９】従来、シグナル配列は、翻訳後の蛋白質の
輸送、糖鎖の付加などの修飾に関与していると考えられ
ていたが、ここで、ｍＲＮＡの転写を促進させる活性が
あることが示された。このことは、これらシグナル配列
が、蛋白質の発現分泌を促進させる目的で使用し得るだ
けでなく、ｍＲＮＡの転写を促進させるために使用し得
ることが示された。特に、本実施例では、上記３種のシ
グナル配列が、ＳＦ２由来ｇｐ１２０の転写促進活性が
あることを示したが、実施例１に示したリゾチーム発現
分泌の促進についても、ｍＲＮＡ転写活性の促進に起因
すると考えられる。このことから、これらシグナル配列
は、ＳＦ２型ｇｐ１２０遺伝子を初めとする種々の遺伝
子のｍＲＮＡ発現を促進し得ることが考えられる。

【０１４０】

【配列表】 <1１0> Hara、Toshio <120> Nucleic acid enhancing the expression of genes <130> 284-1 <160>１６ <170> PatentIn Ver. 2.0 - beta <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Chicken <220> <221> sig#peptide <222> (1)..(54) <400> 1 atg agg tct ttg cta atc ttg gtg ctt tgc ttc ctg ccc ctg gct gct 48 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 ctg ggg 54 Leu Gly <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Chicken <400> 2 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Bacillus brevis <400> 3 Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 20 25 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Fruit Fly <400> 4 Met Lys Ala Phe Ile Val Leu Val Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Ala 1 5 10 15 Phe Gly <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Yeast <400> 5 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala Trp Ser Asn Met 20 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> L8LP <400> 6 Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Honeybee <220> <221> sig#peptide <222> (1)..(63) <400> 7 atg aaa ttc tta gtc aac gtt gcc ctt gtt ttt atg gtc gtg tac att 48 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 tct tac atc tat gcg 63 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Honeybee <400> 8 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 9 <211> 87 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> sig#peptide <222> (1)..(87) <400> 9 atg aaa gtg aag ggg acc agg agg aat tat cag cac ttg tgg aga tgg 48 Met Lys Val Lys Gly Thr Arg Arg Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp 1 5 10 15 ggc acc ttg ctc ctt ggg atg ttg atg atc tgt agt gct 87 Gly Thr Leu Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 10 Met Lys Val Lys Gly Thr Arg Arg Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp 1 5 10 15 Gly Thr Leu Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25 <210> 11 <211> 87 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> sig#peptide <222> (1)..(87) <400> 11 atg aga gtg aag ggg atc agg aag aat tat cag cac ttg tgg aga ggg 48 Met Arg Val Lys Gly Ile Arg Lys Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Gly 1 5 10 15 ggc acc ttg ctc ctt ggg atg ttg atg atc tgt agt gct 87 Gly Thr Leu Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 12 Met Arg Val Lys Gly Ile Arg Lys Asn Tyr Gln His Leu Trp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Thr Leu Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala 20 25 <210> 13 <211> 1530 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 13 atgaaagtga aggggaccag gaggaattat cagcacttgt ggagatgggg caccttgctc 60 cttgggatgt tgatgatctg tagtgctaca gaaaaattgt gggtcacagt ttattatgga 120 gtacctgtgt ggaaagaagc aactaccact ctattttgtg catcagatgc tagagcatat 180 gatacagagg tacataatgt ttgggccaca catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca 240 caagaagtag tattgggaaa tgtgacagaa aattttaaca tgtggaaaaa taacatggta 300 gaacagatgc aggaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcctaaagcc atgtgtaaaa 360 ttaaccccac tctgtgttac tttaaattgc actgatttgg ggaaggctac taataccaat 420 agtagtaatt ggaaagaaga aataaaagga gaaataaaaa actgctcttt caatatcacc 480 acaagcataa gagataagat tcagaaagaa aatgcacttt ttcgtaacct tgatgtagta 540 ccaatagata atgctagtac tactaccaac tataccaact ataggttgat acattgtaac 600 agatcagtca ttacacaggc ctgtccaaag gtatcatttg agccaattcc catacattat 660 tgtaccccgg ctggttttgc gattctaaag tgtaataata aaacgttcaa tggaaaagga 720 ccatgtacaa atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccaat agtgtcaact 780 caactgctgt taaatggcag tctagcagaa gaagaggtag taattagatc tgacaatttc 840 acgaacaatg ctaaaaccat aatagtacag ctgaatgaat ctgtagcaat taactgtaca 900 agacccaaca acaatacaag aaaaagtatc tatataggac cagggagagc atttcataca 960 acaggaagaa taataggaga tataagaaaa gcacattgta acattagtag agcacaatgg 1020 aataacactt tagaacagat agttaaaaaa ttaagagaac agtttgggaa taataaaaca 1080 atagtcttta atcaatcctc aggaggggac ccagaaattg taatgcacag ttttaattgt 1140 agaggggaat ttttctactg taatacaaca caactgttta ataatacatg gaggttaaat 1200 cacactgaag gaactaaagg aaatgacaca atcatactcc catgtagaat aaaacaaatt 1260 ataaacatgt ggcaggaagt aggaaaagca atgtatgccc ctcccattgg aggacaaatt 1320 agttgttcat caaatattac agggctgcta ttaacaagag atggtggtac aaatgtaact 1380 aatgacaccg aggtcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa 1440 ttatataaat ataaagtaat aaaaattgaa ccattaggaa tagcacccac caaggcaaag 1500 agaagagtgg tgcagagaga aaaaagataa 1530 <210> 14 <211> 1443 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <220> <221> CDS <222> (88)..(1443) <400> 14 acagaaaaat tgtgggtcac agtttattat ggagtacctg tgtggaaaga agcaactacc 60 actctatttt gtgcatcaga tgctaga gca tat gat aca gag gta cat aat gtt 114 Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val 1 5 tgg gcc aca cat gcc tgt gta ccc aca gac ccc aac cca caa gaa gta 162 Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val 10 15 20 25 gta ttg gga aat gtg aca gaa aat ttt aac atg tgg aaa aat aac atg 210 Val Leu Gly Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met 30 35 40 gta gaa cag atg cag gag gat ata atc agt tta tgg gat caa agc cta 258 Val Glu Gln Met Gln Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu 45 50 55 aag cca tgt gta aaa tta acc cca ctc tgt gtt act tta aat tgc act 306 Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu Asn Cys Thr 60 65 70 gat ttg ggg aag gct act aat acc aat agt agt aat tgg aaa gaa gaa 354 Asp Leu Gly Lys Ala Thr Asn Thr Asn Ser Ser Asn Trp Lys Glu Glu 75 80 85 ata aaa gga gaa ata aaa aac tgc tct ttc aat atc acc aca agc ata 402 Ile Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile 90 95 100 105 aga gat aag att cag aaa gaa aat gca ctt ttt cgt aac ctt gat gta 450 Arg Asp Lys Ile Gln Lys Glu Asn Ala Leu Phe Arg Asn Leu Asp Val 110 115 120 gta cca ata gat aat gct agt act act acc aac tat acc aac tat agg 498 Val Pro Ile Asp Asn Ala Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Thr Asn Tyr Arg 125 130 135 ttg ata cat tgt aac aga tca gtc att aca cag gcc tgt cca aag gta 546 Leu Ile His Cys Asn Arg Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val 140 145 150 tca ttt gag cca att ccc ata cat tat tgt acc ccg gct ggt ttt gcg 594 Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Thr Pro Ala Gly Phe Ala 155 160 165 att cta aag tgt aat aat aaa acg ttc aat gga aaa gga cca tgt aca 642 Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Lys Gly Pro Cys Thr 170 175 180 185 aat gtc agc aca gta caa tgt aca cat gga att agg cca ata gtg tca 690 Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Ile Val Ser 190 195 200 act caa ctg ctg tta aat ggc agt cta gca gaa gaa gag gta gta att 738 Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile 205 210 215 aga tct gac aat ttc acg aac aat gct aaa acc ata ata gta cag ctg 786 Arg Ser Asp Asn Phe Thr Asn Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu 220 225 230 aat gaa tct gta gca att aac tgt aca aga ccc aac aac aat aca aga 834 Asn Glu Ser Val Ala Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg 235 240 245 aaa agt atc tat ata gga cca ggg aga gca ttt cat aca aca gga aga 882 Lys Ser Ile Tyr Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe His Thr Thr Gly Arg 250 255 260 265 ata ata gga gat ata aga aaa gca cat tgt aac att agt aga gca caa 930 Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Gln 270 275 280 tgg aat aac act tta gaa cag ata gtt aaa aaa tta aga gaa cag ttt 978 Trp Asn Asn Thr Leu Glu Gln Ile Val Lys Lys Leu Arg Glu Gln Phe 285 290 295 ggg aat aat aaa aca ata gtc ttt aat caa tcc tca gga ggg gac cca 1026 Gly Asn Asn Lys Thr Ile Val Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro 300 305 310 gaa att gta atg cac agt ttt aat tgt aga ggg gaa ttt ttc tac tgt 1074 Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys 315 320 325 aat aca aca caa ctg ttt aat aat aca tgg agg tta aat cac act gaa 1122 Asn Thr Thr Gln Leu Phe Asn Asn Thr Trp Arg Leu Asn His Thr Glu 330 335 340 345 gga act aaa gga aat gac aca atc ata ctc cca tgt aga ata aaa caa 1170 Gly Thr Lys Gly Asn Asp Thr Ile Ile Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln 350 355 360 att ata aac atg tgg cag gaa gta gga aaa gca atg tat gcc cct ccc 1218 Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro 365 370 375 att gga gga caa att agt tgt tca tca aat att aca ggg ctg cta tta 1266 Ile Gly Gly Gln Ile Ser Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu 380 385 390 aca aga gat ggt ggt aca aat gta act aat gac acc gag gtc ttc aga 1314 Thr Arg Asp Gly Gly Thr Asn Val Thr Asn Asp Thr Glu Val Phe Arg 395 400 405 cct gga gga gga gat atg agg gac aat tgg aga agt gaa tta tat aaa 1362 Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys 410 415 420 425 tat aaa gta ata aaa att gaa cca tta gga ata gca ccc acc aag gca 1410 Tyr Lys Val Ile Lys Ile Glu Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Lys Ala 430 435 440 aag aga aga gtg gtg cag aga gaa aaa aga taa 1443 Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 445 450 <210> 15 <211> 451 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 15 Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val 1 5 10 15 Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Gly Asn Val Thr Glu 20 25 30 Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met Gln Glu Asp 35 40 45 Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr 50 55 60 Pro Leu Cys Val Thr Leu Asn Cys Thr Asp Leu Gly Lys Ala Thr Asn 65 70 75 80 Thr Asn Ser Ser Asn Trp Lys Glu Glu Ile Lys Gly Glu Ile Lys Asn 85 90 95 Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asp Lys Ile Gln Lys Glu 100 105 110 Asn Ala Leu Phe Arg Asn Leu Asp Val Val Pro Ile Asp Asn Ala Ser 115 120 125 Thr Thr Thr Asn Tyr Thr Asn Tyr Arg Leu Ile His Cys Asn Arg Ser 130 135 140 Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile 145 150 155 160 His Tyr Cys Thr Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys 165 170 175 Thr Phe Asn Gly Lys Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys 180 185 190 Thr His Gly Ile Arg Pro Ile Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly 195 200 205 Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Asp Asn Phe Thr Asn 210 215 220 Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Glu Ser Val Ala Ile Asn 225 230 235 240 Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Tyr Ile Gly Pro 245 250 255 Gly Arg Ala Phe His Thr Thr Gly Arg Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys 260 265 270 Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Gln Trp Asn Asn Thr Leu Glu Gln 275 280 285 Ile Val Lys Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Val 290 295 300 Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe 305 310 315 320 Asn Cys Arg Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Thr Gln Leu Phe Asn 325 330 335 Asn Thr Trp Arg Leu Asn His Thr Glu Gly Thr Lys Gly Asn Asp Thr 340 345 350 Ile Ile Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu 355 360 365 Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Gly Gly Gln Ile Ser Cys 370 375 380 Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Thr Asn 385 390 395 400 Val Thr Asn Asp Thr Glu Val Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg 405 410 415 Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Ile Lys Ile Glu 420 425 430 Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg 435 440 445 Glu Lys Arg 450 <210> 16 <211> 738 <212> DNA <213> Baculovirus <400> 16 atgccggatt attcataccg tcccaccatc gggcgtacct acgtgtacga caacaagtac 60 tacaaaaatt taggtgccgt tatcaagaac gctaagcgca agaagcactt cgccgaacat 120 gagatcgaag aggctaccct cgacccccta gacaactacc tagtggctga ggatcctttc 180 ctgggacccg gcaagaacca aaaactcact ctcttcaagg aaatccgtaa tgttaaaccc 240 gacacgatga agcttgtcgt tggatggaaa ggaaaagagt tctacaggga aacttggacc 300 cgcttcatgg aagacagctt ccccattgtt aacgaccaag aagtgatgga tgttttcctt 360 gttgtcaaca tgcgtcccac tagacccaac cgttgttaca aattcctggc ccaacacgct 420 ctgcgttgcg accccgacta tgtacctcat gacgtgatta ggatcgtcga gccttcatgg 480 gtgggcagca acaacgagta ccgcatcagc ctggctaaga agggcggcgg ctgcccaata 540 atgaaccttc actctgagta caccaactcg ttcgaacagt tcatcgatcg tgtcatctgg 600 gagaacttct acaagcccat cgtttacatc ggtaccgact ctgctgaaga ggaggaaatt 660 ctccttgaag tttccctggt gttcaaagta aaggagtttg caccagacgc acctctgttc 720 actggtccgg cgcgttag 738

【発明の効果】以上の通り、本発明のシグナル配列は、
これを遺伝子に付加することにより、転写、翻訳、さら
には、翻訳後の蛋白質の分泌、糖鎖付加などの修飾など
を含む遺伝子発現を実行又は促進することが可能となっ
た。

【０１４１】また、このシグナル配列を有する発現ベク
ターを用いることにより、ｍＲＮＡの生成、蛋白質の発
現分泌を促進させることから、ｍＲＮＡの生成、蛋白質
の生成を容易にさせた。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるリゾチーム遺伝子の上流に
分泌シグナル配列を挿入したベクターの構築工程を示す
図である。

【図２】実施例１における各分泌シグナル配列による
リゾチーム蛋白質の細胞内（Ａ）又は細胞外（Ｂ）の生
成量を経時的に測定した結果を示すグラフである。

【図３】実施例２におけるＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０
遺伝子を用いて、分泌シグナル配列における遺伝子発現
促進活性を測定するための発現ベクターの構築工程を示
す図である。

【図４】実施例３において、各分泌シグナル配列によ
るＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０の発現分泌活性の有無を判
定した際の電気泳動写真を示す図である。

【図５】分泌シグナル配列の付加により発現分泌され
た各ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質をグリコシダーゼ
で処理して、糖鎖修飾されているかを判定した際の電気
泳動写真を示す図である。

【図６】分泌シグナル配列の付加により発現分泌され
た各ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質が天然のＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０蛋白質と同様に、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対
する結合能をフローサイトメトリにより測定した際の結
果を示す図である。

【図７】分泌シグナル配列の付加により各ＳＦ２型Ｈ
ＩＶｇｐ１２０ｍＲＮＡ発現が誘導されたことを示す電
気泳動図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｒ 1:91） 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロモータに発現可能に連結される任意
の構造遺伝子の上流に挿入され、前記プロモータからの
前記構造遺伝子の発現を実行又は促進させ得る核酸であ
って、前記核酸が、ニワトリリゾチームの分泌シグナル配列又
はＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウイルス（ＨＩＶ）
ｇｐ１２０の分泌シグナル配列であることを特徴とする
核酸。
【請求項２】前記ニワトリリゾチームの分泌シグナル
配列が、配列番号１に示す配列であることを特徴とする
請求項１に記載の核酸。
【請求項３】前記ＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウ
イルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列が、配
列番号１１に示す配列であることを特徴とする請求項１
に記載の核酸。
【請求項４】構造遺伝子の発現を実行又は促進させる
ための発現カセットであって、前記構造遺伝子に発現可
能に接続されるプロモータと、前記構造遺伝子の上流に
配置され、前記プロモータから前記構造遺伝子と一体的
に発現される分泌シグナル配列と、前記構造遺伝子の下
流に配置される３'ＵＴＲと、を備え、前記分泌シグナ
ル配列が、ニワトリリゾチームの分泌シグナル配列又は
ＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウイルス（ＨＩＶ）ｇ
ｐ１２０の分泌シグナル配列であることを特徴とする発
現カセット。
【請求項５】前記ニワトリリゾチームの分泌シグナル
配列が、配列番号１に示す配列であることを特徴とする
請求項４に記載の発現カセット。
【請求項６】前記ＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウ
イルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列が、配
列番号１１に示す配列であることを特徴とする請求項４
に記載の発現カセット。
【請求項７】前記プロモータ及び前記３'ＵＴＲが、
バキュロウイルスのポリヘドリン由来であることを特徴
とする請求項４〜６のいずれかに記載の発現カセット。
【請求項８】請求項４〜７のいずれかに記載の発現カ
セットを担持したベクター。
【請求項９】前記発現カセットがバキュロウイルスベ
クターに担持されていることを特徴とする請求項８に記
載のベクター。
【請求項１０】構造遺伝子の発現を実行するための発
現システムであって、請求項９に記載のベクターと、前
記ベクターが導入される昆虫細胞と、を含む発現システ
ム。
【請求項１１】ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現カセッ
トであって、前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０と、前記Ｓ
Ｆ２型ＨＩＶｇｐ１２０の上流に連結された分泌シグナ
ル配列と、前記分泌シグナル配列が連結されたＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０を発現させ得るように、前記分泌シグ
ナル配列を挟んで前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０の上流
に接続されたプロモータと、前記ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１
２０の下流に接続された３'ＵＴＲと、を有し、前記分
泌シグナル配列が、ニワトリリゾチームの分泌シグナル
配列又はＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群ウイルス（Ｈ
ＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列であることを特徴
とするＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現カセット。
【請求項１２】前記プロモータがバキュロウイルスの
ポリヘドリンプロモータであることを特徴とする請求項
１１に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現カセット。
【請求項１３】前記ニワトリリゾチームの分泌シグナ
ル配列が、配列番号１に示す配列であることを特徴とす
る請求項１１又は１２に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２
０発現カセット。
【請求項１４】前記ＳＦ１６２型ヒト免疫不全症候群
ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０の分泌シグナル配列が、
配列番号１１に示す配列であることを特徴とする請求項
１１又は１２に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現カ
セット。
【請求項１５】請求項１１〜１４のいずれかに記載の
発現カセットを担持したＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現
ベクター。
【請求項１６】前記発現カセットが、バキュロウイル
スベクターに担持されていることを特徴とする請求項１
５に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現ベクター。
【請求項１７】ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現細胞で
あって、請求項１１〜１４のいずれかに記載のＳＦ２型
ＨＩＶｇｐ１２０発現カセット又は請求項１５若しくは
１６に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現ベクターを
保持したＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現細胞。
【請求項１８】請求項１６のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２
０発現ベクターを保持した昆虫細胞であることを特徴と
する請求項１４に記載のＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０発現
細胞。
【請求項１９】請求項１７又は請求項１８に記載の細
胞から産生された単離ＳＦ２型ＨＩＶｇｐ１２０蛋白
質。
【請求項２０】被験体である分泌シグナル配列が構造
遺伝子の発現を実行又は上昇させ得るかを判定する方法
であって、ベクター上のプロモータと３'ＵＴＲとの間に、前記分
泌シグナル配列が上流に連結されたモニタ遺伝子を前記
プロモータから発現され得るように接続して発現ベクタ
ーを調製する発現ベクター調製工程と、前記発現ベクターを細胞に導入する細胞導入工程と、前記細胞における前記モニタ遺伝子の発現量を測定する
測定工程と、を含み、前記測定工程において、前記モニタ遺伝子の転写産物を
測定することにより、前記発現量が測定されることを特
徴とする判定方法。
【請求項２１】前記プロモータと３'ＵＴＲとが、バ
キュロウイルスのポリヘドリン由来であることを特徴と
する請求項２０に記載の判定方法。
【請求項２２】被験体である分泌シグナル配列が遺伝
子の発現を上昇させ得るかを判定するための判定システ
ムであって、プロモータと３'ＵＴＲとを備え、前記プ
ロモータから発現可能に、前記分泌シグナル配列が上流
に連結されたモニタ遺伝子を接続させる発現ベクター
と、前記構造遺伝子が接続された前記発現ベクターを導入し
て前記モニタ遺伝子を発現させる細胞と、を含み、前記
細胞における前記モニタ遺伝子の発現量に基づき、前記
被験体である核酸がモニタ遺伝子の発現を上昇させ得る
かが判定される判定システム。
【請求項２３】前記プロモータと３'ＵＴＲとが、バ
キュロウイルスのポリヘドリン由来であり、前記細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項２２
に記載の判定システム。