CN102311943A

CN102311943A - 苹果酸酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN102311943A
Application number: CN201110264794A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 刘娇; 郑平
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2011-09-07
Filing date: 2011-09-07
Publication date: 2012-01-11

Abstract

本发明涉及一种苹果酸酶突变体及其应用，即通过进化方法快速定向进化苹果酸酶，增加了进化机率并能够有效应用于琥珀酸等的生产。本发明筛选出的苹果酸酶突变体，其蛋白序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。所筛选出的酶突变体能有效的提高产琥珀酸的大肠杆菌中琥珀酸的产量，具有很好的经济应用前景。

Description

苹果酸酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于代谢工程和酶的定向进化领域，具体涉及一种苹果酸酶突变体及其应用，即利用代谢工程改造的重组大肠杆菌定向进化苹果酸酶，并将获得的定向进化苹果酸酶用于提高大肠杆菌琥珀酸的产量。

背景技术

苹果酸酶催化可逆反应：

苹果酸酶在中央代谢途径的三碳(C3)和四碳(C4)化合物的相互转换过程中扮演着重要的角色，是固定CO₂的C4回补途径的重要一员。与其它二氧化碳固定C4回补途径相比，苹果酸酶催化的反应途径具有明显的能量经济性，对研究生命碳循环、发展碳负性工业过程有着重要的意义。

微生物的固碳C4回补途径，主要包括由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PepC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PepCK)、丙酮酸羧化酶(Pyc)、和苹果酸酶(Mae)等催化的四条途径。苹果酸酶Mae催化丙酮酸羧化固定CO₂实现C4回补，从磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)开始计算可以净产生一个ATP，最大限度的回收了能量供细胞使用，因此具有能量经济性。同时，该反应不与大肠杆菌中主要的糖运输途径PTS系统竞争PEP(其底物之一是丙酮酸)，因此该反应具有明显的代谢循环优势。而其它几个C4回补酶都有各自的不足：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和HCO₃ ^-反应生成草酰乙酸和磷酸，没有ATP的产生；磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶催化PEP羧化生成草酰乙酸并净产生一个ATP，但是，该反应依赖于高浓度的PEP，与主要葡萄糖转运系统PTS系统消耗PEP相矛盾；丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，并消耗一个ATP，从PEP开始计算相当于没有净能量的产生，且该酶在大肠杆菌等一些微生物中不存在。因此，如何提高发酵菌中苹果酸酶Mae的含量或效率就成为研究的一个重要方面。

例如，Stols L等利用pTRC99a质粒载体在一个大肠杆菌突变株中过表达MaeA，通过色谱柱纯化了该酶，并且分别在Mn²⁺和Mg²⁺存在下测定了其对丙酮酸和苹果酸的Km值，发现Mn²⁺是更好的激活金属离子。1mM的Mn²⁺存在下，该酶对丙酮酸的Km值为16mM，而对苹果酸的Km值为0.26mM(Stols and Donnelly 1997)。Jinxia Wang等也表达纯化了大肠杆菌的MaeA，在最适pH7.2条件下测定了苹果酸和NAD⁺的Km值，分别为0.42mM和0.097mM，并且发现高浓度的底物苹果酸和NAD+都对脱羧反应酶活具有抑制作用(Wang，Tan et al.2007)。Federico P.Bologna等研究大肠杆菌的MaeA时发现其催化脱羧反应的效率约是羧化反应的30倍，而且发现脱羧反应的最适pH为7.5，而羧化反应的最适pH为7.0，该酶对苹果酸和丙酮酸的Km值分别为0.66mM和2.59mM(Bologna，Andreo et al.2007)。

尽管酶的动力学研究表明在生理条件下苹果酸酶倾向催化苹果酸脱羧反应；但羧化反应的标准自由能变化为-2kcal/mol，所以热力学应该更有利于羧化反应的进行。已有研究表明在生物体内苹果酸酶可以催化丙酮酸羧化反应，参与C4回补途径。Stols等人报道在丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶双突变的大肠杆菌NZN111菌株中过表达大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶，解决了原菌株在厌氧条件下丙酮酸过量积累造成的细胞毒性问题。Zelle等人在丙酮酸羧化酶缺陷的酿酒酵母中过表达大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶，获得了更高ATP产量的葡萄糖厌氧发酵菌株，证实了苹果酸酶催化的逆反应替代丙酮酸羧化酶发挥C4回补功能和有助于ATP积累的优势(Zelle，Harrison et al.2011)。现有的研究表明大肠杆菌NAD依赖的苹果酸酶可以发挥C4回补功能。因此，改造苹果酸酶的催化性能，强化苹果酸酶的表达，将之应用于代谢工程改造微生物，可望构建出具有高效C4回补途径的工程菌株。

发明目的

本发明的目的在提供一种苹果酸酶突变体及其应用，即通过进化方法快速并高通量的定向进化苹果酸酶，增加进化机率并应用于琥珀酸等的生产。

本发明的一个苹果酸酶突变体，其蛋白序列为SEQ ID NO：1，具体就是69位氨基酸密码子由原来的ACC变成了AGC，氨基酸由Thr变成了Ser。

本发明还包括编码序列为SEQ ID NO：1的苹果酸酶突变体的基因核苷酸，所述的基因序列的密码子为大肠杆菌的优势密码子。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：1的苹果酸酶突变体基因的质粒，例如pSLS16。

上述的基因，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一个苹果酸酶突变体，其序列为SEQ ID NO：3，具体就是181位氨基酸密码子由GCC变成了ACC，氨基酸由Ala变成Thr，其质粒命名为pSLS17。

本发明还包括编码序列为SEQ ID NO：3的苹果酸酶突变体的基因编码核苷酸序列，所述的基因序列的密码子为大肠杆菌的优势密码子。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO：3的苹果酸酶突变体基因的质粒，例如pSLS17。

上述的基因，其序列为SEQ ID NO：4。

上述的质粒转入产琥珀酸的大肠杆菌中，用于提高琥珀酸的产量。

本发明运用代谢进化与随机突变相结合的定向进化方法筛选出苹果酸酶突变体，所筛选出的突变体能有效的提高大肠杆菌琥珀酸的产量，具有较好的经济应用前景。

附图说明

图1大肠杆菌C4回补进化体系的构建图。

图2本发明的苹果酸酶突变体质粒构建和筛选过程示意图。

具体实施方式

本发明实施例中涉及到的培养基配方如下：

LB培养基(1L)：10g tryptone，5g yeast extract，5g NaCl。

NBS培养基配方如下：

琥珀酸分析方法如下：采用日本岛津高效液相色谱仪，岛津SPD-20A紫外检测器，BioRad公司Aminex HPX-87H离子色谱柱(300mm×7.8mm，9μm)，流动相2.75mM H2SO4、流速0.6mL/min、柱温50℃。其中用到的标准品如琥珀酸购自Sigma公司钠盐标准品。而发酵液的处理步骤如下：取1ml发酵液，80℃水浴10min，13000rpm离心10min，去除菌体和发酵液中的蛋白，取上清用流动相进行适当稀释，0.22μm微孔膜过滤后测定发酵液中有机酸生成情况。

OD550检测：都是在酶标仪上96孔板200μL体积下测定。

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

一、苹果酸酶突变体的筛选

1、首先构建可用于MaeA及PCK等C4回补酶体内分子进化的体系

敲除乳酸、甲酸、乙酸、乙醇的产生途径，敲除乙醛酸途径的阻遏调控基因iclR，敲除没有能量优势的大肠杆菌主要C4回补酶pepc基因，获得了菌株E.coliMG1655ΔadhEΔackA-ptaΔfocA-pflBΔiclRΔldhAΔpoXBΔppc，命名为SLEcS14，构建策略如图1所示。SLEcS14菌株在NBS基本培养基上好氧和厌氧都无法生长，通过紫外诱变获得了一株在含5％葡萄糖的NBS培养基上能厌氧微弱生长的菌株，命名为SLEcS15，在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上其厌氧生长与C4回补效率及琥珀酸产生相耦联，外源引入高效的具有能量优势的MaeA或PCK可以提高琥珀酸产量并促进菌体生长。SLEcS14大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和SLEcS15大肠埃希氏菌(Escherichia coli)已于2011年8月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号分别为CGMCC NO.5107、CGMCC NO.5108。

2、在SLEcS15菌株中进化筛选苹果酸酶突变体

通过随机突变试剂盒对maeA基因及其启动子区进行随机突变，再将突变的片段克隆至一个低拷贝质粒，并电转化至SLEcS15菌株中进行筛选。具体操作流程如下：以大肠杆菌MG1655基因组为模板，以maeA-1(SEQ ID NO：5AGCACGTGTTTCTTCGCTACGGC)和maeA-2(SEQ ID NO：6CTTCGCCATGTTTCAGTGAG)为引物，利用高保真酶扩增maeA基因及其启动子区，通过平末端克隆至pWSK29质粒的两个pvuII酶切位点中间，获得pSLS15质粒，测序确认其序列正确。以pSLS15质粒为模板，以maeA-1和maeA-2为引物，通过stratagene随机突变试剂盒(GeneMorph II EZCloneDomain Mutagenesis Kit，货号：200552)获得各种频率突变的MaeA^*，再平末端克隆至pWSK29质粒，电转化SLEcS15菌株感受态，转入100ml厌氧瓶装75ml含5％葡萄糖和Amp抗生素的NBS基本培养基进行培养，以含有pSLS15质粒的SLEcS15菌株为对照，以生长和琥珀酸产量为筛选标记，筛选能提高SLEcS15菌株生长和琥珀酸产量的MaeA^*，再DNA测序鉴定其突变位点，流程图见图2所示。pWSK29质粒的NCBI序列号为：AF016889。

以SLEcS15菌株为对照，检测转入了野生型MaeA质粒(命名为pSLS15)的SLEcS15的生长和琥珀酸产量。在LB液体培养基中37℃培养过夜，转接500ul 菌液至100ml厌氧瓶装75ml含5％葡萄糖的NBS基本培养基37℃培养48h，再取1mL转接100ml厌氧瓶装75mLNBS(补加5％葡萄糖和15μg/mL氨苄青霉素)基本培养基，发酵96h和144h检测其生长和琥珀酸产量，结果表明两株菌的生长和琥珀酸产量基本没有差别，也就说明过表达野生型的MaeA不起作用。

通过测定携带meaA酶突变体质粒的SLEcS15菌株生长和琥珀酸产量，获得了两个生长和琥珀酸产量明显提高的MaeA酶突变体，DNA测序鉴定，一个为69位氨基酸密码子由ACC变成了AGC，氨基酸由Thr变成了Ser；其蛋白序列为SEQID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其质粒命名为pSLS16。另一个为181位氨基酸密码子由GCC变成了ACC，氨基酸由Ala变成Thr，其蛋白序列为SEQ ID NO：3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4，其质粒命名为pSLS17。含有两个MaeA酶突变体的菌株生长和琥珀酸产量如下表所示，发酵96h，含pSLS16质粒菌株的生长和产酸分别是对照的1.35和1.95倍，含pSLS17质粒菌株的生长和产酸分别是对照的1.42和2.21倍；发酵144h，含pSLS16质粒菌株的生长和产酸分别是对照的1.48和1.91倍，含pSLS17质粒菌株的生长和产酸分别是对照的1.59和2.29倍。

96h样品	OD550	琥珀酸(g/l)
			SLEcS15(pSLS15)	0.26	1.35
SLEcS15(pSLS16)	0.35	2.63
			SLEcS15(pSLS17)	0.37	2.98
144h样品	OD550	琥珀酸(g/l)
			SLEcS15(pSLS15)	0.29	2.32
SLEcS15(pSLS16)	0.43	4.42
			SLEcS15(pSLS17)	0.46	5.32

由于氨基酸多密码子的存在，本发明筛选出的两个MaeA酶突变体，其蛋白序列可对应不同的核苷酸序列。但为了获得更好的表达效果，编码基因的密码子优选为大肠杆菌偏好密码子。

二、苹果酸酶突变体的应用

将分别(或同时)携带两个MaeA酶突变体(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)的质粒转入产琥珀酸的菌株中，可以有效地提高琥珀酸的产量。本发明具体实施中是将质粒转入了保藏编号为：CGMCC NO.5108的SLEcS15菌株中，琥珀酸产量提高了1～2倍。