CN113512513B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株产胞外蛋白能力和淀粉能力强的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA‑HS；将此菌株接种至发酵培养基中发酵，即可使发酵上清淀粉酶的表达量高达60U/mL；以此菌株为宿主表达编码1,4‑α‑葡聚糖分支酶的基因构建得到的重组菌接种至发酵培养基中发酵，可得发酵上清中1,4‑α‑葡聚糖分支酶的酶活最高达300U/mL。本发明方法在自然界筛选出解淀粉芽孢杆菌，根据特性分析找到淀粉酶和蛋白酶较高的菌株，针对性地探索野生解淀粉芽孢杆菌的电转条件，并对其进行优化，从而提高转化效率并成功表达异源蛋白。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种广泛分布、嗜温、好氧并产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，已被美国食品药品管理局(FDA)认定为GRAS(Generallyrecognized as safe)菌株。解淀粉芽孢杆菌不仅具有很强的抗逆性，还能能分泌大量酶类和产生抗菌物质，因此，一方面作为活菌剂被广泛应用在饲料、生防、环保等领域，另一方面作为表达系统在外源蛋白和代谢产物的生产中发挥重要作用。解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌具有很高的同源性，同时两者在遗传上和生化特征上存在种间差异。与枯草芽孢杆菌相比，解淀粉芽孢杆菌具有更强的蛋白分泌能力。目前，解淀粉芽孢杆菌是许多α-淀粉酶和蛋白酶等酶制剂的重要生产菌株。
尽管解淀粉芽孢杆菌具有优良的蛋白表达和分泌特性，然而相比于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌在外源蛋白表达方面的研究相对较少。这是由于解淀粉芽孢杆菌内存在DNA限制性内切修饰系统，并且外源质粒的稳定性差。限制性内切修饰系统由限制性内切酶和相应的甲基酶组成，这些酶可以识别并切断未被修饰的外源DNA，从而作为细菌细胞的防御工具。由于外源基因转化失败率高，所以很少有可靠的解淀粉芽孢杆菌作为宿主用于重组蛋白的生产。
目前，解淀粉芽孢杆菌的转化方法主要有：1)自然转化；2)原生质体转化；3)电击转化；4)原生质体电击转化。其中，电转化是一种快速、简单的转化方法。电转化的作用原理是在一定的电场强度作用下，细胞膜上形成可恢复的疏水性小孔以便外源DNA进入胞内。理论上电场强度越大，细胞表面产生的疏水性小孔越多，细胞膜通透性越好，外源DNA约容易进入胞内，但是细胞的死亡率也会随着电场强度的增加而增加。对于电转化方法，如何在转化率和细胞死亡率之间找到一个平衡点，建立最佳的电击条件非常重要。
为了改进电转的条件，已经有研究人员做出以下方面的贡献：1)在电击洗涤缓冲液中加入蔗糖、山梨醇、甘露醇或海藻糖之类的渗透剂，提高电击时细胞的存活率；2)优化细菌的收集时间或向液体培养基中加入一些能够抑制细胞壁合成的物质，如D(L)-苏氨酸、甘氨酸、抗生素(如氨苄青霉素)、溶菌酶或吐温-80等。3)对外源DNA进行内外或体内甲基化修饰，以克服宿主体内存在的限制修饰系统，避免被酶切降解。但是这些方法，都有其局限。比如，刘宇帅等人在专利(CN 110423784 A)里提及在电转培养基里加入甘氨酸能够使解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.4038的阳性转化率达到80％，但是早在2011年Zhang等人就在Enhancing electro-transformation competency ofrecalcitrant Bacillusamyloliquefaciens by combining cell-wall weakening and cell-membrane fluiditydisturbing提到加入甘氨酸和DL-苏氨酸可以削弱细胞壁，补充Tween 80进一步提高细胞膜流动性，从而使得外源质粒在解淀粉芽孢杆菌TA208中的转化率达到1.13±0.34x107CFU/μg。
而且对于不同的解淀粉芽孢杆菌，也需要针对性地摸索电击转化的条件，才能取得较为理想的结果。
目前，获得外源蛋白高效表达菌株的途径主要有两种：从自然界筛选和在现有菌株基础上进行改造优化。鉴于菌株本身遗传和生化性质对于蛋白表达的重要性，从自然界筛选获取一株产胞外蛋白能力强的解淀粉芽孢杆菌至关重要。
发明内容
为了实现外源蛋白的高效表达，本发明旨在筛选出一株性质优良的BA菌株，并进一步探究其电转效率提升的条件，从而为外源DNA的表达创造可能，为该酶后续应用提供理论依据。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种性质优良的菌株，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-HS(也称BA 04)，该菌株已于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020389，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA 04为革兰氏阳性菌，呈短杆状(0.7～0.9μm×1.8～3.0μm)，具有运动性，该菌单菌落形态为白色干燥的不规则圆形，边缘不平整，在8-14小时达到生长曲线的对数生长期，具有抗氧化性质，能够分泌具有较高酶活性的蛋白酶及淀粉酶，具有抗氧化性质，可用于外源基因的转化及表达。
其中，所述解淀粉芽孢杆菌的16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种筛选解淀粉芽孢杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取样，然后涂布于LB培养基中进行培养。
(2)将初步培养的菌株进行纯化，具体操作为挑取单菌落划线于新的LB培养基上，经培养后可得到初步筛选的菌株。
步骤(1)中，所述取样主要来自上海及其周边省市，如江苏、浙江等地初步取样；所述取样地主要为农田、湖泊、居民家中水槽。
步骤(1)中，所述LB平板培养基的组分包括：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min。
步骤(1)中，所述培养的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(1)中，所述培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(1)中，所述培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述单菌落为边缘不平整、干燥、呈白色或微黄色的形态。
步骤(2)中，所述LB平板培养基的组分包括：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min。
步骤(2)中，所述培养的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(2)中，所述培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(2)中，所述培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌的特性分析方法，步骤如下：
(1)将上述初步筛选的菌株划线接种于LB平板培养基进行扩增培养。
(2)将步骤(1)扩增后的菌株分别接种于牛奶培养基和淀粉培养基中，通过其水解圈大小的差异值进行筛选，将再次筛选出的四株菌株分别命名为BA 01、BA 02、BA 03、BA04，并对其进行16srDNA检测。
(3)在步骤(2)中的平板上挑取新鲜单菌落先接种至10-20mL的LB培养基中，并于摇床上培养，再接种至LB液体培养基中，装液量30mL，通过每隔1-2h取样，于分光光度计600-670nm下读取吸光光度值，绘制生长曲线。
(4)从步骤(2)中的平板上挑取新鲜单菌落先接种至10-20mL的LB培养基中，并于摇床上培养，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，摇床培养，并于2-4℃下10000-12000rpm离心2-5min，收集上清获得待测液，检测BA四株菌的抗氧化活性。
(5)从步骤(2)中的平板上挑取新鲜单菌落先接种至10-20mL的LB培养基中，并于摇床上培养，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，摇床培养并于2-4℃下10000-12000rpm离心2-5min，收集上清获得待测液，检测BA四株菌的淀粉酶活。
(6)将步骤(2)中筛选得到的菌株制备感受态细胞，电转然后进行质粒的转化，涂布于抗生素平板。
步骤(1)中，所述菌株指从上海及其周边省市，如江苏、浙江等地初步取样，将样品进行初步筛选纯化后得到的4株菌株。
步骤(1)中，所述LB平板培养基的组分包括：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min。
步骤(1)中，所述扩增培养的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(1)中，所述扩增培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(1)中，所述扩增培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述牛奶培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(2)中，在所述牛奶培养基中培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(2)中，在所述牛奶培养基中培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述牛奶培养基的配制过程：将10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至950mL，121℃灭菌15-20min后加入经0.2μm细菌滤器处理过的牛奶溶液50mL，其中奶粉颗粒1g。
步骤(2)中，所述淀粉培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(2)中，在所述淀粉培养基中培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(2)中，在所述淀粉培养基中培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(2)中，所述淀粉培养基的配制过程：先将1g马铃薯淀粉加50-100mL蒸馏水加热糊化，再加入10g胰蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠和25g琼脂粉加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌15-20min。
步骤(2)中，所述方法初步筛选出蛋白酶和淀粉酶酶活都较高的菌株为BA 04。
步骤(3)-(5)中，所述LB液体培养基的配置过程：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min。
步骤(3)-(5)中，所述TB发酵培养基的配置过程：胰蛋白胨：2g/L，酵母提取物：24g/L，甘油：4mL/L，KH2PO4：2.2g/L，K2HPO4：9.4g/L，115℃高温高压灭菌15-20min。
步骤(3)-(5)中，所述LB和TB培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(3)-(5)中，所述摇床培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(4)中，抗氧化活性的测定所用试剂盒为Solarbio的还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒。
步骤(4)-(5)中，所述LB培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(4)-(5)中，所述LB培养的时间为14-18h；优选地，为16h。
步骤(4)-(5)中，所述TB培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃。
步骤(4)-(5)中，所述TB培养的时间为18-30h；优选地，为24h。
步骤(3)(5)中，所述摇床培养的转速为150-220rpm；优选地，为200rpm。
步骤(5)，淀粉酶活的测定中主要试剂的配置：
(a)0.4％(w/v)马铃薯淀粉溶液的配置(底物)：0.4％(w/v)的马铃薯淀粉在60℃下糊化15min后进行冷却，加入100mM Tris-HCl(pH7.5)。
(b)显色液：碘液母液(I2：0.26g；KI：2.6g；蒸馏水定容至10mL)：0.5mL；1N HCl：0.5mL；蒸馏水定容至130mL。显色液用锡箔纸包裹以避光，作为备用显色液。
(c)淀粉酶活力的测定参照Takada等(Takata H,Takaha T,Kuriki T,etal.Properties and active center ofthe thermostable branching enzyme fromBacillus stearothermophilus.Appl Environ Microbiol.1994,60:3096–3104)的方法，具体方法为：将马铃薯淀粉溶解于100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，制备浓度为0.1g/100ml的底物溶液。将50μL适当稀释的待测液与等体积的底物溶液混合，在一定温度中水浴中反应30min。再加入2mL碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值。
淀粉酶活力单位(U)定义：在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1％所需要的酶量。
根据以下公式确定溶液的淀粉酶活性：淀粉酶活(单位(U)/mL)＝(对照溶液在660nm处的吸光度)-样品溶液在660nm处的吸光度)/对照物的吸光度660nm×100/30×20)。
步骤(5)中，所述方法初步筛选出淀粉酶酶活最高的BA 04菌株，酶活达到60U/mL。虽然该酶活不是现有技术中最高的数字，比如在2019年邱锦等人发表的文章《解淀粉芽孢杆菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢杆菌中的高效表达》中提到，野生型解淀粉芽孢杆菌的淀粉酶活在最适温度和最适pH下可以达到6835U/mg，但是酶活测定方法采用的是DNS(3，5-二硝基水杨酸)定糖法，与本发明所述的方法原理不同。
步骤(6)中，感受态细胞的制备及转化方法为：
(6-1)挑取解淀粉芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中过夜培养，按照培养基体积的一定比例取解淀粉芽孢杆菌的过夜培养物接种于LB+0.5M山梨醇液体培养基中，摇床培养，保持一定的OD600值，将培养液冰浴离心收集菌体。
其中，接种量为1-2％；优选地，为1％；
摇床培养的温度为30-45℃；优选地，为37℃；
摇床培养的转速为150-220rpm；优选地，为200rpm；
摇床培养的时间为3-6h；优选地，为3-5h；进一步优选地，为3h；
OD600的数值为0.8-1.2；优选地，为1；
冰浴时间为5-10min；优选地，为5min；
离心温度为2-4℃；优选地，为4℃；
离心转速为5000-8000rpm；优选地，为8000rpm；
离心时间为2-5min；优选地，为5min。
(6-2)在5000-8000rpm离心8-10min漂洗所述步骤一收集到的菌体，然后将菌体吹悬于0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油电转培养基中，即得感受态细胞，每管分装100μL，-80℃保存。
其中，离心转速为5000-8000rpm；优选地，为5000rpm；
离心时间为8-10min；优选地，为8min。
感受态细胞具体是指：此刻的细胞壁脆弱，易于外源DNA进入的细胞。
(6-3)电转的具体步骤为：
质粒加入感受态细胞，加入预冷的电击杯进行电转，电击后立即加入1mL由LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇组成的复苏培养基中，在30-45℃温度下，150-220rpm摇床下培养1-3h后涂布于含有质粒所携带的抗性的LB培养基上继续培养，30-45℃温度下培养16-24h后从长出的菌落中筛选转化成功的菌株；其中，摇床培养的优选条件为：温度37℃，转速200rpm，时间3h；在LB培养基上的优选条件为：温度37℃，时间16h。
步骤(6)中，转化所用质粒为pHT01、pUB18、pWB980等中的一种或多种；优选地，为pWB980。其中，pHT01带有氨苄抗性，pUB18和pWB980带有卡那抗性。
步骤(6)中的带有抗性的LB固体培养基配制过程：
先配制卡那或氨苄溶液母液：卡那或氨苄抗生素0.1g/mL，用蒸馏水定容至100mL，经0.2μm细菌滤器处理后，分装至灭菌离心管1mL/管。
再配制LB固体培养基：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min
待LB固体培养基灭菌后加入卡那或氨苄溶液母液，使得卡那或氨苄抗生素的终浓度为100-200μg/mL，优选地，为100μg/mL。
步骤(6)中，加入质粒的量为0.2-2μg；优选地，为2μg。
步骤(6)中，电转时的电转仪设置条件为：电压1.8-2.2kV，电击时间4.5-5ms，电阻100-200Ω；优选地，电压为2.2kV,电击时间5ms，电阻200Ω。
步骤(6)中，能成功转化的有且仅有BA 04菌株。
本发明还提供了一种重组菌的构建方法，所述方法具体包括以下步骤：
步骤一，培养解淀粉芽孢杆菌：
挑取经过活化稳定培养的解淀粉芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中过夜培养，按照培养基体积的1-2％取解淀粉芽孢杆菌的过夜培养物接种于LB+0.5M山梨醇液体培养基中，在30-45℃、150-220rpm转速下培养3-6h，使得OD600为0.8-1.2，将培养液冰浴5-10min，2-4℃下5000-8000rpm离心2-5min离心收集菌体；
步骤二、制备解淀粉芽孢杆菌的感受态细胞：
在5000-8000rpm离心8-10min漂洗所述步骤一收集到的菌体，然后将菌体吹悬于0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油电转培养基中，即得感受态细胞；
步骤三、电转化：
将质粒加入所述步骤二得到的感受态细胞中，加入预冷的电击杯进行电转，电击后立即加入1mL由LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇组成的复苏培养基中，在30-45℃温度下，150-220rpm摇床上，培养1-3h后涂布于含有质粒所携带的抗性抗生素的LB培养基上继续培养，30-45℃温度下培养16-24h后从长出的菌落中筛选转化成功的菌株。
步骤一中，所述LB培养基的组分包括：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min；所述培养基的pH为5.2-8.4。
步骤三中，所述质粒包括pHT01、pUB18、pWB980；所述加入质粒的量为0.2-2μg。
步骤三中，所述含有抗性抗生素的LB培养基中抗生素的终浓度为100-200μg/mL。
步骤三中，所述电转时质粒添加量为：0.2-2μg；所述电转仪设置条件为：电压1.8-2.2kV，电击时间4.5-5ms，电阻100-200Ω。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌以所述解淀粉芽孢杆菌为宿主表达编码目的蛋白的基因，所述目的蛋白为1,4-α-葡聚糖分支酶，所述1,4-α-葡聚糖分支酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；测得重组菌的分支酶活最高达到300U/mL，且随着时间的增长，在24-72h内，重组菌的酶活不断提高，在SDS-PAGE图(图7)上存在目标蛋白的条带。
本发明还提供了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA 04在作为宿主表达1,4-α-葡聚糖分支酶基因中的应用，步骤如下：
步骤(1)将带有1,4-α-葡聚糖分支酶基因的质粒pWB980-6GT电转化进入BA 04。
步骤(2)挑选转化子，鉴定正确后划线带有卡那抗性的LB平板。
步骤(3)从步骤(2)中的LB固体培养基平板上挑取新鲜单菌落先接种至10-20mL的LB培养基中，并于30-45℃温度下，150-220rpm摇床上培养9-16h，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，并于30-45℃温度下，150-220rpm摇床上培养18-30h，并于4℃下12000rpm离心2min，收集上清获得粗酶液，检测重组菌的分支酶酶活。
步骤(1)中，电转时质粒的量为：0.2-2μg；优选地，为2μg。
步骤(1)中，电转时的电转仪设置条件为：电压1.8-2.2kV，电击时间4.5-5ms，电阻100-200Ω；优选地，电压为2.2kV,电击时间5ms，电阻200Ω。
步骤(2)中，鉴定方法为：
先挑取转化子接种于带有卡那抗性的LB液体培养基中，培养后按照TIANGEN质粒小提试剂盒DP103提取质粒，以质粒DNA为模板，以F1和R1作为GBE的特异性引物，进行目的基因的PCR扩增。扩增后的大小为1884bp。
F1：ATGAAAAAATTCTCTCTTATCTCT(SEQ ID No.3)
R1：TTAGCCTTCATGTTTAAGGTAGATAACA(SEQ ID No.4)
PCR条件：98℃预变性2min；随后30个循环(98℃10s，64℃15s，72℃120s)，72℃再延伸10min。
步骤(2)中的带有卡那抗性的LB固体培养基配制过程：
配制卡那溶液母液：卡那抗生素0.1g/mL，用蒸馏水定容至100mL，经0.2μm细菌滤器处理后，分装至灭菌离心管1mL/管。
配制LB固体培养基：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min；所述培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
待LB固体培养基灭菌后加入卡那溶液母液，使得卡那抗生素的终浓度为100-200μg/mL；优选地，为100μg/mL。
步骤(3)中，所述LB液体培养基的配置过程：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min；所述培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(3)中，所述TB发酵培养基的配置过程：胰蛋白胨：2g/L，酵母提取物：24g/L，甘油：4mL/L，KH2PO4：2.2g/L，K2HPO4：9.4g/L，115℃高温高压灭菌15-20min；所述培养基的pH为5.2-8.4；优选地，为7.0。
步骤(3)中，检测重组菌的分支酶活中主要试剂的配置：
0.4％(w/v)马铃薯淀粉溶液的配置(底物)：0.4％(w/v)的马铃薯淀粉在60℃下糊化15min后进行冷却，加入100mM Tris-HCl(pH7.5)。
显色液：碘液母液(I2：0.26g；KI：2.6g；蒸馏水定容至10mL)：0.5mL；1N HCl：0.5mL；蒸馏水定容至130mL。显色液用锡箔纸包裹以避光，作为备用显色液。
分支酶活力的测定参照Takada等的方法，具体方法为：将马铃薯淀粉溶解于100mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，制备浓度为0.1g/100ml的底物溶液。将50μL适当稀释的待测液与等体积的底物溶液混合，在一定温度中水浴中反应30min。再加入2mL碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值。
分支酶活力单位(U)定义：在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1％所需要的酶量。
根据以下公式确定溶液的分支酶活性：分支酶活(单位(U)/mL)＝(对照溶液在660nm处的吸光度)-样品溶液在660nm处的吸光度)/对照物的吸光度660nm×100/30×20)。
步骤(3)中，所述方法测得重组菌的发酵上清中1,4-α-葡聚糖分支酶活最高达到300U/mL，现有技术还未曾报导有表达，故为现有技术在解淀粉芽孢杆菌中分支酶活最高。
本发明的有益效果包括：提供了针对解淀粉芽孢杆菌的电转效率提高的方法，筛选出一株有异源表达潜能的优势菌株，为解淀粉芽孢杆菌作为宿主表达异源蛋白提供更多思路。
本发明中，所述BA 04与BA-HS为同一物，表示解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。
附图说明
图1是本发明菌株复苏培养时的菌落形态；
图2是本发明菌种初筛时所测量的蛋白酶及淀粉酶水解圈大小；(其中BA 04菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力最强)
图3是本发明菌株初筛所得的生长曲线；(其中BA 04菌株的生长能力最强)
图4是本发明菌株初筛所得的抗氧化性；(其中BA 04菌株的抗氧化能力最强)
图5是本发明菌株初筛所得的淀粉酶活；(其中BA 04的淀粉酶活最高，达到60U/mL)
图6是本发明BA 04作为宿主表达1,4-α-葡聚糖分支酶基因的分支酶活；(其中重组菌的发酵上清中最高分支酶活300U/mL)
图7是本发明BA 04作为宿主表达1,4-α-葡聚糖分支酶基因的蛋白分泌表达情况。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
蛋白酶、淀粉酶高产菌株的筛选及纯化，方法如下：
将待筛选的4株解淀粉芽孢杆菌株(BA 01、BA 02、BA 03、BA 04)于LB平板培养基中进行复苏培养，观察单菌落形态(图1)，发现四株菌形态均为白色干燥的不规则圆形，边缘不平整，将复苏后的菌株分别点种到牛奶培养基和淀粉培养基中，在37℃温度下，培养24h。每株菌点板6个单菌落，观察水解圈的大小。
结果分析，所筛选出的四株菌株(解淀粉芽孢杆菌株BA 01、BA 02、BA 03、BA 04)中水解圈值最高的菌株是解淀粉芽孢杆菌株BA 04(图2)。对筛选出的四株菌株进行16srDNA测序，四株菌株均为解淀粉芽孢杆菌。
实施例2
初筛菌株的生长曲线，方法如下：
将本发明实施例1筛选出的四株菌株(解淀粉芽孢杆菌株BA 01、BA 02、BA 03、BA04)接种至LB固体培养基中，在37℃温度下，培养16个小时。从平板上挑取新鲜单菌落先接种至10mL的LB培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养16h，再接种至LB培养基中，装液量30mL，在37℃、200rpm的摇床上培养，每隔2h取样，于分光光度计600nm下读取吸光光度值，绘制BA四株菌株的生长曲线(图3)。
结果分析，四株菌株都在4-10h达到细菌生长的对数生长期，其中，解淀粉芽孢杆菌株BA 04的生物量OD600所能达到的最高值是四株菌中最大的，说明解淀粉芽孢杆菌株BA04的生长最为旺盛。
实施例3
初筛菌株的抗氧化活性测定，方法如下：
将本发明实施例1筛选出的四株菌株(解淀粉芽孢杆菌株BA 01、BA 02、BA 03、BA04)接种至LB固体培养基中，在37℃温度下，培养16个小时。从平板上挑取新鲜单菌落先接种至10mL的LB培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养16h，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，在37℃、200rpm的摇床上培养，并于4℃下12000rpm离心2min，收集上清获得待测液，用Solarbio的还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒，检测BA四株菌株的抗氧化活性(图4)。
结果分析，所筛选出的四株菌株中抗氧化活性最高的菌株是解淀粉芽孢杆菌株BA04，达到100μg/mL，说明该菌株更不易受到氧化胁迫，具有较强的生存能力。
实施例4
初筛菌株的淀粉酶活测定，方法如下：
将本发明实施例1筛选出的四株菌株(解淀粉芽孢杆菌株BA 01、BA 02、BA 03、BA04)接种至LB固体培养基中，在37℃温度下，培养16个小时。从平板上挑取新鲜单菌落先接种至10mL的LB培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养16h，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，在37℃、200rpm的摇床上培养，并于4℃下12000rpm离心2min，收集上清获得待测液，检测BA四株菌株的淀粉酶活。
结果分析，培养24h后(图5)，解淀粉芽孢杆菌株BA 04的淀粉酶活最高，达到60U/mL，说明该株菌具有较强的淀粉酶分泌能力，对于同样属于淀粉酶家族的1,4-α-葡聚糖分支酶，具有优良的重组表达潜力。
实施例5
pHT01质粒电转解淀粉芽孢杆菌株BA实验的探究，方法如下：
将不同量的质粒pHT01(0.2-2μg)加入感受态细胞，加入预冷的电击杯进行电转，电转时的电转仪设置不同条件为：电压1.8-2.2kV，电击时间4.5-5ms，电阻100-200Ω，电击后立即加入1mL由复苏培养基，在37℃温度下，200rpm的摇床上培养3h后，涂布于含有质粒所携带的抗性的LB培养基上继续培养，37℃温度下培养16h后从长出的菌落中筛选转化成功的菌株。能够长出转化子的菌株认为有可转化能力。同时加上解淀粉芽孢杆菌的标准株FZB42和DSM 1063这两株菌有文献报道通过同源重组染色体的方式表达外源基因，但是有关电转优化方面的文献鲜有报道。
结果分析(表1)，解淀粉芽孢杆菌株BA 01、解淀粉芽孢杆菌株BA 02、解淀粉芽孢杆菌株BA 03、FZB42和DSM 1063不可转化，这可能跟菌株本身的保护机制存在关系。在最优条件下，pHT01质粒能够在解淀粉芽孢杆菌株BA 04中达到的转化率为：5x104CFU/μg。
表1 pHT01质粒电转BA菌株的电转情况
Figure BDA0003140367940000111
Figure BDA0003140367940000121
Figure BDA0003140367940000131
Figure BDA0003140367940000141
Figure BDA0003140367940000151
Figure BDA0003140367940000161
实施例6
pUB18质粒电转解淀粉芽孢杆菌株BA实验的探究，方法同本发明实施例3。
结果分析(表2)，解淀粉芽孢杆菌株BA 01、解淀粉芽孢杆菌株BA 02、解淀粉芽孢杆菌株BA 03、FZB42和DSM 1063均不可转化。但在最优条件下，pUB18质粒能够在解淀粉芽孢杆菌株BA 04中达到的转化率为：26x104CFU/μg。
表2 pUB18质粒电转BA菌株的电转情况
Figure BDA0003140367940000162
Figure BDA0003140367940000171
Figure BDA0003140367940000181
Figure BDA0003140367940000191
Figure BDA0003140367940000201
Figure BDA0003140367940000211
实施例7
pWB980质粒电转解淀粉芽孢杆菌株BA实验的探究，方法同本发明实施例3。
结果分析(表3)，解淀粉芽孢杆菌株BA 01、解淀粉芽孢杆菌株BA 02、解淀粉芽孢杆菌株BA 03、FZB42和DSM 1063均不可转化。在最优条件下，pWB980质粒能够在解淀粉芽孢杆菌株BA 04中达到的转化率为：50x104CFU/μg。
表3 pWB980质粒电转BA菌株的电转情况
Figure BDA0003140367940000221
Figure BDA0003140367940000231
Figure BDA0003140367940000241
Figure BDA0003140367940000251
Figure BDA0003140367940000261
Figure BDA0003140367940000271
结合表1-表3的数据发现，能成功转化的菌株有且仅有解淀粉芽孢杆菌BA 04，能够转化三种质粒(表4)，这说明在重组菌的构建过程中，解淀粉芽孢杆菌BA 04能够允许外源基因的进入，而且其中pWB980质粒的转化率最高，为接下来目的基因的转化摸索了最合适的条件。
表4菌株初筛所得的电转情况
Figure BDA0003140367940000272
实施例8
pWB980-6GT质粒电转解淀粉芽孢杆菌株BA实验的探究，方法如下：
将不同量的质粒(0.2-2μg)加入感受态细胞，加入预冷的电击杯进行电转，电转时的电转仪设置不同条件为：1.8-2.2kV，4.5-5ms，100-200Ω，电击后立即加入1mL由复苏培养基，在37℃温度下，200rpm的摇床上培养3h后，涂布于含有质粒所携带的抗性的LB培养基上继续培养，37℃温度下培养16h后从长出的菌落中筛选转化成功的菌株。能够长出转化子的菌株认为有可转化能力。
表5 pWB980-6GT质粒电转BA菌株的电转情况
Figure BDA0003140367940000281
结果分析(表5)，在最优条件下，pWB980-6GT质粒能够在解淀粉芽孢杆菌BA 04中达到的转化率为：52x104CFU/μg。以上结果说明：解淀粉芽孢杆菌BA 04能够成功转化目的基因，但是能否成功表达目的蛋白，还有待进一步研究。
实施例9
解淀粉芽孢杆菌株BA 04作为宿主表达1,4-α-葡聚糖分支酶基因的分支酶活，其方法如下：
挑取转化子鉴定正确后，从平板上挑取新鲜单菌落先接种至10mL的LB培养基中，并于37℃温度下、200rpm的摇床上，培养16h，再接种至TB发酵培养基中，装液量30mL，并于37℃温度下、200rpm的摇床上培养，于4℃下12000rpm离心2min，收集上清获得待测液，参照Takada等的方法测定酶活。
结果分析，测得重组菌的1,4-α-葡聚糖分支酶活(图6)最高达到300U/mL，且随着培养时间的增长，在培养时间为24-72h内重组菌的酶活不断提高，而且在SDS-PAGE图上也能看到目标蛋白的条带(图7的1表示24h上清酶活，2表示48h上清酶活，3表示72h上清酶活)，说明BA 04不但能够成功转化外源基因，还能成功表达外源蛋白。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
<110> 华东师范大学
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1051
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens BA04
<400> 1
tgcctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60
cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120
ctaataccgg atgcttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc 180
acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240
cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360
ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420
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cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540
tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600
gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720
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atgagtgcta agtgttaggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact 840
ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg cccgcacagc 900
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gaaaatccta gagatagacg tcccttcggg gcagatgaca gtgtgcatga tgtcgtccgc 1020
tcgtgtcgtg aatgttggtt agtccccgca c 1051
<210> 2
<211> 1893
<212> Protein
<213> 1,4-α-葡聚糖分支酶
<400> 2
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala
35 40 45
Gly Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala Cys
50 55 60
Gly Thr Cys Thr Thr Thr Ala Cys Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Thr
65 70 75 80
Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys
85 90 95
Gly Ala Ala Cys Thr Thr Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys
100 105 110
Gly Thr Thr Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Cys
115 120 125
Thr Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr
130 135 140
Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Thr Cys
145 150 155 160
Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala
165 170 175
Cys Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys
180 185 190
Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala
195 200 205
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210 215 220
Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys
245 250 255
Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Ala
260 265 270
Cys Ala Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly
290 295 300
Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys
305 310 315 320
Thr Thr Thr Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys
325 330 335
Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys Ala
340 345 350
Ala Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly
355 360 365
Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Gly Thr
370 375 380
Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr
385 390 395 400
Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Gly Thr Ala Ala
405 410 415
Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr
420 425 430
Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Thr Cys Thr Cys Thr Ala
435 440 445
Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Thr
450 455 460
Thr Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr
465 470 475 480
Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Ala
485 490 495
Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala
500 505 510
Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala
515 520 525
Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly
530 535 540
Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr
545 550 555 560
Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Thr Cys
565 570 575
Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys
580 585 590
Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys
595 600 605
Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys
610 615 620
Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys Thr Cys
625 630 635 640
Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys Gly Gly
645 650 655
Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys
660 665 670
Ala Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Thr Ala Thr Cys Gly Ala Thr Ala
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Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly
690 695 700
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Cys Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr
865 870 875 880
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885 890 895
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Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly
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Thr Ala Thr Gly Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Gly Ala Thr
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Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr
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Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys
995 1000 1005
Cys Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala
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Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Ala Ala Ala Thr Thr Cys
1025 1030 1035
Ala Ala Cys Gly Ala Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys
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Cys Gly Thr Ala Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr
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Gly Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Cys Gly Cys Thr
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Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Thr
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Thr Gly Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Cys Thr
1100 1105 1110
Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Cys Gly Thr Thr
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Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys
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Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys
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Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys
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Gly Ala Thr Ala Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys
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Thr Thr Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr
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Ala Thr Cys Thr Ala Cys Cys Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ala Cys
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Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr Thr
1220 1225 1230
Ala Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly
1235 1240 1245
Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala
1250 1255 1260
Ala Ala Cys Thr Thr Cys Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr
1265 1270 1275
Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala
1280 1285 1290
Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala
1295 1300 1305
Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Cys
1310 1315 1320
Ala Ala Ala Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Thr
1325 1330 1335
Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys
1340 1345 1350
Gly Cys Thr Ala Ala Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr
1355 1360 1365
Cys Thr Thr Thr Thr Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly
1370 1375 1380
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Cys
1385 1390 1395
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr Thr Cys
1400 1405 1410
Ala Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys
1415 1420 1425
Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala
1430 1435 1440
Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala
1445 1450 1455
Thr Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr
1460 1465 1470
Cys Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Cys Cys Thr
1475 1480 1485
Thr Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys
1490 1495 1500
Cys Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala
1505 1510 1515
Gly Ala Thr Cys Thr Thr Ala Ala Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr
1520 1525 1530
Thr Ala Cys Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala
1535 1540 1545
Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala
1550 1555 1560
Gly Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala
1565 1570 1575
Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Thr Thr
1580 1585 1590
Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Gly Gly
1595 1600 1605
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys
1610 1615 1620
Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Thr Ala Ala Ala
1625 1630 1635
Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Ala Ala
1640 1645 1650
Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr
1655 1660 1665
Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala
1670 1675 1680
Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys
1685 1690 1695
Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Gly Gly Cys
1700 1705 1710
Gly Thr Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys
1715 1720 1725
Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys
1730 1735 1740
Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Thr
1745 1750 1755
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys
1760 1765 1770
Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys
1775 1780 1785
Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala
1790 1795 1800
Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Cys Cys Cys Thr
1805 1810 1815
Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Ala Ala
1820 1825 1830
Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr
1835 1840 1845
Ala Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Thr
1850 1855 1860
Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Thr
1865 1870 1875
Ala Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Ala Ala
1880 1885 1890
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaaaaat tctctcttat ctct 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttagccttca tgtttaaggt agataaca 28

Claims (8)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BA-HS，于2020年8月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020389。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在作为宿主表达1,4-α-葡聚糖分支酶基因中的应用。
3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌为宿主表达编码目的蛋白的基因。
4.如权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述目的蛋白为1,4-α-葡聚糖分支酶，所述1,4-α-葡聚糖分支酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.一种重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
步骤一、培养如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌：
挑取经过活化稳定培养的解淀粉芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中过夜培养，按照培养基体积的1-2%取解淀粉芽孢杆菌的过夜培养物接种于LB+0.5M山梨醇液体培养基中，在30-45°C、150-220rpm转速下培养3-6h，使得OD600为0.8-1.2，将培养液冰浴5-10min，2-4°C下5000-8000rpm离心2-5min离心收集菌体；
步骤二、制备解淀粉芽孢杆菌的感受态细胞：
在5000-8000rpm离心8-10min漂洗所述步骤一收集到的菌体，然后将菌体吹悬于0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10%甘油电转培养基中，即得感受态细胞；
步骤三、电转化：
将质粒加入所述步骤二得到的感受态细胞中，加入预冷的电击杯进行电转，电击后立即加入1mL 由LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇组成的复苏培养基中，在30-45℃温度下，150-220rpm摇床上，培养1-3h后涂布于含有质粒所携带的抗性抗生素的LB培养基上继续培养，30-45℃温度下培养16-24h后从长出的菌落中筛选转化成功的菌株。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L和25g/L琼脂粉，最后用蒸馏水补充体系至1L，121℃高温高压灭菌15-20min；所述培养基的pH为5.2-8.4。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述质粒为pHT01、pUB18或pWB980；所述加入质粒的量为0.2-2μg；所述含有抗性抗生素的LB培养基中抗生素的终浓度为100-200μg/mL。
8.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述电转时质粒添加量为：0.2-2μg；所述电转仪设置条件为：电压1.8-2.2kV，电击时间4.5-5ms，电阻100-200Ω。
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