CN105400711A - 一株产l-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的公开了一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于发酵工程领域。本发明在高产丙酮酸的菌株S.cerevisiae？tTAMΔura3Δtrp1中过量游离表达源于Aspergillus？flavus？ATCC13697的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)和苹果酸转运蛋白(Afmae)基因，构建了苹果酸积累路径，获得菌株W1101。上述菌株用于发酵生产L-苹果酸，发酵84h，其苹果酸产量为27.3g/L，而原始出发菌株不积累苹果酸，这将高产L-苹果酸菌株黄曲霉的代谢路径成功应用于酿酒酵母，为高产L-苹果酸菌株的构建提供了一种新策略。

Description

一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌的构建及应用，属于发酵工程领域。
背景技术
苹果酸(Malicacid)又名二羟基丁二酸，是一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为12种有潜力化合物之一。它是TCA生物体循环的重要中间产物，具有特殊愉快的酸味，易被人体吸收利用，因此作为性能优异的食品酸味剂和功能性食品广泛应用于食品行业。同时具有抗氧化、抑制油脂酸败等作用，被用于化妆品、医药、化工行业。
目前，苹果酸的生产方法主要有：生物催化法、两步发酵法和一步发酵法。国内外以生物催化法为主，其中日本是L-苹果酸主要的生产国与出口国。(1)生物催化法以富马酸为底物经富马酸酶转化生成苹果酸。其原料价格高、成品中杂酸高以及生物污染较大；(2)两步发酵法指经两种微生物分两阶段发酵生产苹果酸。其发酵周期长、副产物多、分离纯化成本高以及培养条件复杂，目前正处于实验室研究水平；(3)一步发酵法指经一种微生物发酵获得苹果酸。其发酵条件简单，生产成本低。
一步发酵法常见使用的微生物有霉菌(黄曲霉、米曲霉)和大肠杆菌工程菌。霉菌发酵生产苹果酸虽然其产量高、生产强度大，但由于其积累大量杂酸，提取成本高、菌丝易结球发酵条件难以控制，同时积累大量毒素，难以进行工业化生产。而大肠杆菌由于最适生长pH为中性，提取时需要添加大量中和剂，成本高、环境污染严重。而酿酒酵母具有耐酸性，故选择其作为宿主菌进行进一步研究。
目前，苹果酸积累的路径主要有四条：1)胞质还原路径，丙酮酸经丙酮酸羧化酶羧化成草酰乙酸，再经过苹果酸脱氢酶的作用生成苹果酸；2)TCA循环；3)乙醛酸循环；4)乙醛酸非循环路径，丙酮酸经乙醛酸循环至苹果酸，但苹果酸不再生成草酰乙酸。由于酿酒酵母不存在将线粒体中的苹果酸转运出细胞质的转运蛋白，且胞质还原路径的理论摩尔得率最高，故只能利用胞质还原路径进行积累。
然而，目前利用酿酒酵母积累苹果酸仍存在几个关键问题：1)发酵周期长；2)生产强度低；3)菌体浓度低，菌株生长缓慢；4)异源表达霉菌等真核生物基因时，内含子去除困难；5)过量表达大片段基因，代谢负担重等。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一株利用黄曲霉代谢路径产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌株及其构建方法与应用。本发明是在酿酒酵母中过量表达源于Aspergillusflavus的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)和苹果酸转运蛋白(Afmae)基因构建苹果酸积累路径。
本发明的第一个目的是提供一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌过表达来源于Aspergillusflavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、苹果酸脱氢酶基因Afmdh和苹果酸转运蛋白基因Afmae。
在本发明的一种实施方式中，所述Aspergillusflavus是AspergillusflavusATCC13697。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸羧化酶基因的氨基酸序列与NCBI上accessionnumble：XM_002377040的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸脱氢酶基因的氨基酸序列与是NCBI上accessionnumble：XM_002378178的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸转运蛋白基因的氨基酸序列一致在NCBI上accessionnumble：XM_002376564的基因编码的氨基酸序列一致。
在本发明的一种实施方式中，所述过表达Afpyc是以PY14载体进行游离表达；所述过表达Afmae和Afmdh，是将这两个基因连接到PY26载体上进行游离表达。
在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌是以S.cerevisiaetTAM为宿主得到的；所述S.cerevisiaetTAM是在S.cerevisiaeTAM的基础上，利用Cre/Loxp系统敲除色氨酸基因trp得到；所述S.cerevisiaeTAM是文献(DirectedEvolutionofPyruvateDecarboxylase-NegativeSaccharomycescerevisiae,YieldingaC2-Independent,Glucose-Tolerant,andPyruvate-HyperproducingYeast)的菌株，是在S.cerevisiaeCEN.PK113-7D的基础上通过Cre/LoxP系统敲除基因PDC1，PDC5和PDC6所获得的三重缺陷型菌株。
本发明的第二个目的是提供一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：
(1)PCR扩增或者化学合成核苷酸序列分别如XM_002377040、XM_002378178、XM_002376564所示的Afpyc片段、Afmdh片段、Afmae片段；
(2)将Afpyc片段连接到质粒PY14上得到重组质粒PY14/TEF-Afpyc，将Afmae片段和Afmdh片段先后连接到质粒PY26上得到重组质粒PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh；并验证；
(3)将上一步得到的两个重组质粒，转化到受体菌S.cerevisiaetTAM中，涂布Ura及Trp缺陷平板进行筛选；
(4)验证正确的重组菌，即为产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌。
本发明的第三个目的是提供所述酿酒酵母工程菌在发酵生产L-苹果酸方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将酿酒酵母工程菌活化后，于温度30℃、转速800rpm，通气量1.5vvm，8mM的KOH调节pH至5.0下进行发酵，发酵时间为84h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基含有：葡萄糖100g/L，K2SO46.6g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，尿嘧啶、色氨酸终浓度20mg/L，尿素终浓度1g/L，生物素终浓度为1mg/L，CaCl2·2H2O终浓度为5mM，微量金属离子液1mL/L，维生素液1mL/L。
在本发明的一种实施方式中，所述微量金属离子液，按mg/L计，含有：EDTA15，ZnSO4·7H2O4.5，CoCl2·6H2O0.3，MnCl2·4H2O1，CuSO4·5H2O0.3，CaCl2·2H2O4.5，FeSO4·7H2O3，NaMoO42·2H2O0.4，H3BO31，KI0.1。
在本发明的一种实施方式中，所述维生素液，按mg/L计，含有：生物素0.05，泛酸钙1，烟酸1，肌醇25，盐酸硫胺素1，盐酸吡哆醇1，对氨基苯甲酸0.2。
本发明的有益效果：
由于AspergillusflavusATCC13697本身高产苹果酸，但其具有黄曲霉毒素及发酵工艺难，不能用于工业生产。菌株S.cerevisiaetTAM丙酮酸积累能力强，为苹果酸的积累提供大量的前体物质。因此，本发明在S.cerevisiae中成功构建了黄曲霉积累苹果酸的代谢路径，实现苹果酸的积累。宿主酵母本身不积累苹果酸，利用本发明的酿酒酵母工程菌发酵84h生产苹果酸，产量可达27.3g/L，生产强度为0.325g/(L·h)，苹果酸相对葡萄糖的得率为0.41mol/mol。
附图说明
图1：A.flavus来源基因Afpyc、Afmdh及AfmaePCR扩增图,M:10000Marker；1:Afmdh；2:Afmae；3:Afpyc
图2：质粒PY14/TEF-Afpyc和PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh图谱,A:质粒PY14/TEF-Afpyc图谱；B:质粒PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh图谱
图3：质粒PY14/TEF-Afpyc和PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh酶切示意图，M:10000Marker；1:PY14/TEF-Afpyc质粒BamHI、PstI双酶切图；2：PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh质粒BglII、NotI双酶切示意图；3：PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh质粒EcoRI、XhoI双酶切示意图
具体实施方式
苹果酸检测方法(高效液相色谱条件)：
色谱柱：Atlantis(5μm4.6×250mm)；
流动相：0.1mol/LKH2PO4，磷酸调pH至2.8；
柱温：20℃；
检测波长：215nm；
进样量：10μl；
流速：0.6ml/min。
实施例1：产苹果酸的酿酒酵母工程菌株的构建
(1)以A.flavusATCC13697的cDNA为模板，利用引物1(序列如SEQIDNO.1)和引物2(序列如SEQIDNO.2)将来自于A.flavusATCC13697的丙酮酸羧化酶基因(NCBIaccessionnumble:XM_002377040,3582bp)进行PCR扩增，利用引物3(序列如SEQIDNO.3)和引物4(序列如SEQIDNO.4)扩增苹果酸脱氢酶基因(NCBIaccessionnumble:XM_002378178,996bp)，利用引物5(序列如SEQIDNO.5)和引物6(序列如SEQIDNO.6)进行PCR扩增苹果酸转运蛋白基因(NCBIaccessionnumble:XM_002376564,1197bp)；
引物序列如下：
引物1：5'-CGGGATCCATGGCGGCTCCGTTTCGT-3'
引物2：5'-AACTGCAGTTGCTTACGCTTTGACGAT-3'
引物3：5'-ATTTGCGGCCGCATGGTCAAAGCTGCGGTACT-3'
引物4：5'-GAAGATCTTCAAAGCTTTGGTGGTGGGTT-3'
引物5：5'-CGGAATTCATGTTCAATAACGAACACC-3'
引物6：5'-CCGCTCGAGCTAATCAGATACATCCTCAT-3'
(2)将扩增得到的片段与pMD19Tsimple-vector16℃连接过夜；
(3)将步骤2连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子进行测序验证；
(4)提取测序正确的含有基因Afpyc的质粒，用BamHI、PstI双酶切上述质粒及PY14质粒，提取含有基因Afmae的质粒，用EcoRI、XhoI酶切上述质粒及PY26质粒，胶回收纯化后，用T4DNA连接酶16℃连接过夜；
(5)将步骤4连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，酶切验证，得到质粒PY14/TEF-Afpyc及PY26/GPD-Afmae；
(6)提取质粒PY26/GPD-Afmae,用BglII、NotI双酶切该质粒及含有Afmdh基因的质粒，胶回收纯化后，用T4DNA连接酶16℃连接过夜；
(7)将步骤6连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子，提取质粒，酶切验证，得到质粒PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh；
(8)将步骤5和步骤6得到的质粒PY14/TEF-Afpyc和PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh采用LiAc转化法导入受体菌当中，涂布ura及trp缺陷平板；
(9)PCR验证所述工程菌；
(10)摇瓶发酵，验证苹果酸的生产情况。
实施例2：利用酿酒酵母生产L-苹果酸
将保存于甘油管中的工程菌株接种于YNB培养基斜面，取一环至种子培养基(100mL/500mL三角烧瓶)，30℃，200r/min培养48h后，以10％接种量(V/V)接种发酵培养基(100mL/500mL三角烧瓶)，温度为30℃，转速800rpm，通气量1.5vvm，8mM的KOH调节pH至5.0，发酵时间为84h。采用高效液相色谱(HPLC)测得：本发明的基因工程菌(W1101)苹果酸的产量为27.3g/L，而出发菌株(WT)积累少量苹果酸。苹果酸相对葡萄糖的得率为0.41mol/mol。
表1产物产量(单位：g/L)
本发明的优点：1)本发明菌株相对于已报道的酿酒酵母工程菌生长速率快，生产强度高达0.325g/(L·h)，发酵时间短；2)本发明采用的基因来源为高产苹果酸菌株，成功的将曲霉来源基因在酿酒酵母中表达；3)本发明将丙酮酸羧化酶基因采用低拷贝质粒表达，降低该基因对菌株的代谢负担；此外，发明人发现将本发明的PY14质粒替换成常用的高拷贝质粒PYX212时，会严重增加细胞代谢负担，导致菌株生长缓慢、无法苹果酸或者合成产量极低；4)本发明为高产苹果酸菌株的构建提供了一种新的思路。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌过表达来源于Aspergillusflavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、苹果酸脱氢酶基因Afmdh和苹果酸转运蛋白基因Afmae。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因的氨基酸序列与NCBI上accessionnumble：XM_002377040的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸脱氢酶基因的氨基酸序列与是NCBI上accessionnumble：XM_002378178的基因编码的氨基酸序列一致；所述苹果酸转运蛋白基因的氨基酸序列一致在NCBI上accessionnumble：XM_002376564的基因编码的氨基酸序列一致。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述过表达Afpyc是以PY14载体进行游离表达；所述过表达Afmae和Afmdh，是将这两个基因连接到PY26载体上进行游离表达。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述Aspergillusflavus是AspergillusflavusATCC13697。
5.一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)PCR扩增或者化学合成核苷酸序列分别如XM_002377040、XM_002378178、XM_002376564所示的Afpyc片段、Afmdh片段、Afmae片段；
(2)将Afpyc片段连接到质粒PY14上得到重组质粒PY14/TEF-Afpyc，将Afmae片段和Afmdh片段先后连接到质粒PY26上得到重组质粒PY26/GPD-AfmaeTEF-Afmdh；并验证；
(3)将上一步得到的两个重组质粒，转化到酿酒酵母宿主中，涂布Ura及Trp缺陷平板进行筛选；
(4)验证正确的重组菌，即为产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌。
6.权利要求1所述酿酒酵母工程菌在发酵生产L-苹果酸方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将酿酒酵母工程菌活化后，于温度30℃、转速800rpm，通气量1.5vvm，调节pH至5.0以下进行发酵，发酵时间为84h。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基含有：葡萄糖100g/L，K2SO46.6g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，尿嘧啶、色氨酸终浓度20mg/L，尿素终浓度1g/L，生物素终浓度为1mg/L，CaCl2·2H2O终浓度为5mM，微量金属离子液1mL/L，维生素液1mL/L；所述微量金属离子液，按mg/L计，含有：EDTA15，ZnSO4·7H2O4.5，CoCl2·6H2O0.3，MnCl2·4H2O1，CuSO4·5H2O0.3，CaCl2·2H2O4.5，FeSO4·7H2O3，NaMoO42·2H2O0.4，H3BO31，KI0.1；所述维生素液，按mg/L计，含有：生物素0.05，泛酸钙1，烟酸1，肌醇25，盐酸硫胺素1，盐酸吡哆醇1，对氨基苯甲酸0.2。
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