BRPI0809400A2 - Materiais e métodos para a produção eficiente de succinato e malato - Google Patents

Materiais e métodos para a produção eficiente de succinato e malato Download PDF

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Xueli Zhang
Jonathan C Moore
Keelnatham T Shanmugam
Lonnie O'neal Ingram
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CEPA BACTERIANA geneticamente modificada, métodos DE cultivo OU CRESCIMENTO DA REFERIDA CEPA E DE PRODUÇÃO DE SUCCINATO, FUMARATO OU MALATO, E COMPOSIÇÃO CONTENDO A REFERIDA CEPA".
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N0 de Série 60/895.806, depositado em 20 de março 2007, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras, tabelas e seqüências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos.
Apoio Governamental
Esta invenção foi feita com apoio governamental sob um financiamento concedido pelo "Departamento de Energia" sob a subvenção número USDOE-DE FG02-96ER20222 e do "Departamento de Energia" em conjunto com o "Departamento de Agricultura dos Estados Unidos" sob a sub15 venção número USDA & DOE Biomass RDI DE FG36-04G014019. O Governo possui certos direitos na invenção.
Fundamentos da Invenção
A presente invenção refere-se a produção fermentativa de succinato a partir de matérias-primas renováveis que irá se tomar cada vez mais competiti20 va à medida que os preços do petróleo aumentam. O succinato pode servir como substrato para transformação em plásticos, solventes e outras substâncias químicas atualmente feitas a partir do petróleo (Lee e outros, 2004; Lee e outros, 2005; McKinIay e outros, 2007; Wendisch e outros, 2006; Zeikus e outros, 1999). Foram descritas muitas bactérias com a habilidade natural para produzir succina25 to como um produto de fermentação importante (Patente U.S. N0 5.723.322; Tabela 1). No entanto, frequentemente são necessários processos complexos, meios complexos e longos períodos de incubação.
Uma variedade de abordagens genéticas foram usadas previamente para projetar cepas de Escherichia coli para a produção de succinato com graus variáveis de sucesso (Tabela 1). Na maioria dos estudos, as titulações alcançadas eram baixas e eram necessários ingredientes de meio complexos, tais como extrato de levedura ou água de maceração de milho. Uma cepa NZN111 produziu 108 mM de succinato com um rendimento molar de 0,98 mol de succinato por mol de glicose metabolizada (Chatterjee e outros, 2001; Millard e outros, 1996; Stols e Donnelly, 1997). Essa cepa foi desenvolvida geneticamente por inativação de dois genes (pflB que codifica 5 piruvato-formateliase e IdhA que codifica Iactato desidrogenase) e que superexpressam dois genes de E. coli, malato desidrogenase (mdh) e fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), de plasmídeos multicópias. Uma cepa HL27659k foi desenvolvida geneticamente por mutação de succinato desidrogenase (sdhAB), fosfato acetiItransferase ipta), acetato quinase (ackA), 10 piruvato oxidase (poxfí), transportador de glicose (jptsG) e o repressor de isocitrato Iiase (icIR). Essa cepa produzia menos de 100 mM de succinato e necessitava de condições de fermentação limitada por oxigênio (Cox e outros, 2006; Lin e outros, 2005a, 2005b, 2005 c; Yun e outros, 2005). A Análise do metabolismo in silico foi usada para projetar nocautes gênicos para 15 criar uma via em E. coli que é análoga à via nativa de succinato em Mannheimia succiniciproducens (Lee e outros, 2005 e 2006). Uma cepa resultante, no entanto, produziu muito pouco succinato. Andersson e outros (2007) relataram os níveis mais elevados de produção de succinato por uma E. coli desenvolvida geneticamente (339 mM) que contém apenas genes nativos.
Outros pesquisadores buscaram abordagens alternativas que
expressam genes heterólogos em E. coli. O piruvato carboxilase de Rhizobium eteloti (pyc) foi superexpressa por um plasmídeo multicópias para dirigir
o fluxo de carbono para o succinato (Gokarn e outros, 2000; Vemuri e outros, 2002 a, 2002 b). Uma cepa SBS550 MG foi construída por inativação 25 do repressor de isocitrato Iiase (icIR), adhE, IdhA, e ackA, e superexpressão do citZ de (citrato sintase) Bacillus subtilis e pyc de R. etli por um plasmídeo multicópias (Sanchez e outros, 2005a). Com essa cepa, foram produzidos 160 mM de succinato a partir de glicose com um rendimento molar de 1,6.
Também foram investigados processos mais complexos para a produção de succinato (Tabela 1). Muitos desses processos incluem uma fase de crescimento aeróbico, seguida por uma fase de produção anaeróbica. A fase anaeróbica é frequentemente abastecida com dióxido de carbono, hidrogênio, ou ambos (Andersson e outros, 2007; Sanchez e outros, 2005a e 2005b; Sanchez e outros, 2006; Patente U.S. 5.869.301; Vemuri e outros, 2002a e 2002b). Em um estudo recente com um produtor de succinato nativo, A. succiniciproducens, eletrodiálise, pulverização com CO2, reciclagem 5 celular e alimentação em batelada foram combinados (Meynial-Salles e outros, 2007).
A presente invenção fornece várias formas de micro-organismos, tais como eepas de E. coli, que produzem succinato em altas titulações e rendimentos em meios de sais minerais durante fermentações em batelada 10 simples, controladas por pH, sem a necessidade de genes ou plasmídeos heterólogos. Durante o desenvolvimento, foi caracterizada uma cepa intermediária que produziu malato como o produto dominante.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção fornece novos micro-organismos úteis na produção de ácido lático, por exemplo, Escherichia coli. Consequentemente, os materiais e métodos da presente invenção podem ser usados para a produção de succinato e malato para uso em diversas aplicações.
Em certas modalidades, derivados de Eseheriehia coli (também denominada nesta especificação E. coli) podem ser usados para a constru20 ção de cepas que produzem succinato, malato e alanina. Em várias modalidades, E. coli C (por exemplo, ATCC 8739) pode ser usada, assim como qualquer outra cepa de E. coli que possa ser obtida de vários depositórios ou de fontes comerciais. Os micróbios desenvolvidos geneticamente da invenção, em algumas modalidades, também contêm somente genes nativos (ou 25 seja, não contêm material genético de outros organismos). Vantagens adicionais desta invenção ficarão facilmente evidentes a partir da descrição que será apresentada a seguir.
Breve Descrição das Figuras
Figuras 1A-1B. Fermentação de glicose em succinato. A Figura 1A mostra a via-padrão para a fermentação de glicose por E. coli. Essa via foi redesenhada a partir de Unden e Kleefeld (2004). As setas em negrito representam vias fermentativas centrais. Cruzes representam as eliminações de genes realizadas neste estudo para o projeto de KJ012 (IdhA, adhE, ackA). Genes e enzimas: IdhA, Iactato desidrogenase; pflB, piruvato-formato liase; focA, transportador de formato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato quinase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formato desidrogenase; icd, isocitrato desidrogenase; acs, acetil~CoA sintetase; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; aldA, aldeído desidrogenase; e aldB, aldeído desidrogenase. A Figura 1B mostra o acoplamento da produção de ATP e crescimento em produção de succinato e malato em cepas desenvolvidas geneticamente de E. coli. As setas sólidas conectam os pools de NADH. As setas pontilhadas conectam os pools de NAD+. Durantes a glicólise sob condições anaeróbicas, o crescimento está obrigatoriamente acoplado à produção de ATP e à oxidação de NADH.
Figuras 2A-2D. Vias potenciais de carboxilação para a produção de succinato por E. coli. Genes que codificam enzimas de carboxilação cruciais são mostrados em negrito. A Figura 2A mostra a PEP carboxilase. Nenhum ATP é produzido por fosfoenolpiruvato (PEP). Essa é considerada a 20 via primária para a produção de succinato por E. coli durante a fermentação da glicose.
A Figura 2B mostra a enzima málica (NADH). A energia é conservada durante a produção de ATP a partir de ADP e PEP por piruvato quinase {pykA ou pykF). A enzima málica (sfcA) catalisa uma carboxilação re25 dutiva, ligada à NADH, para a produção de malato. A Figura 2C mostra a enzima málica (NADPH). A energia é conservada durante a produção de ATP a partir de ADP e PEP por piruvato quinase (pykA ou pykF). A enzima málica (maeB) catalisa uma carboxilação redutiva, ligada à NADPH, para a produção de malato. A Figura 2D mostra a PEP carboxiquinase. A energia é 30 conservada pela produção de ATP durante a carboxilação de PEP para a produção de ácido oxalacético.
Figuras 3A-3C. Crescimento durante a evolução metabólica de KJ012 para a produção de KJ017, KJ032 e KJ060. Uma cepa KJ012 foi transferida seqüencialmente em meio NBS contendo glicose 5% (p/v) (Figura 3A) e 10% (p/v) (Figura 3B), respectivamente, para a produção de KJ017. Após a eliminação de focA e pflB, a cepa resultante (KJ032) foi inicialmente 5 subcultivada em meio suplementado com acetato (Figura 3C). Os níveis de acetato foram diminuídos e subsequentemente eliminados durante transferências adicionais para a produção de KJ060. A linha quebrada representa a fermentação por KJ017, sem acetato, adicionado para comparação. Símbolos: densidade óptica a OD550nm, ··
Figuras 4A-4F. Sumário dos produtos de fermentação durante a
evolução metabólica de cepas para a produção de succinato e malato. As culturas foram suplementadas com acetato de sódio, como indicado. Setas pretas representam a transição entre as condições de fermentação, como indicado pelo texto. Nenhum formato e apenas pequenas quantidades de 15 Iactato foram detectadas durante a evolução metabólica de KJ032. Nenhum formato e Iactato foram detectados durante a evolução metabólica de KJ070 e KJ072. A Figura 4A (glicose 5% p/v) e Figura 4B (glicose 10% p/v), KJ012 a KJ017; Figura 4C (glicose 5% p/v) e a Figura 4D (glicose 10% p/v), KJ032 a KJ060; Figura 4E. glicose 10%, KJ070 a KJ071; Figura 4F. glicose 10%, 20 KJ072 a KJ073. Símbolos para todos: ■, succinato; □, formato; Δ, acetato; ▲ , malato; ^,Iactato; e ▼, piruvato.
Figura 5. Diagrama que sumarize as etapas na engenharia genética e evolução metabólica de E. coli C como um biocatalisador para a produção de succinato e malato. Esse processo representa 261 transferên25 cias seriais que fornecem mais de 2.000 gerações de seleção baseada no crescimento. Foram isolados clones da cultura final de cada regime e designações atribuídas à cepa, mostradas entre parênteses na Tabela 3.
Figura 6. Fermentação de glicose e vias associadas. Metabolismo central que indica genes eliminados em construções criadas geneticamente para a produção de succinato. As setas sólidas representam vias fermentativas centrais. A seta pontilhada representa a via microaerofílica para a oxidação de piruvato em acetato (poxB). As setas pontilhadas mostram vias que normalmente funcionam durante o metabolismo aeróbico, piruvato desidrogenase (pdh) e o bypass de glioxilato (aceAB). As cruzes nas caixas representam as três eliminações de genes iniciais (IdhA, adhE, ackA) que foram usadas para construir KJ012 e KJ017. As cruzes simples marcam genes
5 de adição que foram eliminados durante a construção de derivados de KJ017: KJ032 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB), e KJ070 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA) e KJ072 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA, poxB). Genes e enzimas: IdhA, Iactato desidrogenase; focA, transportador de formato; pflB, piruvato-formato liase; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato qui10 nase; adhE, álcool desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, formato desidrogenase; mgsA, metilglioxal sintase; gloAB, glioxilase I e II; poxB, piruvato oxidase; aceA, isocitrato liase; aceB, malato sin15 tase; acnAB, aconitase; e acs, acetil~CoA sintetase.
Figuras 7A-7C. Produção de succinato e malato em meios de sais minerais (glicose 10%) por derivados de E. coli C. A Figura 7A mostra a produção de succinato por KJ060 em meio AM1. A Figura 7B mostra a produção de succinato por KJ073 em meio AM1. A Figura 7C mostra a produ20 ção de malato por KJ071 em meio NBS. As fermentações foram inoculadas em um nível de 33 mg de DCW I1. Símbolos para todos: o, glicose; ·, succinato; ■, malato; Δ, massa da célula.
Figura 8. Construção de pLOI4162. As setas sólidas curtas associadas a pEL04 e pLOI4152 representam iniciadores usados para amplificação de DNA.
Figura 9. Via de produção de succinato em KJ073. O gene pck que codifica fosfoenolpiruvato carboxiquinase, a enzima de carboxilação primária envolvida na produção de succinato neste estudo, é mostrada no tipo reverso. As setas sólidas indicam reações que supostamente são fun30 cionais durante a fermentação anaeróbica de glicose. As cruzes sólidas indicam genes eliminados. As cruzes em caixas representam eliminações cruciais usadas para construir a cepa inicial para a produção de succinato, KJ017 (IdhA, adhE, ackA). A linha pontilhada representa a oxidação de piruvato em acetato por PoxB, um processo que é tipicamente funcional apenas sob condições microaerofílicas. As linhas pontilhadas indicam reações que estão primariamente associadas ao metabolismo aeróbico. Genes e enzimas: I5 dhA, Iactato desidrogenase; pflB, piruvato-formato liase; focA, transportador de formato; pta, fosfato acetiltransferase; ackA, acetato quinase; adhE, álco
ol desidrogenase; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilase; pdh, complexo de piruvato desidrogenase; gltA, citrato sintase; mdh, malato desidrogenase; fumA, fumB, e fumC, isozimas de fumarase; frdABCD, fumarato redutase; fdh, for10 mato desidrogenase; icd, isocitrato desidrogenase; acs, acetibCoA sintetase; mgsA, metilglioxal sintase; poxB, piruvato oxidase; aldA, aldeído desidrogenase; e aldB, aldeído desidrogenase. O gene tdcE (piruvato formatoliase, homóloga ao pflB) e o gene tcdD (propionato quinase, homóloga ao ackA) são mostrados entre parênteses e são tipicamente expressos durante 15 a degradação de treonina.
Figura 10. Porção expandida do metabolismo que ilustra as vias de genes adicionais que foram eliminados (cruzes sólidas). Succinato e acetato são os produtos principais (em caixas) das fermentações de KJ073. Genes e enzimas: citDEF, citrato liase; gltA, citrato sintase; aspC, aspartato a20 minotransferase; pck, fosfoenolpiruvato carboxiquinase; sfcA, enzima málica ligada a NAD+; fumA & fumB, fumarase; frdABCD, fumarato redutase; pykA
& pykF, piruvato quinase; tdcE, piruvato formato-liase (homóloga de pflB)\ pta, fosfato transacetilase; tcdD, acetato quinase (homóloga de ackA). Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção fornece materiais e métodos em que com
binações únicas e vantajosas de mutações gênicas são usadas para dirigir o fluxo de carbono a um produto desejado como, por exemplo, succinato e/ou malato. As técnicas da presente invenção podem ser usadas para se obter produtos por vias nativas, bem como por vias recombinantes. Vantajosamen30 te, a presente invenção fornece uma plataforma versátil para a produção desses produtos apenas com sais minerais e açúcar como nutrientes.
Um micro-organismo da presente invenção pode ser obtido por modificação de um ou mais genes-alvo em uma bactéria, tais como aquelas que pertencem à Escherichia. Em algumas modalidades, a bactéria que é modificada por ser Escherichia coli, ou uma cepa desta em particular, por exemplo, E. coli B, E. coli C, E. coli W, ou similares. Em algumas outras mo5 dalidades da invenção, as bactérias que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem, sem limitação, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, 10 Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydroearboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevi15 bacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbi20 cola, En/vinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium sherma25 nii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarci30 na ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyees eoelieolor, Streptomyees flavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, Streptomyees virídoehromogenes, Aeromonas salmonieida, Bacillus pumilus, Bacillus eireulans, Bacillus thiaminoly5 tieus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri, e assim por diante.
Em certas modalidades, a presente invenção fornece cepas bacterianas (por exemplo, E. coli) desprovidas de plasmídeos, genes de resis10 tência a antibiótico e/ou material de outros organismos que são adequados à produção de succinato ou malato. Diferentemente de outros sistemas microbianos, os micro-organismos da presente invenção podem ser empregados em um processo de produção de uma única etapa com a utilização de açúcares como substratos, possuem altas taxas de produção de produto, altos 15 rendimentos, necessidades nutricionais simples (por exemplo, meio de sais minerais) e um metabolismo robusto que permite a bioconversão de hexoses, pentoses e muitos dissacarídeos.
Dessa forma, os micro-organismos produzidos de acordo com a presente descrição podem ter um ou mais genes-alvo inativados por vários mé20 todos conhecidos na técnica. Por exemplo, os genes-alvo podem ser inativados pela introdução de inserções, eliminações ou mutações aleatórias no genealvo. Dessa forma, certos aspectos da invenção permitem a inserção de pelo menos um códon de parada (por exemplo, um a dez ou mais códons de parada) no gene-alvo. Alguns aspectos da invenção permitem a inserção ou elimi25 nação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais bases a fim de introduzir uma mutação de alteração da fase de leitura Ç'frameshift') em um gene-alvo. Outros aspectos da invenção permitem a inserção ou eliminação de 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10,
11,13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29 ou mais bases a fim de introduzir uma mutação de alteração da fase de leitura em um gene-alvo. Ainda outras modalidades do presente pedido permitem a introdução de uma ou mais mutações pontuais (por exemplo, 1 a 30 ou mais) dentro de um gene-alvo, enquanto outros aspectos da invenção permitem a eliminação parcial, total ou completa de um gene-alvo dos micro-organismos da invenção. Em cada um desses aspectos da invenção, vias metabólicas são inativadas pela inativação da atividade enzimática do polipeptídeo codificado pelos gene(s)-alvo.
O termo "gene(s)-alvo", como aqui usado, refere-se ao gene que
codifica acetato quinase, álcool desidrogenase, aspartato aminotransferase, citrato liase, transportador de formato, Iactato desidrogenase, metilglioxal sintase, piruvato-formato liase, piruvato oxidase, fosfato acetiltransferase, enzima málica e/ou propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase. Em cer10 tas modalidades preferidas, os genes são ackA (acetato quinase), adhE (álcool desidrogenase), aspC (aspartato aminotransferase), citCDEF (citrato liase), focA (transportador de formato), IdhA (lactato desidrogenase), mgsA (metilglioxal sintase), pflB (piruvato-formato liase), poxB (piruvato oxidase), pta (fosfato acetiltransferase), sfcA (enzima málica) e/ou tdcDE (propionato 15 quinase/a-cetobutirato formatoliase). Dessa forma, em certos aspectos da invenção, um ou mais desses genes são inativados em um micro-organismo (qualquer cepa bacteriana que contenha tais genes, por exemplo, E. coli). O processo de seleção para cepas com crescimento e produção de succinato ou malato aprimorados é denominado "evolução metabólica" (cujos exem20 pios são fornecidos dentro dos exemplos apresentados). Deve-se entender que um "gene nativo de E. coli' ou "genes nativos de E. coli' são um gene, ou genes, que são encontrados naturalmente em um micro-organismo E. coli, ao contrário de um "gene heterólogo" que é introduzido em uma E. coli e que foi obtido de qualquer outro micro-organismo diferente de E. coli.
Várias modalidades não-limitantes da presente invenção inclu
em:
1. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende modificações genéticas em um ou mais dos seguintes genes-alvo: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piru30 vato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase e/ou g) citrato liase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo; 2. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agro5 bacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumeseens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydroearboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globo10 sum, Brevibacterium fuseum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, 15 Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobaeterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningoseptieum, Mierococeus sp. CCM 825, Morganel20 Ia morganii, Noeardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus 25 erythropolis, Rhodoeoeeus rhodoehrous, Rhodoeoeeus sp. ATCC 15592, Rhodoeoeeus sp. ATCC 19070, Sporosareina ureae, Staphylocoeeus aureus, Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyees eoelieolor, Streptomyees flavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyees lividans, Strep30 tomyees olivaeeus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, Streptomyces viridoehromogenes, Aeromonas salmonieida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmoriella typhimurium, Salmonella schottmulleri, ou Xanthomonas citri]
3. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1 ou 2, em que a referida cepa bacteriana modificada é E. coli B;
4. A cepa bacteriana geneticamente modificada das modalidades 1, 2 ou 3, em que os seguintes genes-alvo são inativados: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e e) piruvato oxidase;
5. A cepa bacteriana geneticamente modificada da modalidade
4, em que a referida cepa bacteriana ainda compreende um gene inativado de metilglioxal sintase;
6. A cepa bacteriana geneticamente modificada das modalidades 4 ou 5, em que a referida cepa bacteriana ainda compreende um gene
inativado de citrato liase;
7. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4 ou 5, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
8. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com
as modalidades 1,2,3, 4, 5, 6 ou 7, em que os genes, ou porções destes,
são eliminados;
9. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, em que os genes são inativados com mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, pela inserção
de códons de parada ou combinações das mesmas;
10. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é uma cepa de E. coli e não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo (ou contém apenas genes nativos de E.
coli)]
11. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, desde que: 1) a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não tenha tido um ou mais dos seguintes genes inativados: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase (sucAB); d) succinato desidrogenase (por exemplo, sdhAB), fosfato acetiltransferase (por exemplo, pta); e) transportador de gli5 cose (por exemplo, ptsG); f) repressor de isocitrato liase (por exemplo, icIR)] e/ou 2) aquela referida cepa geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam genes como, por exemplo, malato desidrogenase (mdh) e fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc) e/ou citrato sintase (por exem
pio, Bacillus subtilis citZ)\
12. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com as modalidades 1 a 11, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 ou KJ073;
13. Um método de cultivo ou crescimento de uma cepa bacteria
na geneticamente modificada que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou
12 e o cultivo ou crescimento da referida cepa bacteriana geneticamente
modificada;
14. Um método de produção de succinato ou malato que compreende o cultivo de uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 sob condições que permitem a produção de succinato ou malato;
15. O método de acordo com a modalidade 14, em que as refe
ridas uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas são KJ012, KJ034, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 ou KJ073;
16. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 13,
14 ou 15 em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é cul
tivada em um meio de sais minerais;
17. O método de acordo com modalidade 16, em que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) carboidrato; 18. O método de acordo com a modalidade 17, em que o meio de sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%,
18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar;
19. O método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose, celobiose, hemicelulose ou várias combinações destes;
20. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 em que o succinato ou malato é produzido em concentrações de pelo
menos 0,20 M, 0,25 M, 0,30 M, 0,35 M, 0,40 M, 0,45 M, 0,50 M, 0,55 M, 0,60 M, 0,65 M ou 0,70 M;
21. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18,
19 ou 20 em que o meio de cultura é meio de sais minerais NBS ou meio
AM 1 (vide a Tabela 4);
22. O método de acordo com as modalidades 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20 ou 21 em que o rendimento de succinato ou malato é de pelo menos ou maior do que (ou maior ou igual do que) 90%;
23. O método de acordo com modalidade 22, em que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91 %, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%,
94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%;
24. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações
13 a 16 ou 20 a 23, em que o meio de crescimento compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato.
25. O método de acordo com as reivindicações 17 a 19, em que
o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato; ou
26. Uma composição que compreende uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 ou 12 e meio.
As seguintes modalidades adicionais também são fornecidas pelo presente pedido de patente: 1. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende modificações genéticas aos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) citrato liase,
5 h) aspartato aminotransferase, i) transportador de formato, j) fosfato acetiltransferase, k) enzima málica e I) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo;
2. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada
é Escherichia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Aehromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacteríum tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffíneus, Arthro15 bacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibac20 terium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamieum, Corynebaeterium eallunae, Corynebaeterium aeetoaeidophilum, Corynebaeterium aeetoglutamieum, Enterobaeter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia earotovora, Erwinia herbieola, Erwinia ehrysanthemi, Flavobae25 terium peregrinum, Flavobacterium fueatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningoseptieum, Mierococeus sp. CCM 825, MorganelIa morganii, Noeardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseu30 domonas azotoformans, Pseudomonas fluoreseens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeidovolans, Pseudomonas mueidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodoeoeeus erythropolis, Rhodoeoeeus rhodoehrous, Rhodoeoeeus sp. ATCC 15592, Rhodoeoeeus sp. ATCC 19070, Sporosareina ureae, Staphyloeoeeus aureus, Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyees eoelieolor, S5 treptomyees flavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyees lividans, Streptomyees olivaeeus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, Streptomyees virídoehromogenes, Aeromonas salmonieida, Bacillus pumilus, Bacillus eireulans, Bacillus thiaminolytieus, Escherichia freundii, Microbacte
rium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri ou Xanthomonas citri;
3. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 2, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli,
4. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compre
ende:
(a) modificação genética a um gene de citrato liase e um ou mais dos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal
sintase, f) piruvato oxidase, g) aspartato aminotransferase, h) transportador de formato, i) fosfato acetiltransferase, j) enzima málica e/ou k) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase; ou
(b) modificação genética a um gene de citrato liase, gene de lactato desidrogenase, gene de álcool desidrogenase, gene acetato quinase,
gene de transportador de formato, gene de piruvato formatoliase, gene de metilglioxal sintase, gene de piruvato oxidase e um ou mais dos seguintes genes-alvo: a) aspartato aminotransferase, b) fosfato acetiltransferase, c) enzima málica e/ou d) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase;
a referida modificação genética inativando a atividade enzimática
do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo;
5. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 4, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faeealis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthro5 bacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibac10 terium roseum, Brevibaeterium immariophilium, Brevibaeterium linens, Brevibaeterium protopharmiae, Corynebaeterium aeetophilum, Corynebaeterium glutamieum, Corynebaeterium eallunae, Corynebaeterium aeetoaeidophilum, Corynebaeterium aeetoglutamieum, Enterobaeter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia earotovora, Erwinia herbieola, Erwinia ehrysanthemi, Flavobac15 terium peregrinum, Flavobacterium fueatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningoseptieum, Mierococeus sp. CCM 825, MorganelIa morganii, Noeardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseu20 domonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodoeoeeus erythropolis, Rhodoeoeeus rhodochrous, Rhodoeoeeus sp. ATCC 15592, Rhodoeoeeus sp. ATCC 19070, Sporosareina ureae, Staphyloeoeeus aureus, 25 Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyees eoelieolor, Streptomyees flavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyees lividans, Streptomyees olivaeeus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, 30 Streptomyees viridoehromogenes, Aeromonas salmonieida, Bacillus pumilus, Bacillus eireulans, Bacillus thiaminolytieus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri ou Xanthomonas citri;
6. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a modalidade 5, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli;
7. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com
modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
8. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1,2,3,4,5 ou 6, em que o gene-alvo ou porções do mesmo ou
genes-alvo ou porções destes são inativados por eliminação, mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, pela inserção de códons de parada ou combinações das mesmas;
9. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a referida cepa bacteriana genetica
mente modificada não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo ou contém apenas genes nativos;
10. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com modalidade 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, desde que: 1) a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não tenha tido uma ou mais das seguintes enzimas
inativadas: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase; d) succinato desidrogenase; e) transportador de glicose; f) repressor de isocitrato liase; e/ou 2) aquela referida cepa geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam malato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piru
vato carboxilase e/ou citrato sintase;
11. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a modalidade 7, 8, 9, 10 ou 11, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida;
12. A cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com
qualquer uma das modalidades 1 a 10, em que a referida cepa bacteriana
geneticamente modificada produz:
a) concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
b) concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou
700 mM; ou
c) concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM;
13. Uma cepa bacteriana geneticamente modificada, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é KJ012, KJ017, KJ032,
KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134;
14. Um método de cultivo ou crescimento de uma cepa bacteriana geneticamente modificada que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de
acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 e o cultivo ou crescimento da referida cepa bacteriana geneticamente modificada;
15. Um método de produção de succinato, fumarato ou malato que compreende o cultivo de uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 13 sob con
dições que permitem a produção de succinato ou malato ou fumarato;
16. O método de acordo com modalidade 15, em que as referidas uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas são KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134;
17. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 14-
16, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é cultivada em um meio de sais minerais;
18. O método de acordo com modalidade 17, em que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) carboidrato;
19. O método de acordo com modalidade 18, em que o meio de
sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar;
20. O método de acordo com a modalidade 18 ou 19, em que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramno
se, sacarose, celobiose, hemicelulose ou combinações destes;
21. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 15-
20, em que o rendimento de succinato ou malato é maior ou igual a 90%;
22. O método de acordo com modalidade 21, em que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%,
94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%;
23. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 15- 22, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
24. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 15-
22, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM;
25. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 15
a 22, em que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz
concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM;
26. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 17 ou 21 a 25, em que o meio de crescimento compreende glicerol como
um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato;
27. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 18 a 20, em que o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato; ou
28. Uma composição que compreende uma ou mais cepas bac
terianas geneticamente modificadas de acordo com as modalidades 1 a 13 e
meio.
Os micro-organismos foram depositados, como indicado nos Exemplos, com a "Agricultural Research Service Culture Collection", 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 E.U.A. Essas culturas foram depositadas sob condições que asseguram que o acesso às culturas estará disponível durante a pendência do mesmo pedido de patente àqueles determina5 dos pelo "Commissioner of Patents and Trademarks" como tendo direito a ele sob 37 CFR 1.14 e 35 USC 122. Os depósitos estão disponíveis da forma exigida pelas leis de patentes estrangeiras em países nos quais as contrapartes do presente pedido ou seus descendentes estão depositados. No entanto, deve-se entender que a disponibilidade dos depósitos não constitui 10 uma licença para a prática da presente invenção com abdicação dos direitos de patente garantidos por ação governamental.
Além disso, os depósitos de cultura em questão serão armazenados e disponíveis ao público de acordo com as definições do Tratado de Budapeste para o Depósito de Micro-organismos, ou seja, serão armazena15 dos com todos os cuidados necessários para mantê-los viáveis e nãocontaminados por um período de pelo menos cinco anos após a solicitação mais recente para o fornecimento de uma amostra dos depósitos e em qualquer caso, por um período de pelo menos 30 (trinta) anos após a data do depósito ou pela vida útil de qualquer patente que possa descrever as cultu20 ras. O depositante reconhece a obrigação de substituir os depósitos caso o depósito seja incapaz de fornecer uma amostra quando solicitado, em função da condição dos depósitos. Todas as restrições sobre a disponibilidade ao público dos depósitos de cultura em questão serão irrevogavelmente removidas mediante a concessão de uma patente que as descrevem.
A seguir serão apresentados exemplos que ilustram procedimen
tos para a prática da invenção. Esses exemplos não devem ser considerados como limitantes. Todas as percentagens são por peso e todas as proporções de mistura solvente são por volume, a menos que observado de forma diferente.
Exemplo 1
Os micro-organismos foram depositados com a "ARS Culture Collection" da seguinte forma: Cultura Designações da cepa Data do depósito KJ012 B-50022 15 de março 2007 KJ017 B-50023 15 de março 2007 KJ032 B-50024 15 de março 2007 KJ060 B-50025 15 de março 2007 KJ070 B-50026 15 de março 2007 KJ071 B-50027 15 de março 2007 KJ072 B-50028 15 de março 2007 KJ073 B-50029 15 de março 2007 Materiais e métodos
Cepas, meios e condições de crescimento
As cepas usadas neste estudo estão resumidas na Tabela 2. Foram desenvolvidos derivados de E. coli C (ATCC 8739) para a produção de 5 succinato por uma combinação única de eliminações de genes e seleções quanto à produtividade aumentada. As culturas cresceram a 37°C em caldo de Luria-Bertani (LB) modificado (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extrato de levedura Difco, 5 g de cloreto de sódio) (Miller,1992) apenas durante a construção da cepa. Antibióticos foram incluídos, quando necessários.
Meio de sais minerais NBS (Causey e outros, 2004) suplementa
do com 100 mM de KHCO3, 1 mM de HCI de betaína e açúcar (2% a 10%) foi usado como um caldo de fermentação na maioria dos estudos e para a manutenção das cepas. Um novo meio com baixo teor de sal, AM1 (4,2 g Γ1 de sais totais; Martinez e outros, 2007), foi desenvolvido durante os estágios finais 15 dessa investigação e usado em fermentações com KJ060 e KJ073. Esse meio foi suplementado com 100 mM de KHCO3 e açúcar, como indicado, e inclui 1 mM de betaína quando as concentrações iniciais de açúcar são de 5% ou mais. Nenhum gene que codifica resistência a antibióticos, plasmídeos ou outros genes estranhos está presente em cepas desenvolvidas para a produção 20 de succinato, exceto como intermediários durante a construção.
Métodos genéticos
Os plasmídeos e iniciadores usados neste estudo estão resumidos na Tabela 2. Métodos para eliminações cromossômicas, integração e remoção de genes de resistência a antibiótico foram descritos previamente (Datsenko e Wanner1 2000; Grabar e outros 2006; Posfai e outros, 1997; Zhou e outros 2006). Os iniciadores senso contêm seqüências que correspondem ao terminal 5 N de cada gene visado (letra em negrito) seguidas por 20 pb (sublinhado) que correspondem ao cassete FRT-Zcan-FRT. Os iniciadores antissenso contêm seqüências que correspondem à região do terminal C de cada gene visado (letra em negrito), seguida por 20 pb (sublinhado) que correspondem ao cassete. Os fragmentos de DNA amplificados foram eletroporados em cepas de E. coli 10 que abrigam Red recombinase (pKD46). Nos recombinantes resultantes, o cassete FRT-Zcan-FRT substituiu a região eliminada do gene-alvo por recombinação homóloga (evento de cruzamento duplo). O gene de resistência (FRT-ZcanFRT) foi subsequentemente removido do cromossomo com FLP recombinase usando o plasmídeo pFT-A, deixando uma região de cicatriz contendo um sítio 15 de FRT. Eliminações e integrações cromossômicas foram verificadas testandose marcadores de antibióticos, análise por PCR e análise de produtos de fermentação. A transdução generalizada de fago P1 (Miller, 1992) foi usada para transferir a mutação AfocA-pflB::FRT-Zcan-FRT da cepa SZ204 na cepa KJ017 para produzir KJ032.
Eliminação de genes mgsA e poxB
Foi desenvolvido um método modificado para eliminar genes cromossômicos de E. coli usando um processo de recombinação homóloga em duas etapas (Thomason e outros, 2005). Com esse método, nenhum gene de antibiótico ou seqüência cicatricial permanece no cromossomo após 25 a eliminação de genes. Na primeira recombinação, parte do gene-alvo foi substituída por um cassete de DNA contendo um gene de resistência ao cloranfenicol (cat) e um gene de levana-sucrase (sacB). Na segunda recombinação, o cassete cat-sacB foi substituído com seqüências nativas que omitem a região de eliminação. As células que contêm o gene sacB acumulam 30 Ievana durante incubação com sacarose e são mortas. Os recombinantes sobreviventes são altamente enriquecidos para perda do cassete cat-sacB.
Foi construído um cassete para facilitar eliminações de genes. A região cat-sacB foi amplificada por pEL04 (Lee e outros, 2001; Thomason e outros, 2005) por PCR usando o conjunto de iniciadores JMcatsacB (Tabela 2), digerida com NheI e ligada no sítio correspondente de pLOI3421 para produzir pLOI4151. O cassete cat-sacB foi amplificado por PCR usando 5 pLOI4151 (modelo) e o conjunto de iniciadores caf-up2/sacS-down2 (sítio EcoFN incluído em cada iniciador), digerido com EcoFN e usado em ligações subsequentes.
O gene mgsA e regiões de 500 pb vizinhas (yccT-mgsA-helD’, 1435 pb) foram amplificados usando o conjunto de iniciadores mgsA10 up/down e clonados no vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) para produzir o plasmídeo pLOI4228. Uma preparação diluída de 1.000 vezes desse DNA de plasmídeo serviu como modelo para a amplificação de dentro para fora usando o conjunto de iniciadores mgsA-Μ (ambos os iniciadores dentro do gene mgsA e voltados para fora). O fragmento de 4.958 pb resultante con15 tendo o replicon foi ligado ao cassete amplificado cat-sacB, digerido com EcoFN por pLOI4151 para produzir pLOI4229. Esse fragmento de 4.958 pb também foi usado para construir um segundo plasmídeo, pLOI4230 (fosforilação e autoligação). Em pLOI4230, a região central de mgsA está ausente(ycc T-mgsA ’-mgsA”- helD ).
Após digestão de pLOI4229 e pLOI4230 com Xmnl (dentro do
vetor), cada um serviu como modelo para amplificação com o uso do conjunto de iniciadores mgrsA-up/down para produzir os fragmentos de DNA lineares para a etapa de integração I (yccT-mgsA - cat-sacB- mgsA"- helD’) e para a etapa Il (yccT-mgsA’-mgsA"- helD), respectivamente. Após eletropo25 ração do fragmento da etapa I em KJ060 contendo pKD46 (Red recombinase) e 2 horas de incubação a 30°C para permitir a expressão e segregação, foram selecionados recombinantes quanto à resistência ao cloranfenicol (40 mg Γ1) e à ampicilina (20 mg Γ1) nas placas (30°C, 18 horas). Foram escolhidos três clones, desenvolvidos em caldo Luria com ampicilina e arabinose 30 5% p/v, e preparados para eletroporação. Após eletroporação com o fragmento da etapa II, as células foram incubadas a 37°C por 4 horas e transferidas para um frasco de 250 ml contendo 100 ml de LB modificado (100 mM de tampão MOPS adicionados e NaCI omitido) contendo sacarose 10%. Após incubação de um dia para o outro (37°C), foram selecionados clones nas placas de LB modificado (sem NaCI; 100 mM de MOPS adicionados) contendo sacarose 6% (39°C, 16 horas). Os clones resultantes foram testa5 dos quanto à perda de resistência à ampicilina e ao cloranfenicol. A construção foi ainda confirmada por análise por PCR. Um clone desprovido do gene mgsA foi selecionado e designado KJ070.
O gene poxB foi eliminado de KJ071 de uma forma análoga àquela usada para eliminar o gene mgsA. Conjuntos de iniciadores adicionais 10 (poxS-up/down e poxS-1/2) usados para construir a eliminação de poxB estão incluídos na Tabela 2, junto com os plasmídeos correspondentes (pLOI4274, pLOI4275 e pLOI4276). A cepa resultante foi designada KJ072. Ensaios enzimáticos
As células foram desenvolvidas em meio NBS com glicose a 5% 15 ou 10%, e coletadas durante crescimento mid-log por centrifugação (8.000 g por 5 min a 4°C), lavadas com 100 mM de tampão Tris-HCI gelado (pH 7,0), e ressuspensas no mesmo tampão (5 ml). As células foram rompidas por tratamento com glóbulos (MP Biomedicals; Solon, Ohio) com glóbulos de vidro e depois centrifugadas a 13.000 g por 15 min para se obter o extrato 20 bruto. As proteínas foram medidas pelo método de BCA, com albumina sérica bovina como o padrão (Kit de Ensaio de Proteína de Pierce BCA).
A atividade de PEP carboxilase foi medida como descrito anteriormente (Canovas e Kornberg, 1969). A mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM de MgCI2, 1 mM de DTT, 25 mM de NaH25 CO3, 0,2 mM de NADH, 20 U de malato desidrogenase e 10 mM de PEP, e a reação foi iniciada por adição de extrato bruto. A atividade de PEP carboxiquinase foi medida como descrito anteriormente (Van der Werf, e outros, 1997). A mistura de reação contém 100 mM de tampão MES (pH 6,6), 10 mM de MgCI2, 75 mM de NaHCOs, 5 mM de MnCI2, 50 mM de ADP, 1 mM 30 de DTT, 0,2 mM de NADH, 20 U de malato desidrogenase e 10 mM de PEP. A reação foi iniciada por adição de extrato bruto.
A atividade de enzima málica dependente de NAD+ foi medida em ambas as direções como descrito anteriormente (Stols e Donnelly, 1997). Para a direção de carboxilação, a mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 7,5), 25 mM de NaHCO3, 1 mM de MnCI2, 1 mM de DTT, 0,2 mM de NADH e 25 mM de piruvato. A reação foi iniciada por adição 5 de extrato bruto. No entanto, esse método de ensaio não pode medir a atividade de enzima málica em E. coli C do tipo selvagem em função da presença de lactato desidrogenase. Para descarboxilação, a mistura de reação contém 100 mM de tampão Tris-HCI (pH 7,5), 2,5 mM de NAD+, 1 mM de DTT, 10 mM de MgCI2, 20 mM de KCI e 20 mM de L-malato. A reação foi 10 iniciada por adição de extrato bruto.
A atividade de enzima málica dependente de NADP+ foi medida da mesma forma que para a enzima málica dependente de NADP+, exceto que NAD(H)+ foi substituído por NADP(H)+. Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima para oxidar ou reduzir 1 nmol de substrato por min.
Análise por RT-PCR em tempo real
RT-PCR em tempo real foi usada para medir os níveis de RNA, como descrito previamente (Jarboe e outros, 2008). As células foram desenvolvidas em meio NBS com glicose 5% ou 10% e coletadas durante cresci20 mento mid-log por agitação em um banho de gelo seco/etanol, seguido por centrifugação e armazenamento a -80°C em RNALater (Qiagen, Valencia CA) até a purificação. A purificação do RNA foi realizada com colunas RNeasy Mini (Qiagen), seguida por digestão com DNaseI (Invitrogen). A transcrição reversa com Superscript Il (Invitrogen, Carlsbad CA) usou 50 ng de RNA 25 total como modelo. PCR em tempo real foi realizada em um Bio-Rad iCycler com a mistura de PCR "SYBR Green" (Bio-Rad, Hercules CA). O RNA foi verificado quanto à contaminação por DNA genômico por execução de uma RT-PCR na ausência de transcrição reversa. A abundância do transcrito foi estimada com o uso de DNA genômico como padrão e os níveis de expres30 são foram normalizados pelo gene birA, um repressor da transcrição (Jarboe e outros, 2008). Os iniciadores de RT-PCR usados para pck e birA estão listados na Tabela 2. Seauenciamento da reaião pck
A fim de saber se houve a ocorrência de qualquer mutação no gene pck de KJ073, a região codificadora e a região promotora (cerca de 800 pb na frente da região codificadora) do gene pck, tanto em KJ012 quan5 to em KJ073, foram amplificadas por DNA Polimerase de Alta Fidelidade PfuUItra (Stratagene; Wilmington, DE). O conjunto de iniciadores pck-F/R foi usado para amplificar a região codificadora através do terminador da transcrição. O conjunto de iniciadores pck-2 foi usado para amplificar a região promotora. O sequenciamento de DNA foi fornecido pelo "University of Flori10 da Interdisciplinary Center for Biotechnology Research" (com autosequenciadores da Applied Biosystems).
Fermentações
As culturas e fermentações de sementes cresceram a 37°C, 100 rpm, em meio NBS ou AM1 de sais minerais contendo glicose, 100 mM de KHCO3 e 1 mM de HCI de betaína. Essas foram mantidas em pH 7,0 pela adição automática de KOH durante os experimentos iniciais. Subsequentemente, o pH foi mantido por adição de uma mistura 1:1 de 3 M de K2CO3 e 6 N de KOH. As fermentações foram realizadas em pequenos vasos de fermentação com um volume de trabalho de 350 ml. As fermentações foram inoculadas em uma OD55O inicial de 0,01 (3,3 mg de CDW Γ1) ou 0,1 (33,3 mg de CDW Γ1), como indicado. Nenhum gene de resistência a antibiótico estava presente nas cepas que foram testadas. Os vasos de fermentação foram lacrados, exceto por uma agulha de 16 gauge que serviu como um conduto para remoção de amostra. A anaerobiose foi rapidamente obtida durante o crescimento com bicarbonato adicionado servindo para assegurar uma atmosfera de CO2.
Análises
A massa celular foi estimada pela densidade óptica a 550 nm (OD 1,0 = 333 mg de peso seco de células Γ1) com um espectrofotômetro Bausch & Lomb Spectronic 70. Os ácidos orgânicos e açúcares foram determinados pela utilização de cromatografia líquida de alto rendimento (Grabar e outros, 2006). Resultados e discussão
Construção de KJ012 para a produção de succinato: eliminação de IdhA. adhE e ackA
A grande maioria do conhecimento científico de E. coli é derivada de investigações em meio complexo como, por exemplo, caldo de Luria, e não em meio de sais minerais que utiliza baixas concentrações de substratos de açúcar (tipicamente 0,2% p/v; 11 mM) em vez da glicose 5% (p/v) (278 mM) e 10% p/v (555 mM) usada nos estudos aqui relatados. Grandes quantidades de açúcar são necessárias para produzir níveis comercialmente significativos de produto. Pesquisadores anteriores descreveram a construção de muitos derivados de E. coli para a produção de succinato em meio complexo (Tabela 1). Com meio complexo, o planejamento racional baseado em vias primárias foi razoavelmente bem sucedido para demonstrações acadêmicas de engenharia metabólica. No entanto, o uso de nutrientes complexos para a produção de produtos de fermentação bacteriana aumenta o custo de materiais, o custo da purificação e o custo associado ao descarte de resíduos. O uso de um meio de sais minerais sem componentes de meios complexos deve ter uma relação custo-benefício bem melhor.
A E. coli C cresce bem em meio de sais minerais NBS contendo glicose e produz uma mistura de lactato, acetato, etanol e succinato como produtos de fermentação (Figura 1 A; Tabela 3). Em contraste com outros estudos com E. coli (Tabela 1), os estudos aqui relatados se concentraram no desenvolvimento de cepas que são capazes de converter um nível elevado de açúcares em succinato com o uso de um meio de sais minerais para minimizar os custos de materiais, da purificação de succinato e do descarte de resíduos. Por inspeção da Figura 1, que ilustra as vias-padrão de fermentação geralmente aceitas para E. coli, foi desenvolvido um planejamento racional para a engenharia metabólica de uma cepa produtora de succinato no qual eram feitas eliminações em genes que codificam as etapas terminais para todos os produtos alternativos: lactato (IdhA), etanol (adhE) e acetato (ackA). Os resultados dessa engenharia metabólica por planejamento racional foram completamente inesperados. A cepa resultante (KJ012) cresceu muito pouco sob condições anaeróbicas em meio de sais minerais contendo glicose 5% (278 mM) e produziu acetato em vez de succinato como o produto primário da fermentação. Ao contrário das expectativas do planejamento racional, o succinato permaneceu como um produto menor. Os rendimentos molares de succinato com base na glicose metabolizada não se alteraram em conseqüência dessas mutações, 0,2 mol de succinato por mol de glicose para a parente e KJ012 durante fermentação em meio de sais minerais NBS contendo glicose 5%. Confirmamos que o meio de sais minerais NBS contém todos os nutrientes minerais necessários para o crescimento de KJ012 por incubação sob condições aeróbicas (frasco em agitação aeróbica; glicose 5%). Em frascos em agitação aeróbica, os rendimentos celulares para KJ012 foram 5 vezes maiores do que durante o crescimento anaeróbico e 75% daquele da E. coli C (parente) durante o crescimento anaeróbico. Esses resultados também confirmaram que todas as vias biossintéticas centrais permaneceram funcionais em KJ012.
Quando nutrientes complexos estavam presentes (caldo de Luri
a), a produção fermentativa de succinato por KJ012 aumentou 20 vezes, quando comparada com KJ012 em meio mínimo de sais, e o rendimento molar para succinato aumentou em 3,5 vezes. Claramente, o planejamento 20 racional baseado nas vias primárias é mais bem adequado às demonstrações acadêmicas ou aos processos de planejamento destinados ao uso com nutrientes complexos.
A base para o crescimento deficiente, para a baixa produção de succinato e para o aumento da produção de acetato por KJ012 (AldhA::FRT 25 AadhE::FKT AackA::FRT) durante o metabolismo anaeróbico em meio de sais minerais é desconhecida. Há conseqüências inesperadas decorrentes da engenharia metabólica com a utilização do planejamento racional baseado nas tabelas da via-padrão. Em meio mínimo, planejamentos racionais para engenharia metabólica nitidamente não eram previsíveis. A cepa resul30 tante, KJ012, foi inferior à parente no crescimento e não foi melhor do que a parente para a produção de succinato.
Desenvolvimento de KJ017 para a produção de succinato por seleção baseada no crescimento de KJ012
KJ012 (AldhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT) cresceu deficientemente em comparação com a E. coli C parente, exibiu taxas de produção de succinato menores e não forneceu rendimentos molares melhores (Tabe5 Ia 3). Apesar desses resultados, a transferência serial dessa cepa foi tentada como um método para cosselecionar crescimento e produção de succinato aumentados com base na seguinte lógica: acredita-se geralmente que a via primária para a fermentação da glicose em succinato (Figura 1A e Figura 2A.) use fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) para a etapa de carboxilação 10 (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler e outros, 2005; Millard e outros, 1996; Gottschalk, 1985; Karp e outros, 2007). Essa enzima de carboxilação não conserva o fosfato de alta energia em fosfoenolpiruvato e reduz o ATP disponível para o crescimento. Podem ser previstas vias alternativas para a produção de succinato com o uso do repertório de genes de E. coli 15 conhecidos que poderiam aumentar os rendimentos de ATP e poderiam, desse modo, aumentar o crescimento (Figura 1 A; Figura 2B, 2C e 2D). No entanto, nenhuma dessas vias alternativas demonstrou funcionar para a produção de succinato durante a fermentação com cepas nativas de E coli. Enzimas cruciais nessas vias alternativas são reprimidas por glicose e estão 20 normalmente ativas durante a gliconeogênese. Tipicamente, os níveis dessas enzimas gliconeogênicas variam inversamente com a disponibilidade de glicose e de outros metabólitos (Goldie e Sanwal, 1980a; Wright e Sanwal, 1969; Sanwal e Smando, 1969a) e funcionam na direção reversa, descarboxilação (Keseler e outros, 2005; Oh e outros, 2002; Kao e outros, 2005; Stols 25 e Donnelly, 1997; Samuelov e outros, 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere e outros, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal 1970b).
A enzima crucial para uma dessas, enzima málica ligada ao NADH (sfcA) (Figura 2B), demonstrou ser capaz de aumentar a produção de succinato em E coli, mas exigia a superexpressão por um plasmídeo para fazê-lo (Stols e Donnelly, 1997). No entanto, não se esperava que nenhuma dessas vias alternativas fosse funcional em cepas nativas de E. coli ou KJ012 durante o crescimento anaeróbico com níveis elevados de glicose. Transferências seriais de KJ012 com seleção quanto ao crescimento aumentado ofereceram uma oportunidade para a seleção de ativação mutacional de vias alternativas para a produção de succinato (Figura 1B) que manti5 nham o equilíbrio redox e aumentavam os rendimentos de ATP.
KJ012 foi transferida serialmente em meio de glicose NBS sob condições fermentativas tão rapidamente quanto o crescimento permitia (Figura 3A; Figura 4A; Figura 5). O crescimento permaneceu lento com 4 a 5 dias de incubação necessários entre as primeiras 9 transferências, e depois aumentou dramaticamente, permitindo que fossem feitas transferências em intervalos de 24 horas. Esse evento era acompanhado por um aumento de acetato (Figura 4A) com pouca melhora na produção de succinato. Após 27 transferências (60 dias), o KOH foi substituído por uma mistura 1:1 de M de K2CO3 e 6 N de KOH para fornecer dióxido de carbono adicional (100 mM inicialmente adicionados a todos os meios de sais minerais NBS). A continuação das transferências produziu aumentos na produção de succinato. Foi feito um total de 40 transferências em glicose 5% (227 mM), seguidas por outras 40 transferências em glicose 10% (555 mM). Durante as transferências em glicose 10%, os rendimentos de succinato permaneceram aproximadamente 0,7 mol por mole de glicose metabolizada com lactato, acetato e formato como subprodutos (Tabela 3). Esse rendimento era 3 vezes maiores do que E. coli C e KJ012. Foi isolado um clone e designado KJ017. A seleção quanto aos aumentos no crescimento de KJ012 para produzir KJ017 cosselecionou quanto aos aumentos na produção de succinato (taxa, titulação e rendimento molar).
Base fisiológica para a produção aumentada de succinato por KJ017
O succinato produzido por E. coli com a utilização da via geralmente considerada como a via de fermentação nativa (fosfoenolpiruvato carboxilase; ppc) desperdiça a energia de fosfoenolpiruvato por produção de 30 fosfato inorgânico. Um ATP é perdido por succinato produzido por essa via (Figura 1; Figura 6). A conservação dessa energia como ATP pela utilização de sistemas enzimáticos alternativos representa uma oportunidade para aumentar o crescimento celular e cosselecionar quanto à produção aumentada de succinato. Com base em genes conhecidos em E. coli, foram previstas três outras vias enzimáticas para a produção de succinato que conservariam ATP e poderiam, dessa forma, aumentar o crescimento (Figura 1; Figura 6).
5 No entanto, acredita-se que todas as etapas de carboxilação nessas vias alternativas funcionem na direção reversa (descarboxilação) primariamente para gliconeogênese durante o crescimento em substratos como, por exemplo, ácidos orgânicos (Keseler e outros, 2005; Oh e outros, 2002; Kao e outros, 2005; Stols e Donnelly, 1997; Samuelov e outros, 1991; Sanwal, 1970a; 10 Delbaere e outros, 2004; Goldie e Sanwal, 1980b; Sanwal e Smando, 1969b; Sanwal 1970b). Para testar a hipótese de que a seleção baseada no crescimento para desenvolver KJ017 tenha, na verdade, ativado uma ou mais dessas vias alternativas, foram comparadas atividades específicas das etapas de carboxilação fundamentais (Tabela 4). Três das mesmas eram simila15 res ou menores em E. coli C, KJ012, e KJ017. A fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) de conservação de energia estava aumentada em 4 vezes em KJ017, comparada com KJ012, consistente com a hipótese de que a seleção quanto ao crescimento aumentado cosselecionaria quanto à produção aumentada de succinato por meio de rendimentos crescentes de ATP, uma 20 conseqüência do aumento da expressão de uma via de conservação de energia para a produção de succinato.
Seleções baseadas no crescimento posteriores e eliminações de genes adicionais foram usadas para construir muitas cepas adicionais com aumentos adicionais do crescimento e da produção de succinato (Figura 3 e 25 Figura 4). Os níveis de enzima em uma das mesmas também foram examinados, KJ073. Nessa cepa, a atividade in vitro de fosfoenolpiruvato carboxiquinase foi ainda aumentada em 8 vezes em relação àquela de KJ017, enquanto outras enzimas de carboxilação permaneceram basicamente inalteradas (Tabela 4).
A pck e as regiões circundantes foram clonadas por KJ012 e
KJ073, e sequenciadas. Não foram encontradas alterações na região codificadora. Com modificações pós-tradução ausentes, as propriedades catalíticas da enzima devem permanecer inalteradas. Uma única mutação foi detectada na região promotora de pck, G a A no sítio -64 pb em relação ao sítio de início de tradução. Essa mutação estava atrás do sítio de início de transcrição que está em um sítio -139 pb em relação ao sítio de início de tradu5 ção. A restauração dessa seqüência (A a G) em KJ073 para aquela de E. coli C não afetou o crescimento celular, a fermentação ou produção de succinato, indicando que essa mutação não é essencial (dados não mostrados). RT-PCR confirmou que os níveis de mensagem eram elevados em KJ073. Esses resultados são consistentes com uma mutação reguladora 10 como a base para a expressão aumentada de pck.
Investigadores anteriores observaram que os parâmetros cinéticos de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) podem ter efeitos importantes sobre a carboxilação e a produção de succinato (Millard e outros, 1996; Kim e outros, 2004). A Km de bicarbonato 15 para fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) de E. coli é de 0,15 mM (Morikawa e outros, 1980), 9 vezes menor (13 mM) do que fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pck) de E. coli (Krebs e Bridger 1980). Embora a superexpressão de pck por E. coli em plasmídeo multicópias aumentasse a atividade de fosfoenolpiruvato carboxiquinase em 50 vezes, há relatos de que não tenha 20 nenhum efeito sobre a produção de succinato (Millard e outros, 1996). A produção de succinato também não aumentava quando fosfoenolpiruvato carboxiquinase de Anaerobiospirillum succiniciproducens era superexpressa em E. coli K12 (Kim e outros, 2004). Essa enzima também possui uma Km elevada para bicarbonato (30 mM; Laivenieks e outros, 1997). No entanto, 25 quando pck de A. succiniciproducens era superexpressa em um mutante de ppc de E. coli K12, a produção de succinato era aumentada em 6,5 vezes (Kim e outros, 2004). Em KJ017 e derivados subsequentes, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase é a atividade de carboxilação claramente dominante, até mesmo na presença de fosfoenolpiruvato carboxilase funcional nativa.
Os resultados de medidas de enzima de E. coli C foram bem
surpreendentes. A enzima, geralmente considerada como a atividade de carboxilação dominante para a produção de succinato por E. coli nativa (fosfoenolpiruvato carboxilase; ppc) durante o crescimento (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler e outros, 2005; Millard e outros, 1996; Gottschalk 1985; Karp e outros, 2007), não era a enzima mais ativa in vitro para E. coli C. Dessa forma, as vias metabólicas geralmente aceitas para E. coli (Unden e Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Sanchez e outros, 2006; Cox e outros, 2006; Vemuri e outros, 2002a; Wang e outros, 2006; Sanchez e outros, 2005ab; Gokarn e outros, 2000; Karp e outros, 2007) mediante as quais o planejamento racional de engenharia metabólica e estimativas de fluxo metabólico são tipicamente baseados podem não refletir com precisão o metabolismo em todas as cepas. Sob condições de saturação de substrato in vitro, a atividade de fosfoenolpiruvato carboxiquinase era a mais ativa. Em E. coli K12, havia relatos de que as atividades tanto de fosfoenolpiruvato carboxilase quanto de fosfoenolpiruvato carboxiquinase eram iguais in vitro (140 nm min"1 mg'1 proteína celular; Van der Werf e outros, 1997), com a primeira servindo como a via primária para succinato.
Os estudos prévios mostravam que a superexpressão de um gene de ppc nativo em E. coli resultou no aumento da produção específica de succinato (Millard e outros, 2000), aumento da taxa de crescimento específico, e redução da produção específica de acetato em função do aumento 20 da carboxilação de PEP para restabelecer os intermediários do ciclo de TCA (Farmer e Liao, 1997). No entanto, na medida em que PEP é necessário para o sistema de transporte de glicose, a superexpressão de ppc também diminui a taxa de captação de glicose em 15 a 40%, sem aumentar significativamente o rendimento de succinato (por glicose), quando comparado com 25 um controle isogênico (Chao e Liao, 1993; Gokarn e outros, 2000). Essa incapacidade da fosfoenolpiruvato carboxilase nativa em aumentar os rendimentos de succinato desviou a maior parte da atenção das pesquisas para um novo design metabólico, a superexpressão da PYC (piruvato carboxilase) por Lactobacillus Iactis ou Rhizobium etli como a etapa de carboxilação 30 (Vemuri e outros, 2002ab; Gokarn e outros, 2000; Lin e outros, 2005abc), em vez de prosseguir com trabalhos com o repertório nativo de genes de E. coli.
Bactérias de ruminantes, tais como Actinobacillus succinogenes, produzem succinato como um produto primário durante a fermentação da glicose com o uso da fosfoenolpiruvato carboxiquinase que conserva energia para carboxilação (Kim e outros, 2004; McKinIay e outros, 2005; McKinIay e Vieille, 2008). As atividades relatadas para esse organismo são 5 vezes 5 aquelas de KJ017 e metade daquela obtida por seleção continuada baseada no crescimento (evolução metabólica) de KJ073. Dessa forma, utilizando-se uma combinação de engenharia metabólica (IdhA adhE ackA) e evolução metabólica (seleção baseada no crescimento para eficiência aumentada da produção de ATP), os estudos aqui relatados demonstram o desenvolvimen10 to de cepas produtoras de succinato de E. coli que se assemelham e um organismo de ruminantes como, por exemplo, A. succinogenes, utilizando-se apenas o repertório nativo de genes de E. coli. Apesar dos relatos prévios de que a superexpressão da fosfoenolpiruvato carboxilase de E. coli (ppc) não é útil para a produção de succinato na ausência de uma mutação em fosfoe15 nolpiruvato sintase (Chao e Liao, 1993; Kim e outros, 2004; Gokarn e outros, 2000; Millard e outros, 1996), foram criados geneticamente KJ017 e derivados para utilizar fosfoenolpiruvato carboxiquinase como a via primária para a produção de succinato e malato.
Construção de KJ032 e KJ060 Durante o crescimento com glicose 10% (p/v), subprodutos inde
sejados (acetato, formato e lactato) eram abundantes em fermentações com KJ017 (Δ/dM.vFRT AadftEvFRT AackA::FRT), apesar da eliminação de genes que codificam as atividades primárias de lactato desidrogenase (IdhA) e acetato quinase (ackA) (Tabela 3). A produção de lactato e de acetato tam25 bém poderia resultar em rendimentos mais elevados de ATP, uma base para a seleção baseada no crescimento (Figura 1A).
O gene que codifica piruvato formatoliase (pflB) foi eliminado de KJ017 para eliminar a perda da capacidade redutora como formato e um excesso de acetil~CoA, uma fonte potencial de acetato. O transportador de 30 formato (focA) a montante nesse óperon também foi eliminado. Como esperado, essa cepa eliminada (KJ032) não cresceu sem acetato, confirmando que essa é a via primária para a produção de acetil~CoA em KJ017 (Figura 3C). A eliminação de pflB sabidamente causa auxotrofia de acetato sob condições anaeróbicas (Sawers e Bock1 1988). O crescimento e a produção de succinato por KJ032 foram restaurados pela adição de 20 mM de acetato (Figura 3C, Figura 4C e Figura 5). A produção de formato e de acetato foi substancialmente reduzida em conseqüência da eliminação DE pflB (e de focA). Embora essa cepa necessitasse de acetato para o crescimento, também foi produzido acetato adicional durante a fermentação. O mesmo fenômeno foi relatado previamente para cepas com pflB eliminado durante a construção de biocatalisadores de E. coli K-12 para a produção de piruvato (Causey e outros, 2004). Os níveis de lactato também estavam reduzidos em KJ032 (Tabela 3; Figura 4C). Transferências subsequentes foram acompanhadas por aumentos do crescimento e da produção de succinato. O acetato adicionado foi reduzido, o tamanho dos inóculos foi reduzido, e a concentração de glicose foi dobrada (10% p/v) durante transferências subsequentes (Figura 4D). Após redução da quantidade de acetato a 5 mM, surgiu uma população instável que produzia níveis elevados de malato às custas de succinato. Após transferências adicionais, o acetato foi omitido e foi desenvolvida uma cepa que não era mais auxotrófica para acetato, presumivelmente em função da expressão aumentada de outro gene. No entanto, os rendimentos de succinato declinaram com a eliminação de acetato adicionado, enquanto os níveis de malato e acetato aumentaram. As fontes de acetato e base para o aumento de malato são desconhecidas. Uma pequena quantidade de piruvato também foi produzida. Um clone foi isolado da última transferência e designado KJ060 (Δ/dM.vFRT AadhE::FRT Aac/cAvFRT AfocA-pflB::FRT). Essa cepa produziu 1 mol de succinato por mol de glicose metabolizada em meio de sais minerais NBS com glicose 10%. Construção de KJ070 e KJ071 por eliminação de metilglioxal sintase (mgsA) Presume-se que a pequena quantidade de lactato presente nos caldos de fermentação de várias cepas se origine da via de metilglioxal sintase (Figura 6; Grabar e outros 2006). Embora isso represente uma pequena perda de rendimento, a produção de lactato por essa via é indicativa de acúmulo de metilglioxal, um inibidor tanto do crescimento quanto da glicólise (Egyud e Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar e outros, 2006; Hopper e Cooper, 1971). A produção de metilglioxal e lactato foi eliminada por eliminação do gene de mgsA (metilglioxal sintase) em KJ060 para produzir KJ070 (AldhA::FRT AadhE::FRT AacM:;FRT AfocA-pflB::FRT AmgsA). Uma cepa 5 KJ070 foi inicialmente subcultivada em glicose 5% (p/v) (Figura 4E e Figura 5). Presume-se que a eliminação de mgsA tenha aumentado o fluxo glicolítico, como evidenciado pelo acúmulo de piruvato no meio (Tabela 3). Esse aumento do fluxo glicolítico também pode ser responsável pelo declínio adicional na proporção de succinato/malato em função da produção aumentada 10 de oxaloacetato, um inibidor alostérico de fumarato redutase (Iverson e outros, 2002; Sanwal, 1970c).
Na transferência 21, a glicose foi dobrada em 10% (p/v) e as transferências continuaram. Esse nível mais elevado de glicose e transferências subsequentes resultou em aumentos adicionais da produção de ma15 lato, excedendo succinato nas últimas transferências (Figura 4E). A produção aumentada de malato versus succinato em glicose 10% p/v também é consistente com o fluxo glicolítico aumentado e a inibição de fumarato redutase por oxaloacetato. Na transferência 50, 1,3 mol de malato e 0,71 mol de succinato foram produzidos por mole de glicose metabolizada (Tabela 3). 20 Quantidades significativas de acetato também foram produzidas. Uma nova cepa foi isolada da subcultura final e designada KJ071 (AldhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT AfocA-pflB::FRT AmgsA). Essa cepa pode ser útil para a produção de malato.
Construção de KJ072 e KJ073 por eliminação de poxB Embora a conversão de glicose em acetato seja neutra em ter
mos de redox, a divisão de carbono em acetato diminui o rendimento de succinato e malato. A piruvato oxidase (poxB) representa uma fonte potencial de acetato e CO2 durante incubação sob condições microaerofílicas (Causey e outros, 2004). Embora não deva funcionar para oxidar piruvato sob 30 condição anaeróbica, poxB foi visada para eliminação de genes (Figura 6). Como esperado, a eliminação de poxB para produzir KJ072 (AldhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT AfocA-pflB::FRT AmgsA ApoxB) não reduziu a produção de acetato, indicando que estão envolvidas vias alternativas na produção de acetato. No entanto, a eliminação de poxB resultou em mudanças inesperadas nos produtos de fermentação, um aumento em succinato e uma diminuição em malato (Tabela 3; Figura 4F). O mecanismo para esse au5 mento na produção de succinato é desconhecido, mas pode estar relacionado a outras atividades de piruvato oxidase como, por exemplo, produção de acetoína, descarboxilação, e carboligação (Ajl e Werkman, 1948; Chang e Cronan, 2000).
A cepa KJ072 foi submetida a 40 rodadas adicionais de evolução metabólica em meio AM1, um meio com baixo teor de sal, com glicose 10% (p/v) (Tabela 3; Figura 4F e Figura 5). Aumentos do crescimento, rendimento celular e produção de succinato foram observados durante essas transferências. Os níveis de malato, piruvato e acetato também aumentaram. Foi isolado um clone da transferência final e designado KJ073 (AldhA::FRT AadhE::FRT AackA::FRT ApflB::FRT AmgsA ApoxB). Essa cepa retinha a via de fosfenolpiruvato carboxiquinase para carboxilação (Tabela 4). A atividade in vitro dessa cepa era 45 vezes maior do que aquela de KJ012, e 10 vezes maior do que a de KJ017, fornecendo evidências adicionais para a associação íntima entre a conservação de energia para a produção de succinato e o crescimento, e ainda estabelecendo a base usada para seleção.
Fermentação de KJ060 e KJ073 em meio AM1 contendo glicose 10% (p/v)
A Figura 7 mostra fermentações em batelada com KJ060 e KJ073, os dois melhores biocatalisadores para a produção de succinato. Embora o crescimento tivesse se completado dentro das primeiras 48 horas 25 de incubação, a produção de succinato continuou por 96 horas. Um terço da produção de succinato ocorreu na ausência de crescimento celular. Essas cepas produziram titulações de succinato de 668 a 733 mM, com um rendimento molar de 1,2 a 1,6 com base na glicose metabolizada. Com o meio AM1, os rendimentos foram tipicamente maiores do que com o meio de sais 30 minerais NBS. Acetato, malato e piruvato se acumularam como subprodutos indesejáveis e diminuíram o rendimento de succinato potencial (Tabela 3). O rendimento teórico máximo de succinato a partir de glicose e CO2 (exces

Claims (28)

1.Cepa bacteriana geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende modificações genéticas aos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) citrato liase, h) aspartato aminotransferase, i) transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferase, k) enzima málica, e I) propionato quinase/acetobutirato formatoliase, as referidas modificações genéticas inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene-alvo.
2. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lactieum, Agrobacterium tumefaeiens, Agrobacterium radiobacter, Alealigenes faeealis, Arthrobaeter eitreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobaeter paraffineus, Arthrobaeter hydrocarboglutamieus, Arthrobaeter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobaeter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamieum, Brevibacterium helcolum, Brevibaeterium pusillum, Brevibacterium testaeeum, Brevibacterium roseum, Brevibaeterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamieum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium aeetoaeidophilum, Corynebaeterium aeetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodoeoeeus erythropolis, Rhodoeoeeus rhodochrous, Rhodoeoeeus sp. ATCC 15592, Rhodoeoeeus sp. ATCC 19070, Sporosareina ureae, Staphyloeoeeus aureus, Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia paruIosa, Streptomyees eoeIieolor, Streptomyees fIavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyees lividans, Streptomyees olivaeeus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, Streptomyees viridoehromogenes, Aeromonas salmonieida, Bacillus pumilus, Bacillus Cireulansi Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri ou Xanthomonas eitrí.
3. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli.
4. Cepa bacteriana geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) modificação genética a um gene de citrato liase e um ou mais dos seguintes genes-alvo que codificam: a) acetato quinase, b) lactato desidrogenase, c) álcool desidrogenase, d) piruvato formatoliase, e) metilglioxal sintase, f) piruvato oxidase, g) aspartato aminotransferase, h) transportador de formiato, i) fosfato acetiltransferase, j) enzima málica e/ou k) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase; ou (ii) modificação genética a um gene de citrato liase, gene de lactato desidrogenase, gene de álcool desidrogenase, gene acetato quinase, gene de transportador de formiato, gene de piruvato formatoliase, gene de metilglioxal sintase, gene de piruvato oxidase e um ou mais dos seguintes genes-alvo: a) aspartato aminotransferase, b) fosfato acetiltransferase, c) enzima málica e/ou d) propionato quinase/a-cetobutirato formatoliase; a referida modificação genética inativando a atividade enzimática do polipeptídeo produzido pelo referido gene ou pelo referido gene-alvo.
5. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli, Gluconobacter oxidans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viseosus, Achromobacter laeticum, Agrobacterium tumefaeiens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxidans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibaeterium Iactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibaeterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibaeterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobaeterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM 825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodoeoeeus erythropolis, Rhodoeoeeus rhodochrous, Rhodoeoeeus sp. ATCC 15592, Rhodoeoeeus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphyloeoeeus aureus, Vibrio metsehnikovii, Vibrio tyrogenes, Aetinomadura madurae, Aetinomyees violaeeoehromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyees eoelieolor, Streptomyees flavelus, Streptomyees griseolus, Streptomyees lividans, Streptomyees olivaeeus, Streptomyees tanashiensis, Streptomyees virginiae, Streptomyees antibiotieus, Streptomyees eaeaoi, Streptomyees lavendulae, Streptomyees viridoehromogenes, Aeromonas salmonicída, Bacillus pumilus, Bacillus eireulans, Bacillus thiaminolytieus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri ou Xanthomonas citri.
6. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é Escherichia coli.
7. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida.
8. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene ou porções do mesmo ou genes-alvo ou porções destes são inativados por eliminação, mutações de alteração da fase de leitura, mutações pontuais, pela inserção de códons de parada ou combinações das mesmas.
9. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não contém um gene exógeno ou fragmento do mesmo ou contém apenas genes nativos.
10. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta a condição de: i) a referida cepa bacteriana geneticamente modificada não tenha tido uma ou mais das seguintes enzimas inativadas: a) fumarato redutase; b) ATP sintase; c) 2-cetoglutarato desidrogenase; d) succinato desidrogenase; e) transportador de glicose; f) repressor de isocitrato liase; e/ou ii) a referida cepa geneticamente modificada não contenha um plasmídeo ou plasmídeo multicópias que codificam e/ou superexpressam genes para malato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase e/ou citrato sintase.
11. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é metabolicamente desenvolvida.
12. Cepa bacteriana geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz: a) concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM; b) concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM; ou c) concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM.
13. Cepa bacteriana geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134.
14. Método de cultivo ou crescimento de uma cepa bacteriana geneticamente modificada, caracterizado pelo fato de que compreende a inoculação de um meio de cultura com uma ou mais cepas geneticamente modificadas bacterianas como definidas na reivindicação 1 e o cultivo ou crescimento da referida cepa bacteriana geneticamente modificada.
15. Método de produção de succinato, fumarato ou malato, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas como definidas na reivindicação 1 sob condições que permitam a produção de succinato ou malato ou fumarato.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as referidas uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas são KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122 ou KJ134.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada é cultivada em um meio de sais minerais.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio de sais minerais compreende entre 2% e 20% (p/v) de carboidrato.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o meio de sais minerais contém 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% ou 20% (p/v) de um açúcar.
20. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o carboidrato é glicose, frutose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose, celobiose, hemicelulose ou combinações destes.
21. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o rendimento de succinato ou malato é maior ou igual a 90%.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o rendimento é de pelo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5% ou 99%.
23. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de succinato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM.
24. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de malato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM ou 500 mM.
25. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida cepa bacteriana geneticamente modificada produz concentrações de fumarato de pelo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM ou 700 mM.
26. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato.
27. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido meio ainda compreende glicerol como um substrato para a produção de succinato, malato ou fumarato.
28. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais cepas bacterianas geneticamente modificadas como definidas na reivindicação 1 e um meio.
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