CN104892751B - 自组织化重组透明颤菌血红蛋白及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白及其基因在基因工程产品生产中的应用，属于基因工程技术领域。是由透明颤菌血红蛋白模块、连接肽模块和自组织化模块组成；透明颤菌血红蛋白模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；连接肽模块的氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)n，n值是连接肽模块的串联重复次数，n＝2～10的整数；自组织化模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。本发明公开基因所表达的蛋白与透明颤菌蛋白相比具有自组织化能力，自组织化的重组透明颤菌血红蛋白具有更高的质膜结合性质，可以在环境溶氧不足情况下提高宿主细胞的生物量和提高宿主细胞的基因工程产品产量，降低成产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白及其基因在基因工程产品生产中的应用。
背景技术
随着细胞生物学以及生物工程技术在微生物、植物、动物领域的应用，利用基因工程技术已经可以生产、改良甚至构建具有目的功能或者生产目的基因工程产品，基因工程产品的生产已经取得了巨大的成功。
基因工程技术结合对宿主细胞代谢合成途径的认知，利用基因工程技术可以实现宿主生物质促进生产、目的基因工程产品促进生产、目的次级代谢产物促进生产。
在基因工程产品生产中，通过基因工程技术将目的基因与载体在体外连接后转入受体宿主细胞，使外源基因在宿主细胞中稳定表达并遗传。
以抗生素等次级代谢产物为代表的基因工程产品在生产过程往往受到氧供给的限制，氧需要通过溶解、传递等环节才能被宿主细胞利用，氧自身在水溶液中的溶解度有限，为提高氧的供给能力，需要通过增加通气量、加快搅拌速度等办法来增加溶氧，这使得基因工程产品生产成为高能耗产业。随基因工程技术的发展，利用基因工程技术改良宿主氧获得能力，降低基因工程产品生产能耗，提高基因工程产品产量成为可能。目前，VHb已经应用于发酵、重组蛋白表达、次级代谢产品表达、转基因动物、转基因植物和环保领域，取得了显著成效。
透明颤菌血红蛋白(vitroeoscilla hemoglobin,VHb)是目前研究较为深入的原核生物血红蛋白，VHb是由两个相同亚基构成的同型二聚体蛋白，每个亚基含有146个氨基酸残基和一个b型血红素分子。VHb具有很强的氧结合能力和非常迅速的氧释放能力，在基因工程产品生产中往往作为辅助蛋白使用，提高宿主菌的氧俘获能力。
在氧浓度较低(溶氧低于5％大气饱和度)的情况下，VHb受到其天然启动子的诱导表达，研究表明，当VHb在宿主细胞中表达时，宿主细胞的tRNAs和核糖体含量有所提高，宿主细胞的呼吸活性和ATP含量也有所增加。Khosla等(Nature,1988,331,633-635)提出，在低氧条件下，VHb血红蛋白能够大量积累，一部分VHb以活性的氧合蛋白形式存在，加速氧在低氧条件下向胞内传递，构造一个有机体可直接利用的蓄氧仓库，氧合血红蛋白能提高氧在呼吸链上的传递效率，加快了质子传递，促进了ATP的合成，提高了整个能量代谢水平。
Ramandeep(J.Biol.Chem.2001,276,24781–24789)研究表明VHb在大肠杆菌中表达时存在质膜结合和胞质表达两种模式，Rinaldi指出质膜结合形式的VHb起到氧俘获功能(Biochemistry 2006,45,4069-4076)，Anand指出胞质表达VHb起到氧感受器的功能，感受宿主细胞内的氧化压力，当宿主细胞内氧化压力增加时抑制VHb蛋白的表达(BiochemJ.2010,426,271-280)。相比而言，质膜结合型的VHb对宿主细胞的氧供给能力有着更为重要的作用。
为提高VHb对宿主细胞的促进效果，对VHb的密码子偏好性改造、定点突变、易错PCR(error-prone PCR)改造、DNA改组(DNA shuffling)改造已经广泛展开，这些工作的进行进一步加深了对VHb生物工程和结构关系的理解，Isarankura-Na-Ayudhya指出对VHb自身结构的改造会引发该蛋白功能的较大变化(J microbiol biotechnol 2010,20,532-541；J.Biosci.Bioeng.2010,110,633-637；Int J biol Sci.2008,4,71-80)。
这种情况下，在保留VHb自身结构稳定的前提下，在VHb功能结构域之外引入自组织化多肽序列构建新的重组蛋白，利用自组织化片段间的相互识别和相互作用，改变重组蛋白的组装和宿主细胞内的分布形式，进而影响宿主的氧俘获和氧储存能力就成为一种新的VHb蛋白结构改造方法。
自组织化是蛋白质的一种特殊的组装方式，自组织化是通过多肽序列间直接的弱相互作用进行识别和组装的，自组织化后的蛋白质自组装体呈现出较强的质膜结合能力。自组织化多肽序列可以通过基因工程技术拼接到不同的重组蛋白内，诱导重组蛋白实现自组织化。至今未见利用自组织化片段重组技术，改进重组透明颤菌血红蛋白的质膜结合能力的研究
发明内容
为提高宿主细胞中质膜结合型VHb含量，本发明提供一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白，该蛋白在宿主细胞内依据自身结构和蛋白质的理化性质，提高质膜结合型VHb含量，增加宿主细胞从环境中获得氧的能力，改善宿主细胞的氧俘获能力。
本发明所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白是以连接肽模块连接透明颤菌血红蛋白模块和自组织化模块；自组织化模块诱导重组蛋白在宿主细胞内形成自组装体，自组装体蛋白依据其自身的质膜结合能力与宿主细胞质膜进行结合，透明颤菌血红蛋白模块在宿主细胞质膜附近起到从宿主细胞生存环境中俘获氧的功能。本发明可以用于改进宿主细胞从环境中获得氧的能力，有助于促进基因工程产品的表达，降低基因工程产品生产的能耗(实施例1中有体现(图10)，相同转速条件下，含有自组织化重组透明颤菌血红蛋白的宿主细胞发酵液中溶氧值高于阴性对照组(仅表达GFPuv的宿主细胞)，在停止外界供氧的条件下，含有自组织化重组透明颤菌血红蛋白的宿主细胞的发酵液中氧浓度降低缓慢，而阴性对照组氧迅速的消耗殆尽，这说明我们的基因产物自组织化透明颤菌血红蛋白可以实现氧储存和氧缓释，有效的缓解发酵液发酵罐中的氧不足，一般说来，只要降低了发酵过程中向发酵液(罐)中补充氧或者空气的量(频率)，或者提高了发酵液中细胞环境的溶氧度，就会降低基因工程产品生产的能耗，为了保持发酵过程中发酵液中细胞周围的氧浓度，向发酵罐中补充氧气或者空气的能耗很高)。
与背景技术相比：
1)利用连接肽模块分割了自组织化模块与透明颤菌血红蛋白模块，连接肽模块的存在，保证了重组蛋白中各个功能模块在蛋白质折叠过程中以自身固有的折叠及组装规律进行二级、三级结构的实现，以单独的结构域存在在多模块重组蛋白中，连接肽模块在不影响透明颤菌血红蛋白氧结合-释放能力的前提下，赋予重组蛋白自组织化功能；
2)利用透明颤菌血红蛋白模块实现重组透明颤菌血红蛋白的氧结合和释放功能，保留了对透明颤菌血红蛋白进行进一步的密码子代换、突变、易错PCR改进和DNA重组改进的可能，即该重组蛋白保留了随技术进步再次进行优化和改造的能力；
3)利用自组织化模块实现了重组透明颤菌血红蛋白在宿主细胞内的自组织化和质膜结合定位，改进了宿主细胞的氧俘获功能。
4)自组织化重组透明颤菌血红蛋白基因在透明颤菌血红蛋白基因自身的厌氧启动子控制下，可以通过本领域中为人所熟知的知识和技术引入不同的基因载体和宿主细胞中，进行基因工程产品的生产。
如图1所示，本发明所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白是由透明颤菌血红蛋白模块、连接肽模块和自组织化模块组成，其中连接肽模块数目可有操作人员依据具体需求进行灵活调整；自组织化模块分为强质膜结合(膜破坏)模块和强质膜结合(膜稳定)模块，本发明中，膜破坏不是杀伤性的破坏细胞膜，而是让细胞膜不稳定，使细胞内的基因工程产品向发酵液中泄露，这种泄露并不影响四百的存活和基因工程产品的生产，本发明中强质膜结合(膜破坏)模块可以替代基因工程蛋白产物分泌型表达时常采用的信号肽序列，操作人员可以根据具体需求进行灵活选择。
其中连接肽模块的序列为(SEQ ID NO.2)n，n值是连接肽模块的串联重复次数，n＝2～10的整数；n值越大，透明颤菌血红蛋白模块的结构和功能越不受自组织化进程产生的自组装体结构影响，自组织化重组蛋白在宿主细胞内形成自组装体的概率越小，自组织化重组血红蛋白的质膜结合型越少，宿主细胞的氧俘获能力改善程度越低。
其中透明颤菌血红蛋白模块的肽序列为SEQ ID NO.1，该模块在重组蛋白中的作用是在自组装体内起到氧俘获和氧释放功能，改善宿主细胞的氧俘获能力；在胞质表达型时起到氧感受器作用，宿主细胞内氧化压力上升时，抑制自组织化重新透明颤菌血红蛋白的表达，降低氧化压力对宿主细胞的损伤。
其中自组织化模块的肽序列为SEQ ID NO.3强质膜结合(膜破坏)模块或者SEQ IDNO.4强质膜结合(膜稳定)模块；其中SEQ ID NO.4呈现出更强的诱导自组织化重组透明颤菌血红蛋白蛋白形成自组装能力，而该种自组装体与质膜结合的能力略低于SEQ ID NO.3模块，这使得含有SEQ ID NO.3的重组蛋白呈现出更强的氧俘获能力，基因工程产品在不添加其他信号肽的前提下获得更强的胞外表达能力。
按照上述模块的功能和具体需求，构建自组织化重组透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列，按照核酸编码氨基酸的密码子翻译蛋白的基因序列，根据所要选择的蛋白表达宿主及基因载体体系说明书和相关标准教材的指导，选择宿主物种偏好的遗传密码子进行基因序列的优化。
利用基因工程常规操作技术，将自组织化重组透明颤菌血红蛋白的基因置于透明颤菌血红蛋白厌氧启动子下转入基因载体中，并转入所需的宿主。按照宿主及载体的使用说明书及相关文献，进行目的基因工程产品(基因工程产品可以是蛋白质，如蛋白质药物、疫苗、激素等；也可以是次级代谢产物，如抗生素)的生产。常见基因载体为pET系列、pUC系列、pBR系列、pGEX系列、pBEn系列、pSEn系列、pPIC系列、pACYC系列、pSV系列、pCMV系列、pMT系列、pMK系列、pSB**5系列、BBa系列、pSAM系列、Ti、pSLP1、pSAM2等，常见宿主为大肠杆菌、链霉菌、运动发酵单孢菌、枯草杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等。
附图说明
图1：本发明所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白的结构示意图；
图2：实施例1中所述自组织化重组透明颤菌血红蛋白基因在载体中的结构示意图；
图3：实施例1和2中所述GFPuv蛋白基因的正向测序谱图；
图4：实施例1和2中所述VHb蛋白基因正向测序谱图；
图5：实施例1和2中所述自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜破坏)基因正向测序谱图；
图6：实施例1和2中所述自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜结合)基因正向测序谱图；
图7：实施例1中各个宿主细胞的GFPuv表达紫外光激发下荧光表征图；
图8：实施例1中各个宿主细胞培养3天后，GFPuv蛋白表达电泳表征图；
图9：实施例1中各个宿主细胞的卟啉蛋白表达紫外-可见吸收光谱表征图；
图10：实施例1中各个宿主细胞培养3天后，氧俘获及氧消耗曲线图；
图11：实施例2中各个宿主细胞培养24、48和72小时时的细胞内及培养基中GFPuv蛋白的表达情况。
具体实施方式
实施例1
自组织化重组透明颤菌血红蛋白在E.coli BL21菌中的表达及对菌体俘获氧能力的影响
基因工程产品生产中发酵是以微生物、动植物和昆虫细胞为宿主细胞进行基因工程产品生产的主要生产方式，氧的供给是影响发酵进程的重要因素之一，一般说来蛋白质类和抗生素类基因工程产品的生产对发酵液中氧的需求更高。
实施例中以pGFPuv作为自组织化重组透明颤菌血红蛋白及其厌氧启动子基因序列的载体(pGFPuv载体是基于pUC19载体构建的)，以E.coli BL21作为基因工程产品生产的宿主细胞(宿主细胞E.coli BL21是大肠杆菌细胞的一种)，研究自组织化重组透明颤菌血红蛋白对基因工程产品GFPuv生产宿主菌E.coli BL21从环境中俘获氧能力的变化。
本发明所述的自组织化重组透明颤菌血红蛋白及其厌氧启动子基因是通过常规的分子生物技术(分子克隆实验指南第3版科学出版社2013年)，利用双酶切及双酶连技术转入基因载体中的，具体的内切酶和连接酶的选择与基因载体的多克隆酶切序列组成有关。
自组织化重组透明颤菌血红蛋白一级序列的排布方式及相对位置如图2所示，其中，
自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜破坏)序列为
1)透明颤菌血红蛋白模块，肽序列为SEQ ID NO.1；
2)连接肽模块，肽序列为SEQ ID NO.2，其中n＝5；
3)自组织化模块，SEQ ID NO.3
自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜稳定)序列为
1)透明颤菌血红蛋白模块，肽序列为SEQ ID NO.1；
2)连接肽模块，肽序列为SEQ ID NO.2，其中n＝5；
3)自组织化模块，SEQ ID NO.4
针对上述两种重组蛋白，根据所要选择的蛋白表达宿主及基因载体体系说明书和相关标准教材的指导，选择宿主物种偏好的遗传密码子进行基因序列的优化。优化后的基因与透明颤菌血红蛋白自身的厌氧启动子基因序列连接，形成膜破坏基因序列(vhb9a)和膜稳定基因序列(vhb22a)，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示(外源蛋白想要在宿主中表达，就需要采用宿主的遗传密码子以及宿主偏好的遗传密码子，这个选择宿主偏好的密码子和宿主的密码子的过程就是优化，不经过优化的基因序列在宿主中很难正确表达成目标蛋白质的)。
本实施例中使用E.coli BL21细胞作为宿主细胞，通过通过常规的分子生物技术(分子克隆实验指南第3版科学出版社2013年)构建重组载体，重组载体pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv分别转化E.coli细胞，并使用氨苄青霉素筛选出能稳定表达的单克隆细胞株，获得能表达自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜破坏)、自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜稳定)、透明颤菌血红蛋白的转化子，其中转化pGFPuv的转化子可以表达透明颤菌血红蛋白，该转化子作为阳性对照，转化pGFPuv的转化子作为阴性对照。其中阳性对照组pGFPuv-vgb的vgb基因序列如SEQ ID NO.6所示，vgb基因所表达蛋白即为透明颤菌血红蛋白，透明颤菌血红蛋白的氨基酸序列如SEQ ID：1所示；阴性对照组pGFPuv的GFPuv的基因序列如SEQ ID:9所示，GFPuv蛋白的氨基酸序列如SEQ ID:10所示。
具体操作：
通过常规分子生物技术(分子克隆实验指南第3版科学出版社2013年)，利用双酶切及双酶连技术将目的重组蛋白基因转入基因载体中构建重组载体，将1.0微克的重组载体pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv分别加入100微升E.coli BL21感受态细胞中，混匀冰浴30分钟，42摄氏度水浴中保温1分钟，立即取出，放置在冰浴中冷却2分钟，加入800微升37摄氏度预热的LB液体培养基，37摄氏度下150转每分钟培养60分钟，取100微升培养液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37摄氏度培养16小时后获得单转化菌落，挑取单转化菌落进行测序验证。
基因正向测序结果见图3-6
pGFPuv-vgb9a(图5)从测序文件第27位碱基到第644位碱基截止，这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO.7序列从第1位碱基开始至第618位碱基相似性达到100％，这说明各个质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜破坏)的序列。
pGFPuv-vgb22a(图6)从测序文件第27位碱基到第683位碱基截止，这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO.8序列从第1位碱基开始至第657位碱基相似性达到100％，这说明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜结合)序列。
pGFPuv-VHb(图4)从测序文件第26位碱基到第601位碱基截止，这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO.6序列从第1位碱基开始至第576位碱基相似性达到100％，这说明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中透明颤菌血红蛋白阳性对照序列。
pGFPuv(图3)从测序文件第101位碱基到第817位碱基截止，这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO.9序列从第1位碱基开始至第717位碱基相似性达到100％，这说明质粒中的蛋白序列是本专利实施例1中GFPuv蛋白阴性对照序列。
挑取经测序证明目的基因转入宿主细胞，进行发酵研究。
分别将接载有pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv基因的转化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养基OD值为0.7到0.9时，取3OD菌转接到250毫升锥形瓶200毫升LB培养基中，培养基中含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度120转每分钟进行培养，培养3天后，利用检测发酵体系的溶氧值和停止振荡充氧后，细胞培养体系中的溶氧值变化。
从图7中可以看到从左到右pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb(阳性对照样品)以及pGFPuv(阴性对照样品)基因的转化子细胞中GFPuv蛋白已经进行了表达，紫外光照射下菌体呈现绿色荧光。
从蛋白质SDS-PAGE电泳图(图8)上可知，从左向右，条带1是蛋白质标准分子量，条带2～5分别为pGFPuv，pGFPuv-vgb，pGFPuv-vgb9a和pGFPuv-vgb22a，各个基因的转化子细胞中均表达了GFPuv蛋白。与pGFPuv-vgb相比，pGFPuv-vgb9a和pGFPuv-vgb22a表达的非质膜结合自组织化重组透明颤菌血红蛋白明显较少。
pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb(阳性对照样品)以及pGFPuv(阴性对照样品)基因的转化子细胞在超声裂菌后经12000转每分钟离心30分钟，上清液的紫外-可见吸收光谱如图9所示，图9中光谱吸收信号从上到下分别为pGFP-vgb，pGFPuv-Vgb9a，pGFPuv-vgb22a和pGFPuv，其中pGFPuv(阴性对照样品)基因的转化子细胞破碎上清液中呈现395nm吸收的特征信号，该信号来自于GFPuv蛋白；pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb(阳性对照样品)基因转化子细胞破碎上清液中呈现不同程度的卟啉蛋白信号(415nm)与GFPuv蛋白信号(395nm)的混合信号，这表明在各个转化子细胞中透明颤菌血红蛋白/自组织化重组透明颤菌血红蛋白都有所表达，且pGFPuv-vgb9a的自组织化重组透明颤菌血红蛋白表达量明显大于pGFPuv-vgb22a，也明显大于pGFPuv-vgb的透明颤菌血红蛋白的表达量。
综上所述，以SEQ ID NO.3为自组织化模块的强质膜结合(膜破坏)自组织化重组透明血红蛋白具有更高的自组织化重组透明颤菌血红蛋白表达量，在宿主细胞内部也具有更高的质膜结合形式存在的自组织化透明颤菌血红蛋白。
从图10可见，37摄氏度120转每分钟培养3天后，各个转化子细胞在从环境中获得氧的能力方面呈现出巨大的不同，图10中氧俘获和氧消耗进程曲线从上到下分别为pGFPuv-vgb22a，pGFPuv-vgb9a，pGFPuv-vgb和pGFPuv：
1)在维持振荡充氧操作时，pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb(阳性对照样品)以及pGFPuv(阴性对照样品)基因的转化子细胞所处发酵环境的溶氧值分别为6.33mg/L、8.07mg/L、3.35mg/L和0.49mg/L，自组织化重组透明颤菌血红蛋白基因(vgb9a和vgb22a)的存在极大的提高了宿主细胞从环境中获得氧的能力；
2)在停止振荡充氧操作时，pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a和pGFPuv-vgb呈现出优于pGFPuv基因转化子细胞的氧缓释能力，阴性对照样品pGFPuv基因转化子细胞所处环境在3分钟内溶氧迅速消耗尽，阳性对照样品pGFPuv-vgb基因转化子细胞所处环境在37分钟后溶氧消耗尽，pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a转化子细胞在37分钟和50分钟消耗尽环境溶氧，与阳性对照组pGFPuv-vgb相比pGFPuv-vgb9a转化子虽然并未呈现出更长的氧缓释时间，但是pGFPuv-vgb9a转化子呈现更高的氧储备能力和相对更快的氧利用速度。
3)与阳性对照组pGFPuv-vgb转化子相比，pGFPuv-vgb22a转化子同样呈现复杂的氧缓释曲线，这表征两者具有相似的透明颤菌血红蛋白分布形式。
综上所述，自组织化重组透明颤菌血红蛋白可以通过基因工程技术转入目的宿主细胞中进行表达，自组织化重组透明颤菌血红蛋白在宿主细胞中的表达可以增加宿主细胞从环境中获得氧的能力，也可以增加宿主细胞在低氧浓度下向环境中释放所储存的氧的能力。该能力能极大的增强基因工程宿主细胞在溶氧限制的情况下生产基因工程产品的能力。
实施例2
为探索自组织化重组透明颤菌血红蛋白的自组织化模块对宿主细胞质膜稳定性的影响，采用较高的氧供给条件进行实施例1中各转化子细胞的发酵研究。
具体操作如下：
分别将接载有pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv基因的转化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养基OD值为0.7到0.9时，取3OD菌转接到250毫升锥形瓶100毫升LB培养基中，培养基中含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度180转每分钟进行培养，检测发酵过程中各个转化子细胞的GFPuv蛋白的表达能力，分别测定培养基中和细胞中的GFPuv荧光信号强度。
图11中各个光谱图中实线光谱是宿主细胞在新鲜培养基中检测到的荧光光谱，虚线是发酵液中样品的荧光光谱，荧光检测条件为激发光波长为395nm，荧光光谱检测范围为415nm到770nm，狭缝宽度为Ex＝3nm，Em＝5nm。
如图11所示，在发酵进程中pGFPuv-vgb9a转化子细胞随发酵时间延长发酵液中明显出现GFPuv蛋白509nm处的特异荧光信号，这表明载有SEQ IDNO.3序列的自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜破坏)可以影响宿主细胞膜的稳定性造成宿主细胞表达基因工程产品的泄露。实验同样表明，在出现膜泄露的同时，pGFPuv-vgb9a转化子细胞的增殖能力和增殖速度并未出现低于pGFPuv转化子细胞的情况。
同样，如图11所示，发酵进程中pGFP-vgb22a转化子细胞随发酵时间延长，发酵液中未见明显的GFPuv蛋白在509nm处的荧光信号，这表明载有SEQ ID NO.4序列的自组织化重组透明颤菌血红蛋白(膜稳定)可以在宿主细胞内进行表达并执行其生物功能。
图11中所示的胞内GFPuv蛋白荧光强度与胞内的实际GFPuv蛋白表达量无关，其主要原因在于透明颤菌血红蛋白和自组织化重组透明颤菌血红蛋白的卟啉辅基会对GFPuv蛋白的荧光信号进行粹灭，胞内荧光信号强度与GFPuv蛋白表达量和胞内的卟啉蛋白的表达量有关。
综上所述，自组织化重组透明颤菌血红蛋白可以通过选择SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4不同的自组织化模块，使重组蛋白在宿主细胞中呈现不同的质膜结合能力，在基因工程产品生产中具体自组织化模块的选择与基因工程产品生产的目的和工艺流程有关。
实施例3
为探索自组织化重组透明颤菌血红蛋白的自组织化模块对宿主细胞基因工程产品生产的影响，采用较高的氧供给条件进行实施例1中各基因载体在宿主细胞E.coliBL21DE3中的发酵研究。pGFPuv基因载体中的GFPuv蛋白可以在E.coli BL21DE3宿主细胞中进行自非诱导表达和IPTG诱导表达。
具体操作：
将1.0微克的重组载体pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv分别加入100微升E.coli BL21DE3感受态细胞中，混匀冰浴30分钟，42摄氏度水浴中保温1分钟，立即取出，放置在冰浴中冷却2分钟，加入800微升37摄氏度预热的LB液体培养基，37摄氏度下150转每分钟培养60分钟，取100微升培养液涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37摄氏度培养16小时后获得单转化菌落，挑取单转化菌落进行测序验证。
测序结果同实施例1(图3～6)，即各个基因未见可检测差异。
非诱导表达研究
分别将接载有pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv基因的转化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养基OD值为0.7到0.9时，取3OD菌转接到250毫升锥形瓶100毫升LB培养基中，培养基中含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度180转每分钟进行培养，检测发酵过程中各个转化子细胞的GFPuv蛋白的表达能力，分别测定培养基中和细胞中的GFPuv荧光信号强度。
研究表明，发酵24小时时pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb基因转化子细胞的OD值与pGFPuv基因转化子细胞的OD值增加比分别为1.23、1.25和1.20，即自组织化重组透明颤菌血红蛋白能明显增加宿主细胞在发酵进程中的宿主细胞繁殖能力；单位pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a基因转化子细胞产生GFPuv蛋白的能力与pGFPuv-vgb基因转化子细胞的产生GFPuv蛋白的能量之比为1.82和1.34，这说明在自诱导的情况下自组织化重组透明颤菌血红蛋白可以明显增加宿主细胞的繁殖能力和蛋白表达能力，这有利于基因工程产品的发酵和生产。
IPTG诱导表达研究
分别将接载有pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb以及pGFPuv基因的转化子细胞于有200微克每升氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养基OD值为0.7到0.9时，取3OD菌转接到250毫升锥形瓶100毫升LB培养基中，培养基中含有200微克每升氨苄青霉素，37摄氏度180转每分钟进行培养，转化子OD值达到1.2时加入IPTG进行诱导表达，IPTG终浓度为2mM，检测发酵过程中各个转化子细胞的GFPuv蛋白的表达能力，分别测定培养基中和细胞中的GFPuv荧光信号强度。
研究表明，添加IPTG诱导发酵12小时时pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a、pGFPuv-vgb基因转化子细胞的OD值与pGFPuv基因转化子细胞的OD值比分别为0.90、1.24和1.05，即自组织化重组透明颤菌血红蛋白能明显增加宿主细胞在发酵进程中的宿主细胞繁殖能力；单位pGFPuv-vgb9a、pGFPuv-vgb22a基因转化子细胞产生GFPuv蛋白的能力与pGFPuv-vgb基因转化子细胞的产生GFPuv蛋白的能量之比为2.46和1.65，这说明在自诱导的情况下自组织化重组透明颤菌血红蛋白可以明显增加宿主细胞的繁殖能力和蛋白表达能力，这有利于基因工程产品的发酵和生产。
Claims (4)
1.一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白，其特征在于：是由透明颤菌血红蛋白模块、连接肽模块和自组织化模块组成；透明颤菌血红蛋白模块的氨基酸序列为SEQID NO.1；连接肽模块的氨基酸序列为(SEQ ID NO.2)n，n值是连接肽模块的串联重复次数，n＝2～5的整数；自组织化模块的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
2.一种具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白基因，其特征在于：基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8。
3.一种基因工程表达载体，其特征在于：是由权利要求2所述的具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白基因与pET系列、pUC系列、pBR系列、pGEX系列、pBEn系列、pSEn系列、pPIC系列、pACYC系列、pSV系列、pCMV系列、pMT系列、pMK系列、pSB**5系列、BBa系列、pSAM系列、Ti、pSLP1或pSAM2载体构建的重组表达载体。
4.权利要求2所述的具有自组织化能力的重组透明颤菌血红蛋白基因在改善大肠杆菌E.coli BL21的氧俘获能力、繁殖能力或蛋白表达能力方面的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN1712534A (zh) * | 2004-06-25 | 2005-12-28 | 私立逢甲大学 | 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 |
| CN1884533A (zh) * | 2006-06-16 | 2006-12-27 | 中国科学院微生物研究所 | 一种透明颤菌血红蛋白基因及其应用 |
| EP2081029A2 (en) * | 2008-01-17 | 2009-07-22 | Korea University Research and Business Foundation | Bio-markers for diagnosing diabetic retinopathy |
| CN104487586A (zh) * | 2013-02-18 | 2015-04-01 | 味之素株式会社 | 基于沉淀的蛋白质制造方法 |
-
2015
- 2015-06-27 CN CN201510363614.0A patent/CN104892751B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1712534A (zh) * | 2004-06-25 | 2005-12-28 | 私立逢甲大学 | 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 |
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| EP2081029A2 (en) * | 2008-01-17 | 2009-07-22 | Korea University Research and Business Foundation | Bio-markers for diagnosing diabetic retinopathy |
| CN104487586A (zh) * | 2013-02-18 | 2015-04-01 | 味之素株式会社 | 基于沉淀的蛋白质制造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 鸡β2-微球蛋白在马立克氏病毒感染与致肿瘤中的作用研究;郁川;《中国博士学位论文全文数据库》;20150115;第28页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN104892751A (zh) | 2015-09-09 |
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