BRPI0809400B1 - célula de escherichia coli geneticamente modificada, métodos de cultivo ou crescimento da referida célula e de produção de succinato, fumarato ou malato, e composição contendo a referida célula - Google Patents

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Abstract

cepa bacteriana geneticamente modificada, métodos de cultivo ou crescimento da referida cepa e de produção de succinato, fumarato ou malato, e composição contendo a referida cepa. foram construídos micro-organismos geneticamente engenheirados para produzir succinato e maiato em meios de sal mineral em fermentações em batelada com ph controlado, sem a adição de plasmídeos ou genes estranhos. a presente invenção refere-se também a métodos de produ- ção de succinato e maiato que compreendem o cultivo de micro-organismos geneticamente modificados.

Description

(54) Título: CÉLULA DE ESCHERICHIA COLI GENETICAMENTE MODIFICADA, MÉTODOS DE CULTIVO OU CRESCIMENTO DA REFERIDA CÉLULA E DE PRODUÇÃO DE SUCCINATO, FUMARATO OU MALATO, E COMPOSIÇÃO CONTENDO A REFERIDA CÉLULA (73) Titular: UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION, INC., Sociedade Norte Americana. Endereço: 223 Grinter Hall - Gainesville, FL 32611-2037, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: KAEMWICH JANTAMA; MARK JOHN HAUPT; XUELI ZHANG; JONATHAN C. MOORE; KEELNATHAM T. SHANMUGAM; LONNIE O'NEAL INGRAM.
Código de Controle: 525A4B31B18DDED8 884CC5C77B90304C
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 04/12/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 04/12/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CÉLULA DE ESCHERICHIA COLI GENETICAMENTE MODIFICADA, MÉTODOS DE CULTIVO OU CRESCIMENTO DA REFERIDA CÉLULA E DE PRODUÇÃO DE SUCCINATO, FUMARATO OU MALATO, E COMPOSIÇÃO CONTENDO A REFERIDA CÉLULA.
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° de Série 60/895.806, depositado em 20 de março 2007, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras, tabelas e sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos.
Apoio Governamental
Esta invenção foi feita com apoio governamental sob um financiamento concedido pelo Departamento de Energia sob a subvenção número USDOE-DE FG02-96ER20222 e do Departamento de Energia em conjunto com o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos sob a subvenção número USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04G014019. O Governo possui certos direitos na invenção.
Fundamentos da Invenção
A presente invenção refere-se a produção fermentativa de succinato a partir de matérias-primas renováveis que irá se tornar cada vez mais competitiva à medida que os preços do petróleo aumentam. O succinato pode servir como substrato para transformação em plásticos, solventes e outras substâncias químicas atualmente feitas a partir do petróleo (Lee e outros, 2004; Lee e outros, 2005; McKinlay e outros, 2007; Wendisch e outros, 2006; Zeikus e outros, 1999). Foram descritas muitas bactérias com a habilidade natural para produzir succinato como um produto de fermentação importante (Patente U.S. N° 5.723.322; Tabela 1). No entanto, frequentemente são necessários processos complexos, meios complexos e longos períodos de incubação.
Uma variedade de abordagens genéticas foram usadas previamente para projetar cepas de Escherichia coli para a produção de succinato com graus variáveis de sucesso (Tabela 1). Na maioria dos estudos, as titulações alcançadas eram baixas e eram necessários ingredientes de meio
Segue-se folha 1a de 07/03/2018, pág. 9/21
1a
Figure BRPI0809400B1_D0001
Petição 870180018283, de 07/03/2018, pág. 10/21
Uma cepa NZN111 produziu 108 mM de succinato com um rendimento molar de 0,98 mol de succinato por mol de glicose metabolizada (Chatterjee e outros, 2001; Millard e outros, 1996; Stols e Donnelly, 1997). Essa cepa foi desenvolvida geneticamente por inativação de dois genes (pfíB que codifica piruvato-formateliase e IdhA que codifica lactato desidrogenase) e que superexpressam dois genes de E. coli, malato desidrogenase (mdh) e fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), de plasmídeos multicópias. Uma cepa HL27659k foi desenvolvida geneticamente por mutação de succinato desidrogenase (sdhAB), fosfato acetiltransferase (pta), acetato quinase (ackA), piruvato oxidase (poxfí), transportador de glicose (ptsG) e o repressor de isocitrato liase (icIR). Essa cepa produzia menos de 100 mM de succinato e necessitava de condições de fermentação limitada por oxigênio (Cox e outros, 2006; Lin e outros, 2005a, 2005b, 2005 c; Yun e outros, 2005). A Análise do metabolismo in silico foi usada para projetar nocautes gênicos para criar uma via em E. coli que é análoga à via nativa de succinato em Mannheimia succiniciproducens (Lee e outros, 2005 e 2006). Uma cepa resultante, no entanto, produziu muito pouco succinato. Andersson e outros (2007) relataram os níveis mais elevados de produção de succinato por uma E. coli desenvolvida geneticamente (339 mM) que contém apenas genes nativos.
Outros pesquisadores buscaram abordagens alternativas que expressam genes heterólogos em E. coli. O piruvato carboxilase de Rhizobium eteloti (pyc) foi superexpressa por um plasmídeo multicópias para dirigir o fluxo de carbono para o succinato (Gokarn e outros, 2000; Vemuri e outros, 2002 a, 2002 b). Uma cepa SBS550 MG foi construída por inativação do repressor de isocitrato liase (icIR), adhE, IdhA, e ackA, e superexpressão do citZ de (citrato sintase) Bacillus subtilis e pyc de R. etli por um plasmídeo multicópias (Sanchez e outros, 2005a). Com essa cepa, foram produzidos 160 mM de succinato a partir de glicose com um rendimento molar de 1,6.
Também foram investigados processos mais complexos para a produção de succinato (Tabela 1). Muitos desses processos incluem uma fase de crescimento aeróbico, seguida por uma fase de produção anaeróbica. A fase anaeróbica é frequentemente abastecida com dióxido de carbono, hi3 drogênio, ou ambos (Andersson e outros, 2007; Sanchez e outros, 2005a e 2005b; Sanchez e outros, 2006; Patente U.S. 5.869.301; Vemuri e outros, 2002a e 2002b). Em um estudo recente com um produtor de succinato nativo, A. succiniciproducens, eletrodiálise, pulverização com CO2, reciclagem celular e alimentação em batelada foram combinados (Meynial-Salles e outros, 2007).
A presente invenção fornece várias formas de micro-organismos, tais como cepas de E. coli, que produzem succinato em altas titulações e rendimentos em meios de sais minerais durante fermentações em batelada simples, controladas por pH, sem a necessidade de genes ou plasmídeos heterólogos. Durante o desenvolvimento, foi caracterizada uma cepa intermediária que produziu malato como o produto dominante.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção fornece novos micro-organismos úteis na produção de ácido lático, por exemplo, Escherichia coli. Consequentemente, os materiais e métodos da presente invenção podem ser usados para a produção de succinato e malato para uso em diversas aplicações.
Em certas modalidades, derivados de Escherichia coli (também denominada nesta especificação E. coli) podem ser usados para a construção de cepas que produzem succinato, malato e alanina. Em várias modalidades, E. coli C (por exemplo, ATCC 8739) pode ser usada, assim como qualquer outra cepa de E. coli que possa ser obtida de vários depositórios ou de fontes comerciais. Os micróbios desenvolvidos geneticamente da invenção, em algumas modalidades, também contêm somente genes nativos (ou seja, não contêm material genético de outros organismos). Vantagens adicionais desta invenção ficarão facilmente evidentes a partir da descrição que será apresentada a seguir.
Breve Descrição das Figuras
Figuras 1A-1B. Fermentação de glicose em succinato. A Figura
1A mostra a via-padrão para a fermentação de glicose por E. coli. Essa via foi redesenhada a partir de Unden e Kleefeld (2004). As setas em negrito representam vias fermentativas centrais. Cruzes representam as eliminações de genes realizadas neste estudo para o projeto de KJ012 (IdhA, adhE, ackA). Genes e enzimas: IdhA, lactato desidrogenase; pflB, piruvato-formato liase; focA, transportador de formato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato quinase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formato desidrogenase; icd, isocitrato desidrogenase; acs, acetil-CoA sintetase; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; aldA, aldeído desidrogenase; e aldB, aldeído desidrogenase. A Figura 1B mostra o acoplamento da produção de ATP e crescimento em produção de succinato e malato em cepas desenvolvidas geneticamente de E. coli. As setas sólidas conectam os pools de NADH. As setas pontilhadas conectam os pools de NAD+. Durantes a glicólise sob condições anaeróbicas, o crescimento está obrigatoriamente acoplado à produção de ATP e à oxidação de NADH.
Figuras 2A-2D. Vias potenciais de carboxilação para a produção de succinato por E. coli. Genes que codificam enzimas de carboxilação cruciais são mostrados em negrito. A Figura 2A mostra a PEP carboxilase. Nenhum ATP é produzido por fosfoenolpiruvato (PEP). Essa é considerada a via primária para a produção de succinato por E. coli durante a fermentação da glicose.
A Figura 2B mostra a enzima málica (NADH). A energia é conservada durante a produção de ATP a partir de ADP e PEP por piruvato quinase (pykA ou pykF). A enzima málica (sfcA) catalisa uma carboxilação redutiva, ligada à NADH, para a produção de malato. A Figura 2C mostra a enzima málica (NADPH). A energia é conservada durante a produção de ATP a partir de ADP e PEP por piruvato quinase (pykA ou pykF). A enzima málica (maeB) catalisa uma carboxilação redutiva, ligada à NADPH, para a produção de malato. A Figura 2D mostra a PEP carboxiquinase. A energia é conservada pela produção de ATP durante a carboxilação de PEP para a produção de ácido oxalacético.
Figuras 3A-3C. Crescimento durante a evolução metabólica de
KJ012 para a produção de KJ017, KJ032 e KJ060. Uma cepa KJ012 foi transferida sequencialmente em meio NBS contendo glicose 5% (p/v) (Figura 3A) e 10% (p/v) (Figura 3B), respectivamente, para a produção de KJ017. Após a eliminação de focA e pflB, a cepa resultante (KJ032) foi inicialmente subcultivada em meio suplementado com acetato (Figura 3C). Os níveis de acetato foram diminuídos e subsequentemente eliminados durante transferências adicionais para a produção de KJ060. A linha quebrada representa a fermentação por KJ017, sem acetato, adicionado para comparação. Símbolos: densidade óptica a OD55onm, ··
Figuras 4A-4F. Sumário dos produtos de fermentação durante a evolução metabólica de cepas para a produção de succinato e malato. As culturas foram suplementadas com acetato de sódio, como indicado. Setas pretas representam a transição entre as condições de fermentação, como indicado pelo texto. Nenhum formato e apenas pequenas quantidades de lactato foram detectadas durante a evolução metabólica de KJ032. Nenhum formato e lactato foram detectados durante a evolução metabólica de KJ070 e KJ072. A Figura 4A (glicose 5% p/v) e Figura 4B (glicose 10% p/v), KJ012 a KJ017; Figura 4C (glicose 5% p/v) e a Figura 4D (glicose 10% p/v), KJ032 a KJ060; Figura 4E. glicose 10%, KJ070 a KJ071; Figura 4F. glicose 10%, KJ072 a KJ073. Símbolos para todos: , succinato; □, formato; Δ, acetato; A, malato; 4,1801810: e ▼, piruvato.
Figura 5. Diagrama que sumarize as etapas na engenharia genética e evolução metabólica de E. coli C como um biocatalisador para a produção de succinato e malato. Esse processo representa 261 transferências seriais que fornecem mais de 2.000 gerações de seleção baseada no crescimento. Foram isolados clones da cultura final de cada regime e designações atribuídas à cepa, mostradas entre parênteses na Tabela 3.
Figura 6. Fermentação de glicose e vias associadas. Metabolismo central que indica genes eliminados em construções criadas geneticamente para a produção de succinato. As setas sólidas representam vias fermentativas centrais. A seta pontilhada representa a via microaerofíiica para a oxidação de piruvato em acetato (poxB). As setas pontilhadas mostram vias que normalmente funcionam durante o metabolismo aeróbico, piruvato desidrogenase (pdh) e o bypass de glioxilato (aceAB). As cruzes nas caixas representam as três eliminações de genes iniciais (IdhA, adhE, ackA) que foram usadas para construir KJ012 e KJ017. As cruzes simples marcam genes de adição que foram eliminados durante a construção de derivados de KJ017: KJ032 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB), e KJ070 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA) e KJ072 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA, poxB). Genes e enzimas: IdhA, lactato desidrogenase; focA, transportador de formato; pflB, piruvato-formato liase; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato quinase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formato desidrogenase; mgsA, metilglioxal sintase; gloAB, glioxilase I e II; poxB, piruvato oxidase; aceA, isocitrato liase; aceB, malato sintase; acnAB, aconitase; e acs, acetil~CoA sintetase.
Figuras 7A-7C. Produção de succinato e malato em meios de sais minerais (glicose 10%) por derivados de E. coli C. A Figura 7A mostra a produção de succinato por KJ060 em meio AM1. A Figura 7B mostra a produção de succinato por KJ073 em meio AM1. A Figura 7C mostra a produção de malato por KJ071 em meio NBS. As fermentações foram inoculadas em um nível de 33 mg de DCW I*1. Símbolos para todos: o, glicose; ·, succinato; , malato; Δ, massa da célula.
Figura 8. Construção de pLOI4162. As setas sólidas curtas associadas a pEL04 e pLOI4152 representam iniciadores usados para amplificação de DNA.
Figura 9. Via de produção de succinato em KJ073. O gene pck que codifica fosfoenolpiruvato carboxiquinase, a enzima de carboxilação primária envolvida na produção de succinato neste estudo, é mostrada no tipo reverso. As setas sólidas indicam reações que supostamente são funcionais durante a fermentação anaeróbica de glicose. As cruzes sólidas indicam genes eliminados. As cruzes em caixas representam eliminações cruciais usadas para construir a cepa inicial para a produção de succinato, KJ017 (IdhA, adhE, ackA). A linha pontilhada representa a oxidação de piruvato em acetato por PoxB, um processo que é tipicamente funcional apenas sob condições microaerofílicas. As linhas pontilhadas indicam reações que estão primariamente associadas ao metabolismo aeróbico. Genes e enzimas: IdhA, lactato desidrogenase: pflB, piruvato-formato liase; focA, transportador de formato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato quinase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formato desidrogenase; icd, isocitrato desidrogenase; acs, acetil~CoA sintetase; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; aldA, aldeído desidrogenase; e aldB, aldeído desidrogenase. O gene tdcE (piruvato formatoliase, homóloga ao pflB) e o gene tcdD (propionato quinase, homóloga ao ackA) são mostrados entre parênteses e são tipicamente expressos durante a degradação de treonina.
Figura 10. Porção expandida do metabolismo que ilustra as vias de genes adicionais que foram eliminados (cruzes sólidas). Succinato e acetato são os produtos principais (em caixas) das fermentações de KJ073. Genes e enzimas: citDEF, citrato liase; gltA, citrato sintase; aspC, aspartato aminotransferase; pck, fosfoenolpiruvato carboxiquinase; sfcA, enzima málica ligada a NAD+; fumA & fumB, fumarase; frdABCD, fumarato redutase; pykA & pykF, piruvato quinase; tdcE, piruvato formato-liase (homóloga de pflB)·, pta, fosfato transacetilase; tcdD, acetato quinase (homóloga de ackA). Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção fornece materiais e métodos em que combinações únicas e vantajosas de mutações gênicas são usadas para dirigir o fluxo de carbono a um produto desejado como, por exemplo, succinato e/ou malato. As técnicas da presente invenção podem ser usadas para se obter produtos por vias nativas, bem como por vias recombinantes. Vantajosamente, a presente invenção fornece uma plataforma versátil para a produção desses produtos apenas com sais minerais e açúcar como nutrientes.
Um micro-organismo da presente invenção pode ser obtido por modificação de um ou mais genes-alvo em uma bactéria, tais como aquelas que pertencem à Escherichia. Em algumas modalidades, a bactéria que é modificada por ser Escherichia coli, ou uma cepa desta em particular, por exemplo, E. coli B, E. coli C, E. coli W, ou similares. Em algumas outras mo5 dalidades da invenção, as bactérias que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens,
Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevi15 bacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbi20 cola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium sherma25 nii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarci30 na ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flaveius, Streptomyces gri9 , seolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces virídochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminoly5 ticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri, e assim por diante.
Em certas modalidades, a presente invenção fornece cepas bacterianas (por exemplo, E. coli) desprovidas de plasmídeos, genes de resis10 tência a antibiótico e/ou material de outros organismos que são adequados à produção de succinato ou malato. Diferentemente de outros sistemas microbianos, os micro-organismos da presente invenção podem ser empregados em um processo de produção de uma única etapa com a utilização de açúcares como substratos, possuem altas taxas de produção de produto, altos rendimentos, necessidades nutricionais simples (por exemplo, meio de sais minerais) e um metabolismo robusto que permite a bioconversão de hexoses, pentoses e muitos dissacarídeos.
Dessa forma, os micro-organismos produzidos de acordo com a presente descrição podem ter um ou mais genes-alvo inativados por vários mé20 todos conhecidos na técnica. Por exemplo, os genes-alvo podem ser inativados pela introdução de inserções, eliminações ou mutações aleatórias no genealvo. Dessa forma, certos aspectos da invenção permitem a inserção de pelo menos um códon de parada (por exemplo, um a dez ou mais códons de parada) no gene-alvo. Alguns aspectos da invenção permitem a inserção ou elimi25 nação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais bases a fim de introduzir uma mutação de alteração da fase de leitura ('frameshiff') em um gene-alvo. Outros aspectos da invenção permitem a inserção ou eliminação de 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11,13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29 ou mais bases a fim de introdu30 zir uma mutação de alteração da fase de leitura em um gene-alvo. Ainda outras modalidades do presente pedido permitem a introdução de uma ou mais mutações pontuais (por exemplo, 1 a 30 ou mais) dentro de um gene-alvo, enquanto outros aspectos da invenção permitem a eliminação parcial, total ou completa de um gene-alvo dos micro-organismos da invenção. Em cada um desses aspectos da invenção, vias metabólicas são inativadas pela inativação da atividade enzimática do polipeptídeo codificado pelos gene(s)-alvo.
O termo gene(s)-alvo, como aqui usado, refere-se ao gene que codifica acetato quinase, álcool desidrogenase, aspartato aminotransferase, citrato liase, transportador de formato, lactato desidrogenase, metilglioxal sintase, piruvato-formato liase, piruvato oxidase, fosfato acetiltransferase, enzima málica e/ou propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase. Em certas modalidades preferidas, os genes são ackA (acetato quinase), adhE (álcool desidrogenase), aspC (aspartato aminotransferase), citCDEF (citrato liase), focA (transportador de formato), IdhA (lactato desidrogenase), mgsA (metilglioxal sintase), pflB (piruvato-formato liase), poxB (piruvato oxidase), pta (fosfato acetiltransferase), sfcA (enzima málica) e/ou tdcDE (propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase). Dessa forma, em certos aspectos da invenção, um ou mais desses genes são inativados em um micro-organismo (qualquer cepa bacteriana que contenha tais genes, por exemplo, E. coli). O processo de seleção para cepas com crescimento e produção de succinato ou malato aprimorados é denominado evolução metabólica (cujos exemplos são fornecidos dentro dos exemplos apresentados). Deve-se entender que um gene nativo de E. col?' ou genes nativos de E. col?' são um gene, ou genes, que são encontrados naturalmente em um micro-organismo E. coli, ao contrário de um gene heterólogo que é introduzido em uma E. coli e que foi obtido de qualquer outro micro-organismo diferente de E. coli.
Várias modalidades não-limitantes da presente invenção incluem:
1. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende modificações genéticas em um ou mais dos seguintes genes-alvo: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase e/ou g) citrato liase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo;
2. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escheríchia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divarícatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium iinens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetogiutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus,
Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, ou Xanthomonas citri;
3. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1 ou 2, em que a referida cepa bacteriana modificada é E. coli B;
4. A cepa bacteriana geneticamente modificada das modalidades 1, 2 ou 3, em que os seguintes genes-alvo são inativados: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e e) piruvato oxidase;
5. A cepa bacteriana geneticamente modificada da modalidade 4, em que a referida cepa bacteriana ainda compreende um gene inativado de metilglioxal sintase;
6. A cepa bacteriana geneticamente modificada das modalidades 4 ou 5, em que a referida cepa bacteriana ainda compreende um gene inativado de citrato liase;
7. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4 ou 5, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
8. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1,2,3, 4, 5, 6 ou 7, em que os genes, ou porções destes, são eliminados;
9. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que os genes são inativados com mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, pela inserção de códons de parada ou combinações das mesmas;
10. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é uma cepa de E. coli e não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo (ou contém apenas genes nativos de E. coli);
11. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, desde que: 1) a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não tenha tido um ou mais dos seguintes genes inativados: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase (sucAB)', d) succinato desidrogenase (por exemplo, sdhAB), fosfato acetiltransferase (por exemplo, pfa); e) transportador de glicose (por exemplo, ptsG); f) repressor de isocitrato liase (por exemplo, icIR)·, e/ou 2) aquela referida cepa geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam genes como, por exemplo, malato desidrogenase (mdh) e fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc) e/ou citrato sintase (por exemplo, Bacillus subtilis citZ)·
12. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1 a 11, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 ou KJ073;
13. Um método de cultivo ou crescimento de uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 e o cultivo ou crescimento da referida cepa bacteriana geneticamente modificada;
14. Um método de produção de succinato ou malato que compreende o cultivo de uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 sob condições que permitem a produção de succinato ou malato;
15. O método de acordo com a modalidade 14, em que as referidas uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas são KJ012, KJ034, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 ou KJ073;
16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 13, 14 ou 15 em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é cultivada em um meio de sais minerais;
17. O método de acordo com modalidade 16, em que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) carboidrato;
18. O método de acordo com a modalidade 17, em que o meio de sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar;
19. O método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose, celobiose, hemicelulose ou várias combinações destes;
20. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 em que o succinato ou malato é produzido em concentrações de pelo menos 0,20 M, 0,25 M, 0,30 M, 0,35 M, 0,40 M, 0,45 M, 0,50 M, 0,55 M, 0,60 M, 0,65 M ou 0,70 M;
21. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 em que o meio de cultura é meio de sais minerais NBS ou meio AM1 (vide a Tabela 4);
22. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 em que o rendimento de succinato ou malato é de pelo menos ou maior do que (ou maior ou igual do que) 90%;
23. O método de acordo com modalidade 22, em que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%;
24. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16 ou 20 a 23, em que o meio de crescimento compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato.
25. O método de acordo com as reivindicações 17 a 19, em que o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato; ou
26. Uma composição que compreende uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 e meio.
As seguintes modalidades adicionais também são fornecidas pelo presente pedido de patente:
1. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende modificações genéticas aos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) citrato liase, h) aspartato aminotransferase, i) transportador de formato, j) fosfato acetiltransferase, k) enzima málica e I) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo;
2. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escheríchia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrío metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces gríseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri ou Xanthomonas citri;
3. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 2, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli;
4. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende:
(a) modificação genética a um gene de citrato liase e um ou mais dos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) aspartato aminotransferase, h) transportador de formato, i) fosfato acetiltransferase, j) enzima málica e/ou k) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase; ou (b) modificação genética a um gene de citrato liase, gene de lactato desidrogenase, gene de álcool desidrogenase, gene acetato quinase, gene de transportador de formato, gene de piruvato formatoliase, gene de metilglioxal sintase, gene de piruvato oxidase e um ou mais dos seguintes genes-alvo: a) aspartato aminotransferase, b) fosfato acetiltransferase, c) enzima málica e/ou d) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase;
a referida modificação genética inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo;
5. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 4, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escheríchia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacteríum tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffíneus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacteríum ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacteríum flavum, Brevibacteríum globosum, Brevibacteríum fuscum, Brevibacteríum ketoglutamicum, Brevibacteríum helcolum, Brevibacteríum pusillum, Brevibacteríum testaceum, Brevibacteríum roseum, Brevibacteríum immariophilium, Brevibacteríum linens, Brevibacteríum protopharmiae, Corynebacteríum acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escheríchia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimuríum, Salmo18 nella schottmulleri ou Xanthomonas citri;
6. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a modalidade 5, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia colr,
7. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
8. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1,2,3,4,5 ou 6, em que o gene-alvo ou porções do mesmo ou genes-alvo ou porções destes são inativados por eliminação, mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, pela inserção de códons de parada ou combinações das mesmas;
9. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo ou contém apenas genes nativos;
10. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, desde que: 1) a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não tenha tido uma ou mais das seguintes enzimas inativadas: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase; d) succinato desidrogenase; e) transportador de glicose; f) repressor de isocitrato liase; e/ou 2) aquela referida cepa geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam malato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase e/ou citrato sintase;
11. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a modalidade 7, 8, 9, 10 ou 11, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
12. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz:
a) concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM,
300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
b) concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM; ou
c) concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM;
13. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134;
14. Um método de cultivo ou crescimento de uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 e o cultivo ou crescimento da referida cepa bacteriana geneticamente modificada;
15. Um método de produção de succinato, fumarato ou malato que compreende o cultivo de uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 sob condições que permitem a produção de succinato ou malato ou fumarato;
16. O método de acordo com modalidade 15, em que as referidas uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas são KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134;
17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1416, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é cultivada em um meio de sais minerais;
18. O método de acordo com modalidade 17, em que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) carboidrato;
19. O método de acordo com modalidade 18, em que o meio de sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%,
13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar;
20. O método de acordo com a modalidade 18 ou 19, em que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose, celobiose, hemicelulose ou combinações destes;
21. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1520, em que o rendimento de succinato ou malato é maior ou igual a 90%;
22. O método de acordo com modalidade 21, em que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%;
23. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1522, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
24. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 1522, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM;
25. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 15 a 22, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
26. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 17 ou 21 a 25, em que o meio de crescimento compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato;
27. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 20, em que o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato; ou
28. Uma composição que compreende uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com as modalidades 1 a 13 e meio.
Os micro-organismos foram depositados, como indicado nos E21 xemplos, com a Agricultural Research Service Culture Collection, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 E.UA. Essas culturas foram depositadas sob condições que asseguram que o acesso às culturas estará disponível durante a pendência do mesmo pedido de patente àqueles determinados pelo Commissioner of Patents and Trademarks como tendo direito a ele sob 37 CFR 1.14 e 35 USC 122. Os depósitos estão disponíveis da forma exigida pelas leis de patentes estrangeiras em países nos quais as contrapartes do presente pedido ou seus descendentes estão depositados. No entanto, deve-se entender que a disponibilidade dos depósitos não constitui uma licença para a prática da presente invenção com abdicação dos direitos de patente garantidos por ação governamental.
Além disso, os depósitos de cultura em questão serão armazenados e disponíveis ao público de acordo com as definições do Tratado de Budapeste para o Depósito de Micro-organismos, ou seja, serão armazenados com todos os cuidados necessários para mantê-los viáveis e nãocontaminados por um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente para o fornecimento de uma amostra dos depósitos e em qualquer caso, por um período de pelo menos 30 (trinta) anos após a data do depósito ou pela vida útil de qualquer patente que possa descrever as culturas. O depositante reconhece a obrigação de substituir os depósitos caso o depósito seja incapaz de fornecer uma amostra quando solicitado, em função da condição dos depósitos. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público dos depósitos de cultura em questão serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão de uma patente que as descrevem.
A seguir serão apresentados exemplos que ilustram procedimentos para a prática da invenção. Esses exemplos não devem ser considerados como limitantes. Todas as percentagens são por peso e todas as proporções de mistura solvente são por volume, a menos que observado de forma diferente.
Exemplo 1
Os micro-organismos foram depositados com a ARS Culture Collection da seguinte forma:
Cultura Designações da cepa Data do depósito
KJ012 B-50022 15 de março 2007
KJ017 B-50023 15 de março 2007
KJ032 B-50024 15 de março 2007
KJ060 B-50025 15 de março 2007
KJ070 B-50026 15 de março 2007
KJ071 B-50027 15 de março 2007
KJ072 B-50028 15 de março 2007
KJ073 B-50029 15 de março 2007
Materiais e métodos
Cepas, meios e condições de crescimento
As cepas usadas neste estudo estão resumidas na Tabela 2. Foram desenvolvidos derivados de E. coli C (ATCC 8739) para a produção de 5 succinato por uma combinação única de eliminações de genes e seleções quanto à produtividade aumentada. As culturas cresceram a 37°C em caldo de Luria-Bertani (LB) modificado (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extrato de levedura Difco, 5 g de cloreto de sódio) (Miller, 1992) apenas durante a construção da cepa. Antibióticos foram incluídos, quando necessários.
Meio de sais minerais NBS (Causey e outros, 2004) suplementado com 100 mM de KHCO3, 1 mM de HCI de betaína e açúcar (2% a 10%) foi usado como um caldo de fermentação na maioria dos estudos e para a manutenção das cepas. Um novo meio com baixo teor de sal, AM1 (4,2 g Γ1 de sais totais; Martinez e outros, 2007), foi desenvolvido durante os estágios finais dessa investigação e usado em fermentações com KJ060 e KJ073. Esse meio foi suplementado com 100 mM de KHCO3 e açúcar, como indicado, e inclui 1 mM de betaína quando as concentrações iniciais de açúcar são de 5% ou mais. Nenhum gene que codifica resistência a antibióticos, plasmídeos ou outros genes estranhos está presente em cepas desenvolvidas para a produção de succinato, exceto como intermediários durante a construção.
Métodos genéticos
Os plasmídeos e iniciadores usados neste estudo estão resumidos na Tabela 2. Métodos para eliminações cromossômicas, integração e remoção de genes de resistência a antibiótico foram descritos previamente (Datsenko e Wanner, 2000; Grabar e outros 2006; Posfai e outros, 1997; Zhou e outros 2006). Os iniciadores senso contêm sequências que correspondem ao terminal N de cada gene visado (letra em negrito) seguidas por 20 pb (sublinhado) que correspondem ao cassete FRT-kan-FRT. Os iniciadores antissenso contêm sequências que correspondem à região do terminal C de cada gene visado (letra em negrito), seguida por 20 pb (sublinhado) que correspondem ao cassete. Os fragmentos de DNA amplificados foram eletroporados em cepas de E. coli que abrigam Red recombinase (pKD46). Nos recombinantes resultantes, o cassete FRT-kan-FRT substituiu a região eliminada do gene-alvo por recombinação homóloga (evento de cruzamento duplo). O gene de resistência (FRT-kanFRT) foi subsequentemente removido do cromossomo com FLP recombinase usando o plasmídeo pFT-A, deixando uma região de cicatriz contendo um sítio de FRT. Eliminações e integrações cromossômicas foram verificadas testandose marcadores de antibióticos, análise por PCR e análise de produtos de fermentação. A transdução generalizada de fago P1 (Miller, 1992) foi usada para transferir a mutação AfocA-pflB::FRT-kan-FRT da cepa SZ204 na cepa KJ017 para produzir KJ032.
Eliminação de genes mgsA e poxB
Foi desenvolvido um método modificado para eliminar genes cromossômicos de E. coli usando um processo de recombinação homóloga em duas etapas (Thomason e outros, 2005). Com esse método, nenhum gene de antibiótico ou sequência cicatricial permanece no cromossomo após a eliminação de genes. Na primeira recombinação, parte do gene-alvo foi substituída por um cassete de DNA contendo um gene de resistência ao cloranfenicol (caf) e um gene de levana-sucrase (sacB). Na segunda recombinação, o cassete cat-sacB foi substituído com sequências nativas que omitem a região de eliminação. As células que contêm o gene sacB acumulam levana durante incubação com sacarose e são mortas. Os recombinantes sobreviventes são altamente enriquecidos para perda do cassete cat-sacB.
Foi construído um cassete para facilitar eliminações de genes.
A região cat-sacB foi amplificada por pEL04 (Lee e outros, 2001; Thomason e outros, 2005) por PCR usando o conjunto de iniciadores JMcatsacB (Tabela 2), digerida com Nhe\ e ligada no sítio correspondente de pLOI3421 para produzir pLOI4151. O cassete cat-sacB foi amplificado por PCR usando pLOI4151 (modelo) e o conjunto de iniciadores caf-up2/sacfi-down2 (sítio EcoRV incluído em cada iniciador), digerido com EcoFtV e usado em ligações subsequentes.
O gene mgsA e regiões de 500 pb vizinhas (yccT’-mgsA-helD’, 1435 pb) foram amplificados usando o conjunto de iniciadores mgsAup/down e clonados no vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) para produzir o plasmídeo pLOI4228. Uma preparação diluída de 1.000 vezes desse DNA de plasmídeo serviu como modelo para a amplificação de dentro para fora usando o conjunto de iniciadores mgsA-V (ambos os iniciadores dentro do gene mgsA e voltados para fora). O fragmento de 4.958 pb resultante contendo o replicon foi ligado ao cassete amplificado cat-sacB, digerido com EcoFN por pLOI4151 para produzir pLOI4229. Esse fragmento de 4.958 pb também foi usado para construir um segundo plasmídeo, pLOI4230 (fosforilação e autoligação). Em pLOI4230, a região central de mgsA está ausente(ycc T’-mgsA ’-mgsA”- helD *).
Após digestão de pLOI4229 e pLOI4230 com Xmn\ (dentro do vetor), cada um serviu como modelo para amplificação com o uso do conjunto de iniciadores mgsA-up/down para produzir os fragmentos de DNA lineares para a etapa de integração I (yccT’-mgsA’- cat-sacB- mgsA- helD7) e para a etapa II (yccT’-mgsA’-mgsA- helD'), respectivamente. Após eletroporação do fragmento da etapa I em KJ060 contendo pKD46 (Red recombinase) e 2 horas de incubação a 30°C para permitir a expressão e segregação, foram selecionados recombinantes quanto à resistência ao cloranfenicol (40 mg Γ1) e à ampicilina (20 mg Γ1) nas placas (30°C, 18 horas). Foram escolhidos três clones, desenvolvidos em caldo Luria com ampicilina e arabinose 5% p/v, e preparados para eletroporação. Após eletroporação com o fragmento da etapa II, as células foram incubadas a 37°C por 4 horas e transferidas para um frasco de 250 ml contendo 100 ml de LB modificado (100 mM de tampão MOPS adicionados e NaCI omitido) contendo sacarose 10%. Após incubação de um dia para o outro (37°C), foram selecionados clones nas placas de LB modificado (sem NaCI; 100 mM de MOPS adicionados) contendo sacarose 6% (39°C, 16 horas). Os clones resultantes foram testados quanto à perda de resistência à ampicilina e ao cloranfenicol. A construção foi ainda confirmada por análise por PCR. Um clone desprovido do gene mgsA foi selecionado e designado KJ070.
O gene poxB foi eliminado de KJ071 de uma forma análoga àquela usada para eliminar o gene mgsA. Conjuntos de iniciadores adicionais (poxS-up/down e ροχβ-1/2) usados para construir a eliminação de poxB estão incluídos na Tabela 2, junto com os plasmídeos correspondentes (pLOI4274, pLOI4275 e pLOI4276). A cepa resultante foi designada KJ072. Ensaios enzimáticos
As células foram desenvolvidas em meio NBS com glicose a 5% ou 10%, e coletadas durante crescimento mid-log por centrifugação (8.000 g por 5 min a 4°C), lavadas com 100 mM de tampão Tris-HCI gelado (pH 7,0), e ressuspensas no mesmo tampão (5 ml). As células foram rompidas por tratamento com glóbulos (MP Biomedicals; Solon, Ohio) com glóbulos de vidro e depois centrifugadas a 13.000 g por 15 min para se obter o extrato bruto. As proteínas foram medidas pelo método de BCA, com albumina sérica bovina como o padrão (Kit de Ensaio de Proteína de Pierce BCA).
A atividade de PEP carboxilase foi medida como descrito anteriormente (Canovas e Kornberg, 1969). A mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM de MgCb, 1 mM de DTT, 25 mM de NaHCO3, 0,2 mM de NADH, 20 U de malato desidrogenase e 10 mM de PEP, e a reação foi iniciada por adição de extrato bruto. A atividade de PEP carboxiquinase foi medida como descrito anteriormente (Van der Werf, e outros, 1997). A mistura de reação contém 100 mM de tampão MES (pH 6,6), 10 mM de MgCU 75 mM de NaHCO3, 5 mM de MnCb, 50 mM de ADP, 1 mM de DTT, 0,2 mM de NADH, 20 U de malato desidrogenase e 10 mM de PEP. A reação foi iniciada por adição de extrato bruto.
A atividade de enzima málica dependente de NAD+ foi medida em ambas as direções como descrito anteriormente (Stols e Donnelly, 1997). Para a direção de carboxilação, a mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 7,5), 25 mM de NaHCO3, 1 mM de MnCI2, 1 mM de DTT, 0,2 mM de NADH e 25 mM de piruvato. A reação foi iniciada por adição de extrato bruto. No entanto, esse método de ensaio não pode medir a atividade de enzima málica em E. coli C do tipo selvagem em função da presença de lactato desidrogenase. Para descarboxilação, a mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 7,5), 2,5 mM de NAD+, 1 mM de DTT, 10 mM de MgCI2, 20 mM de KCI e 20 mM de L-malato. A reação foi iniciada por adição de extrato bruto.
A atividade de enzima málica dependente de NADP+ foi medida da mesma forma que para a enzima málica dependente de NADP+, exceto que NAD(H)+ foi substituído por NADP(H)+. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima para oxidar ou reduzir 1 nmol de substrato por min.
Análise por RT-PCR em tempo real
RT-PCR em tempo real foi usada para medir os níveis de RNA, como descrito previamente (Jarboe e outros, 2008). As células foram desenvolvidas em meio NBS com glicose 5% ou 10% e coletadas durante crescimento mid-log por agitação em um banho de gelo seco/etanol, seguido por centrifugação e armazenamento a -80°C em RNALater (Qiagen, Valencia CA) até a purificação. A purificação do RNA foi realizada com colunas RNeasy Mini (Qiagen), seguida por digestão com DNasel (Invitrogen). A transcrição reversa com Superscript II (Invitrogen, Carlsbad CA) usou 50 ng de RNA total como modelo. PCR em tempo real foi realizada em um Bio-Rad iCycler com a mistura de PCR SYBR Green (Bio-Rad, Hercules CA). O RNA foi verificado quanto à contaminação por DNA genômico por execução de uma RT-PCR na ausência de transcrição reversa. A abundância do transcrito foi estimada com o uso de DNA genômico como padrão e os níveis de expressão foram normalizados pelo gene birA, um repressor da transcrição (Jarboe e outros, 2008). Os iniciadores de RT-PCR usados para pck e birA estão listados na Tabela 2.
Sequenciamento da região pck
A fim de saber se houve a ocorrência de qualquer mutação no gene pck de KJ073, a região codificadora e a região promotora (cerca de 800 pb na frente da região codificadora) do gene pck, tanto em KJ012 quanto em KJ073, foram amplificadas por DNA Polimerase de Alta Fidelidade PfuUltra (Stratagene; Wilmington, DE). O conjunto de iniciadores pck-F/R foi usado para amplificar a região codificadora através do terminador da transcrição. O conjunto de iniciadores pck-2 foi usado para amplificar a região promotora. O sequenciamento de DNA foi fornecido pelo University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research (com autosequenciadores da Applied Biosystems).
Fermentações
As culturas e fermentações de sementes cresceram a 37°C, 100 rpm, em meio NBS ou AM1 de sais minerais contendo glicose, 100 mM de KHCO3 e 1 mM de HCI de betaína. Essas foram mantidas em pH 7,0 pela adição automática de KOH durante os experimentos iniciais. Subsequentemente, o pH foi mantido por adição de uma mistura 1:1 de 3 M de K2CO3 e 6 N de KOH. As fermentações foram realizadas em pequenos vasos de fermentação com um volume de trabalho de 350 ml. As fermentações foram inoculadas em uma OD55o inicial de 0,01 (3,3 mg de CDW Γ1) ou 0,1 (33,3 mg de CDW Γ1), como indicado. Nenhum gene de resistência a antibiótico estava presente nas cepas que foram testadas. Os vasos de fermentação foram lacrados, exceto por uma agulha de 16 gauge que serviu como um conduto para remoção de amostra. A anaerobiose foi rapidamente obtida durante o crescimento com bicarbonato adicionado servindo para assegurar uma atmosfera de CO2.
Análises
A massa celular foi estimada pela densidade óptica a 550 nm (OD 1,0 = 333 mg de peso seco de células Γ1) com um espectrofotômetro
Bausch & Lomb Spectronic 70. Os ácidos orgânicos e açúcares foram determinados pela utilização de cromatografia líquida de alto rendimento (Grabar e outros, 2006).
Resultados e discussão
Construção de KJ012 para a produção de succinato: eliminação de IdhA, adhE e ackA
A grande maioria do conhecimento científico de E. coli é derivada de investigações em meio complexo como, por exemplo, caldo de Luria, e não em meio de sais minerais que utiliza baixas concentrações de substratos de açúcar (tipicamente 0,2% p/v; 11 mM) em vez da glicose 5% (p/v) (278 mM) e 10% p/v (555 mM) usada nos estudos aqui relatados. Grandes quantidades de açúcar são necessárias para produzir níveis comercialmente significativos de produto. Pesquisadores anteriores descreveram a construção de muitos derivados de E. coli para a produção de succinato em meio complexo (Tabela 1). Com meio complexo, o planejamento racional baseado em vias primárias foi razoavelmente bem sucedido para demonstrações acadêmicas de engenharia metabólica. No entanto, o uso de nutrientes complexos para a produção de produtos de fermentação bacteriana aumenta o custo de materiais, o custo da purificação e o custo associado ao descarte de resíduos. O uso de um meio de sais minerais sem componentes de meios complexos deve ter uma relação custo-benefício bem melhor.
A E. coli C cresce bem em meio de sais minerais NBS contendo glicose e produz uma mistura de lactato, acetato, etanol e succinato como produtos de fermentação (Figura 1 A; Tabela 3). Em contraste com outros estudos com E. coli (Tabela 1), os estudos aqui relatados se concentraram no desenvolvimento de cepas que são capazes de converter um nível elevado de açúcares em succinato com o uso de um meio de sais minerais para minimizar os custos de materiais, da purificação de succinato e do descarte de resíduos. Por inspeção da Figura 1, que ilustra as vias-padrão de fermentação geralmente aceitas para E. coli, foi desenvolvido um planejamento racional para a engenharia metabólica de uma cepa produtora de succinato no qual eram feitas eliminações em genes que codificam as etapas terminais para todos os produtos alternativos: lactato (IdhA), etanol (adhE) e acetato (ackA). Os resultados dessa engenharia metabólica por planejamento racional foram completamente inesperados. A cepa resultante (KJ012) cresceu muito pouco sob condições anaeróbicas em meio de sais minerais contendo glicose 5% (278 mM) e produziu acetato em vez de succinato como o produto primário da fermentação. Ao contrário das expectativas do planejamento racional, o succinato permaneceu como um produto menor. Os rendimentos molares de succinato com base na glicose metabolizada não se alteraram em consequência dessas mutações, 0,2 mol de succinato por mol de glicose para a parente e KJ012 durante fermentação em meio de sais minerais NBS contendo glicose 5%. Confirmamos que o meio de sais minerais NBS contém todos os nutrientes minerais necessários para o crescimento de KJ012 por incubação sob condições aeróbicas (frasco em agitação aeróbica; glicose 5%). Em frascos em agitação aeróbica, os rendimentos celulares para KJ012 foram 5 vezes maiores do que durante o crescimento anaeróbico e 75% daquele da E. coliC (parente) durante o crescimento anaeróbico. Esses resultados também confirmaram que todas as vias biossintéticas centrais permaneceram funcionais em KJ012.
Quando nutrientes complexos estavam presentes (caldo de Luria), a produção fermentativa de succinato por KJ012 aumentou 20 vezes, quando comparada com KJ012 em meio mínimo de sais, e o rendimento molar para succinato aumentou em 3,5 vezes. Claramente, o planejamento racional baseado nas vias primárias é mais bem adequado às demonstrações acadêmicas ou aos processos de planejamento destinados ao uso com nutrientes complexos.
A base para o crescimento deficiente, para a baixa produção de succinato e para o aumento da produção de acetato por KJ012 (Δ/dM/.FRT ÁadhE/.FRT AackA/FRT) durante o metabolismo anaeróbico em meio de sais minerais é desconhecida. Há consequências inesperadas decorrentes da engenharia metabólica com a utilização do planejamento racional baseado nas tabelas da via-padrão. Em meio mínimo, planejamentos racionais para engenharia metabólica nitidamente não eram previsíveis. A cepa resultante, KJ012, foi inferior à parente no crescimento e não foi melhor do que a parente para a produção de succinato.
Desenvolvimento de KJ017 para a produção de succinato por seleção base30 ada no crescimento de KJ012
KJ012 (A/dbA.FRT AadbE/.FRT AackA./FRT) cresceu deficientemente em comparação com a E. coli C parente, exibiu taxas de produção de succinato menores e não forneceu rendimentos molares melhores (Tabela 3). Apesar desses resultados, a transferência serial dessa cepa foi tentada como um método para cosselecionar crescimento e produção de succinato aumentados com base na seguinte lógica: acredita-se geralmente que a via primária para a fermentação da glicose em succinato (Figura 1A e Figura 2A.) use fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) para a etapa de carboxilação (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler e outros, 2005; Millard e outros, 1996; Gottschalk, 1985; Karp e outros, 2007). Essa enzima de carboxilação não conserva o fosfato de alta energia em fosfoenolpiruvato e reduz o ATP disponível para o crescimento. Podem ser previstas vias alternativas para a produção de succinato com o uso do repertório de genes de E. coli conhecidos que poderíam aumentar os rendimentos de ATP e poderiam, desse modo, aumentar o crescimento (Figura 1 A; Figura 2B, 2C e 2D). No entanto, nenhuma dessas vias alternativas demonstrou funcionar para a produção de succinato durante a fermentação com cepas nativas de E. coli. Enzimas cruciais nessas vias alternativas são reprimidas por glicose e estão normalmente ativas durante a gliconeogênese. Tipicamente, os níveis dessas enzimas gliconeogênicas variam inversamente com a disponibilidade de glicose e de outros metabólitos (Goldie e Sanwal, 1980a; Wright e Sanwal, 1969; Sanwal e Smando, 1969a) e funcionam na direção reversa, descarboxilação (Keseler e outros, 2005; Oh e outros, 2002; Kao e outros, 2005; Stols e Donnelly, 1997; Samuelov e outros, 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere e outros, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal 1970b).
A enzima crucial para uma dessas, enzima málica ligada ao
NADH (sfcA) (Figura 2B), demonstrou ser capaz de aumentar a produção de succinato em E. coli, mas exigia a superexpressão por um plasmídeo para fazê-lo (Stols e Donnelly, 1997). No entanto, não se esperava que nenhuma dessas vias alternativas fosse funcional em cepas nativas de E. coli ou
KJ012 durante o crescimento anaeróbico com níveis elevados de glicose. Transferências seriais de KJ012 com seleção quanto ao crescimento aumentado ofereceram uma oportunidade para a seleção de ativação mutacional de vias alternativas para a produção de succinato (Figura 1B) que mantinham o equilíbrio redox e aumentavam os rendimentos de ATP.
KJ012 foi transferida serialmente em meio de glicose NBS sob condições fermentativas tão rapidamente quanto o crescimento permitia (Figura 3A; Figura 4A; Figura 5). O crescimento permaneceu lento com 4 a 5 dias de incubação necessários entre as primeiras 9 transferências, e depois aumentou dramaticamente, permitindo que fossem feitas transferências em intervalos de 24 horas. Esse evento era acompanhado por um aumento de acetato (Figura 4A) com pouca melhora na produção de succinato. Após 27 transferências (60 dias), o KOH foi substituído por uma mistura 1:1 de M de K2CO3 e 6 N de KOH para fornecer dióxido de carbono adicional (100 mM inicialmente adicionados a todos os meios de sais minerais NBS). A continuação das transferências produziu aumentos na produção de succinato. Foi feito um total de 40 transferências em glicose 5% (227 mM), seguidas por outras 40 transferências em glicose 10% (555 mM). Durante as transferências em glicose 10%, os rendimentos de succinato permaneceram aproximadamente 0,7 mol por mole de glicose metabolizada com lactato, acetato e formato como subprodutos (Tabela 3). Esse rendimento era 3 vezes maiores do que E. coli C e KJ012. Foi isolado um clone e designado KJ017. A seleção quanto aos aumentos no crescimento de KJ012 para produzir KJ017 cosselecionou quanto aos aumentos na produção de succinato (taxa, titulação e rendimento molar).
Base fisiológica para a produção aumentada de succinato por KJ017
O succinato produzido por E. coli com a utilização da via geralmente considerada como a via de fermentação nativa (fosfoenolpiruvato carboxilase; ppc) desperdiça a energia de fosfoenolpiruvato por produção de fosfato inorgânico. Um ATP é perdido por succinato produzido por essa via (Figura 1; Figura 6). A conservação dessa energia como ATP pela utilização de sistemas enzimáticos alternativos representa uma oportunidade para au32 mentar o crescimento celular e cosselecionar quanto à produção aumentada de succinato. Com base em genes conhecidos em E. coli, foram previstas três outras vias enzimáticas para a produção de succinato que conservariam ATP e poderíam, dessa forma, aumentar o crescimento (Figura 1; Figura 6). No entanto, acredita-se que todas as etapas de carboxilação nessas vias alternativas funcionem na direção reversa (descarboxilação) primariamente para gliconeogênese durante o crescimento em substratos como, por exemplo, ácidos orgânicos (Keseler e outros, 2005; Oh e outros, 2002; Kao e outros, 2005; Stols e Donnelly, 1997; Samuelov e outros, 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere e outros, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal 1970b). Para testar a hipótese de que a seleção baseada no crescimento para desenvolver KJ017 tenha, na verdade, ativado uma ou mais dessas vias alternativas, foram comparadas atividades específicas das etapas de carboxilação fundamentais (Tabela 4). Três das mesmas eram similares ou menores em E. coli C, KJ012, e KJ017. A fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) de conservação de energia estava aumentada em 4 vezes em KJ017, comparada com KJ012, consistente com a hipótese de que a seleção quanto ao crescimento aumentado cosselecionaria quanto à produção aumentada de succinato por meio de rendimentos crescentes de ATP, uma consequência do aumento da expressão de uma via de conservação de energia para a produção de succinato.
Seleções baseadas no crescimento posteriores e eliminações de genes adicionais foram usadas para construir muitas cepas adicionais com aumentos adicionais do crescimento e da produção de succinato (Figura 3 e Figura 4). Os níveis de enzima em uma das mesmas também foram examinados, KJ073. Nessa cepa, a atividade in vitro de fosfoenolpiruvato carboxiquinase foi ainda aumentada em 8 vezes em relação àquela de KJ017, enquanto outras enzimas de carboxilação permaneceram basicamente inalteradas (Tabela 4).
A pck e as regiões circundantes foram clonadas por KJ012 e KJ073, e sequenciadas. Não foram encontradas alterações na região codificadora. Com modificações pós-tradução ausentes, as propriedades catalíti33 cas da enzima devem permanecer inalteradas. Uma única mutação foi detectada na região promotora de pck, G a A no sítio -64 pb em relação ao sítio de início de tradução. Essa mutação estava atrás do sítio de início de transcrição que está em um sítio -139 pb em relação ao sítio de início de tradução. A restauração dessa sequência (A a G) em KJ073 para aquela de E. coli C não afetou o crescimento celular, a fermentação ou produção de succinato, indicando que essa mutação não é essencial (dados não mostrados). RT-PCR confirmou que os níveis de mensagem eram elevados em KJ073. Esses resultados são consistentes com uma mutação reguladora como a base para a expressão aumentada de pck.
Investigadores anteriores observaram que os parâmetros cinéticos de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) podem ter efeitos importantes sobre a carboxilação e a produção de succinato (Millard e outros, 1996; Kim e outros, 2004). A Km de bicarbonato para fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) de E. coli é de 0,15 mM (Morikawa e outros, 1980), 9 vezes menor (13 mM) do que fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) de E. coli (Krebs e Bridger 1980). Embora a superexpressão de pck por E. coli em plasmídeo multicópias aumentasse a atividade de fosfoenolpiruvato carboxiquinase em 50 vezes, há relatos de que não tenha nenhum efeito sobre a produção de succinato (Millard e outros, 1996). A produção de succinato também não aumentava quando fosfoenolpiruvato carboxiquinase de Anaerobiospirillum succiniciproducens era superexpressa em E. coli K12 (Kim e outros, 2004). Essa enzima também possui uma Km elevada para bicarbonato (30 mM; Laivenieks e outros, 1997). No entanto, quando pck de A. succiniciproducens era superexpressa em um mutante de ppc de E. coli K12, a produção de succinato era aumentada em 6,5 vezes (Kim e outros, 2004). Em KJ017 e derivados subsequentes, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase é a atividade de carboxilação claramente dominante, até mesmo na presença de fosfoenolpiruvato carboxilase funcional nativa.
Os resultados de medidas de enzima de E. coli C foram bem surpreendentes. A enzima, geralmente considerada como a atividade de carboxilação dominante para a produção de succinato por E. coli nativa (fos34 foenolpiruvato carboxilase; ppc) durante o crescimento (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler e outros, 2005; Millard e outros, 1996; Gottschalk 1985; Karp e outros, 2007), não era a enzima mais ativa in vitro para E. coli C. Dessa forma, as vias metabólicas geralmente aceitas para E. coli (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Sanchez e outros, 2006; Cox e outros, 2006; Vemuri e outros, 2002a; Wang e outros, 2006; Sanchez e outros, 2005ab; Gokarn e outros, 2000; Karp e outros, 2007) mediante as quais o planejamento racional de engenharia metabólica e estimativas de fluxo metabólico são tipicamente baseados podem não refletir com precisão o metabolismo em todas as cepas. Sob condições de saturação de substrato in vitro, a atividade de fosfoenolpiruvato carboxiquinase era a mais ativa. Em E. coli K12, havia relatos de que as atividades tanto de fosfoenolpiruvato carboxilase quanto de fosfoenolpiruvato carboxiquinase eram iguais in vitro (140 nm min1 mg1 proteína celular; Van der Werf e outros, 1997), com a primeira servindo como a via primária para succinato.
Os estudos prévios mostravam que a superexpressão de um gene de ppc nativo em E. coli resultou no aumento da produção específica de succinato (Millard e outros, 2000), aumento da taxa de crescimento específico, e redução da produção específica de acetato em função do aumento da carboxilação de PEP para restabelecer os intermediários do ciclo de TCA (Farmer e Liao, 1997). No entanto, na medida em que PEP é necessário para o sistema de transporte de glicose, a superexpressão de ppc também diminui a taxa de captação de glicose em 15 a 40%, sem aumentar significativamente o rendimento de succinato (por glicose), quando comparado com um controle isogênico (Chao e Liao, 1993; Gokarn e outros, 2000). Essa incapacidade da fosfoenolpiruvato carboxilase nativa em aumentar os rendimentos de succinato desviou a maior parte da atenção das pesquisas para um novo design metabólico, a superexpressão da PYC (piruvato carboxilase) por Lactobacillus lactis ou Rhizobium etli como a etapa de carboxilação (Vemuri e outros, 2002ab; Gokarn e outros, 2000; Lin e outros, 2005abc), em vez de prosseguir com trabalhos com o repertório nativo de genes de E. coli.
Bactérias de ruminantes, tais como Actinobacillus succinogenes, produzem succinato como um produto primário durante a fermentação da glicose com o uso da fosfoenolpiruvato carboxiquinase que conserva energia para carboxilação (Kim e outros, 2004; McKinlay e outros, 2005; McKinlay e Vieille, 2008). As atividades relatadas para esse organismo são 5 vezes aquelas de KJ017 e metade daquela obtida por seleção continuada baseada no crescimento (evolução metabólica) de KJ073. Dessa forma, utilizando-se uma combinação de engenharia metabólica (IdhA adhE ackA) e evolução metabólica (seleção baseada no crescimento para eficiência aumentada da produção de ATP), os estudos aqui relatados demonstram o desenvolvimento de cepas produtoras de succinato de E. coli que se assemelham e um organismo de ruminantes como, por exemplo, A. succinogenes, utilizando-se apenas o repertório nativo de genes de E. coli. Apesar dos relatos prévios de que a superexpressão da fosfoenolpiruvato carboxilase de E. coli (ppc) não é útil para a produção de succinato na ausência de uma mutação em fosfoenolpiruvato sintase (Chao e Liao, 1993; Kim e outros, 2004; Gokarn e outros, 2000; Millard e outros, 1996), foram criados geneticamente KJ017 e derivados para utilizar fosfoenolpiruvato carboxiquinase como a via primária para a produção de succinato e malato.
Construção de KJ032 e KJ060
Durante o crescimento com glicose 10% (p/v), subprodutos indesejados (acetato, formato e lactato) eram abundantes em fermentações com KJ017 (A/dhA:.FRT AadhE./FRT AacAA/FRT), apesar da eliminação de genes que codificam as atividades primárias de lactato desidrogenase (IdhA) e acetato quinase (ackA) (Tabela 3). A produção de lactato e de acetato também poderia resultar em rendimentos mais elevados de ATP, uma base para a seleção baseada no crescimento (Figura 1A).
O gene que codifica piruvato formatoliase (pflB) foi eliminado de KJ017 para eliminar a perda da capacidade redutora como formato e um excesso de acetil~CoA, uma fonte potencial de acetato. O transportador de formato (focA) a montante nesse óperon também foi eliminado. Como esperado, essa cepa eliminada (KJ032) não cresceu sem acetato, confirmando que essa é a via primária para a produção de acetil~CoA em KJ017 (Figura
3C). A eliminação de pflB sabidamente causa auxotrofia de acetato sob condições anaeróbicas (Sawers e Bock, 1988). O crescimento e a produção de succinato por KJ032 foram restaurados pela adição de 20 mM de acetato (Figura 3C, Figura 4C e Figura 5). A produção de formato e de acetato foi substancialmente reduzida em consequência da eliminação DE pflB (e de focA). Embora essa cepa necessitasse de acetato para o crescimento, também foi produzido acetato adicional durante a fermentação. O mesmo fenômeno foi relatado previamente para cepas com pflB eliminado durante a construção de biocatalisadores de E. coli K-12 para a produção de piruvato (Causey e outros, 2004). Os níveis de lactato também estavam reduzidos em KJ032 (Tabela 3; Figura 4C). Transferências subsequentes foram acompanhadas por aumentos do crescimento e da produção de succinato. O acetato adicionado foi reduzido, o tamanho dos inóculos foi reduzido, e a concentração de glicose foi dobrada (10% p/v) durante transferências subsequentes (Figura 4D). Após redução da quantidade de acetato a 5 mM, surgiu uma população instável que produzia níveis elevados de malato às custas de succinato. Após transferências adicionais, o acetato foi omitido e foi desenvolvida uma cepa que não era mais auxotrófica para acetato, presumivelmente em função da expressão aumentada de outro gene. No entanto, os rendimentos de succinato declinaram com a eliminação de acetato adicionado, enquanto os níveis de malato e acetato aumentaram. As fontes de acetato e base para o aumento de malato são desconhecidas. Uma pequena quantidade de piruvato também foi produzida. Um clone foi isolado da última transferência e designado KJ060 (A/dM/.FRT AadhE/.FRT AackA.FRT AfocA-pflB::FRT). Essa cepa produziu 1 mol de succinato por mol de glicose metabolizada em meio de sais minerais NBS com glicose 10%. Construção de KJ070 e KJ071 por eliminação de metilglioxal sintase (mqsA)
Presume-se que a pequena quantidade de lactato presente nos caldos de fermentação de várias cepas se origine da via de metilglioxal sintase (Figura 6; Grabare outros 2006). Embora isso represente uma pequena perda de rendimento, a produção de lactato por essa via é indicativa de acúmulo de metilglioxal, um inibidor tanto do crescimento quanto da glicólise (Egyud e Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar e outros, 2006; Hopper e Cooper, 1971). A produção de metilglioxal e lactato foi eliminada por eliminação do gene de mgsA (metilglioxal sintase) em KJ060 para produzir KJ070 (Δ/c//?A;FRT &adhE::FRT AacfcA.FRT AfocA-pflB: :FRT AmgsA). Uma cepa KJ070 foi inicialmente subcultivada em glicose 5% (p/v) (Figura 4E e Figura
5). Presume-se que a eliminação de mgsA tenha aumentado o fluxo glicolítico, como evidenciado pelo acúmulo de piruvato no meio (Tabela 3). Esse aumento do fluxo glicolítico também pode ser responsável pelo declínio adicional na proporção de succinato/malato em função da produção aumentada de oxaloacetato, um inibidor alostérico de fumarato redutase (Iverson e outros, 2002; Sanwal, 1970c).
Na transferência 21, a glicose foi dobrada em 10% (p/v) e as transferências continuaram. Esse nível mais elevado de glicose e transferências subsequentes resultou em aumentos adicionais da produção de malato, excedendo succinato nas últimas transferências (Figura 4E). A produção aumentada de malato versus succinato em glicose 10% p/v também é consistente com o fluxo glicolítico aumentado e a inibição de fumarato redutase por oxaloacetato. Na transferência 50, 1,3 mol de malato e 0,71 mol de succinato foram produzidos por mole de glicose metabolizada (Tabela 3). Quantidades significativas de acetato também foram produzidas. Uma nova cepa foi isolada da subcultura final e designada KJ071 (A/dhA./FRT Aad/?E.;FRT Aac/<A.;FRT AfocA-pflB: :FRT AmgsA). Essa cepa pode ser útil para a produção de malato.
Construção de KJ072 e KJ073 por eliminação de poxB
Embora a conversão de glicose em acetato seja neutra em termos de redox, a divisão de carbono em acetato diminui o rendimento de succinato e malato. A piruvato oxidase (poxB) representa uma fonte potencial de acetato e CO2 durante incubação sob condições microaerofílicas (Causey e outros, 2004). Embora não deva funcionar para oxidar piruvato sob condição anaeróbica, poxB foi visada para eliminação de genes (Figura 6). Como esperado, a eliminação de poxB para produzir KJ072 (A/dhA.FRT Aad/)E;.FRT AackA.FRT AfocA-pflB:;FRT AmgsA ΔροχΒ) não reduziu a pro38 dução de acetato, indicando que estão envolvidas vias alternativas na produção de acetato. No entanto, a eliminação de poxB resultou em mudanças inesperadas nos produtos de fermentação, um aumento em succinato e uma diminuição em malato (Tabela 3; Figura 4F). O mecanismo para esse aumento na produção de succinato é desconhecido, mas pode estar relacionado a outras atividades de piruvato oxidase como, por exemplo, produção de acetoína, descarboxilação, e carboligação (Ajl e Werkman, 1948; Chang e Cronan, 2000).
A cepa KJ072 foi submetida a 40 rodadas adicionais de evolução metabólica em meio AM1, um meio com baixo teor de sal, com glicose 10% (p/v) (Tabela 3; Figura 4F e Figura 5). Aumentos do crescimento, rendimento celular e produção de succinato foram observados durante essas transferências. Os níveis de malato, piruvato e acetato também aumentaram. Foi isolado um clone da transferência final e designado KJ073 (A/c//?A;.FRT AadhE ::FRT AackA.;FRT Ap//B;;FRT AmgsA ΔροχΒ). Essa cepa retinha a via de fosfenolpiruvato carboxiquinase para carboxilação (Tabela 4). A atividade in vitro dessa cepa era 45 vezes maior do que aquela de KJ012, e 10 vezes maior do que a de KJ017, fornecendo evidências adicionais para a associação íntima entre a conservação de energia para a produção de succinato e o crescimento, e ainda estabelecendo a base usada para seleção.
Fermentação de KJ060 e KJ073 em meio AM1 contendo glicose 10% (p/v)
A Figura 7 mostra fermentações em batelada com KJ060 e KJ073, os dois melhores biocatalisadores para a produção de succinato. Embora o crescimento tivesse se completado dentro das primeiras 48 horas de incubação, a produção de succinato continuou por 96 horas. Um terço da produção de succinato ocorreu na ausência de crescimento celular. Essas cepas produziram titulações de succinato de 668 a 733 mM, com um rendimento molar de 1,2 a 1,6 com base na glicose metabolizada. Com o meio AM1, os rendimentos foram tipicamente maiores do que com o meio de sais minerais NBS. Acetato, malato e piruvato se acumularam como subprodutos indesejáveis e diminuíram o rendimento de succinato potencial (Tabela 3). O rendimento teórico máximo de succinato a partir de glicose e CO2 (exces39 so) é de 1,71 mol por mol de glicose, com base na seguinte equação:
C6Hi2O6 + 6 CO2 -+ 12 C4H6O4 + 6 H2O
No entanto, não há uma via direta de succinato em E. coli que obtenha esse rendimento (Figura 6).
Conversão de outros substratos em succinato
Embora este estudo tenha se concentrado primariamente na conversão de glicose em succinato, sabe-se que E. coli possui a habilidade nativa para metabolizar todos os açúcares de hexose e pentose que são constituintes de paredes celulares de plantas (Asghari e outros, 1996; Underwood e outros, 2004). Algumas cepas de E. coli também podem metabolizar sacarose (Moniruzzaman e outros, 1997). Uma cepa KJ073 foi testada quanto à utilização de açúcares 2% de hexoses e pentoses em tubos de soro. Em todos os casos, esses açúcares foram convertidos primariamente em succinato. Uma cepa KJ073 também metabolizou glicerol em succinato. Durante a incubação com glicerol 2%, 143 mM de glicerol foram metabolizados para produzir 127 mM de succinato com um rendimento molar de 0,89, 89% do máximo teórico.
Produção de malato em meio NBS contendo 1 mM de betaína e glicose 10%
Durante as seleções baseadas em crescimento, observou-se que as culturas variavam em sua produção de malato (Tabela 3), um produto alternativo potencialmente útil. O malato foi o produto mais abundante de KJ071 com glicose 10% (Tabela 3; Figura 4E), quase o dobro daquele de succinato. Essa cepa produziu 516 mM de malato com um rendimento molar de 1,44, com base na glicose metabolizada (Tabela 3).
Conclusões
O metabolismo fermentativo de E. coli mostrou ser acentuadamente adaptável. Derivados foram projetados e desenvolvidos para contornar numerosas eliminações de genes relacionados às vias de fermentação nativas e aumentar os fluxos através das enzimas restantes para manter o equilíbrio redox, aumentar a eficiência da produção de ATP e aumentar o cresci40 mento. Embora muito mais desafiadoras, as células podem fazer essas mudanças adaptivas em meios de sais minerais equilibrando, ao mesmo tempo, a divisão de carbono para satisfazer a todas as necessidades biossintéticas. Após eliminação das vias primárias para oxidação de NADH (lactato desidrogenase, álcool desidrogenase) e produção de acetato (acetato quinase), o crescimento e a produção de ATP permanecem ligados à oxidação de NADH e à produção de malato ou succinato para equilíbrio redox (Figura 1B). Seleções baseadas no crescimento anaeróbico asseguram o equilíbrio redox e selecionam quanto à eficiência aumentada e taxas de produção de ATP aumentadas, as bases para o crescimento aumentado. Essa seleção quanto ao equilíbrio redox e à produção de ATP não pode distinguir facilmente entre malato e succinato como produtos finais, na medida em que os precursores de ambos servem como receptores de elétrons. Durante essas investigações, foi desenvolvida uma cepa em (KJ071) que produz mais malato do que succinato. Essa cepa e derivados adicionais podem ser úteis para a produção de malato. Outras cepas como, por exemplo, KJ073 e KJ060, produzem succinato como o produto primário em rendimentos de 1,2 a 1,6 mol por mol de glicose.
A eliminação de pflB, a fonte primária de acetil~CoA durante o crescimento anaeróbico, resultou em uma exigência auxotrófica para acetato (Sawers e Bock, 1988). Essa exigência foi eliminada através da evolução metabólica, presumivelmente em função da produção aumentada de acetil~CoA por outras vias como, por exemplo, piruvato desidrogenase (de Graef e outros, 1999). A fonte metabólica do acetato ou da acetil~CoA que substituiu essa exigência auxotrófica é desconhecida. Muitas mudanças nos produtos metabólicos não foram previstas. O aumento de malato durante as seleções após eliminação de mgsA não tem explicação. O metilglioxal é um inibidor metabólico que é produzido em resposta a um desequilíbrio no metabolismo (Grabar e outros, 2006). A eliminação da produção de metilglioxal pode ter fornecido uma vantagem relacionada ao crescimento como, por exemplo, taxa de crescimento aumentada, um intervalo mais curto após inoculação etc. A redução de malato e a mudança para uma produção mais elevada de succinato após uma eliminação de poxB também foram surpre41 endentes. Foram observadas poucas alterações no nível de acetato, indicando que essa enzima era uma fonte menos importante de acetato ou que ela foi substituída funcionalmente por outras vias para a produção de acetato. Após eliminação de poxB, foi produzido novamente succinato como o ácido dicarboxílico dominante. Com as melhores cepas para a produção de succinato, KJ060 e KJ073, malato e acetato permaneceram subprodutos igualmente abundantes (Tabela 3; Figuras 4D e 4F). A eliminação destes representa uma oportunidade adicional para o aumento dos rendimentos.
Todas as cepas de E. coli criadas geneticamente previamente desenvolvidas para a produção de succinato utilizavam meios complexos e plasmídeos com antibióticos para manutenção. A maioria delas obteve apenas titulações baixas de succinato em fermentações em batelada simples, que necessitam de processos mais complexos para se obter titulações elevadas (Tabela 1). Foram relatadas diversas abordagens genéticas que aumentam a produção de succinato a partir de glicose por E. coli recombinante em meio complexo. Em nossa construção inicial, o crescimento e o metabolismo de açúcar foram muito deficientes em meio de sais minerais, mas foram muito robustos em meio complexo (caldo de Luria). Meios complexos contendo vitaminas, aminoácidos e outros precursores macromoleculares podem mascarar problemas reguladores potenciais no metabolismo e na biossíntese que foram criados por engenharia metabólica.
Muitos outros investigadores também utilizaram genes heterólogos e processos complicados que incluem pulverização com gás (CO2, H2, O2 ou ar) e etapas de processos duplos, aeróbicos e anaeróbicos. Seria de se esperar que essa complexidade de processo e nutrientes aumentasse o custo de construção, materiais, purificação e descarte de resíduos. Em contraste, as cepas KJ060 e KJ073 produziram titulações elevadas de succinato (600-700 mM) em fermentações em batelada simples (açúcar 10%) com a utilização meio de sais minerais sem quaisquer nutrientes complexos ou genes estranhos.
Exemplo 2
Os micro-organismos foram depositados com a ARS Culture
Collection da seguinte forma:
Cultura Designações da cepa Data do depósito
KJ073 B-50029 15 de março 2007
KJ091 B-50110 20 de fevereiro de 2008
KJ098 B-50111 20 de fevereiro de 2008
KJ104 B-50112 20 de fevereiro de 2008
KJ110 B-50113 20 de fevereiro de 2008
KJ119 B-50114 20 de fevereiro de 2008
KJ122 B-50115 20 de fevereiro de 2008
KJ134 B-50116 20 de fevereiro de 2008
Materiais e métodos
Cepas, meios e condições de crescimento
Novos derivados de E. coli C (ATCC 8739) foram desenvolvidos para a produção de succinato com a utilização de uma combinação única de eliminações de genes associadas à seleção baseada no crescimento. Cepas, plasmídeos e iniciadores usados neste estudo estão resumidos na Tabela 1. Durante a construção da cepa, as culturas cresceram a 37°C em caldo de Luria-Bertani (LB) modificado (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extrato de levedura Difco, 5 g de cloreto de sódio) (Miller, 1992) e suplementado com antibióticos, como adequado (Jantama et al, 2008; Zhang e outros, 2007). Nenhum gene que codifica resistência a antibióticos, plasmídeos ou genes estranhos está presentes nas cepas finais desenvolvidas para a produção de succinato. Após a construção, as cepas cresceram e foram mantidas em meio
AM1 (Martinez e outros, 2007). Esse meio foi suplementado com 100 mM de KHCO3 e glicose (como indicado). Betaína (1 mM) também era adicionada quando as concentrações iniciais de glicose fossem de 5% (p/v) ou maiores. Eliminação de FRT marcadores nas regiões adhE, IdhA, e focA-pflB
A estratégia usada para produzir eliminações de genes sequen20 ciais e remover os marcadores de FRT dos loci adhE, IdhA e focA-pflB foram descritas previamente (Datsenko e Wanner, 2000; Grabar e outros, 2006; Jantama e outros, 2008; Zhang e outros, 2007). O plasmídeo pLOI4151 foi usado como uma fonte de um cassete cat-sacB, e Red recombinase (pKD46) foi usada para facilitar o cruzamento duplo, eventos de recombinação homóloga. A resistência ao cloranfenicol foi usada para selecionar quanto à integração. O crescimento com sacarose foi usado para selecionar quanto à perda de sacB. Com essa abordagem, foram construídas eliminações sucessivas para produzir derivados de KJ079 que eliminavam todos os sítios de FRT. Os iniciadores e plasmídeos estão listados na Tabela 1.
Para remover o sítio de FRT na região AadhE, foram projetados iniciadores híbridos (WMadhEA/C) para a região-alvo Aac/bE/.FRT para conter aproximadamente 50 pb de homologia para as regiões 5’ e 3’ do sítio de AadhE/.FRT e 20 pb que correspondem ao gene de cat-sacB de pLOI4151. Esses iniciadores foram usados para amplificação por PCR do cassete catsacB com o uso de pLOI4151 como modelo. O produto de PCR resultante foi usado para substituir o sítio de FRT na região AadhE com um cassete catsacB por um cruzamento duplo, evento de recombinação homóloga com seleção quanto à resistência ao cloranfenicol, para produzir TG200.
O gene de adhE e a sequência circundante foram amplificados por E. coli C com o uso dos iniciadores up/downadhE. O produto de PCR contendo ychE’-adhE-ychG’ (3,44 kb) foi clonado em pCR2.1-TOPO, gerando pLOI4413. Um segundo conjunto de iniciadores (IO-adhEup/down) foi usado para amplificar o produto de dentro para fora com pLOI4413 como modelo e Pfu polimerase para gerar um produto de extremidade romba no qual um segmento interno de 2,6 kb da sequência de adhE foi eliminado. Esse produto de PCR de dentro para fora foi tratado com quinase e autoligado, resultando em pLOI4419. O produto de PCR amplificado por pLOI4419 (iniciadores up/downadhE) foi usado para substituir o cassete catsacB em TG200 com a sequência cromossômica desejada por outro evento duplo de recombinação homóloga com seleção de sacarose para perda de sacB. A cepa resultante foi designada TG201 (KJ079 com o FRT removido da região AadhE).
Os sítios de FRT nas regiões AldhA e A(focA-pflB) foram removidos de uma forma análoga àquela usada para eliminar o sítio de a44 d/?E:: FRT. Os conjuntos de iniciadores adicionais (IdhAAJC e IO/dhAup/down) usados para remover o sítio de FRT em AldhA estão incluídos na Tabela 1, juntos com os plasmídeos correspondentes (pLOI4430 e pLOI4432). Uma cepa TG202 foi produzida por substituição dessa região em TG201 com o produto de PCR de pLOI4151 (iniciadores WM/dhAA/C). O cassete cat-sacB em TG202 foi substituído com o produto de PCR de pLOI4432 (iniciadores IdhAAJC) com seleção de sacarose quanto à perda de sacB para produzir TG203.
Os conjuntos de iniciadores (upfocAIMidpflA e IO-ycaOup/IOmidpf/Adown) e plasmídeos correspondentes (pLOI4415 e pLOI4421) usados para remover o sítio de FRT em A(focA-pflB) estão incluídos na Tabela 1. Uma cepa TG204 foi produzida por substituição dessa região em TG203 com o produto de PCR de pLOI4151 (iniciadores \NMpflBAJC). O cassete cat-sacB em TG204 foi substituído com o produto de PCR de pLOI4421 (iniciadores upfocA/MidpflA) com seleção de sacarose quanto à perda de sacB para produzir KJ091. KJ091 é um derivado de KJ073 no qual todos os sítios de FRT foram removidos das regiões AadhE, Δ/dhA e AfocA-pflB do cromossomo.
Construção de dLOI4162 contendo um cassete cat-sacB para eliminações de genes sem marcador
Para facilitar a eliminação sequencial de DNA cromossômico, o plasmídeo pLOI4162 (Figura 1) foi construído com um cassete cat-sacB removível e com a opção de incluir um segmento de 18 pb de DNA sintético com códons de parada em todos os quadros de leitura. Esse plasmídeo é composto por sequências sintéticas e partes dos plasmídeos pLOI2228 (Martinez-Morales e outros, 1999), pLOI2511 (Underwood e outros, 2002) e pEL04 (Lee e outros, 2001; Thomason e outros, 2005). Usando pEL04 como modelo, a PCR de dentro para fora foi realizada com os iniciadores JMpEL04F1/R1 para eliminar sítios Sma\ e BamH\ indesejados entre os genes de cate sacB. O produto amplificado foi digerido com BglW (dentro de ambos os iniciadores) e autoligado para produzir pLOI4152. O plasmídeo pLOI4131 foi construído por ligação do fragmento FRT-caf-FRT (Ban\ tratado com Kle45 now, C/al) de pLOI2228 em sítios compatíveis de pLOI2511 (Nhe\ tratado com Klenow, C/al). O plasmídeo pLOI4131 foi subsequentemente digerido com EcoRl e autoligado para remover o fragmento FRT-caf-FRT para produzir pLOI4145, retendo sítios únicos de Kasl e Xmal. Um segmento poliligante (SfPBXPS) foi preparado por anelamento de oligonucleotídeos complementares (SfPBXPSsense e SfPBXPScomp). Após digestão com Kasl e Xmal, esse segmento foi ligado em sítios correspondentes de pLOI4145 para produzir pLOI4153. O cassete cat-sacB modificado em pLOI4152 foi amplificado por PCR usando o conjunto de iniciadores JMcafsacSup3/down3. Após digestão com fiamHI e Xhol, esse cassete foi ligado em sítios correspondentes de pLOI4153 para produzir pLOI4146. Para criar uma região de 18 pb (5’GCCTAATTAATTAATCCC3’) (ID. DE SEQ. N°: 1) com códons de parada em todos os seis quadros de leitura, pLOI4146 foi digerido com Pacl e autoligado para produzir pLOI4154 (não mostrado), removendo o cassete catsacB. Duas bases adicionais (T e A) foram inseridas entre os sítios Sfol e Pacl de pLOI4154 com a utilização de iniciadores mutagênicos (JM4161senso/comp) e amplificação de plasmídeo linear para produzir pLOI4161. Finalmente, o fragmento digerido com Pacl de pLOI4146 que contém o cassete cat-sacB foi ligado no sítio de pLOI4161 digerido com Pacl para produzir pLOI4162 (N° de Acesso no GenBank EU531506).
Construção de eliminações de genes em tdcDE, e aspC
O gene de tdcDE e as regiões vizinhas de 1.000 pb (tdcG’tdcFED-tdcC’, 5.325 pb) foram amplificados com o uso de iniciadores tdcDEup/down e clonados no vetor pCR2.1-TOPO para produzir o plasmídeo pLOI4515. Uma preparação diluída 1.000 vezes desse DNA de plasmídeo serviu como modelo para amplificação de dentro para fora com o uso dos iniciadores tdcDEF7/R7 (ambos os iniciadores dentro do gene de tdcDE e voltados para fora). O fragmento de 6.861 pb resultante contendo o réplicon foi ligado ao cassete cat-sacB amplificado, digerido com Smal/S/bl, de pLOI4162 (iniciadores JMca/sacfiup3/down3) para produzir pLOI4516. Esse fragmento de 6.861 pb também foi usado para construir um segundo plasmídeo, pLOI4517 (tratado por quinase, autoligação), contendo uma eliminação de tcdD e tdcE. Os fragmentos de PCR amplificados de pLOI4516 e pLOI4517 (iniciadores fdcDEup/down) foram usados para substituir a região tdcDE em KJ091. Os clones resultantes foram testados quanto à perda de resistência à ampicilina e ao cloranfenicol e designados KJ098.
O gene de aspC foi eliminado de KJ104 de uma forma análoga àquela usada para eliminar o gene de tdcDE. Conjuntos de iniciadores adicionais (aspCup/down e aspC1/2) usados para construir a eliminação de aspC estão incluídos na Tabela 1, juntos com os plasmídeos correspondentes (pLOI4280, pLOI4281 e pLOI4282). A cepa resultante foi designada KJ110. Nem KJ098 nem KJ110 contêm qualquer sequência interveniente dentro das respectivas regiões eliminadas (tdcDE e aspC).
Remoção do sítio de FRT na região ackA e construção de eliminações de genes de citF, sfcA, e pta-ackA
Para eliminar o sítio de FRT na região ackA de KJ073, foram construídos plasmídeos contendo sequências da mutação desejada da seguinte forma. O DNA genômico de E. coli C foi usado como o modelo para amplificação por PCR de ackA com os iniciadores JMac/fAF1/R1 que se ligam aproximadamente 200 pb acima e abaixo do gene de ackA. O produto linear foi clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) para produzir pLOI4158. O plasmídeo pLOI4158 foi então usado como modelo para a PCR de dentro para fora com iniciadores JMackAup1/down1 e Pfu polimerase para gerar um produto de extremidade romba desprovido de um segmento interno de 808 pb de ackA. O cassete cat-sacB flanqueado por Pac\ (fragmento SmaVSfo\ de pLOI4162) foi então ligado no produto de PCR rombo para produzir pLOI4159. O plasmídeo pLOI4159 serviu como modelo para a amplificação por PCR (iniciadores JMackAF1/R1). Esse produto de PCR foi usado para substituir o sítio de FRT na região ackA de KJ073 por recombinação homóloga por cruzamento duplo, com seleção quanto à resistência ao cloranfenicol. O clone resultante foi designado KJ076.
O plasmídeo pLOI4159 também foi digerido com Pac\ para remover o cassete cat-sacB e autoligado para produzir pl_OI4160, retendo a sequência de parada de tradução 18 pb. O plasmídeo pl_OI4160 serviu como um modelo de PCR (iniciadores JMac/o4F1/R1). Esse fragmento amplificado foi usado para substituir o cassete cat-sacB em KJ076 por recombinação homóloga por cruzamento duplo com seleção quanto à perda de sacB. Após remoção de pKD46 por crescimento em temperatura elevada, a cepa resultante foi designada KJ079. Nessa cepa, a região eliminada foi substituída pela sequência de parada de tradução de 18 pb.
A estratégia usada acima para remover o sítio de FRT da região ackA foi empregada para fazer eliminações sequenciais de citF, sfcA e ptaackA e para substituir as regiões eliminadas com a sequência de parada de tradução de 18 pb. Os conjuntos de iniciadores adicionais (c/YFup/down e C/YF2/3) usados para construir as eliminação de citF estão incluídos na Tabela 1, juntos com os plasmídeos correspondentes (pl_OI4629, pLOI4630 e pLOI4631). A cepa resultante foi designada KJ104.
O gene de sfcA foi eliminado de cepas KJ104 e KJ110, resultando em cepas designadas KJ119 e KJ122, respectivamente. Os conjuntos de iniciadores adicionais (sfcAup/down e sfcA1/2) usados para construir as eliminações de sfcA estão incluídos na Tabela 1, juntos com os plasmídeos correspondentes (pLOI4283, pLOI4284 e pLOI4285).
O óperon ackA-pta (incluindo a sequência de parada de tradução sintética) foi eliminado de KJ122 para produzir a cepa KJ134. Os conjuntos de iniciadores adicionais (ackAup/p/adown e ackA2/pta2) usados para construir essa eliminação estão incluídos na Tabela 1, juntos com os plasmídeos correspondentes (pLOI4710, pLOI4711 e pl_OI4712). Uma cepa KJ134 não contém nenhum sítio de FRT ou genes estranhos.
Fermentações
Culturas e fermentações de sementes foram incubadas a 37°C (100 rpm) em meio de sais minerais AM1 (Martinez e outros, 2007) contendo glicose 10% (p/v) (555 mM), 100 mM de KHCO3 e 1 mM de HCI de betaína. Uma mistura de 3 M de K2CO3 e 6 N de KOH foi adicionada para manter o pH e fornecer CO2. As diferenças na composição de base (misturas de 1:1, 4:1, 6:1) tiveram pouco efeito sobre a fermentação. As fermentações foram realizadas em pequenos vasos com um volume de trabalho de 350 ml. As fermentações foram inoculadas em uma OD550 inicial de 0,01 (3,3 mg CDW Γ1), a menos que indicado de forma diferente. Os vasos de fermentação forma lacrados, exceto para uma agulha de 16 gauge que serviu como uma válvula e uma entrada para remoção de amostras. A anaerobiose foi rapidamente obtida durante o crescimento. Bicarbonato adicionado serviu para assegurar uma atmosfera de CO2.
Análises
A massa celular foi estimada a partir da densidade óptica a 550 nm (OD 1,0 = 333 mg de peso seco de células Γ1) com a utilização de um espectrofotômetro da Bausch & Lomb Spectronic 70. Os ácidos orgânicos e os açúcares forma determinados com o uso de cromatografia líquida de alto desempenho (Grabar e outros, 2006).
Resultados e discussão
Construção de cepas sem marcador para a produção de succinato
Os genes centrais para a fermentação anaeróbica em E. coli C do tipo selvagem foram eliminados sequencialmente pela estratégia de Datsenko e Wanner (2000) com produtos de PCR e marcadores de antibióticos removíveis (pela utilização de sítios de reconhecimento de FRT e FLP recombinase). Essas construções, em combinação com evolução metabólica (seleção baseada no crescimento quanto à eficiência aumentada de produção de ATP), foram usadas para a seleção de uma cepa mutante que recrutasse a fosfoenilpiruvato carboxiquinase conservadora de energia (pck) para aumentar o crescimento e a produção de succinato (Figura 9). A cepa resultante, KJ073, produziu 1,2 mol de succinato por mol de glicose metabolizada (Jantama e outros, 2008) e agora usa uma via de succinato bem análoga à bactéria de ruminantes Actinobacillus succinogenes (van der Werf e outros, 1997) e Mannheimia succiniciproducens (Song e outros, 2007). No entanto, os métodos usados para a construção dessas eliminações de genes deixam uma cicatriz genética única de 82 a 85 nt ou sítio de FRT na região de cada gene eliminado (ackA, IdhA, adhE, ackA, focA-pflB). Esses sítios de FRT serviram como sítios de reconhecimento para FLP recombinase (Storici e outros, 1999) durante a remoção dos genes de antibiótico. Todas essas se49 quências estranhas foram sequencialmente removidas de KJ073 e substituídas com DNA nativo somente com a eliminação de genes desejada com o uso de métodos que foram descritos previamente (Grabar e outros, 2006; Zhang e outros, 2007; Jantama e outros, 2008). A cepa resultante, KJ091, contém eliminações específicas em ackA, IdhA, adhE, focA-pflB, ackA, mgsA e poxB e é desprovida de todos os sítios de FRT. Essa cepa é desprovida de todo o DNA estranho e sintético, exceto quanto a uma sequência de parada de tradução de 18 pb dentro de ackA. A produção de succinato pela cepa KJ091 era equivalente àquela de KJ073 (Tabela 7). Essa cepa foi usada como parente para aumentos adicionais na produção de succinato.
Redução de acetato durante a produção de succinato por eliminação de tdcD e tdcE
Durante a fermentação anaeróbica de glicose por E. coli, piruvato formato-liase (pflB) serve como a fonte primária de acetil~CoA, o precursor de acetil~P, e acetato quinase (ackA) serve como a via primária para a produção de acetato a partir de acetil~P (Karp e outros, 2007; Kessler e Knappe, 1996). A abundância de acetato como um produto de fermentação em cepas KJ073 e KJ091 foi surpreendente, na medida em que essas cepas contêm eliminações tanto em ackA quanto em pflB (Figura 9). Esse acetato residual ao final da fermentação representa uma oportunidade potencial para redirecionar ainda mais o metabolismo para um rendimento de succinato aumentado.
Uma enzima relacionada à atividade de acetato quinase (e proprionato quinase) é codificada por tdcD, mas é tipicamente produzida somente para a degradação de treonina (Hesslinger e outros, 1998; Reed e outros, 2003). É possível que mutações que ocorrem durante a seleção possuem expressão aumentada de tdcD, como ilustrado na Figura 10. Durante o crescimento anaeróbico com glicose 10% (p/v), a expressão de tdcD poderia substituir funcionalmente ackA, aumentando a produção de acetato a partir de acetil~P. O gene de tdcE adjacente no mesmo óperon é similar ao de pflB e codifica uma atividade de piruvato (e α-cetobutirato) formatoliase que é coexpressa durante a degradação de treonina (Hesslinger e outros, 1998).
É possível que a expressão aumentada desse gene durante o crescimento anaeróbico com glicose 10% (p/v) poderia aumentar a produção de acetil~CoA, o precursor imediato de acetil~P, e o resíduo redutor como formato (Figura 10). Tanto tdcD quanto tdcE (adjacente) foram eliminados simultaneamente de KJ091 para produzir KJ098. A eliminação desses dois genes reduziu a produção de acetato à metade e aumentou o rendimento de succinato em 10% em KJ098, em comparação com KJ091, estabelecendo a importância dessa via inesperada afastando do fluxo de carbono do succinato. Surpreendentemente, a produção de malato por KJ091 também foi eliminada em consequência das novas eliminações em KJ098. O nível de piruvato produzido por KJ098 também declinou em 40%, um intermediário que supostamente aumentaria com a eliminação de duas vias alternativas para o metabolismo de piruvato, atividade de piruvato formato-liase (tdcD) e atividade de acetato quinase (tdcE). Os mecanismos responsáveis pela eliminação de malato (um contaminante problemático durante a purificação de succinato), pela redução de piruvato e pelo aumento de succinato que resultaram da eliminação simultânea de tdcD e tdcE são desconhecidos.
Efeito da eliminação de citrato liase (citDEF) sobre o rendimento de acetato durante a produção de succinato
Embora KJ098 represente um aperfeiçoamento significativo em relação a KJ091, pode ser possível uma redução adicional nos níveis de acetato e aumentos adicionais dos rendimentos de succinato. Sob condições anaeróbicas, o oxaloacetato é dividido entre o produto reduzido (malato) e o intermediário oxidado (citrato) (Figura 9). O citrato pode ser convertido de volta em oxaloacetato e acetato pela citrato liase (citDEF) para reciclar o pool de OAA intracelular para outras funções metabólicas (Nilekani e outros, 1983). A expressão de quantidades significativas de citrato liase está associada ao crescimento do citrato (Lutgens e Gottschalk, 1980; Kulla e Gottschalk, 1977). A citrato liase é um complexo multienzimas constituído por três cadeias polipeptídicas diferentes. A subunidade α ou grande é uma citratoACP transferase que catalisa a primeira etapa. A subunidade β ou média é uma citril-ACP liase que catalisa a segunda etapa. A subunidade γ ou pe51 quena atua como uma proteína veículo de acila e também transporta os componentes do grupo prostético. Todas as três subunidades são necessárias para que a reação ocorra (Quentmeier e outros, 1987). A eliminação de genes que codificam uma ou mais dessas subunidades eliminaria a atividade de citrato liase e pode reduzir ainda mais o nível de acetato durante a produção de succinato. O gene de citF foi eliminado de KJ098 para produzir KJ104. Essa eliminação, no entanto, não teve efeito sobre a produção de acetato ou sobre o rendimento de outro succinato (Tabela 7). Na medida em que a eliminação de citF não causou nenhuma redução no acetato, presume-se que esse intermediário surja de outras vias. Por razões desconhecidas, a eliminação de citF afetou de forma adversa o crescimento de KJ104 (rendimento celular reduzido em 22%) e aumentou o nível de piruvato ao final da fermentação em quase 50%, em comparação com KJ098. No entanto, o rendimento de succinato, titulação, produtividade média e níveis de acetato com KJ104 eram comparáveis àqueles com KJ098 (Tabela 7).
Efeito de eliminações de aspC e sfcA sobre o rendimento de succinato
A aspartato aminotransferase (aspC) é uma enzima multifuncional que catalisa a síntese de aspartato, fenilalanina e outros compostos por transaminação. Na reação, L-aspartato é sintetizado a partir de oxaloacetato, um intermediário da carboxilação de PEP, por uma reação de transaminação com L-glutamato. Aspartato é um constituinte de proteínas e participa em várias outras vias biossintéticas. Estima-se que cerca de 27 por cento do nitrogênio celular fluam através de aspartato (Reitzer, 2004). A biossíntese de aspartato e a produção de succinato compartilham um pool intracelular comum de oxaloacetato. A eliminação de aspC poderia levar à produção aumentada de succinato, mas também pode criar necessidades auxotróficas que impedem o crescimento anaeróbico em meio de sais mínimo como, por exemplo, AM1.
Esse gene de aspartato aminotransferase (aspC) foi eliminado de KJ104 para produzir KJ110. Inesperadamente, a eliminação de aspC não teve nenhum efeito sobre o rendimento de succinato ou o rendimento celular em KJ110, quando comparado com KJ104 (Tabela 7). Dessa forma, a aspar52 tase parece não desviar níveis significativos de oxaloacetato da produção de succinato em nossa cepa. Parece haver enzimas alternativas que substituem as necessidades biossintéticas anteriormente catalisadas pela aspartato aminotransferase.
Quantidades significativas de piruvato estão presentes ao final da fermentação com KJ104 e outras cepas de E. coli criadas geneticamente para a produção de succinato (Tabela 7). Esse piruvato representa um produto indesejado e uma oportunidade adicional para aumentar o rendimento de succinato. Esse nível elevado de piruvato no caldo de fermentação poderia resultar da descarboxilação de malato em piruvato por enzima málica (sfcA), como ilustrado na Figura 10. Acredita-se que essa enzima funcione primariamente durante a gliconeogênese (Unden e Kleefeld, 2004; Stols e Donnelly, 1997; Oh e outros, 2002), e não durante o catabolismo anaeróbico da glicose. Embora a carboxilação redutiva de piruvato para formar malato seja favorecida termodinamicamente, os parâmetros cinéticos dessa enzima favorecem a desidrogenação e descarboxilação sob condições fisiológicas (Stols e Donnelly, 1997). A superexpressão dessa enzima para carboxilar piruvato foi usada previamente como a base para a construção de cepas para a produção de succinato de E. coli (Stols e Donnelly 1997).
Caso a enzima málica (sfcA) seja carboxilante em KJ104 (e cepas relacionadas) e contribua para a produção de succinato, seria de se esperar que a eliminação desse gene reduzisse os rendimentos de succinato e aumentasse os níveis de outros produtos como, por exemplo, piruvato. Alternativamente, caso a enzima málica (scfA) seja descarboxilante em KJ104 e desviando malato em piruvato, seria de se esperar que a eliminação do gene que codifica essa enzima aumentasse os rendimentos de succinato e diminuísse os níveis de piruvato. Inesperadamente, a eliminação do gene de sfcA de KJ104 para produzir KJ119 não teve efeitos mensuráveis sobre a produção de succinato, crescimento, níveis de piruvato etc (Tabela 7), em comparação com KJ104. Esses resultados demonstraram claramente que a enzima málica (sfcA) não é importante para a produção de succinato em KJ104 e em cepas relacionadas. Esse resultado está em claro contraste com as cepas produtoras de succinato desenvolvidas por Stols e outros (1997), nas quais a produção aumentada de enzima málica foi usada como a via primária para a produção de succinato.
Embora não tenham sido observados benefícios significativos pela eliminação de sfcA ou pela eliminação de aspC em KJ104, foram feitos estudos para testar o efeito da eliminação de ambos os genes em combinação. Isso foi feito por eliminação do gene de sfcA em KJ110 para produzir KJ122, e não seria esperado nenhum benefício. No entanto, a eliminação combinada tanto de sfcA quanto de aspC (cepa KJ122) resultou em um aumento inesperado do rendimento e da titulação de succinato, com uma pequena redução de acetato (Tabela 7), em comparação com a cepa KJ110 parente e cepas relacionadas (KJ104 e KJ119). A eliminação combinada (aspC e sfcA) em KJ122 resultou em aumentos significativos do rendimento de succinato, da titulação de succinato e uma produtividade média de 18%, 24% e 24%, respectivamente, quando comparado com KJ104. Embora o mecanismo seja desconhecido, é possível que mutações únicas fossem ineficazes porque fossem compensadas, em parte, por um fluxo aumentado através da atividade restante, enzima málica ou aspartato aminotransferase (Figura 10), neutralizando qualquer benefício potencial. O aumento do rendimento e da titulação de succinato supostamente resulta de um aumento da disponibilidade de oxaloacetato, o que permite que uma fração maior evolua até succinato. Os níveis de malato também permaneceram extremamente baixos.
A cepa KJ122 (Tabela 7) produziu 1,5 mol de succinato por mol de glicose, 88% do rendimento teórico máximo (1,71 mol por mol de glicose). Para produzir esse nível elevado de succinato e reduzir totalmente malato, era necessário um agente redutor adicional. Embora a fonte desse redutor adicional seja desconhecida, esses resultados são consistentes com um aumento do fluxo de piruvato através da piruvato desidrogenase. Acredita-se que essa enzima funcione primariamente durante o metabolismo aeróbico (Guest e outros, 1989), mas também há relatos de que funcione em níveis baixos durante a fermentação (de Graef e outros, 1999).
Redução em piruvato e acetato por eliminação de pta
KJ122 produziu excelentes rendimentos de succinato (1,5 mol mol'1 de glicose) mais quantidades menores de acetato e piruvato. O rendimento teórico máximo para succinato é de 1,71 mol mol'1 de glicose e esses intermediários de 3 carbonos representam uma oportunidade para aumentar ainda mais o rendimento. Presume-se que o piruvato se acumule por glicólise como um excesso metabólico e possa estar relacionado ao acúmulo de acetato. Acetil~CoA é um regulador alostérico de muitas enzimas. A fonte de acetato e da atividade de acetato quinase é desconhecida, na medida em que os genes que codificam as duas atividades primárias para acetato quinase (tdcD e ackA) foram eliminadas (Figura 9 e Figura 10). Presumindo-se que o acetato seja produzido a partir de acetil~P, o produto de fosfotransacetilase, foi construída uma eliminação adicional em KJ122 para inativar o gene de pta. A cepa resultante, KJ134, produziu um nível de succinato próximo ao teórico (Tabela 7). Nessa cepa, os níveis de piruvato e acetato foram substancialmente reduzidos. A produtividade volumétrica também foi reduzida em 17%. Os rendimentos de succinato com a cepa KJ134 são iguais ou melhores do que todas as outras cepas, independentemente da complexidade dos processos de fermentação, dos meios ou das condições de crescimento.
Tabela 1. Comparação da produção de succinato por biocatalisadores microbianosa Referência Este trabalho Este trabalho i ; Este trabalho i Guettler e outros, 1996a Vemuri e outros, 2002ab Meynial- Salles e outros, 2007 Guettler e outros, 1996b
Rendimento de succinato (mol/mol) v- 1,20 cõ 1,25 i_ ί 1,68 1,35 1,37
Titulação de succinato (mM)b 733 [0,90] 668 [0,82] 622 [0,61] co 00 co σ> oo ΣΖ i i 841 [1,31] 703 [0,55] ío co 0 co
Meio/Condição 100 g/l de glicose AM1 com 10 g/l de NaHCO3, fermentação em batelada simples, incubação de 120 horas, pH mantido com mistura 1:1 de 6 M de KOH + 3 M de K2CO3 100 g/l de glicose AM1 com 10 g/l de NaHCO3, fermentação em batelada simples, I incubação de 96 horas, pH mantido com mistura 1:1 de 6 M de KOH + 3 M de K2CO3 100 g/l de glicose AM1 com 10 g/l de NaHCO3, fermentação em batelada simples, incubação de 120 horas, pH mantido com mistura 1:1 de 6 M de KOH + 3 M de K2CO3 130 g/l de glicose suplementado com 15 g/l de CSL e 5 g/l de YE, 80 g/l de MgCO3, fermentação anaeróbica em batelada, incubação de 78 horas 40 g/l de glicose (90 g de glicose total) em meio suplementado com 20 g/l de tríptona, 10 g/l de YE e 40 g/l de MgCO3, fermentação em batelada alimentada em fase dupla, incubação de 76 horas 120 g/l de glicose em meio baseado em peptona/YE, eletrodiálise integrada membra- na-biorreator- com pulverização de CO2, incubação de 150 horas 100 g/l de glicose suplementado com 15 g/l de CSL e YE, 80 g/l de MgCO3, fermentação anaeróbica em batelada, pulverização de CO2, incubação de 39 horas
Organismo E. coli KJ060 (IdhA adhE ackA focA pflB) E. coli KJ073 (IdhA adhE ackA focA pflB mgsA poxB) E. coli KJ060 (IdhA adhE ackA focA pflB) inóculo elevado (200 mg de CDW Γ1) Actinobacillus succinogenes FZ53 E. coli AFP111 (pflAB, IdhA, ptsG) Rhizobium etlipyc superexpressa Anaerobiospirillum succiniciprodu- cens ATCC 53488 Actinobacillus succinogenes 130Z
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Tabela 1. Comparação da produção de succinato por biocatalisadores microbianos
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anaeróbicas. A biomassa foi gerada predominantemente durante o crescimento aeróbico. O succinato foi produzido primariamente durante incubação anaeróbica com C02, H2 ou uma mistura de ambos.
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Tabela 3. Fermentação de glicose em meio de sais minerais por cepas mutantes de £ coli Produtos de fermentação (mM)θ For 262 ± 19 1 CO ▼— 1 10 T“ 199
Lac 98 ± 24 1 1 V CM V $ 8
Ace 152 ± 30 26±1 226 T“ CO CO CM 179 δ
u. Q_ 33 ± 10 1 1 1 1 1 1
Mal O) 1 1 1 1 1 1 1
O ω 49±3 6 ±0,4 0 108 CO CO CM 204 288
:> CD ? 3 I Q. E S 0,12 ± 0,01 -H S 5 0 0 0,02 0,09 0,072 0,128 0,251 0,354
Rendimento de succinatoc § 0,12 0,13 90Ό 0,50 0,09 CO ▼“ 0 0,48 0,49
mol/mol 0,19 ± 0,02 0,20 ± 0,01 0 0 0,70 0,13 0,28 0,73 0,74
- ? & Έ 2,0 ±0,2 0,3 ±0,1 10 10 CO 0 K O CO cm
Meios, Glic (p/v) NBS 5% NBS 5% I NBS 5% + MOPS LB5% NBS 5% NBS 5% NBS 5% NBS10%
Condições de cultura OD550OJ, 0,1 mM de betaína OD550 0,1,0,1 mM de betaína OD550 0,1, 0,1 mM de betaína frasco agitadoh OD550 0,1, caldo de Luria 1*TF: sem betaína, ODsso 0,1, transferências de 120 horas 3’ TF: 2 mM de betaína, ODsso 0,1, transferências de 96 horas 40* TF: 1 mM de betaína, ODsso 0,1, transferências de 24 horas, 3 M de K2CO3+6NdeKOH 40a TF: 1 mM de betaína, OD550 0,1, transferências de 24 horas, 3 M de K2CO3+6NdeKOH
a o E. coli C do tipo selvagemf *CM δ 2 KJ012 KJ012 ís c £ ! 1 1
Tabela 3. Fermentação de glicose em meio de sais minerais por cepas mutantes de E coli Produtos de fermentação (mM)e For 1 1 1 1 1
Lac 1 7 CM V 1 1
Ace 4 170 δ 102 £ 8
□l 1 O) σ> CM V
Mal 331 318 219 626 £ T“
Suc 212 596 579 294 341 539
:> 3 5 I Q- E -2 0,260 0,736 0,711 0,361 0,419 0
Rendimento de suca'natoc 0,97 0,71 0,69 I I I 0,70 0,47 0,64
mol/mol r- 0 1,04 1,06 0,71 0,97
? S S 3 o Μ; 0 CO
Meios, Glic (p/v) NBS 5% NBS 10% NBS 10% NBS 5% NBS 10% NBS 10%
Condições de cultura 2^ TF: 1 mM de betaína, OD550 0,1, transferências de 48 horas, 20 mM de NaOAc, 3 M de K2CO3+6 NdeKOH 15a TF: 1 mM de betaína, ODssoO.OI, transferências de 24 horas, 5 mM de NaOAc, 3 M de K2CO3 + 6NdeKOH 5a TF: 1 mM de betaína, ODkoO.OI, transferências de 24 horas, sem NaOAc, 3 M de K2CO3+ 6 NdeKOH 1a TF: 1 mM de betaína, OD550 0,01, TF de 24 horas, 3 M de K2CO3+ 6 N de KOH, 50a TF: 1 mM de betaína, ODssoO.OI, transferências de 24 horas, 3 M de «2003+6 N de KOH 2^ TF: 1 mM de betaína, ODkoO.OI, transferências de 24 horas, 3 M de K2CO3+6 N de KOH
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$ CM 172 183 ±27 250 ±36 180 ±13 64 ±9
1 J!d | 103 55 ±22 1 58 ±15
(0 38 313 118 ±13 39 ±17 17 ±5 516 ±14
Suc 596 669 668 ±8 733 ±39 622 ±8 280 ±7
_: ω . <0 £ E > 0,733 0,858 0,82 ±0,01 0,90 i θ'04 0,77 ±0,04 0,33 ±0,04
Rendimento de succinato0 00 00 o 0,83 r- SO +* 0,92 ±0,05 1,05 ±0,09 0,53 ±0,01
mol/mol 1,34 1,26 1,20 ±0,09 1,41 ±0,07 1,61 ±0,12 0,78 ±0,02
Rend. celb(g/l) cm. V- iq T“ 2,3 ±0,1 2,2 ±0,1 I 2,2 ±0,1 1.5 ±0,0
Meios, G1ic(p/V) AM1 10% AM1 10% AM1 10% AM1 10% AM1 10% NBS 10%
Condições de cultura -8 o 13 O 2 S co Ω . o g 8 5 1 O “ a> •S -8 _ ffl Π c σ c c to É|§ δ> £ £ 45a TF: 1 mM de betaina, ODsoO.OI, 1 transferências de 24 horas, 3 M de KaCOa+eNdeKOH 1 mM de betaina, 3 M de K2CO3 + 6 N de KOH ODsso 0,01 inóculo 1 mM de betaina, 3 M de K2CO3 + 6 N de KOH ODsso 0,01 inóculo 1 mM de betaina, 3 M de K2CO3 + 6 N de KOH OD550 0,60 inóculo 1 mM de betaina, 3 M de K2CO3 + 6 N de KOH OD550 0,01 inóculo
8. 0) o KJ072 (IdhA, ackA, adhE, focA pflB, mgsA,poxB) (KJ073) £ 0 2 1 1 P3 0 2
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Média de 3 ou mais fermentações com desvios-padrão.
Traço indica ausência de produto.
Frasco aeróbico agitado (100 rpm; 100 ml de NBS, frasco de 250 ml).
οι -C
Tabela 4. Comparação de atividades de enzima de carboxilação em diferentes cepas Atividade específica [nmol min'1 (mg de proteína)'1] Actinobacillus succinogenes3 o 4.700 Desconhecida Desconhecida
<s CN 5 o o ui O T“ 140 Desconhecida Desconhecida
E. coli KJ073 27 ±2 7341 ± 462 12±3 V
1- δ —> X. — q o ui 17 ± 1 700 ± 68 12±4 V
CN δ —> õ o ui 25 ±2 162 ± 11 5±2 V
E. coliC 20 ±2 295 ± 23 Λ Ω Z V
Enzima PEP carboxilase PEP carboxiquinase Enzima málica (NADH, carboxilação) Enzima málica (NAD- PH, carboxilação)
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Tabela 5. Composição dos meios (excluindo fonte de carbono).
Componente Concentração (mmol Γ1)
a NBS + 1 mM de betaína AM1 1 mM de betaína
KH2PO4 25,72 0
K2HPO4 28,71 0
(NH4)2HPO4 26,50 19,92
NH4H2PO4 0 7,56
PO4 Total 80,93 27,48
N Total 53,01 47,39
b K Total 84,13 1,00
MgSO4 7 H2O 1,00 1,50
CaCI22 H2O 0,10 0
HCI de tiamina 0,015 0
KCI de Betaína 1,00 1,00
(pmol r1)c
FeCI36 H2O 5,92 8,88
C0CI2 6 H2O 0,84 1,26
CuCI2 2 H2O 0,59 0,88
ZnCI2 1,47 2,20
Na2MoO4 2 H2O 0,83 1,24
H3BO3 0,81 1,21
MnCI2 4 H2O2 0 2,50
Sais totais 12,5 gL1 4,1 g L·’
a NBS + 1 mM de betaína: meios NBS media com adição de betaína (1 mM). b O cálculo inclui KOH usado para neutralizar o estoque de HCI de betaína. c Estoque de metal residual (1.000 X) foi preparado em 120 mM de HCI.
Tabela 6. Cepas de Escheríchia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
Cepas de Escheríchia coli
Características relevantes Fontes
KJ073 Δ/d/iA-.FRT ÁadhE/.FRT A(focApff6):.FRT AacfcA:FRT Amg- sA ΔροχΒ Jantama e outros, 2008
KJ076 KJ073, AackA::cat-sacB, sequência de parada de tradução Aqui revelada
KJ079 KJ073, AackA.sequência de parada de tradução Aqui revelada
TG200 KJ079, AadhE::cat-sacB Aqui revelada
TG201 TG200, AadhE Aqui revelada
TG202 TG201, ÁldhA::cat-sacB Aqui revelada
TG203 TG202, AldhA Aqui revelada
TG204 TG203, Δ (focA-pflB)::cat-sacB Aqui revelada
KJ091 TG204, A(focA-pflB) Aqui revelada
KJ098 KJ091, AtdcDE Aqui revelada
KJ104 KJ098, AcitF Aqui revelada
KJ110 KJ104, AaspC Aqui revelada
KJ119 KJ104, AsfcA Aqui revelada
KJ122 KJ110, AsfcA Aqui revelada
KJ134 KJ122, AackA-pta Aqui revelada
Plasmídeos
pKD46 Bla γ β exo (red recombinase), replicon temperatura- condicional Datsenko, 2000
pEL04 Cassete cat-sacB Lee, 2001 Thomason, 2005
pLOI2228 Cat, cassete FRT-caí-FRT Martinez-Morales e outros, 1999
PLOI2511 bla kan; cassete FRT-kan-FRT Underwood e outros, 2002
Tabela 6. Cepas de Escherichia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
PLOI4131 bla; ligação de pLOI2228 (cassete FRT-caf-FRT digerido com Bani, tratado com Klenow, digerido com C/al) e pLOI2511 (digerido com Nhe\, tratado com Klenow, digerido com C/al) Aqui revelada
PLOI4145 bla; EcoRl digerido pLOI4131, autoligação Aqui revelada
PLOI4146 bla cat; ligação de cassete cat-sacB amplificado por PCR (usando os iniciadores JMcatsacBup3/down3) de pLOI4152, digerido com BamHUXhol e pLOI4153digerido com Ba- mHUXhol Aqui revelada
PLOI4151 bla cat; cassete cat-sacB Jantama e outros, 2008
PLOI4152 Cassete cat-sacB; cassete amplificado por PCR por pEL04 (usando os iniciadores JMpEL04F1/R1), digestão por Sg/ll e autoligação Aqui revelada
pLOI4153 Bla; ligação de pLOI4145 (digerido com KaslIXmal) e polivin- culador SfPBXPS digerido com KaslIXmal (anelamento de oligonucleotídeos complementares SfPBXPSsen- so/SfPBXPScomp) Aqui revelada
PLOI4154 pLOI4146 digerido com Pacl, autoligação Aqui revelada
PLOI4161 bla cat; cassete cat-sacB Aqui revelada
PLOI4162 bla cat; ligação de cassete cat-sacB (digerido com Pacl) de PLOI4146 e pLOI4161 digerido com Pacl Aqui revelada
pCR2.1- TOPO bla kan; vetor de clonagem TOPO TA Invitrogen
pLOI4158 bla kan; ackA (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores JMackA-F1/R1) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
pLOI4159 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clonado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de PLOI4158 (usando JMackAup1/down1) Aqui revelada
PLOI4160 Digestão de pLOI4159 com Pacl, e depois autoligado Aqui revelada
pLOI4515 bla kan; tdcG’-tdcFED-tdcC' (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores fdcDE-up/down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
Tabela 6. Cepas de Escherichia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
pLOI4516 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clo- nado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4515 (usando os iniciadores tdcDE-F7IR7) Aqui revelada
PLOI4517 Fragmento do produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI415 (usando os iniciadores fcfcDE-F7/R7), tratado com quinase e depois autoligado Aqui revelada
PLOI4629 bla kan; citF (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores citF- up2/down2) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4630 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clonado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4629 (usando os iniciadores citF-213) Aqui revelada
PLOI4631 Digestão com Pacl de pLOI4630, e depois autoligado Aqui revelada
pLOI4280 bla kan; aspC (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores aspC-up/down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4281 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clonado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de PLOI4280 (usando os iniciadores aspC-1/2) Aqui revelada
pLOI4282 Fragmento do produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4280 (usando os iniciadores aspC-1/2), tratado com quinase e depois autoligado Aqui revelada
pLOI4283 bla kan; sfcA (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores sfcA- up/down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4284 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clonado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4283 (usando os iniciadores sfcA-1/2) Aqui revelada
PLOI4285 Digestão com Pacl de pLOI4284 e depois autoligado Aqui revelada
PLOI4710 bla kan; ackA-pta (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores ack/t-up/pfa-down) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
pLOI4711 Cassete cat-sacB digerido com Smal/Sfol de pLOI4162 clonado no produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4710 (usando os iniciadores ackA-2/pta-2) Aqui revelada
Tabela 6. Cepas de Escheríchia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
PLOI4712 Pacl digestão de pLOI4711, e depois autoligado Aqui revelada
PLOI4413 bla kan; ychE’-adhE-ychG’ (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores up/down-adhE) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4419 Fragmento do produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4413 (usando os iniciadores IO-adhE-up/down), tratado com quinase e depois autoligado Aqui revelada
PLOI4415 bla kan; ycaO'-focA-pfíB-pflA’ (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores up-focA/Mid-pflA) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4421 Fragmento do produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4415 (usando os iniciadores IO-ycaO-up/IO- midp/7S-down), tratado com quinase e depois autoligado Aqui revelada
PLOI4430 bla kan; hslJ’-ldhA-ydbH’ (PCR) de E. coli C (usando os iniciadores IdhA-A/C) clonado no vetor pCR2.1-TOPO Aqui revelada
PLOI4432 Fragmento do produto de PCR amplificado de dentro para fora de pLOI4424 (usando os iniciadores IO-/dM-up/down), tratado com quinase e depois autoligado Aqui revelada
Conjuntos de iniciadores
JM4161 senso/comp 5’ACCGCATCAGGCGCCTAATTAATTAATCCCGG3’ (ID. DE SEQ. N°: 30) 5’CCGGGATTAATTAATTAGGCGCCTGATGCGGT3’ (ID. DE SEQ. N°: 31) Aqui revelada
JM- pEL04F1/R1 5’CAGCAGATCTAAGTAAATCGCGCGGGTTTG3’ (ID. DE SEQ. N°: 32) 5’CAGCAGATCTAGCGGCTATTTAACGACCCT3’ (ID. DE SEQ. N°: 33) Aqui revelada
JMac/cA- F1/R1 5’GCCTGAAGGCCTAAGTAGTA3’ (ID. DE SEQ. N°: 34) 5OCACGATAGTCGTAGTCTGA3’ (ID. DE SEQ. N°: 35) Aqui revelada
JmackA up1/down1 5OTTGAGCGCTTCGCTGTGAG3’ (ID. DE SEQ. N°: 36) 5OCCGCAATGGTTCGTGAACT3’ (ID. DE SEQ. N°: 37) Aqui revelada
Tabela 6. Cepas de Escherichia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
JmcatsacB up3/down3 5OTCACCTCGAGTGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (ID. DE SEQ. N°: 38) 5’GTGCAGGATCCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 39) Aqui revelada
SfPBXPS senso/comp 5’ATGTAGGCGCCATTAATTAATGGATCCACTATCTCGAG ATTAATTAATCCCGGGACTAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 40) 5’ATAGTCCCGGGATTAATTAATCTCGAGATAGTGGATCC ATTAATTAATGGCGCCTACAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 41) Aqui revelada
WMadhE A/C 5’ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTAG AGCGTCGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 42) 5’TTAAGCGGAI I III ICGCI I I I I ICTCAGCTTTAGCCGGA GCAGCACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 43) Aqui revelada
WM/dM A/C 5’ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGA AGTACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 44) 5’TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGA TTGCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 45) Aqui revelada
WMpflB A/C 5’TTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTACGGGCC TATAACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 46) 5’TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGC TGCTGTTCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 47) Aqui revelada
tdcDE- up/down 5’CGCCGACAGAGTAATAGGTT3’ (ID. DE SEQ. N°: 48) 5’TGATGAGCTACCTGGTATGG3’ (ID. DE SEQ. N°: 49) Aqui revelada
tdcDE-F7/R7 5’CGATGCGGTGGCCAATTAAG3’ (ID. DE SEQ. N°: 50) 5’GACGACGTGCTGGATTACGA3’ (ID. DE SEQ. N°: 51) Aqui revelada
citF- up2/down2 5’GGGTATTCAGGCGTTCGATA3’ (ID. DE SEQ. N°: 52) 5OCCCGAGAGGATGACTATGT3’ (ID. DE SEQ. N°: 53) Aqui revelada
citF-2/3 5’GGTGATCGATGTTGTGCATC3’ (ID. DE SEQ. N°: 54) 5’CCCGTTCTTGTCGTTGAGAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 55) Aqui revelada
\O-adhE- up/down 5’GCTGCTCCGGCTAAAGCTGA3’ (ID. DE SEQ. N°: 56) 5’ACGCTCTACGAGTGCGTTAA3’ (ID. DE SEQ. N°: 57) Aqui revelada
Tabela 6. Cepas de Escherichia coli, plasmídeos e iniciadores aqui utilizados
up-focA/Mid- pflB 5’AGATCGCCAGCCGCTGCAAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 58) 5’AACCGTTGGTGTCCAGACAG3’ (ID. DE SEQ. N°: 59) Aqui revelada
\O-ycaO- up/IO- midpflS-down 5’GCCTACATTGCGTAGGCTAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 60) 5’GCAGCAGGACGTTATTACTC3’ (ID. DE SEQ. N°: 61) Aqui revelada
IdhA-fiJC 5’ATGAAACTCGCCGTTTATAG3’ (ID. DE SEQ. N°: 62) 5’TTAAACCAGTTCGTTGCCC3’ (ID. DE SEQ. N°: 63) Aqui revelada
\O-ldhA- up/down 5’CGTTCGATCCGTATCCAAGT3’ (ID. DE SEQ. N°: 64) 5’AGGCTGGAACTCGGACTACT3’ (ID. DE SEQ. N°: 65) Aqui revelada
aspC- up/down 5’TCCATCGCTTACACCAAATC3’ (ID. DE SEQ. N°: 66) 5’TGGGGGATGACGTGATATTT3’ (ID. DE SEQ. N°: 67) Aqui revelada
aspC-1/2 5’AGATAACATGGCTCCGCTGT3’ (ID. DE SEQ. N°: 68) 5 AGGAGCGGCGGTAATGTTC3' (ID. DE SEQ. N°: 69) Aqui revelada
sfcA-up/down 5’CTATGCTTGATCGGCAACCT3’ (ID. DE SEQ. N°: 70) 5’ACGATCGCCTGGTTTTAATG3’ (ID. DE SEQ. N°: 71) Aqui revelada
sfcA-VZ 5'TACCGCCGTACCTCCATCTA3’ (ID. DE SEQ. N°: 72) 5’CGTAAGGGATATAAAGCGAACG3’ (ID. DE SEQ. N°: 73) Aqui revelada
ackA-upipta- down 5’CGGGACAACGTTCAAAACAT3’ (ID. DE SEQ. N°: 74) 5’ATTGCCCATCTTCTTGTTGG3’ (ID. DE SEQ. N°: 75) Aqui revelada
ackA-2lpta-2 5’AACTACCGCAGTTCAGAACCA3’ (ID. DE SEQ. N°: 76) 5’TCTGAACACCGGTAACACCA3’ (ID. DE SEQ. N°: 77) Aqui revelada
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Tabela 7. Fermentação de glicose em meio de sais minerais AM1 por cepas mutantes de E. coli
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Ο produtos totais, os subprodutos representaram 11%.
Referências
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<223> Conjunto de iniciadores para pck (rt-pcr) <400> 27 gtcgacaacg aacagacgt 19 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para birA (RT-PCR) <400> 28 atcgtgatgg cggaagt 17 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para birA (rt-pcr) <400> 29 cttgcgatcc tgcagatag 19 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para JM4161 sense/comp <400> 30 accgcatcag gcgcctaatt aattaatccc gg 32 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para 3M4161 sense/comp <400> 31 ccgggattaa ttaattaggc gcctgatgcg gt 32 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para 3MpEL04Fl/Rl <400> 32 cagcagatct aagtaaatcg cgcgggtttg 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para JMpEL04Fl/Rl <400> 33 cagcagatct agcggctatt taacgaccct 30 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para JMackA-Fl/Rl <400> 34 gcctgaaggc ctaagtagta 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para JMackA-Fl/Rl <400> 35 gcacgatagt cgtagtctga <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> conjunto de iniciadores para <400> 36 gttgagcgct tcgctgtgag <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para <400> 37 gccgcaatgg ttcgtgaact <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para <400> 38 ctcacctcga gtgtgacgga agatcacttc g <210> 39 <211> 34 <212> DNA
IMackA upl/downl
JMackA upl/downl
JMcatsacB up3/down3 <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para JmcatsacB up3/down3 <400> 39 gtgcaggatc catcaaaggg aaaactgtcc atat <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para sfPBXPS sense/comp <400> 40 atgtaggcgc cattaattaa tggatccact atctcgagat taattaatcc cgggactat <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para SfPBXPS sense/comp <400> 41 atagtcccgg gattaattaa tctcgagata gtggatccat taattaatgg cgcctacat <210> 42 <211> 65 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para WMadhE A/C <400> 42 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtcggca cgtaagaggt tccaa <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para WMadhE A/C
5 <400> 43
ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcagcacact gcttccggta 60
gtcaa 65
<210> 44
<211> 64
10 <212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Conjunto de iniciadores para WMldhA A/C
<400> 44
15 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacggcac gtaagaggtt 60
ccaa 64
<210> 45
<211> 65
<212> DNA
20 <213> Sequência Artificial
<220>
<223> conjunto de iniciadores para WMldhA A/c
<400> 45
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgctacact gcttccggta 60
25 gtcaa 65
<210> 46
<211> 65
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
30 <22O>
<223> Conjunto de iniciadores para WMpflB A/C
<400> 46 ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataacggca cgtaagaggt tccaa <210> 47 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para WMpflB a/C <400> 47 ttacatagat tgagtgaagg tacgagtaat aacgtcctgc tgctgttcta cactgcttcc ggtagtcaa <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para tdcDE-up/down <400> 48 cgccgacaga gtaataggtt <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores para tdcDE-up/down <400> 49 tgatgagcta cctggtatgg <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
para tdcDE-F7/R7 <223> Conjunto de iniciadores <400> 50 cgatgcggtg gccaattaag <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> conjunto de iniciadores <400> 51 gacgacgtgc tggattacga <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 52 gggtattcag gcgttcgata <210> 53 <211> 20 <212> DNA para tdcDE-F7/R7 para citF-up2/down2 <213> Sequência Artificial <220>
<223> conjunto de iniciadores para citF-up2/down2 <400> 53 gcccgagagg atgactatgt <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
100 para citF-2/3 <223> Conjunto de iniciadores <400> 54 ggtgatcgat gttgtgcatc <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 55 cccgttcttg tcgttgagat <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> conjunto de iniciadores <400> 56 gctgctccgg ctaaagctga <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 57 acgctctacg agtgcgttaa <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial para citF-2/3 para 10-adhE-up/down para io-adhE-up/down <22O>
101 <22 3> Conjunto de iniciadores para up-focA/Mid-pflB <400> 58 agatcgccag ccgctgcaat 20 <210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Conjunto de iniciadores para up-focA/Mid-pflB
<400> 59
aaccgttggt gtccagacag 20 <210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Conjunto de iniciadores para io-ycaO-up/lo-midpflB-down
<400> 60
gcctacattg cgtaggctat 20 <210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Conjunto de iniciadores para iO-ycaO-up/IO-midpflB-down
<400> 61
gcagcaggac gttattactc 20 <210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
102 para IdhA-A/C <223> Conjunto de iniciadores <400> 62 atgaaactcg ccgtttatag <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 63 ttaaaccagt tcgttgccc <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> conjunto de iniciadores <400> 64 cgttcgatcc gtatccaagt <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 65 aggctggaac tcggactact <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial para IdhA-A/C para 10/ldhA-up/down para io-ldhA-up/down <220>
103 para aspC-up/down <223> Conjunto de iniciadores <400> 66 tccatcgctt acaccaaatc <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 67 tgggggatga cgtgatattt <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 68 agataacatg gctccgctgt <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 69 aggagcggcg gtaatgttc <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial para aspc-up/down para aspc-1/2 para aspc-1/2 <22O>
104 para sfcA-up/down <223> Conjunto de iniciadores <400> 70 ctatgcttga tcggcaacct <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 71 acgatcgcct ggttttaatg <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 72 taccgccgta cctccatcta <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> sequência Artificial <22O>
<223> Conjunto de iniciadores <400> 73 cgtaagggat ataaagcgaa cg <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial para sfcA-up/down para sfcA-1/2 para sfcA-1/2 <220>
105
<223> conjunto de iniciadores para ackA-up/pta-down
<400> 74
cgggacaacg ttcaaaacat
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> conjunto de iniciadores para ackA-up/pta-down
<400> 75
attgcccatc ttcttgttgg 20
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<220>
<223> Conjunto de iniciadores para ackA-2/pta-2
<400> 76 aactaccgca gttcagaacc a 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Sequência Artificial
<22O>
<223> Conjunto de iniciadores para ackA-2/pta-2
<400> 77
tctgaacacc ggtaacacca

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES
1/20
1. Célula de Escherichia coli geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende modificações genéticas nos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) citrato liase, h) aspartato aminotransferase, i) transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferase, k) enzima málica, e I) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido alvo, em que as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática compreende deleção dos genes ou porções destes, mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, inserção de códons de parada ou combinações das mesmas.
2/20
Glicose
XJ XJ jB|npn o)U9uii3S3J3
2. Célula de E. coli geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida célula de E. coli geneticamente modificada não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo ou contém apenas genes nativos.
3/20
Η Ο, CO
3. Célula de E. coli geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta a condição de:
i) a referida célula de E. coli geneticamente modificada não tenha tido uma ou mais das seguintes enzimas inativadas: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase; d) succinato desidrogenase; e) transportador de glicose; f) repressor de isocitrato liase; e/ou ii) a referida célula de E. coli geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam genes para malato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase e/ou citrato sintase.
4. Célula de E. coli geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida célula de E. coli geneticamente modificada produz succinato ou malato em concentrações de pelo menos 200 mM.
5. Célula de E. co//geneticamente modificada, caracterizada pelo
14/08/2018, pág. 4/10 fato de que a referida célula geneticamente modificada é B-50116.
6. Método de cultivo ou crescimento de uma célula de E. coli geneticamente modificada, caracterizado pelo fato de que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais células de E. coli genetica5 mente modificadas como definidas na reivindicação 1 e o cultivo ou crescimento da referida célula geneticamente modificada.
7. Método de produção de succinato ou malato, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma ou mais células de E. coli geneticamente modificadas como definidas na reivindicação 1 sob condições
10 que permitam a produção de succinato ou malato.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais células de E. co//geneticamente modificadas são B-50116.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a
15 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula de E. coli geneticamente modificada é cultivada em um meio de sais minerais.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) de carboidrato.
20
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o meio de sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%,
12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar.
25 12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose, celobiose, hemicelulose ou combinações destes.
13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo
30 fato de que o rendimento de succinato ou malato é maior ou igual a 90%.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%,
Petição 870180070735, de 14/08/2018, pág. 5/10
92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%.
15. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula de E. co//geneticamente modificada produz con5 centrações de succinato de pelo menos 200 mM.
16. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula de E. coli geneticamente modificada produz concentrações de malato de pelo menos 200 mM.
17. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado 10 pelo fato de que o meio de crescimento compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato ou malato.
18. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato ou malato.
15 19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais células de E. coli geneticamente modificadas, como definidas na reivindicação 1, e um meio.
Petição 870180070735, de 14/08/2018, pág. 6/10
4/20 K2C5 ο
co co
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