KR101060384B1 - 조효소 ｑ-10의 개선된 생산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론으로 형질전환된 로도박터 속의 미생물의 발효에 의한 CoQ10의 개선된 생산 방법에 관한 것이다.

Description

조효소 Ｑ-10의 개선된 생산{IMPROVED PRODUCTION OF COENZYME Q-10}
본 발명은 미생물에 의한 조효소 Q-10의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환된 미생물 및 형질전환체 그자체에 의해 조효소 Q-10의 생산을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 형질전환체는 로도박터(Rhodobacter) 속의 미생물, 바람직하게는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 종이고, 이는 상이한 미생물, 바람직하게는 파라코커스(Paracoccus) 속, 보다 바람직하게는 파라코커스 제아크산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens) 종의 메발로네이트 오페론으로 형질전환되었다.
유비퀴논-10으로서 공지된 조효소 Q-10(2,3-다이메톡시-다이메틸-6-데카프레닐-1,4-벤조퀴논)은 10개의 C-5 아이소프레노이드 단위로 구성된 아이소프레노이드 측쇄를 갖는 지용성 벤조퀴논이다. 조효소 Q-10(이후에서, CoQ10으로 축약됨)은 동물 뿐만 아니라 미생물 및 식물에서 관찰된다. 이는 인간 및 대부분 포유동물에서 유비퀴논의 가장 일반적인 형태이다. CoQ10이 인간의 건강 상태 및 질병으로부터 이들의 보호에 중요한 인자라는 증거가 확립되고 증대되고 있다. CoQ10의 의학적 및 건강상 유익한 효과는 다음의 2개의 주요 생리적인 기능과 관련이 있다. 즉, 마이토콘드리아 전자 전달 계(아데노신 삼인산의 합성과 커플링됨)의 주요한 보조인자로서 기능을 하고 지용성 항산화제로서 작용한다.
CoQ10의 건강상 이점으로 인해 이 화합물의 상업적인 중요성이 증가된다. CoQ10은 화학적인 합성에 의해서 또는 미생물을 사용하는 발효에 의해서 생산될 수 있다. 이들 미생물은 유전 공학에 의해서 CoQ10 생산이 개선된 자연의 CoQ10 생산자이거나 또는 이들은 천연적으로는 CoQ10을 생산할 수 없지만 유전 공학에 의해 조작되어서 이를 합성할 수 있다.
박테리아에서, 유비퀴논의 퀴노이드 고리는 방향족 화합물의 생합성에서 핵심 중간체인 코리스메이트로부터 유래하고, 유비퀴논의 아이소프레노이드 말단은 C-5 화합물 아이소펜테닐 피로포스페이트(IPP)로부터 유래한다. 퀴노이드 고리에 부가된 아이소프레노이드 말단의 길이는 박테리아에 존재하는 특정 프레닐트랜스퍼라제 효소에 의존한다. 예를 들어, 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 옥타프레닐 피로포스페이트 합성효소는 파르네실 피로포스페이트(FPP, C-15) 및 5개의 IPP 단위로부터 옥타프레닐 피로포스페이트(C-40)의 형성을 촉매한다. 퀴노이드 고리에 이 분자를 첨가하면 유비퀴논-8이 형성된다. 파라코커스 및 로도박터 종에서, 데카프레닐 피로포스페이트(DPP) 합성효소는 FPP(C-15) 및 7개의 IPP 단위로부터 DPP(C-50)의 형성을 촉매한다. 이어서, DPP를 퀴노이드 고리에 첨가하면 유비퀴논-10(CoQ10)이 형성된다.
자연에서, IPP(도 1)의 생합성에 대해 2개의 상이한 경로가 공지되어 있다. 그의 이름이 의미하는 바와 같이 메발로네이트 경로는 핵심 중간체로서 메발로네이트를 이용하고 진핵생물에서 잘 연구되었다. 메발로네이트 경로는 자연에서 IPP 합성의 보편적인 경로로 수년동안 생각되었다. 그러나, 최근에 비-메발로네이트 경로 또는 MEP 경로(중간체로서 2C-메틸-D-에리트리톨 4-포스페이트를 갖기 때문)로 불리는 IPP 생합성의 제 2 경로가 발견되었다. MEP 경로는 지금까지 많은 진정세균 및 보다 고등 식물의 색소체 구획에서 존재하는 것으로 나타났다.
미국 특허 제 4,070,244 호는 동화가능한 탄소원 및 소화가능한 질소원을 함유하는 배양배지에서 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 및 우스포리디움(Oosporidium) 속의 특정한 미생물을 배양함에 의해 CoQ10을 생산하는 방법을 개시하고 있다.
주 엑스(Zhu X.)(문헌[J. Fermentation & Bioengin., 79, 493-5, 1995]) 등은 유비퀴논 생합성에 관련된 유전자를 함유하는 플라스미드의 구축 및 이. 콜라이(E. coli)에서 유비퀴논을 생산하는 이들 유전자의 과발현을 처음으로 기술하고 있다.
숙주 미생물, 특히 이. 콜라이를 아그로박테리움(Agrobacterium)속의 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA로 형질전환시키고, 형질전환체를 배양함으로써 CoQ10을 생산하는 방법은 유럽 특허 제 EP 1 070 759 A1 호에 개시되어 있다.
유럽 특허 제 EP 1 072 683 A1 호는 형질전환된 미생물에 의해서 아이소프레노이드 화합물, 특히 유비퀴논을 생산하는 방법을 개시하고 있다. 열거된 일부의 70개 숙주 종중에서 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus) 및 로도박터 스페로이드가 구체적으로 언급되었다. 그러나, 실시예는 단지 이. 콜라이의 형질전환체중에서 CoQ3의 생산만을 설명한다.
유럽 특허 제 EP 1 123 979 A1 호는 사이토엘라(Saitoella) 속의 진균 균주로부터 데카프레닐 다이포스페이트 합성효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 박터로 이. 콜라이를 형질전환시킴에 의해 효율이 개선된 CoQ10의 생산을 개시하고 있다.
제 WO 02/099095 A2 호는 마침내 박테리아, 특히 파라코커스 속이 메발로네이트 경로의 유전자를 과발현시킴에 의해서 아이소프레노이드 화합물, 특히 제아크산틴을 생산하도록 하는 유전공학 방법을 개시하고 있다.
그램-음성 박테리아인 로도박터 스페로이드는 CoQ10의 자연적 생산자이고, 따라서, CoQ10의 산업적인 생산에 대해 개발을 시도하였다. 요시다(Yoshida) 등(문헌[J. Gen. Appl. Microbiol. 44, 19-26, 1998])은 CoQ10 생산에 미치는 폭기의 영향 및 CoQ10 함량을 증가시키는 로도박터 스페로이드의 비-재조합 돌연변이주의 단리에 대해 기술하고, 사카토(Sakato) 등(문헌[Biotechnol. Appl. Biochem. 16, 19-28, 1992])은 배양(발효) 조건을 최적화시킴에 의해서 로도박터 스페로이드의 비-재조합 돌연변이주에서 CoQ10 생산을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 보다 최근에, 분자 유전공학 기법을 적용하여 로도박터 스페로이드에 의한 CoQ10 생산을 증가시켰다.
유럽 특허 제 EP 1 227 155 A1 호는 로도박터 속중에서 이 화합물을 생산할 수 있는 미생물에 의한 CoQ10의 증가된 생산을 개시하고 있다. CoQ10 생산 증가는 환원되거나 결손된 제라닐제라닐 전이효소 활성, 강화된 데카프레닐다이포스페이트 합성효소 및 강화된 p-하이드록시벤조산 데카프레닐 전이효소 활성으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 특성을 미생물에 도입함에 의해 달성된다.
1-데옥스-D-자일룰로스 5-포스페이트 환원이성질화효소를 코딩하는 yaeM 유전자(이제부터 ispC로 지칭됨)의 로도박터 스페로이드에서의 존재 및 로도박터 스페로이드의 거의 완전한 게놈 서열의 조사에 근거하여, 이 박테리아는 IPP의 생합성을 위해 MEP 경로를 배타적으로 사용하는 것으로 보인다. 로도박터 스페로이드에서 MEP 경로의 배타적인 사용을 지지하는 추가의 증거는, 밀접하게 관련된 종인 로도박터 캡슐라투스가 아이소프레노이드 생합성을 위해 MEP 경로만을 사용한다는 발견이다.
제 WO 02/26933 A1 호는 MEP 경로의 효소의 일부를 코딩하는 몇몇 선천적인 및/또는 이형의 유전자를 과발현함에 의해 로도박터 스페로이드에서 CoQ10의 생산을 증가시키는 방법을 기술하고 있다. 그러나, 이들 유전자의 과발현은 CoQ10 생산에서 매우 온화한 개선만을 초래하였다. 이는 아마도 MEP 경로의 효소중 일부의 활성만 증가되고, 로도박터 스페로이드에서 IPP 생합성을 현저하게 증가시키기 위해서는 추가의 유전자의 과발현이 필요하기 때문이다.
상기에서 언급된 바와 같이, 일부 박테리아는 IPP 생합성을 위해 메발로네이트 경로만을 사용한다. 파라코커스 제아크산티니파시엔스는 이러한 박테리아의 예이다. 파라코커스 제아크산티니파시엔스에서, 메발로네이트 경로의 5개의 효소를 코딩하는 유전자와 함께 IPP 이성화효소를 코딩하는 유전자(도 1 참조)는 염색체 상에서 단일 전사 단위에서 함께 무리를 이루고, 즉 이후에서 메발로네이트 오페론으로 불리는 오페론이다(문헌[Humbelin et al., Gene 297, 129-139, 2002]). 아세토 아세틸-CoA를 IPP로 전환시키는데 필요한 모든 유전자의 이 독특한 무리는, 클로닝된 메발로네이트 오페론을 세포내로 삽입함으로써 임의의 박테리아에서 IPP 생산을 증가시키는 효과적인 유전적 수단을 제공할 수 있다. 이는 IPP 생합성용 메발로네이트 경로를 자연적으로 함유하는 박테리아 뿐만 아니라 MEP 경로만을 사용하는 박테리아에서도 달성될 수 있고, 메발로네이트 경로의 전구체인, 아세토 아세틸 CoA가 공통의 대사산물이기 때문이다. 아세토아세틸-CoA는 β-케토싸이올라제로서 지칭되는 넓은 패밀리의 효소의 작용에 의해 2개의 아세틸-CoA 분자로부터 생산된다. 따라서, 아세토아세틸-CoA의 공급처는 심지어 IPP 생합성을 위해 메발로네이트 경로를 사용하지 않는 박테리아에서도 존재한다.
도 1은 IPP 형성을 위해 MEP 경로를 사용하는 로도박터 스페로이드에서의 CoQ10 생합성을 위한 경로를 나타낸다. 박스 영역은 메발로네이트 경로(IPP 형성을 초래함)와 함께 IPP 이성화효소 단계를 포함하는 반응 순서를 나타낸다. 메발로네이트 경로는 로도박터 스페로이드에서는 자연적으로 발생하지 않는다. 파라코커스 제아크산티니파시엔스에서, 메발로네이트 경로의 5개의 효소와 함께 IPP 이성화효소를 코딩하는 유전자는 이후에서 메발로네이트 오페론이라고 불리는 오페론을 형성한다.
자연의 CoQ10 생산자를 유전자 조작시키는 방법에 의해서 미생물에서 CoQ10의 생산을 증가시키는 시도에 추가하여, 파라코커스 속 미생물의 클로닝된 메발로네이트 오페론을 로도박터 속의 미생물에 도입함에 의해 이를 달성할 수 있음을 발견하였다. 파라코커스의 메발로네이트 오페론을 도입함으로써 로도박터에서 IPP 공급을 개선시키고 CoQ10 생산을 증가시킨다는 개념은 선험적으로 단순하게 여겨질 수 있지만, 파라코커스로부터의 이들 유전자가 로도박터에서 기능적으로 발현될 수 있다는 이전의 증거가 없고, IPP 생합성에 관련된 파라코커스 효소가 로도박터에서 적절히 작용할 수 있다는 증거 또한 없다. 게다가, 모든 이용가능한 증거는 로도박터가 메발로네이트 경로의 중간체를 자연적으로는 함유하지 않는다고 나타내기 때문에, 이들 비-선천적인 화합물이 분해되거나 또는 달리 이형적으로-발현된 파라코커스 효소에 의해 이용될 수 없게 될 수 있다는 명확한 가능성이 있다.
본 발명은 파라코커스 속의 미생물, 특히 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론을 로도박터 균주로 도입하는 단계 및 형질전환체를 배양하는 단계에 의해 로도박터 속의 미생물, 특히 로도박터 스페로이드에서 CoQ10 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 파라코커스 속에 속하는 미생물, 특히 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론을 로도박터 속에 속하는 미생물, 특히 로도박터 스페로이드에 도입하는 단계 및 개질된 로도박터 균주를 배양하는 단계를 포함하는 CoQ10을 생산하기 위한 방법을 제공하고, 이에 의해 방법은 증가된 CoQ 10의 생산을 초래한다.
달리 말하자면, 본 발명은 파라코커스 속의 미생물의 메발로네이트 오페론이 도입된 로도박터 속의 미생물을 배지에서 배양하는 단계, CoQ10이 형성되고 배양액에 축척되게 하는 단계 및 이로부터 CoQ10을 회수하는 단계를 포함하는 CoQ10을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 파로코커스 속의 미생물, 특히 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론을 함유하는 로도박터 속의 미생물, 특히 로도박터 스페로이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 로도박터 속의 미생물, 특히 로도박터 스페로이드에서 CoQ10 생산을 증가시키기 위한 방법 또는 공정에서 파라코커스 속의 미생물, 특히 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 파라코커스 속의 미생물의 메발로네이트 오페론을 로도박터 속의 숙주 유기체에 도입하는 단계 및 형질전환된 숙주를 배양하는 단계에 의해 형질 전환된 숙주가 보다 높은 수율로 CoQ10을 발현할 수 있다는 발견에 근거한다.
실제로 본 발명을 실시하기 위해 수행되는 모든 공정 단계는 당업자에게 친숙한 통상적인 공정 단계이고 구체적인 설명이 필요없다.
본 발명에서 사용되는 메발로네이트 오페론은 9066개 뉴클레오타이드의 DNA 서열로 구성되고, 조절 서열(조절자)과는 별개로 아세토아세틸-CoA를 DMAPP로 형질전환시키기 위해서 필요한 하기 효소를 코딩하는 구조 유전자를 다음 순서로 함유한다: MvaA(하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소), Idi(아이소펜테닐 다이포스페이트 이성화효소), Hcs(하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소), Mvk(메발로네이트 키나제), Pmk(포스포메발로네이트 키나제) 및 Mvd(다이포스포메발로네이트 데카복실라제). 이 오페론의 DNA 서열은 제 WO 02/099095 호(예를 들어, 서열 번호 제 42 참조)에 개시되어 있다. 이 서열은 제아크산틴-생산 균주(파라코커스 제아크산티니파시엔스)인 파라코커스 종 R114로부터 유래하고, 이 균주는 부다페스트 조약에 따라 2001년 4월 24일에 특허 기탁 명칭 PTA-3335로 ATCC에 기탁되었다. 오페론에서 구조 유전자의 순서는 이들이 코딩하는 효소가 연속적인 대사 경로 반응을 촉매하는 순서와는 상이하다는 점에 주목해야 한다.
파라코커스 또는 파라코커스 속 미생물의 메발로네이트 오페론이란 용어는 본 발명에서 사용되는 오페론이 파라코커스 유기체로부터 실제로 단리되거나 유래되었음을 의미하는 것이 아니라 파라코커스 유기체에 존재하는 메발로네이트 오페론과 동일하다는 의미이다. 따라서, 파라코커스로부터 완전하게 단리되거나, 총체적으로 합성되거나, 또는 부분적으로 단리되고 합성될 수 있다. 완전하게 기능하는 오페론의 DNA 서열의 대립 유전자 변이체 및 돌연변이체 또한 상기 용어에 포함된다.
기타 파라코커스 종 및 균주, 및 플라보박테리움 종의 파라코커스로의 분류학적 재분류에 관해서 제 WO 02/099095 호 47ff 페이지를 참고할 수 있다. 미생물 "파라코커스 제아크산티니파시엔스" 및 "로도박터 스페로이드"는 원핵생물의 명명법의 국제 코드에 의해 정의된 바와 동일한 생리화학적 특성을 갖는 이러한 종의 유의어 또는 기본명을 또한 포함한다.
로도박터 속의 미생물 또는 숙주 유기체의 형질 전환과 관련하여 본 명세서 및 청구서에서 사용되는 용어 "~내로 도입"은 유전적 물질, 특히 메발로네이트 오페론을 숙주 유기체로 효율적으로 전달하는데, 즉, 유기체에 의해서 발현되도록 하는데 사용될 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함한다. 도입은 표준 방법에 따라서 예를 들어 벡터, 바람직하게는 발현 플라스미드에 의해 또는 숙주 게놈내로 통합에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 CoQ10의 개선된 생산에 바람직한 숙주 유기체가 로도박터 스페로이드이지만, CoQ10을 생산할 수 있는 로도박터 속의 기타 종, 예를 들어 로도박터 아드리아티쿠스(Rhodobacter adriaticus), 로도박터 캡슐라투스, 로도박터 설피도필루스(Rhodobacter sulfidophilus) 및 로도박터 벨드캄피(Rhodobacter veldkampii)를 숙주로서 사용할 수 있다. 모든 숙주 미생물은 이미 야생형 균주의 돌연변이를 나타내거나, 또는 야생형 균주의 CoQ10 생산성과 비교할 때 개선된 CoQ10 생산성을 특징으로 하는 유전적으로 조작된 균주를 나타낼 수 있다.
메발로네이트 오페론을 숙주 미생물내로 성공적으로 도입한 후, 형질전환된 숙주를 공지된 방법에 따라서, 바꿔 말하면 탄소 및 질소원, 무기 염 등(이들은 숙주에 의해서 동화할 수 있다)을 함유하는 배지에서 효과적인 성장 및 바람직한 생성물 CoQ10의 발현에 적합한 온도, pH 및 호기 조건하에서 배양한다.
발효 액체배지 및/또는 형질전환체, 즉 파라코커스 속에 속하는 미생물의 메발로네이트 오페론이 도입된 미생물로부터의 단리, 및 필요하다면 인간 또는 동물 용도를 위한 배합을 비롯한 수득된 CoQ10의 정제는 당분야에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 그러나, 동물 건강 및 영양에서 사용하는 경우, 구체적인 정제가 필수적이지 않을 수 있다. 이 경우에, 생물자원 및/또는 발효 배지의 기타 성분과 함께 CoQ10을 추가로 처리하여 상업적으로 매력적인 제품을 제공할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하지 않고, 본 발명을 예시한다.
이 실시예는 파라코커스 제아크산티니파시엔스로부터 클로닝된 메발로네이트 오페론을 로도박터 스페로이드 DSM 158로 도입시 CoQ10 생산이 개선됨을 나타낸다.
박테리아 및 배양 조건
로도박터 스페로이드 균주 DSM 158(도이치 사믈룬 본 미크루올가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로부터 수득됨)을 CoQ10의 생산이 개선된 재조합 균주의 구축을 위한 기본 균주로서 사용하였다. 모든 로도박터 스페로이드 균주는 28℃에서 RS100 배지에서 성장하였다. 배지 RS100의 조성 및 제조는 표 1에 요약하였다. 카나마이신 50mg/ℓ를 재조합 균주의 성장을 위해서 배지에 첨가하였다. 이. 콜라이 균주를 LB 배지(벡톤 디킨손(Becton Dickinson), 스파크스(Sparks), 미국 메릴랜드주)에서 성장시켰다. 재조합 이. 콜라이 균주에서 플라이스미드의 유지를 위해서, 앰피실린(100mg/ℓ) 및/또는 카나마이신(25 내지 50mg/ℓ, 플라스미드에 따라서)을 배양 배지에 첨가하였다. 이. 콜라이 및 로도박터 스페로이드의 액체 배지는 200rpm에서 회전식 진탕기에서 호기적으로 주기적으로 배양하였다. 고체 배지가 필요하면, 한천(1.5% 최종 농도)을 첨가하였다.
Figure 112009039397510-pct00006
플라스미드 pBBR -K- Nde 및 pBBR -K- mev - opR114 의 구축
플라스미드 pBBR-K-Nde(빈 플라스미드) 및 pBBR-K-mev-op-up-4(메발로네이트 오페론의 처음 4개의 유전자를 함유하는 플라스미드)의 구축은 각각 제 WO 02/099095 호의 실시예 6(91페이지, 12 내지 17 줄) 및 13(105페이지, 10 줄 내지 106페이지 8 줄)에 상세하게 기술되어 있다.
PCR 프라이머 hcs-5326(서열 번호 제 1)은 파라코커스 제아크산티니파시엔스 hcs 유전자의 서열(코돈 214에서 시작하여 코돈 220의 두번째 뉴클레오타이드에서 종결함)에 상응하는 반면에, PCR 프라이머 mvd-9000(서열 번호 제 2)은 파라코커스 제아크산티니파시엔스 mvd 유전자의 종결 코돈 후 뉴클레오타이드 104 내지 123의 서열의 역 상보체에 상응한다(WO 02/099095, 각각 서열 번호 제 46 및 52 참조). 플라스미드 TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt는 pCR2.1-TOPO에서 프라이머 hcs-5326 및 mvd-9000(주형으로서 파라코커스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588 게놈 DNA를 사용함)으로 수득된 PCR 단편을 클로닝하여 구축되었다. 따라서, 이 플라스미드는 hsc의 3' 말단 및 마지막 3개의 유전자, mvk, pmk 및 mvd를 포함하는 메발로네이트 오페론의 하부 절반을 함유한다. 플라스미드 pBBR-K-mev-op-up-4 및 TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt를 제한적 엔도뉴클라제 SacI 및 NdeI으로 절단하고, 후자의 절단에서 나온 보다 짧은 단편을 pBBR-K-mev-op-up-4에서 나온 보다 큰 단편과 연결하였다. 생성된 플라스미드인 pBBR-K-mev-op-wt는 이의 (추정적) 프로모터를 포함하는 파라코커스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588로부터 나온 완전한 메발로네이트 오페론을 함유한다. 파라코커스 제아크산티니파시엔스 균주 ATCC 21588(야생형)과 R114의 메발로네이트 오페론 서열 사이의 유일한 차이는 알라닌이 발린(A265V)으로 잔기 265가 변화된 mvk에서의 돌연변이이다. 파라코커스 제아크산티니파시엔스 ATCC 21588 게놈 DNA가 플라스미드 TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt 구축에 대한 PCR 주형으로서 사용되기 때문에, 이는 야생형 mvk 유전자를 함유한다. 부위-지향적 돌연변이에 의해 mvk(GCC에서 GTC로 변화된 코돈 265)에서 돌연변이를 도입하여 플라스미드 pBBR-K-mev-op-R114를 생성한다.
로도박터 스페로이드를 위한 형질전환 과정
클로닝을 위해 플라스미드로 이. 콜라이 S17-1을 형질 전환시키고, 후속적으로 접합에 의해 S17-1로부터 로도박터 스페로이드 DSM 158로 플라스미드를 전달하는 과정을 표준 과정을 사용하여 수행하였다(문헌[Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 18, 6169, 1990; Simon et al., Bio/Technology 1983, 784-91]). 로도박터 스페로이드 DSM 158의 자발적인 리팜피신 저항성 돌연변이주는, 먼저 리팜피신 100mg/ℓ로 보충된 RS100 액체 배지에서 DSM 158을 성장시키는 단계, 리팜피신 100mg/ℓ를 함유하는 RS100 플레이트에 세포를 플레이팅하는 단계 및 단일 콜로니(colony)를 단리하는 단계에 의해 단리되었다. 접합을 위해서, 리팜피신 100mg/ℓ를 함유하는 RS100 배지에서 성장시킨 수용 세포 배양액의 분취액 1㎖(리팜피신-저항성 로도박터 스페로이드 DSM 158) 및 공여 세포(전달될 플라스미드를 갖는 이. 콜라이 S17-1, 카나마이신 50mg/ℓ을 함유하는 LB 액체배지에서 성장시킴)를 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고, 세포를 신선한 RS100 배지로 2회 세척하여 항생제를 제거하였다. 이어서, 각각의 펠렛을 신선한 RS100 배지 1㎖중에 재현탁하였다. 공여 세포 50㎕ 및 수용 세포 0.45㎖를 혼합하고, 원심분리에 의해 펠렛화하고, 신선한 RS100 배지 0.03㎖중에 재현탁하고, RS100플레이트 상에 점을 찍었다. 28℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 접종 루프로 수집하고, RS100 배지 0.3㎖에 재현탁하였다. 이 현탁액의 희석액을 리팜피신 100mg/ℓ 및 카나마이신 50mg/ℓ를 함유하는 RS100 플레이트에 도말하고 28℃에서 배양하였다. 콜로니(로도박터 스페로이드 DSM 158의 추정적 형질전환된 세포)를 플레이트로부터 수집하고, 카나마이신 50mg/ℓ를 함유하는 액체 RS100 배지에서 성장시키고; 플라스미드의 존재를 적합한 프라이머를 사용한 PCR에 의해 검사하였다. 양성 클론을 카나마이신 50mg/ℓ를 함유하는 RS100 플레이트에 스트리킹하여 단일 콜로니를 수득하였다. 각각의 클론에서 나온 하나의 단일 콜로니를 다시 카나마이신 50mg/ℓ를 함유하는 액체 RS100배지에서 성장시키고, 예상 플라스미드의 존재를 PCR에 의해 확인하였다. 로도박터 스페로이드 DSM 158의 최종 형질전환된 균주는, 배양액에 글리세롤(15% v/v)을 첨가하고 -80℃로 동결하여 보존되었다.
로도박터 스페로이드에서 CoQ10 생산을 평가하기 위한 배양 조건
배지 RS100을 로도박터 스페로이드(50mg/카나마이신을 재조합 로도박터 스페로이드 균주의 성장을 위해서 첨가함)와 함께 모든 실험에서 사용하였다. 25㎖ 배양액을 200rpm으로 진탕하면서 250㎖ 들이 배플(baffled) 엘렌마이어 플라스크에서 28℃로 배양하였다. CoQ10 생산을 시험하기 위해서, 로도박터 스페로이드 균주의 동결된 글리세롤 첨가된 저장 배양액을 사용하여 종자 배양액 25㎖에 접종하였다. 24 내지 28시간 동안 종자 배양액을 성장시킨 후, 660nm에서 초기 광학 밀도(OD660)가 0.16가 되도록 적합한 부피의 배양액을 사용하여 실험 플라스크에 접종하였다. 시료 2㎖를 무균적으로 24시간 간격으로 수집하였다. 분석은 성장(OD660으로서 측정함), pH, 배양 상청액중 글루코스 및 CoQ10 및 카로테노이드(고 성능 액체 크로마토그래피[HPLC]에 의해 결정함- 다음의 분석 방법 단락 참조)를 포함하였다.
분석 방법
시약: 아세토나이트릴, 다이메틸설폭사이드(DMSO), 테트라하이드로퓨란(THF), t-뷰틸 메틸 에터(TBME) 및 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT)는 puriss. p.a. 또는 HPLC 등급이고, 플루카(Fluka, 스위스)로부터 수득하였다. 또한, CoQ10을 플루카로부터 구입하였다. 메탄올(리츠로솔브(Lichrosolv))을 메르크(Merch, 다름스타트)로부터 구입하였다. 카로테노이드 표준을 로슈 비타민 리미티드(Roche Vitamins Ltd., 스위스)의 화학 연구 부서로부터 구입하였다.
시료 제조 및 추출: 총 액체배지 400㎕를 1회용 15㎖ 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮겼다. 안정화된 추출 용액(1:1(v/v) DMSO/THF중 0.5g/ℓ BHT) 4㎖를 첨가하고 시료를 실험용 진탕기(IKA, 독일)에서 20분동안 혼합하여 추출을 증진시켰다. 최종적으로, 시료를 원심분리하고 상청액을 HPLC에 의해 분석하기 위해서 호박색의 유리 바이엘로 옮겼다.
HPLC: 역상 HPLC 방법을 유비퀴논 및 이들의 상응하는 하이드로퀴논의 동시 측정을 위해서 개발하였다. 방법은 CoQ10으로부터 카로테노이드 피토엔, 스페로이데논, 스페로이덴 및 뉴로스포렌을 확실하게 분리할 수 있다. 크로마토그래피는 온도-조절된 자동샘플러 및 다이오드 정렬 검출기를 갖춘 아길렌트(Agilent) 1100 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 방법 매개변수는 다음과 같다:
Figure 112009039397510-pct00007
Figure 112009039397510-pct00008
계산: 계산은 피크 면적을 기준으로 하였다.
선택성: 방법의 선택성은 관련된 참조 화합물의 표준 용액을 주입함에 의해 증명하였다. 목적 화합물(CoQ10 및 유비퀴놀-10)을 완전하게 단리하고 방해를 나타내지 않았다.
검출의 선형성 및 한계: 안정화된 추출 용액(상기 참조)중의 CoQ10의 일련의 희석액을 제조하고 분석하였다. 선형 범위는 5mg/ℓ 내지 50mg/ℓ에서 관찰되었다. 상관성 계수는 0.9999였다. 이 HPLC 방법에 의해 CoQ10에 대한 검출 한계가 4mg/ℓ로 결정되었다.
재현성: 추출 과정을 포함하는 방법의 재현성을 검사하였다. 10개의 개별적인 시료 제제를 비교하였다. 상대적인 표준 편차가 4%로 결정되었다.
로도박터 스페로이드 균주에 의한 CoQ10 생산의 결정
로도박터 스페로이드 균주 DSM 158, DSM 158/pBBR-K-Nde(빈 벡터 대조군) 및 DSM 158/pBBR-K-mev-opR114를 상기 구체화된 조건 하에서 진탕 플라스크 배양액에서 배양하고, CoQ10 생산을 측정하였다. 결과를 표 3에서 요약하였다. 제시된 값은 2개의 독립적인 실험값의 평균이고, 각각의 독립적인 실험에서, 각각의 균주를 2배수로 시험하였다. 이 결과는 파라코커스 제아크산티니파시엔스로부터 클로닝된 메발로네이트 오페론의 발현이 로도박터 스페로이드에서 CoQ10의 생산을 현저하게 개선시킴을 명백하게 나타낸다.
Figure 112006000978048-pct00004
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Improved production of coenzyme Q-10 <130> Case 21841 <150> EP 03015367.0 <151> 2003-07-08 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer hcs-5336 <400> 1 gcgctggtcg aggcgtggaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer mvd-9000 <400> 2 cgtcagcgtg gcgggcaagt 20

Claims (9)

  1. 파라코커스 제아크산티니파시엔스(Paracoccus zeaxanthinifaciens)의 메발로네이트 오페론을 로도박터(Rhodobacter) 속에 속하는 미생물에 도입하는 단계 및 변형된 로도박터 균주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 메발로네이트 오페론이 조절 서열인 조절자와는 별개로 MvaA(하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소), Idi(아이소펜테닐 다이포스페이트 이성화효소), Hcs(하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소), Mvk(메발로네이트 키나제), Pmk(포스포메발로네이트 키나제) 및 Mvd(다이포스포메발로네이트 데카복실라제)를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는, CoQ10의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    로도박터 속에 속하는 미생물이 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)인 방법.
  3. 삭제
  4. 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론이 도입된 로도박터 속의 미생물을 배지에서 배양하는 단계, CoQ10이 배양액에서 형성되고 축적되게 하는 단계 및 이로부터 CoQ10을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 메발로네이트 오페론이 조절 서열인 조절자와는 별개로 MvaA, Idi, Hcs, Mvk, Pmk 및 Mvd를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는, CoQ10의 생산 방법.
  5. 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론을 함유하며, 상기 메발로네이트 오페론이 조절 서열인 조절자와는 별개로 MvaA, Idi, Hcs, Mvk, Pmk 및 Mvd를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는, 로도박터 속의 미생물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    로도박터 스페로이드인 미생물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 파라코커스 제아크산티니파시엔스의 메발로네이트 오페론을 로도박터 균주 내로 도입하고 형질전환체를 배양함으로써 로도박터 속의 미생물에서 CoQ10의 생산을 증가시키며, 상기 메발로네이트 오페론이 조절 서열인 조절자와는 별개로 MvaA, Idi, Hcs, Mvk, Pmk 및 Mvd를 코딩하는 구조 유전자를 함유하는 방법.
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