CN114277065A

CN114277065A - 一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法

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Publication number: CN114277065A
Application number: CN202111649937.8A
Authority: CN
Inventors: 杨付伟; 王竞辉; 马光; 吴计划; 常红星; 张光祥
Original assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Current assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114277065B

Abstract

本发明属于生物化工领域，提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，包括：(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合，(2)好氧培养阶段，用于生长菌体；(3)厌氧培养阶段，用于生产乳酸和丁二酸。本发明方法能够提高产物中丁二酸含量，使丁二酸易于回收，降低回收成本。

Description

一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及乳酸和丁二酸的生产。

背景技术

聚乳酸(PLA)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS)是可降解材料中比较有前景的两种材料，它们能够在自然条件下完全降解，安全无毒，可以显著改善生态环境；其良好的力学性能和加工性能也能够满足各大领域的需求。

聚乳酸的制备单体是乳酸。传统的乳酸制备方法是乳腈法，即乙醛和氢氰酸在碱性催化剂的作用下生成乳腈，乳腈加入浓盐酸或浓硫酸酸化，得到粗乳酸。粗乳酸经过甲醇酯化、水解、精制得到精制乳酸。由于在制备过程中会发生消旋，用化学法制得的乳酸是DL-乳酸，无法用于聚合领域，并且由于用到氢氰酸等剧毒物质，限制了化学法乳酸单体的应用领域。

目前也有利用微生物发酵法生产乳酸，但由于微生物生长代谢的复杂性，乳酸发酵过程中不可避免地存在着各种杂酸代谢途径，包括甲酸、乙酸、丁二酸、富马酸、丙酮酸、2-羟基羧酸类化合物、苯乳酸等，从而导致发酵液中杂质含量高，乳酸化学纯度低，不仅增加了乳酸单体分离提取成本，也降低了碳源转化率，提高了乳酸单体和聚乳酸的生产成本。且无论以何种方式发酵，丁二酸都是难以避免的副产物之一，含量在1g/L～3g/L。如果将其作为废弃物，由于丁二酸和乳酸不容易相互分离，将会显著降低乳酸收率，增加生产成本；如果将其作为副产物回收，由于丁二酸含量相对较低，为此而增加的设备投资和回收副产物的预期收益相比，经济性较差。

因此，现实中需要有更环保、更便捷、成本低廉的生产乳酸以及丁二酸的方法。

发明内容

本发明旨在解决现有的乳酸发酵过程中杂质种类多、杂酸含量高、分离成本高、碳源转化率低、发酵尾气处理成本高等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，包括：

(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合接种至培养基中，两种菌的比例为1:10～10:1，优选地1:5～5:1，更优选地1:1；

(2)好氧培养阶段：用于生长菌体，向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的烟酸和1～10mmol/L的乙偶姻；至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：用于生产乳酸和丁二酸，该阶段向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的甘氨酸和1～10mmol/L的甘露醇；

其中，所述产乳酸菌株包括凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产L-和/或D-乳酸的菌株；所述产丁二酸菌株包括琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产丁二酸的菌株。

在一些实施方案中，上述方法中，所述培养基包含碳源，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉糖化液、秸秆糖化液中的一种或多种。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述培养基包含氮源，所述氮源选自蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母浸粉、玉米粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种。

在一些实施方案中，上述任一项所述的方法中，所述培养基包含：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述步骤(2)和步骤(3)中pH5.0-7.5，优选6.5-7.0；优选地通过加入氧化钙、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、氢氧化钠中的一种或多种调节pH值。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述好氧培养阶段温度为25℃-60℃、优选35℃-55℃，溶氧10％-70％、优选30％-60％，培养时间为3-10h、优选4-8h；促使菌株快速增殖，提高生产效率。

进一步地，所述好氧培养阶段的转速为100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压为0.05-0.15MPa，根据溶氧调整转速、通风量和罐压，使溶氧维持在10％-70％、优选30％-60％。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述厌氧培养阶段温度为30℃-60℃、优选45℃-55℃，培养时间为20-50h、优选20-40h，转速为200r/min以下，罐压为0-0.02MPa；通过调节厌氧培养阶段温度，改变产物中乳酸和丁二酸比例，抑制杂酸代谢途径，并提高乳酸产量。

优选地，在厌氧培养阶段，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，还包括回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.1vvm-1.0vvm，优选0.1vvm-0.5vvm，每小时间歇通气时间为0.1～0.5h，优选0.1～0.5h，通过调节回用尾气通气量，抑制杂酸代谢途径，并调节产物中乳酸和丁二酸的比例。

在一种实施方式中，所述方法包括：

(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合接种至培养基中，优选地，两种菌的比例为1:5～5:1，优选地1:1；所述产乳酸菌株为CICC 23843或CGMCC No.11059，所述产丁二酸菌株为CICC 23845；所述培养基的组成为：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水；

(2)好氧培养阶段：向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1mmol/L的烟酸和1mmol/L的乙偶姻；转速100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压0.05-0.15MPa，温度37℃，溶氧30％-60％，在发酵的过程中流加氨水将pH维持到6.5-7.0，至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1mmol/L的甘氨酸和1mmol/L的甘露醇；转速为200r/min，罐压为0-0.02MPa，温度为45℃，维持pH为6.5-7.0，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L之间；回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.5vvm，每小时间歇通气时间为0.5h；当产酸速率下降到5g/L.h^-1以下时，菌体活力减弱，停止补糖，待葡萄糖耗尽后，结束发酵。

本发明的方法以混合发酵方式联产乳酸和丁二酸，混合后分段培养，好氧阶段用于生长菌体，厌氧阶段用于生产乳酸和丁二酸，通过添加辅因子和调控代谢途径的工艺参数，控制两种产物的比例，并抑制副产物代谢途径，使得产物中丁二酸含量提高，易于回收，降低回收成本，且乳酸和丁二酸的纯度高，同时获得了两种产品。收集好氧培养阶段产生的CO₂并回用至厌氧培养阶段，即解决了尾气处理问题，又提高了碳转化率，具备工业化应用价值。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的生物学实验方法均参照常规方法，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 23843，产L-乳酸。

大肠杆菌(Escherichia coli)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为，CGMCC No.11059，产D-乳酸。

大肠杆菌(Escherichia coli)，中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CICC 23845，产丁二酸。

下述实施例中使用的检测方法：

乳酸、丁二酸及其它杂酸检测:

取发酵液，使用50％硫酸进行酸化，8000rpm离心5min，取上清液稀释15倍，使用的高效液相色谱进行测量。色谱柱为Aminex HPX-87H organic acid analysis column，流动相为5mM硫酸，流动相流速为1mL/min，柱温为40℃，运行时间为1h。

葡萄糖检测：

取发酵液，8000rpm离心5min，取上清液，将葡萄糖稀释到0-1g/L范围内，使用生物传感仪SBA-40D进行测量。

菌体浓度的测量：

在好氧培养阶段，取发酵液稀释到OD值在0.2-0.6之间，使用紫外分光光度计进行测量，波长为600nm。在厌氧培养阶段，取发酵液使用1mol/L稀盐酸将发酵液稀释到0.2-0.4，使用紫外分光光度计进行测量，波长为600nm。

生产效率的计算方法：

发酵液中乳酸和丁二酸的浓度(g/L)之和，除以发酵时间。

碳源转化率计算方法：

发酵液中乳酸和丁二酸的浓度(g/L)之和，乘以发酵液总体积(L)，得到发酵液中乳酸和丁二酸的总量(g)，除以整个批次所有碳源的总质量(g)，得到碳源转化率(％)。

实施例1

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，具体步骤如下：

1、以-80℃条件下冻存的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CICC 23843和大肠杆菌(Escherichia coli)CICC 23845为发酵菌株，分别经两级平板活化，挑取单菌落接种于摇瓶种子培养基，37℃、200rpm条件下培养16h。

种子培养基组成如下：

胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L，余量为水。

2、将步骤1的两种培养物按照6％的接种量，分别接种到两个装有步骤1种子培养基的3L种子罐，装液量为1.5L。在37℃、溶氧10％-50％的条件下分别培养6-10h，两种种子液的OD均达到6.0以上，得到成熟种子液。

3、将步骤2得到的两种种子液分别按照3％的接种量接种到装液量25L的装有发酵培养基的50L发酵罐，进行培养。

培养基组成如下：

葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水，其中葡萄糖配制成600g/L母液，单独灭菌。

接种前向培养基中分别添加单独灭菌的2.5L 600g/L葡萄糖母液、100ml0.25mol/L烟酸和100ml 0.25mol/L乙偶姻。

0-8h为好氧培养阶段，转速100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压0.05-0.15MPa，温度37℃，根据溶氧调整转速、通风量和罐压，使溶氧维持在30％-60％，在发酵的过程中流加氨水将pH维持到6.5-7.0。生长阶段尾气通入集气缓冲罐。

待混合菌株的OD₆₀₀达到35以后，关闭通风，转速降低到200r/min，罐压为0-0.02MPa。温度提高到45℃，pH调节剂由氨水换成30％的氢氧化钙，维持pH为6.5-7.0，转入厌氧培养阶段。此时，向罐内加入25ml 1mol/L甘氨酸和25ml 1mol/L甘露醇，使培养基含有终浓度为1mmol/L的甘氨酸和1mmol/L的甘露醇。每小时取样检测发酵罐中剩余葡萄糖浓度，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L之间。

进入产酸阶段并升高温度后，凝结芽孢杆菌CICC 23843快速利用葡萄糖生成乳酸。此时，间歇通入集气缓冲罐中过滤后的发酵尾气，大肠杆菌CICC23845固定部分CO₂生成丁二酸，并与其它杂质代谢途径竞争底物和能量。通过调节回用尾气的通气量和通气间歇时间，调节产物中乳酸和丁二酸比例。本例中回用尾气通气量为0.5vvm、每小时间歇通气0.5h、中断0.5h。

当产酸速率下降到5g/L.h^-1以下时，菌体活力减弱，停止补糖，待葡萄糖耗尽后，结束发酵，进入乳酸和丁二酸分离提取工序。分离使用分子蒸馏工艺，本实施例中，由于丁二酸的浓度已达到可分离浓度，可以增加新的设备，从发酵液中分离丁二酸副产物，并将丁二酸计入碳源转化率，平衡乳酸的生产成本。

实施例2

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，将葡萄糖替换为蔗糖，其余与实施例1一致。

实施例3

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，将葡萄糖替换为甘油，其余与实施例1一致。

实施例4

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，好氧培养阶段温度为37℃，厌氧培养阶段温度为52℃，其余与实施例1一致。

实施例5

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，种子液由3L种子罐向50L发酵罐接种时，凝结芽孢杆菌CICC 23843和大肠杆菌CICC 23845分别按照5％和1％的接种量，其余与实施例1一致。

实施例6

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，种子液由3L种子罐向50L发酵罐接种时，凝结芽孢杆菌CICC 23843和大肠杆菌CICC 23845分别按照1％和5％的接种量，其余与实施例1一致。

实施例7

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，厌氧培养阶段回用尾气通气量为0.1vvm、通气0.1h、中断0.1h，其余与实施例1一致。

实施例8

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，产乳酸菌株为大肠杆菌CGMCC No.11059，其余与实施例1一致。

对比例1

本实施例提供一种单一菌株发酵产乳酸的方法，产乳酸菌株为凝结芽孢杆菌CICC23843，不再接入产丁二酸菌株大肠杆菌CICC 23845，其余与实施例1一致。

对比例2

本实施例提供一种单一菌株发酵产丁二酸的方法，产丁二酸菌株为大肠杆菌CICC23845，不再接入产乳酸菌株为凝结芽孢杆菌CICC 23843，其余与实施例1一致。

对比例3

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，厌氧培养阶段不通入好氧培养阶段的尾气，其余与实施例1一致。

对比例4

本实施例提供一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，好氧培养阶段不添加烟酸和乙偶姻，厌氧培养阶段不添加甘氨酸和甘露醇，其余与实施例1一致。

效果测试：

对实施例1-8和对比例1-4得到乳酸和丁二酸以及其它杂酸进行检测，结果如下：

比较实施例1-8和对比例1-4显示，本发明通过产乳酸菌和产丁二酸菌混合培养的方式，显著提高了发酵液中丁二酸含量，使其达到可以回收利用的程度，在一种发酵体系中同时得到两种产品；通过添加辅因子，大幅度提高了生产效率；通过调整两种菌的混合比例、厌氧培养阶段温度、通气量及其它参数，可以调整产物中两种产品的比例，能够根据市场情况灵活调整生产计划；以混菌培养的方式，用产丁二酸菌的代谢活动，来影响产乳酸菌的生长代谢，竞争底物和能量，在提高丁二酸产量的同时，降低了其它杂质含量，提高了碳源转化率。利用本发明的方法，乳酸产量可以达到160-220g/L，丁二酸产量4-15g/L，其它杂酸总量小于2g/L，碳源转化率90％-95％。

本发明方法在实施过程中，好氧培养阶段罐压为0.05-0.15MPa，厌氧培养阶段罐压为0-0.02MPa，回用发酵尾气不需要加压处理；好氧培养阶段尾气中二氧化碳浓度为0.04％-3.00％，集气缓冲罐中二氧化碳浓度为1.20％-1.50％，尾气回用后，厌氧培养阶段的二次尾气中二氧化碳浓度低于0.50％，达到减少废气处理成本的目的。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的乳酸和丁二酸制备方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种混合发酵联产乳酸和丁二酸的方法，包括：

(2)好氧培养阶段：向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的烟酸和1～10mmol/L的乙偶姻；至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1～10mmol/L的甘氨酸和1～10mmol/L的甘露醇；

其中，所述产乳酸菌株选自凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产L-和/或D-乳酸的菌株；所述产丁二酸菌株选自琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌以及其它通过基因工程手段改造可以用来生产丁二酸的菌株；

优选地，所述产乳酸菌株为CICC 23843或CGMCC No.11059，所述产丁二酸菌株为CICC23845。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基包含碳源，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、甘油、糖蜜、淀粉糖化液、秸秆糖化液中的一种或多种；和/或所述培养基包含氮源，所述氮源选自蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母浸粉、玉米粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种；优选地，所述培养基包含：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤(2)和步骤(3)中，pH5.0-7.5，优选6.5-7.0；优选地，通过加入氧化钙、氢氧化钙、碳酸钙、氨水、氢氧化钠中的一种或多种调节pH值。

4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述好氧培养阶段温度为25℃-60℃、优选35℃-55℃，溶氧为10％-70％、优选30％-60％，培养时间为3-10h、优选4-8h。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，进一步地，所述好氧培养阶段的转速为100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压为0.05-0.15MPa。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述厌氧培养阶段温度为30℃-60℃、优选45℃-55℃，培养时间为20-50h、优选20-40h，转速为200r/min以下，罐压为0-0.02MPa。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在厌氧培养阶段，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，还包括回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.1vvm-1.0vvm、优选0.1vvm-0.5vvm，每小时间歇通气时间0.1～0.5h、优选0.1～0.5h。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，包括：

(1)将产乳酸菌株和产丁二酸菌株混合接种至培养基中，两种菌的比例为1:5～5:1，优选地1:1；所述产乳酸菌株为CICC 23843或CGMCC No.11059，所述产丁二酸菌株为CICC23845；所述培养基的组成为：葡萄糖60g/L、玉米浆8g/L、硝酸钠8g/L、磷酸二氢钾5g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水；

(2)好氧培养阶段：向培养基中补充烟酸和乙偶姻，使培养基含有终浓度为1mmol/L的烟酸和1mmol/L的乙偶姻；转速100-600rpm，通风量为0-3VVM，罐压0.05-0.15MPa，温度37℃，溶氧30％-60％，pH为6.5-7.0，至菌株OD₆₀₀达到30～35，转入厌氧培养阶段；

(3)厌氧培养阶段：向培养基中补充甘氨酸和甘露醇，使培养基含有终浓度为1mmol/L的甘氨酸和1mmol/L的甘露醇；转速为200r/min，罐压为0-0.02MPa，温度为45℃，维持pH为6.5-7.0，向发酵罐中补加600g/L的葡萄糖，使葡萄糖的浓度维持在20-30g/L之间；回收好氧培养阶段产生的尾气，返回至厌氧培养阶段，尾气返回的通气量为0.5vvm，每小时间歇通气时间为0.5h；当产酸速率下降到5g/L.h^-1以下时，停止补糖，待葡萄糖耗尽后，结束发酵。