CN101165169A

CN101165169A - 生物絮凝剂xm-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法

Info

Publication number: CN101165169A
Application number: CNA2007100096057A
Authority: CN
Inventors: 何宁; 陈坚; 李寅; 李清彪; 卢英华
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2008-04-23
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: CN101165169B

Abstract

生物絮凝剂XM－11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，涉及一种生物絮凝剂，尤其是涉及一种生物絮凝剂XM－11的发酵过程分阶段供氧的控制方法。提供一种生物絮凝剂XM－11的发酵过程分阶段供氧的控制方法。菌种为诺卡氏菌(Nocardia sp.)XM－B11。将菌种在液体发酵培养基中培养；种子培养时间为8～16h，接种量为8％～15％；液体发酵条件为25～30℃；液体发酵分阶段供氧控制模式为：发酵初期0～20h维持搅拌转速100～150r/min，至第30～56h结束发酵。既保证菌种在发酵初期阶段生长良好，又使发酵后期生物絮凝剂处于最佳合成状态，减少生物絮凝剂的生产能耗，降低成本。

Description

生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法

技术领域

本发明涉及一种生物絮凝剂，尤其是涉及一种生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法。

背景技术

20世纪80年代末，日本在微生物絮凝剂开发上取得了引人注目的成果，通产省工业技术研究所的仓根一郎等人已从土壤中分离出红平红球菌的S-1菌株，并获得了由其产生的第一种生物絮凝剂-NOC-1，该絮凝剂仍是目前发现的效果最好的生物絮凝剂。Kurane对其进行了深入透彻的研究，包括其产生菌的筛选、发酵条件优化、分离纯化、分子结构的剖析以及应用(Kurane R，Toeda K，Takeda K，Suzuki T.Culture condition for production of microbialflocculant by Rhodococcus erythropolis.Agric Biol Chem.，1986，50：2309-2313；Kurane R，Hatamochi K，Kakuno T，et.al.Purification and characterization of lipid bioflocculant produced byRhodococcus erythropolis.Biosci Biotechnol Biochem，1994，58：1977-1982)。迄今为止，已发现多种微生物絮凝剂产生菌，其中研究较深入的还有拟青霉(Paecilomyces sp.)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)等。2004年，Kumar等从韩国仁川附近被污染的滩涂中筛选出一株新的絮凝剂高产菌株Bacillus sp.I-450。总之，关于生物絮凝剂，目前已有的理论研究主要集中在鉴别絮凝物质，测定絮凝物质的性质(Kurane R，Hatamochi K，Kakuno T，et al.Chemical structureof lipid bioflocculant produced by R.erythropolis.Agric Biol Chem.，1995，59：1652-1656)，观测絮凝效果(Kurane R，Takeda K，Suzuki T.Screening and characteristics of microbial flocculants.Agric Biol Chem.，1986，50：2301-2307)，以及通过遗传基因工程寻找具有絮凝功能的遗传因子以用于组建工程菌(Miki B L，Poon N H，James A P，and Seligy V L.Possible mechanism forflocculation interactions governed by gene FLO1 in Saccharomyces cerevisiae.J.Bacteriol，1982，150：878-889)。

絮凝剂作为微生物的代谢产物，其合成受到许多因素的影响，包括培养基组成、培养基初始pH、培养温度、通气状况等。研究这些影响因素对于提高絮凝剂产量，降低其生产成本进而推动生物絮凝剂的工业化大规模生产具有重要的意义。

目前的研究大都集中在营养条件对絮凝剂合成的影响方面。R.erythropolis要求以葡萄糖，果糖为碳源，以尿素和硫酸铵为无机氮源，有机氮源酵母膏和酪蛋白水解物能刺激絮凝剂的产生(Kurane R，Toeda K，Takeda K，Suzuki T.Culture condition for production of microbialflocculant by Rhodococcus erythropolis.Agric Biol Chem 1986，50：2309-2313)。KNO₃作为细菌菌株S-4K′发酵培养基的最佳氮源，是絮凝剂终产量的最重要的影响因素之一，而尿素不利于该菌合成絮凝剂(Huang SL.Studies on culture condition for production of flocculant bybacterial strain S-4K.Taiwan Tangye Yanjiusuo Yanjiu Huibao 1990，129：11-19)。培养基中的离子种类与浓度对絮凝剂的产生也有较大的影响。Paecilomyces sp.I-1在10mg/mL CaO下，菌体生长和絮凝剂产量均有较大幅度的提高(Takagi H，Kadowaki K.Flocculant production byPaecilomyces sp.Taxonomic studies and culture conditions for production.Agric Biol Chem 1985，49(11)：3151-3157)。但某些菌株只有在低离子浓度下才能提高絮凝活性，高离子浓度则抑制絮凝剂的产生。絮凝剂合成的最佳pH一般为中性到偏碱性，过酸或过碱均不利于絮凝剂的产生(王镇，王孔星，谢裕敏，姚茵丽。几株絮凝剂产生菌的特性研究，微生物学报，1995，35(2)：121-129)。

此外，作为最基本的发酵条件之一，发酵体系中溶氧浓度(DOT)的改变会引起微生物胞内代谢流的重新分配，因此，对于好氧微生物的代谢产物，DOT作为通风发酵控制中的关键参数之一，直接影响着生物絮凝剂的生产过程和生产成本。优化控制发酵过程溶氧水平可以实现生物絮凝剂产量的大幅度提高。然而，近年来这一点却一直被国内外生物絮凝剂研究学者忽略。

Kurane(Kurane R，Toeda K，Takeda K，Suzuki T.Culture condition for production ofmicrobial flocculant by Rhodococcus erythropolis.Agric Biol Chem 1986，50：2309-2313)曾经对R.erythropolis S-1合成生物絮凝剂NOC-1的溶氧条件进行探讨。发现，通气量过大，NOC-1产量出现显著下降；当停止通气，仅仅维持500r/min的搅拌转速时，NOC-1活性达到最大。而通气量的变化对细胞生长影响不大。王镇(王镇，王孔星.微生物絮凝剂的研究概况，微生物学通报，1993，20(6)：362-367；王镇，王孔星，谢裕敏，姚茵丽.几株絮凝剂产生菌的特性研究，微生物学报，1995，35(2)：121-129)则发现，通气量加大会刺激细菌产生絮凝剂。虽然这些研究者都发现发酵体系中的溶氧浓度直接影响生物絮凝剂的合成，但是他们均未对产生这种现象的原因进行分析，亦未对此做更加深入系统的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法。

本发明的技术方案是以诺卡氏菌为出发菌株，以葡萄糖、酵母膏、尿素作为发酵培养基的主要原料，采用分阶段供氧控制模式发酵合成生物絮凝剂XM-11。

本发明采用的菌种为诺卡氏菌(Nocardia sp.)XM-B11，于2007年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2135。

本发明包括以下步骤：

1)将菌种在液体发酵培养基中培养；

2)种子培养时间为8～16h，接种量为8％～15％；

3)液体发酵条件为25～30℃；

4)液体发酵分阶段供氧控制模式为：发酵初期0～20h维持搅拌转速100～150r/min，至第30～56h结束发酵。

液体发酵培养基的组成可采用葡萄糖、尿素、酵母膏、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄·7H₂O。

液体发酵培养基各成份的含量最好为每升液体发酵培养基中含有葡萄糖15～20g、尿素0.5～1g、酵母膏0.5～1g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 0.2g和MgSO₄·7H₂O 0.4g。

液体发酵的液体发酵培养基的初始pH最好为4.0～10.0。

液体发酵的整个发酵过程通气量最好为1～3L/L/min。

由于本发明采用分阶段供氧控制模式发酵合成生物絮凝剂，既保证菌种在发酵初期阶段生长良好，又使发酵后期生物絮凝剂处于最佳的合成状态，同时大大减少了生物絮凝剂的生产能耗，降低生产成本，促进了生物絮凝剂在工业生产中的实际应用进程。

根据实验，采用该分阶段供氧控制模式，诺卡氏菌在菌体量保持较高水平的情况下，生物絮凝剂产量较单一搅拌转速控制发酵过程提高了近65％，发酵周期亦大大缩短。

附图说明

图1为本发明实施例不同单一搅拌转速下菌体生长量随时间的变化曲线。在图1中，横坐标为培养时间(h)，纵坐标为细胞干重(g/L)。●0r/min，▲100r/min，◆200r/min×300r/min。

图2为本发明实施例不同单一搅拌转速对絮凝活性的影响。在图2中，横坐标为培养时间(h)，纵坐标为生物絮凝剂XM-11的絮凝活性(U/mL)。●0r/min，▲100r/min，◆200r/min×300r/min。

图3为本发明实施例不同单一搅拌转速下XM-11浓度及产率系数的变化。在图3中，横坐标为搅拌转速(r/min)，左纵坐标为生物絮凝剂XM-11的产量(μg/mL)，右纵坐标为生物絮凝剂的产率系数(Yp/s，g/g)。▲生物絮凝剂XM-11的产量，■生物絮凝剂XM-11的产率系数。

图4为本发明实施例分阶段供氧控制的分批发酵过程曲线。在图4中，横坐标为时间培养时间(h)，左纵坐标为生物絮凝剂XM-11的絮凝活性(U/mL)，右纵坐标为残糖量(g/L)和细胞干重(g/L)。○絮凝活性，△细胞干重，■残糖浓度。

具体实施方式

以下实施例主要详细地解释本发明中的某些关键点，以便更好地理解本发明的内容。

实施例1

采用的液体发酵培养基包括葡萄糖15g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L；种子培养时间为8h，接种量8％；发酵温度25℃，培养基初始pH4.0。发酵过程维持单一搅拌转速，考察不同搅拌转速对菌体生长的影响。图1为不同搅拌转速下生物絮凝剂合成菌株菌体量随时间的变化曲线。

由图1可见，菌体生长量存在一最佳搅拌转速——100r/min，搅拌转速过高或过低都会引起菌体生长量降低；但在较高的搅拌转速下，菌体比生长速率较高，这样可以缩短菌体达到最高生长量的时间。如在300r/min条件下发酵时，菌体生长达到最大值的时间可比100r/min时提前4～5h。在摇瓶发酵过程中还发现，装液量较少时(15～50mL/250mL锥形瓶)，发酵后期会出现菌体自絮凝现象。这是菌体细胞本身对转速过高而引发的毒害作用的一种抵御和自我保护措施。可见，转速增加虽然能够加快细胞代谢速率，缩短细胞生长周期，但同时也会对细胞生长造成毒害作用，从而影响最终菌体细胞生长量。

实施例2

采用如实施例1所述发酵条件，考察搅拌转速对菌体生长的影响。其区别在于所使用的液体发酵培养基中葡萄糖20g/L，尿素1g/L，酵母膏1g/L；种子培养时间为16h，接种量15％；发酵温度30℃，培养基初始pH10.0。

实施例3

采用如实施例1所述发酵条件，考察搅拌转速对菌体生长的影响。其区别在于所使用的液体发酵培养基中葡萄糖18g/L，尿素0.8g/L，酵母膏0.8g/L；种子培养时间为12h，接种量10％；发酵温度28℃，培养基初始pH7.8。

实施例4

如实施例1所述发酵条件，在5L发酵罐上考察不同搅拌转速对生物絮凝剂XM-11合成的影响。图2为不同搅拌转速下生物絮凝剂XM-11的絮凝活性随时间的变化趋势曲线。图3为搅拌转速对XM-11终产量及产率系数的影响。

由图2可见，在5L发酵罐上进行发酵，搅拌转速对絮凝剂的合成影响较大，这种影响主要体现在发酵过程的中后期阶段。随搅拌转速增加，当发酵进行到15h后，絮凝活性开始出现显著差距，尤其当搅拌转速升高至200r/min时，其发酵所得絮凝活性比不搅拌发酵(0r/min)时降低了70％以上；当搅拌转速升高至300r/min时，絮凝活性几乎消失。

实施例5

如实施例2所述发酵条件，在5L发酵罐上考察不同搅拌转速对生物絮凝剂XM-11合成的影响。

实施例6

如实施例3所述发酵条件，在5L发酵罐上考察不同搅拌转速对生物絮凝剂XM-11合成的影响。

实施例7

采用上述液体发酵培养基，其中葡萄糖15g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L；种子培养时间为8h，接种量8％：发酵温度25℃，培养基初始pH4.0。发酵过程的分阶段供氧控制策略为：0～20h维持搅拌转速100r/min，20h后停止搅拌至第45h，整个发酵过程通气量维持在1L/L/min。

分阶段供氧控制发酵过程曲线如图4所示。为了更深入地理解不同搅拌方式下发酵过程的特征，对不同搅拌方式下发酵过程的主要参数进行了比较(参见表1)。

表1 不同供氧控制模式下的发酵过程主要参数比较

指标	单一搅拌转速(r/min)			分阶段搅拌转速(r/min)
	单一搅拌转速(r/min)			分阶段搅拌转速(r/min)	0	100	200	100(0～20h)无搅拌(＞20h)
	ρ(XM-11)/(mg/L)生产强度/(mg/L/h)Yp/s/(g/g)δ(DCW)/(g/L)Yx/s/(g/g)μ/h^-1残糖/(g/L)葡萄糖消耗速率/(g/L/h)发酵周期/h	560.216.50.0661.160.1370.0961.560.24834	463.213.60.0531.200.1380.0971.280.25634	140.15.80.0161.230.1360.1370.980.34826	0	100	200	100(0～20h)无搅拌(＞20h)	896.029.90.0961.200.1280.1350.660.31030

将图4与单一搅拌转速发酵过程曲线(图2)对照可见，在发酵前期XM-11产量基本没有明显提高，但进入后期阶段后，絮凝剂产量出现了大幅度提高，最终发酵液所得絮凝活性达到900.0U/mL，比单一搅拌转速下的最高产量550U/mL提高了63.6％，发酵周期也由34h缩短到30h。而菌体生长量与搅拌转速为100r/min和200r/min时的基本相当。

从表1可以更清楚地看到采用分阶段供氧控制模式优化生物絮凝剂XM-11的发酵过程非常有效。与单一搅拌转速控制模式相比，在前者的发酵状态下，不仅絮凝剂产量有了大幅度提高，其生产强度也比搅拌转速恒定为0、100和200r/min的分批发酵过程分别提高了81.2％、120％和420％；同时产率比只通气不搅拌时提高45％。

实施例8

采用如实施例7所述发酵培养基与发酵条件，考察分阶段供氧控制发酵模式对生物絮凝剂XM-11合成的影响。其区别在于所采用的分阶段供氧控制策略为：0～20h维持搅拌转速150r/min，20h后停止搅拌，发酵至第56h结束，整个发酵过程通气量维持在3L/L/min。

实施例9

采用如实施例7所述发酵培养基与发酵条件，考察分阶段供氧控制策略对生物絮凝剂XM-11合成的影响。其区别在于所采用的分阶段供氧控制策略为：0～20h维持搅拌转速120r/min，20h后停止搅拌，发酵至第48h结束，整个发酵过程通气量维持在2L/L/min。

实施例10

采用如实施例7所述发酵培养基与发酵条件，考察分阶段供氧控制发酵模式对生物絮凝剂XM-11合成的影响。其区别在于所采用的分阶段供氧控制策略为：0～20h维持搅拌转速100r/min，20h后停止搅拌，发酵至第30h结束，整个发酵过程通气量维持在1.5L/L/min。

Claims

1.生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，采用的菌种为诺卡氏菌(Nocardia sp.)XM-B11，于2007年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2135，其特征在于包括以下步骤：

1)将菌种在液体发酵培养基中培养；

2)种子培养时间为8～16h，接种量为8％～15％；

3)液体发酵条件为25～30℃；

2.如权利要求1所述的生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，其特征在于液体发酵培养基的组成采用葡萄糖、尿素、酵母膏、KH₂PO₄、NaCl和MgSO₄·7H₂O。

3.如权利要求1所述的生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，其特征在于液体发酵培养基各成份的含量为每升液体发酵培养基中含有葡萄糖15～20g、尿素0.5～1g、酵母膏0.5～1g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 0.2g和MgSO₄·7H₂O 0.4g。

4.如权利要求1所述的生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，其特征在于液体发酵的液体发酵培养基的初始pH为4.0～10.0。

5.如权利要求1所述的生物絮凝剂XM-11的发酵过程分阶段供氧的控制方法，其特征在于液体发酵的整个发酵过程通气量为1～3 L/L/min。