CN104561163B - 生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使用重组棒杆菌微生物来生产L‑氨基酸的方法，在该重组棒杆菌微生物中利用基因转录抑制方法减弱了目的基因的表达。

Description

生产L-氨基酸的方法
相关申请
本申请要求于2013年10月11日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2013-0121090以及于2014年7月18日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2014-0091307的权益，以引用的方式将其公开的内容整体纳入到本文之中。
发明领域
本发明的一个或多个具体实施方式涉及利用基因转录抑制法来生产L-氨基酸的方法。
发明背景
相关技术的描述
丙酮酸，其是在棒杆菌(coryneform)微生物中对各种碳源进行糖酵解而产生的，经由草酰乙酸而转变成天冬氨酸。天冬氨酸可通过不同的生物合成通路转变成多种氨基酸，如苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸以及赖氨酸等(图1)。因此，可抑制处于氨基酸生物合成过程中各个分支点上的基因的表达，来降低副产物生成并提高目的氨基酸生产。
如上所述，为了利用基因工程和代谢工程开发能够高效生产目的材料的微生物菌株，需要选择性地控制与微生物各种代谢途径相关的基因的表达。最近，报道了一种用于减弱基因表达的技术，称之为“人工会聚转录”(artificial convergent transcription)(Krylov等，J Mol Microbiol Biotechnol，18：1-13，2010)。人工会聚转录是一种用于减弱目的基因表达的技术，通过将启动子插入到目的基因的转录终止子的下游区域中，使得启动子的相对方向(opposite direction)引起转录过程中源自每个启动子的RNA聚合酶复合体的碰撞。
本发明人开发了一种在乙酸盐存在的情况下选择性抑制目的基因表达的技术，通过在目的基因转录相对的方向上插入乙酸盐诱导型启动子进行，并有效地应用该技术来抑制棒杆菌微生物中位于分支点的基因的表达。随后发明人证实通过利用该技术提供了以高产量(yield)生产L-氨基酸的棒杆菌微生物并完成了本发明。
发明概述
本发明的目的在于提供一种通过利用乙酸盐诱导型启动子抑制目的基因转录来生产L-氨基酸的方法。
本发明的一个具体实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括：
1)培养能够生产L-氨基酸的重组棒杆菌微生物，其中该重组棒杆菌微生物通过将乙酸盐诱导型启动子插入到染色体中目的基因的终止密码子的下游转化的；以及
2)在培养过程中加入乙酸盐以减弱目的基因的表达并增强重组棒杆菌微生物的L-氨基酸生产能力。
附图简述
根据结合附图进行的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得显而易见的以及更容易理解，其中：
图1显示了棒杆菌微生物中的氨基酸生物合成过程的分支点；以及
图2为示意图，显示了通过将aceA基因启动子a)插入到aceE基因的终止密码子和转录终止子上游之间或b)以与aceE基因转录方向相反的方向插入至转录终止子下游而使得aceE基因表达受抑制。
发明详述
现在详细参考实施方式，其实例在附图中例示，其中相同的参考编号在全文中代表相同的要素。在这个方面，本发明具体实施方式可具有不同的形式，并且不应当被解释为限于本文所述的说明书。因此，下文中仅参照附图描述具体实施方式以解释本发明的方面。“至少一个/种”等表述，当在一系列要素之前时，修饰了整个系列的要素，而并不是修饰该系列的单个要素。
在下文中，详细描述了本发明。
本发明的一个具体实施方式提供了生产L-氨基酸的方法，该方法包括：
1)培养能够生产L-氨基酸的重组棒杆菌微生物，其中该重组棒杆菌微生物是通过将乙酸盐诱导型启动子插入到染色体中的目的基因终止密码子的下游而被转化的；以及
2)在培养过程中加入乙酸盐以减弱目的基因的表达并增强重组棒杆菌微生物的L-氨基酸生产能力。
本文中所使用的术语“乙酸盐诱导型启动子”是指在乙酸盐存在的情况下具有基因表达诱导活性的启动子。
在棒杆菌微生物中，乙酸盐被乙酸激酶(acetate kinase)(ackA，NCgl2656)和磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)(pta，NCgl2657)，或者被琥珀酰-CoA：乙酸CoA-转移酶(actA，NCgl2480)转化成乙酰辅酶A，随后在乙醛酸(glyoxalate)循环中被异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase)(aceA，Ncgl2248)所代谢。在大肠杆菌(Escherichia coli)中，乙酸盐被乙酰辅酶A合成酶(acs，b4069)转化成乙酰辅酶A(Gerstmeir等，J Biotechnol，104：99-122，2003)。参与乙酸盐代谢的所述基因的表达在乙酸盐存在的情况下被诱导。因此，当使用所述基因的启动子时，可在乙酸盐存在的情况下特异性地诱导基因的表达。
乙酸盐诱导型启动子包括异柠檬酸裂合酶(aceA，Ncgl2248)编码基因的启动子或磷酸转乙酰酶(pta，NCgl2657)编码基因和乙酸激酶(ackA，NCgl2656)编码基因的操纵子的启动子，其是pta基因的上游启动子。更具体地，在上述的乙酸盐诱导型启动子中，aceA基因的启动子如SEQ ID NO：1的核苷酸序列所示，包括aceA基因上游的486个碱基对以及来自于开放阅读框(ORF)N端的36个碱基对。
pta基因的上游启动子，其为另一种乙酸盐诱导型启动子，如SEQ ID NO：2的核苷酸序列所示，包括pta基因上游的340个碱基对。
此外，很明显，能够通过乙酸盐诱导目的基因表达的任何启动子都可包括在本发明的范围内。例如，乙酸盐诱导型启动子可包括：包括SEQ ID NO：1或2核苷酸序列，或包括SEQ IDNO：1或2核苷酸序列的保守序列并在一个或多个位置上进行替换、缺失、插入、添加或倒置(inverse)的一个或多个核苷酸(具体地为2至20，更具体地，2至10，更为具体地，2至5个核苷酸，取决于蛋白质氨基酸残基的空间构象)的核苷酸序列。只要诱导型启动子的功能得到维持或增强，可包括核苷酸序列与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列具有超过80％同源性，具体地超过90％，更具体地超过95％，更更具体地超过97％。只要诱导型启动子的功能得到维持，替换、缺失、插入、添加或倒置的核苷酸序列可包括自发的突变体序列，或者甚至是人工突变体序列。
本文中所使用的术语“同源性”是指两条不同核苷酸序列之间的同一性。同源性可由本领域已知的方法利用计算参数，诸如得分、同一性和相似性的BLAST 2.0软件程序进行测定。然而，测定同源性的方法并不限于此。
除非在本文中另有说明，术语“上游”是指5’方向，术语“下游”是指3’方向。通常，转录进行的方向是5’至3’，因此启动子的位置往往位于目的基因的上游(5’)。
在本文中，染色体中的目的基因可以是参与从各种碳源中生物合成氨基酸，例如苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸以及赖氨酸等的过程的基因，特别是位于生物合成通路的分支点上的基因。
例如，对于赖氨酸，参与丙酮酸向乙酰辅酶A的转化的丙酮酸脱氢酶亚基E1(pyruvate dehydrogenase subunit E1)(aceE，NCgl2167)基因，从天冬氨酸产生高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase)(hom，NCgl1136)基因，以及利用内消旋-2，6-二氨基庚二酸(meso-2，6-diaminopimelate)(其在体细胞合成中是赖氨酸前体)的UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2，6-二氨基庚二酸连接酶(UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamate-2，6-diaminopimelate ligase)(murE，NCgl2083)基因，位于生物合成通路中的分支点上。
此外，对于是苏氨酸，参与从天冬氨酸生产赖氨酸过程的二氢甲基吡啶酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)(dapA，NCgl1896)位于分支点上，对于甲硫氨酸，参与从高丝氨酸生产苏氨酸的高丝氨酸激酶(thrB，NCgl1137)位于分支点上。对于作为丙酮酸衍生的氨基酸的丙氨酸和缬氨酸，参与将丙酮酸转化为乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶亚基E1(aceE，NCgl2167)基因位于分支点上。
因此，目的基因可选自由如下组成的组中：编码丙酮酸脱氢酶亚基E1(aceE，NCgl2167)的基因，编码高丝氨酸脱氢酶(hom，NCgl1136)的基因，编码UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2，6-二氨基庚二酸连接酶(murE，NCgl2083)的基因，以及编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA，NCgl1896)的基因，但不限于此。
具体而言，丙酮酸脱氢酶亚基E1(aceE，NCgl2167)是丙酮酸脱氢酶复合体中(PDHC)的蛋白质亚基之一，其参与作为糖酵解终产物的丙酮酸流向三羧酸循环(TCA循环)的过程。因此，减弱aceE基因的表达可减少碳源向TCA循环的流入，并增加碳源向赖氨酸生物合成通路的流入以提高赖氨酸的产量。
高丝氨酸脱氢酶(hom，NCgl1136)是一种从天冬氨酸半醛合成高丝氨酸的酶。由于天冬氨酸半醛是赖氨酸生物合成通路的中间前体之一，减弱hom基因活性可减少碳源向高丝氨酸生物合成通路的流入，并增加碳源向赖氨酸生物合成通路的流入以提高赖氨酸的产量。
UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2，6-二氨基庚二酸连接酶(murE，NCgl2083)利用内消旋-2，6-二氨基庚二酸进行体细胞合成。由于内消旋-2，6-二氨基庚二酸也被用作赖氨酸生物合成的前体，减弱murE基因活性可减少碳源向体细胞合成的流入，并增加碳源向赖氨酸生物合成通路的流入以提高赖氨酸的产量。
二氢吡啶二羧酸合酶(dapA，NCgl1896)是参与利用天冬氨酸半醛来产生赖氨酸的酶。由于天冬氨酸半醛是赖氨酸生物合成通路的中间前体之一，dapA基因活性的减弱可减少碳源向赖氨酸生物合成通路的流入，并增加碳源向苏氨酸生物合成通路的流入以提高苏氨酸的产量。
本文中所使用的术语“终止密码子”是指在mRNA上不编码氨基酸但却作为蛋白质合成的终止信号行使功能的密码子。通常包括UAA、UAG和UGA的三个密码子被用作终止密码子。
本文中所使用的术语“转录终止子”是指富含GC碱基的反向重复序列。转录终止子形成发夹环以终止基因转录。
在本发明中，为了减弱目的基因的表达，如上所述，可将乙酸盐-诱导型启动子导入至目的基因终止密码子下游，具体而言，位于终止密码子和转录终止子上游之间。乙酸盐诱导型启动子可用于导致目的基因的反向转录，以使得RNA聚合酶复合体相互抵触，从而减弱目的基因的表达。
可在培养的任意时间减弱目的基因的表达。更具体而言，可在培养前或在培养中减弱目的基因的表达。
本文中所使用的术语“转化”是指将包含编码目的基因的多核苷酸的载体导入宿主细胞中，以使得由该多核苷酸编码的蛋白能在宿主细胞中表达。该多核苷酸可插入宿主细胞的染色体中或存在于染色体之外，只要导入的多核苷酸可在宿主细胞中表达即可。此外，多核苷酸包括编码目的蛋白的DNA或RNA。只要能够将多核苷酸导入宿主细胞并在宿主细胞中表达，该多核苷酸可以以任何形式导入。
在本发明的一个实施方式中，棒杆菌微生物可包括棒杆菌属(Corynebacterium)，短杆菌属(Brevibacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)菌种、细杆菌属(Microbacterium)物种的微生物。棒杆菌类微生物的示例包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、热氨基棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)以及由此制备的生产L-氨基酸的变种。具体而言，棒杆菌类微生物可以是谷氨酸棒杆菌，但不限于这些示例。
更具体地，本发明中的棒杆菌微生物可包括谷氨酸棒杆菌KCCM11016P(以前的登录号：KFCC10881，参见韩国专利号10-0159812)，谷氨酸棒杆菌KCCM10770P(参见韩国专利号10-0924065)以及谷氨酸棒杆菌KCCM11347P(以前的登录号：KFCC10750，参见韩国专利号10-0073610)。
谷氨酸棒杆菌CJ3P也可包括在本发明的棒杆菌微生物中。已经通过对亲本菌株(根据Binder等(Binder等，Genome Biology，13：R40，2012)报道的野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13032))引入涉及赖氨酸生产效率的三个基因的突变(pyc(P458S)、hom(V59A)和lysC(T311I))将CJ3P开发为具有赖氨酸生产能力。
此外，本发明中的另外一个棒杆菌类微生物可以是谷氨酸棒杆菌KCCM11222P，其为L-苏氨酸生产菌株(参见韩国专利号10-1335853)。
根据本发明的一个具体实施方式，在所有导入有由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列所示的启动子的棒杆菌微生物中，L-赖氨酸或L-苏氨酸生产力比起亲本菌株有所提高。
关于本发明中提供的方法，可通过应用本领域已知的任意的培养条件以及培养方法来进行棒杆菌类微生物的培养。
可用于棒杆菌菌株的培养的培养基可以是，例如由美国微生物学会出版的Manualof Methods for General Bacteriology(华盛顿特区，美国，1981)中描述的培养基。
可用于培养基中的碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉以及纤维素，油或脂类，例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，例如甘油和乙醇，以及有机酸，例如乙酸。这些物质可以是单独的也可以作为混合物。
可用于培养基中的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(com steep liquid)、大豆和尿素，以及无机氮源，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵以及硝酸铵。这些氮源也可以是单独的或作为混合物。
可用于培养基中的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及其含钠盐。此外，培养基可能必须包括生长所需的金属盐，例如硫酸镁和硫酸铁。除了上述的物质，还可使用生长所必需的物质，例如氨基酸和维生素。此外，培养基中可使用合适的前体。原料在培养过程中可以以分批方式或以连续方式加入到培养溶液中。
在微生物的培养过程中，可通过以合适的方式向培养基中加入碱性化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾和氨水，或酸性化合物，例如磷酸和硫酸来调整培养基的pH值。此外，通过使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，来抑制泡沫形成。为了维持需氧环境，可向培养基中注入氧气或含氧气的气体(例如空气)。培养基的温度通常可以为约20℃至约45℃，具体地，约25℃至约40℃。可持续进行培养直到产生所需量的L-氨基酸，但合适的培养时间可从约10至160小时。
关于本发明所提供的方法，培养可以以连续方式或分批方式(例如分批法、分批补料法以及重复分批补料法)进行。这些培养方法在本领域是已知的，并可使用任意的培养方法。
本文中所使用的术语“培养”包括制备培养基和培养微生物的时间两者。
关于本发明中提供的方法，该方法可进一步包括纯化和回收步骤。根据诸如分批培养、连续培养和分批补料法培养等方法而定，可通过使用本领域已知的合适方法来从培养溶液中纯化或回收目的L-氨基酸。
在本发明的培养中所产生的L-氨基酸可以是选自如下组中的一种：苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸，具体而言，赖氨酸或苏氨酸。
在下文中，将参照实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅用于描述目的而不是将本发明的范围限制于此。
实施例
实施例1：乙酸盐诱导型启动子的选择
异柠檬酸裂合酶(aceA，NCgl2248)是乙醛酸循环的关键性酶，异柠檬酸裂合酶编码基因在乙酸盐存在的情况下表达。此外，乙酸激酶(ackA，NCgl2656)和磷酸转乙酰酶(pta，NCgl2657)(它们是参与乙酸盐代谢过程的酶)形成操纵子，并且它们的表达在乙酸盐存在的情况下得到增强。aceA基因和pta-ackA操纵子的启动子区域是已知的(Gerstmeir等，J Biotechnol，104，99-122，2003)。
在实施例1中，选择了aceA基因的启动子以及pta-ack操纵子的启动子(其为pta基因的上游启动子区域)以在乙酸盐存在的情况下抑制目的基因的转录。基于在美国NIHGenBank中登记的aceA基因(NCBI登记号：NCgl2248)，获得了核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其包括aceA基因上游的486个碱基对和从开放阅读框(ORF)N末端起的36个碱基对。此外，基于在美国NIH GenBank中登记的pta基因(NCBI登记号：NCgl2657)，获得了包括pta基因上游340个碱基对的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
实施例2：用于抑制aceE基因表达的载体的制备
丙酮酸脱氢酶亚基E1(aceE，NCgl2167)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)的蛋白质亚基之一，其参与丙酮酸(其为糖酵解最终的代谢产物)流入TCA循环。因此，使aceE基因表达的减弱可降低碳源向TCA循环的流入并提高碳源流入赖氨酸生物合成通路，从而提高赖氨酸生产(Blombach等，Appl Microbiol Biotechnol，76(3)：615-23，2007)。
将aceA基因启动子插入到aceE基因的下游，以使得在乙酸盐存在的情况下，从此启动子开始的转录与aceE基因转录的初始方向相对，从而可选择地抑制aceE基因的表达(图2)。
首先，使用CLC主工作台软件(CLC Bio，丹麦)来预测aceE基因的转录终止子。转录终止子是富含GC碱基的反向重复序列，其形成发夹环以终止基因转录。对aceE基因转录终止子预测的结果显示，从aceE基因终止密码子起其下游的第21个碱基对至第56个碱基对之间的36个碱基对形成了发夹环，其为转录终止子。基于此结果，制备了两个载体，以将aceE启动子分别插入至aceE基因转录终止子的上游或下游，使得从此启动子的转录可以在与初始转录的方向相对的方向发生。
<2-1>用于抑制aceE基因表达的pDZ-aceE1-PaceA载体的制备
通过将aceA基因启动子插入到aceE基因终止密码子的下游(在终止密码子和转录终止子的上游之间)来制备载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceE基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板来合成引物(SEQ ID NO：3和4)，所述引物被设计为在片段的5’端具有XbaI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有SpeI限制性酶识别位点。利用合成的引物进行PCR以获得包括从aceE基因的起始密码子起第2474个核苷酸至第2769个核苷酸(aceE基因的终止密码子)之间共296个碱基对的DNA片段。此外，合成了设计为在片段的5’端具有SpeI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有XbaI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：5和6)，并使用该引物进行PCR以获得包括位于aceE基因终止密码子下游的300个碱基对的DNA片段。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶进行PCR，其使用30个循环的95℃变性30秒，55℃退火30秒，以及72℃聚合30秒；然后在72℃聚合7分钟。
使用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR扩增产物与已用XbaI限制性酶切割准备好的用于进行染色体导入的pDZ载体(参见韩国专利：10-0924065)进行克隆以制备pDZ-aceE1载体。
SEQ ID NO：3：aceE-P1F 5’-ccggggatcctctagacctccggcccatacgttgc-3’
SEQ ID NO：4：aceE-P1R 5’-ttgagactagttattcctcaggagcgtttg-3’
SEQ ID NO：5：aceE-P2F 5’-gaataactagtctcaagggacagataaatc-3’
SEQ ID NO：6：aceE-P2R 5’-gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag-3’
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceA基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端和3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：7和8)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约500碱基对的如SEQID NO：1所示的启动子区域。利用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将PCR扩增产物与用SpeI限制性酶处理pDZ-aceE1而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-aceE1-PaceA载体。
SEQ ID NO：7：PaceA-P3F 5’-gtcccttgagactagtagcactctgactacctctg-3’
SEQ ID NO：8：PaceA-P3R 5’-ctgaggaata actagtttcctgtgcggtacgtggc-3’
<2-2>用于抑制aceE基因表达的pDZ-aceE2-PaceA载体的制备
通过将aceA基因启动子插入至aceE基因转录终止子的下游来制备载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceE基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，并使用设计为在片段的5’端具有XbaI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：9和10)。利用合成的引物进行PCR以获得包括从aceE基因起始密码子起第2538个核苷酸至终止密码子下游第62个核苷酸之间共294个碱基对的DNA片段。此外，使用设计为在片段的5’端具有SpeI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有XbaI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：11和12)进行PCR，以获得包括aceE基因终止密码子下游第69个核苷酸至第362个核苷酸之间的294个碱基对的DNA片段。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，进行PCR：30个循环的95℃变性30秒，55℃退火30秒，以及72℃聚合30秒；然后在72℃聚合7分钟。
使用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR扩增产物与已用XbaI限制性酶切割而准备好的用于进行染色体导入的pDZ载体进行克隆以制备pDZ-aceE2载体。
SEQ ID NO：9：aceE-P4F 5’-ccggggatcctctagaggtcccaggcgactacacc-3’
SEQ ID NO：10：aceE-P4R 5’-gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta-3’
SEQ ID NO：11：aceE-P5F 5’-gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc-3’
SEQ ID NO：12：aceE-P5R 5’-gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac-3’
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceA基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端和3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：13和14)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约500碱基对的如SEQID NO：1所示的启动子区域。利用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将PCR扩增产物与用SpeI限制性酶处理pDZ-aceE2载体而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-aceE2-PaceA载体。
SEQ ID NO：13：PaceA-P6F 5’-aaaaagagctactagtagcactctgactacctctg-3’
SEQ ID NO：14：PaceA-P6R 5’-gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc-3’
实施例3：aceA基因启动子插入aceE基因下游的菌株的制备
通过电脉冲将实施例2中制备的pDZ-aceE1-PaceA和pDZ-aceE2-PaceA载体分别导入到L-赖氨酸生产菌株-谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中(转化方法描述于Van der Rest等，Appl Microbiol Biotechnol，52：541-545，1999中)。通过实施PCR来选择相应的菌株以获得L-赖氨酸生产菌株，在所述菌株中，aceA基因启动子插入到染色体上的aceE基因终止密码子下游以使得从此启动子的转录可以在与初始转录的方向相反的方向发生。所选择出来的菌株分别命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE1-PaceA以及谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE2-PaceA。谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE1-PaceA于2013年6月12日以谷氨酸棒杆菌CA01-2271为名国际保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Centerof Microorganism(KCCM))，登录号为KCCM11432P。利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6作为引物对KCCM11016P：：aceE1-PaceA，利用SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12作为引物对KCCM11016P：：aceE2-PaceA进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的菌株。
实施例4：aceA基因启动子插入aceE基因下游的菌株的赖氨酸生产力比较
利用下文所述的方法培养谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株(用作亲本菌株)以及谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE1-PaceA和谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE2-PaceA(为实施例3中所制备的L-赖氨酸生产菌株)。
将谷氨酸棒杆菌KCCM11016P KCCM11016P：：aceE1-PaceA以及谷氨酸棒杆菌KCCM11016P：：aceE2-PaceA分别接种至其中含有25ml种子培养基的250ml有转角挡板的(corner-baffled)烧瓶中，随后在30℃以200rpm振荡培养20小时。将1ml种子培养溶液加入至含有下文所述24ml生产培养基的250ml有转角挡板的烧瓶中，随后在30℃以200rpm振荡培养72小时。相应的种子培养基和生产培养基的组成如下所述。
<种子培养基(pH7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO44g，K2HPO48g，MgSO4·7(H2O)0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(以1L蒸馏水为参准)。
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖100g，(NH4)2SO440g，大豆蛋白2.5g，玉米浆固体5g，尿素3g，KH2PO41g，MgSO4·7(H2O)0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3000μg，CaCO330g(以1L蒸馏水为参准)。
在培养之后，用HPLC来测量L-赖氨酸的浓度。当未加入乙酸盐的时候，谷氨酸棒杆菌KCCM11016P、KCCM11016P：：aceE1-PaceA和KCCM11016P：：aceE2-PaceA培养溶液中的L-赖氨酸浓度显示在表1中。
表1.L-赖氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐，用同样的方法培养菌株以对比L-赖氨酸生产。培养溶液中L-赖氨酸的浓度显示在表2中。
表2.L-赖氨酸生产的变化(加入5g/L的乙酸盐)
如表1中所示，在不存在乙酸盐的情况下，KCCM11016P：：aceE1-PaceA菌株和KCCM11016P：：aceE2-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力与亲本菌株KCCM11016P的并无不同。
然而，如表2中所示，在存在乙酸盐的情况下，KCCM11016P：：aceE1-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力比亲本菌株KCCM11016P高出了超过3.6％，KCCM11016P：：aceE2-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力比亲本菌株KCCM11016P高出了超过2.5％。
此外，KCCM11016P：：aceE1-PaceA菌株和KCCM11016P：：aceE2-PaceA菌株的对比显示，KCCM11016P：：aceE1-PaceA菌株(其中aceA启动子插入到aceE基因转录终止子的上游，位于终止密码子和转录终止子的上游之间)生产L-赖氨酸更为有效。这暗示，使用终止密码子和转录终止子的上游之间的区域可更加有效地抑制基因表达。
实施例5：用于抑制aceE基因表达的pDZ-aceE-Ppta载体的制备
乙酸激酶(ackA，NCgl2656)和磷酸转乙酰酶(pta，NCgl2657)，其为参与乙酸盐代谢途径的酶，形成操纵子，并且在存在乙酸盐的情况下其表达得到增强。因此，当使用这些基因的启动子时，在存在乙酸盐时可特异性地诱导基因的表达。
在实施例5中，为了在乙酸盐存在的情况下抑制aceE基因的表达，制备了使用pta-ack操纵子启动子(其为pta基因上游启动子区域)的载体。
为了抑制aceE基因的表达，构建了在aceE基因终止密码子下游含有pta基因启动子(即位于终止密码子和转录终止子的上游之间)的载体，以使得从pta基因启动子的转录可以在与aceE基因转录的初始方向相反的方向发生。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceE基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，用与实施例2相同的方法来制备pDZ-aceE1载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的pta基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端和3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：15和16)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约340碱基对的如SEQID NO：2的核苷酸序列所示的启动子区域。利用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将PCR扩增产物与用SpeI限制性酶处理pDZ-aceE1而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-aceE1-Ppta载体。
SEQ ID NO：15：Ppta-P7F 5’-gtcccttgagactagtctttgctggggtcagatttg-3’
SEQ ID NO：16：Ppta-P7R 5’-ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3’
实施例6：pta基因启动子插入aceE基因下游的菌株的制备及其赖氨酸生产力的比较
用实施例5中制备的pDZ-aceE1-Ppta载体根据与实施例3相同的方法来转化谷氨酸棒杆菌KCCM11016P。通过实施PCR来选择相应的菌株，在所述菌株中，pta基因启动子插入到染色体上的aceE基因终止密码子下游以使得从此启动子的转录可以在与初始转录的方向相反的方向发生，以获得L-赖氨酸生产菌株，命名为KCCM11016P：：aceE1-Ppta。利用SEQID NO：3和SEQ ID NO：6作为引物进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的KCCM11016P：：aceE1-Ppta菌株。
利用与实施例4相同的方法来培养所制备的菌株，并测量从培养溶液中回收到的L-赖氨酸的浓度。当未加入乙酸盐时，培养溶液中L-赖氨酸的浓度如表3所示。
表3.L-赖氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐，用同样的方法培养菌株以对比L-赖氨酸生产。培养溶液中L-赖氨酸的浓度显示在表4中。
表4.L-赖氨酸生产的变化(加入5g/L的乙酸盐)
如表3中所示，在不存在乙酸盐的情况下，KCCM11016P：：aceE1-Ppta的L-赖氨酸生产力与亲本菌株KCCM11016P的并无不同。
然而，如表4中所示，在存在乙酸盐的情况下，KCCM11016P：：aceE1-Ppta菌株的L-赖氨酸生产力比亲本菌株KCCM11016P高出了超过2.4％。
此外，由于在存在乙酸盐的情况下，KCCM11016P：：aceE1-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力比KCCM11016P：：aceE1-Ppta菌株的要高，因此使用aceA基因启动子可能要比使用pta基因启动子更能有效地抑制目的基因的表达。
实施例7：aceA基因启动子插入aceE基因下游的菌株的制备
用实施例2中制备的pDZ-aceE1-PaceA载体，根据与实施例3相同的方法分别转化三种赖氨酸-生产菌株(谷氨酸棒杆菌KFCC10750、KCCM10770P和CJ3P)。通过实施PCR来选择菌株，其中aceA基因启动子插入到染色体上的aceE基因终止密码子下游以使得从此启动子的转录可以与初始转录的方向相反的方向上发生。所获得的三种L-赖氨酸生产菌株是KFCC10750：：aceE1-PaceA、KCCM10770P：：aceE1-PaceA和CJ3P：：aceE1-PaceA。利用SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：6作为引物进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的菌株。
利用与实施例4相同的方法来培养所制备的菌株，并测量从培养溶液中回收到的L-赖氨酸的浓度。当未加入乙酸盐时，培养溶液中L-赖氨酸的浓度如表5所示。
表5：L-赖氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐外，用同样的方法培养菌株以对比L-赖氨酸的产量。培养溶液中L-赖氨酸的浓度显示在表6中。
表6：L-赖氨酸生产的变化(加入5g/L乙酸盐)
如表5中所示，在不存在乙酸盐的情况下，3种菌株KFCC10750：：aceE1-PaceA、KCCM10770P：：aceE1-PaceA、CJ3P：：aceE1-PaceA的L-赖氨酸生产力与亲本菌株并无不同。
然而，如表6中所示，在存在乙酸盐的情况下，KFCC10750：：aceE1-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力比亲本菌株高出了5％，KCCM10770P：：aceE1-PaceA菌株比亲本菌株高2.8％，CJ3P：：aceE1-PaceA菌株比亲本菌株高15％。
实施例8：用于抑制hom基因表达的载体的制备
可以减弱与L-赖氨酸生物合成通路使用相同底物的L-苏氨酸生物合成通路来提高L-赖氨酸的产量。减弱L-苏氨酸生物合成通路的方法的示例为降低高丝氨酸脱氢酶(hom，NCgl1136)的酶活性，该酶可从天冬氨酸生产高丝氨酸。
在谷氨酸棒杆菌中，hom基因与thrB基因形成hom-thrB操纵子，hom基因的转录终止子位于thrB基因的下游。据报道，hom基因上游，即hom-thrB操纵子的上游中具有一个启动子。此外，据报道thrB基因操纵子的上游有第二个启动子(Mateos等，J Bacteriol，176：7362-7371，1994)。因此，将aceA基因启动子插入到hom基因终止密码子的下游，以使得在存在乙酸盐时从此启动子的转录可以在与hom基因转录的初始方向相反的方向发生，以便选择性抑制hom基因的表达。为了维持thrB基因的表达，在thrB基因ORF的上游加入第二个启动子序列。
在实施例8中，通过将aceA基因启动子插入至hom基因终止密码子下游和thrB基因上游之间来制备重组载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的hom基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，并合成引物(SEQ ID NO：17和18)，所述引物被设计为在片段的5’端具有XbaI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有SpeI限制性酶识别位点。使用合成的引物进行PCR，以获得包括从hom基因起始密码子起第1039位核苷酸至第1338位核苷酸(其为终止密码子)之间共300个碱基对的DNA片段。甚至于当aceA插入至hom-thrB操纵子之间时，thrB基因的表达也应维持。因此，当制备包括hom基因终止密码子下游300个碱基对的DNA片段时，合成了设计为将32个碱基对的thrB启动子序列进一步加入到5’端的引物(SEQ IDNO：19和20)。使用这些引物(SEQ ID NO：19和20)进行PCR以获得在片段的5’端具有SpeI限制性酶识别位点以及片段的3’端具有XbaI限制性酶识别位点的334个碱基对的DNA片段。PCR是在与实施例2相同的条件下实施。
用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR扩增产物与已利用XbaI限制性酶切而准备好用于染色体导入的pDZ载体进行克隆来制备pDZ-hom载体。
SEQ ID NO：17：hom-h1F 5’-ccggggatcctctagaccaggtgagtccacctacg-3’
SEQ ID NO：18：hom-h1R 5’-gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg-3’
SEQ ID NO：19：hom-h2F 5’-actagtgatccgcctcgaaagggac-3’
SEQ ID NO：20：hom-h2R 5’-gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg-3’
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceA基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端和3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：21和22)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约500碱基对的如SEQID NO：1所示的启动子区域。利用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将PCR扩增产物与用SpeI限制性酶处理pDZ-hom载体而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-hom-PaceA载体。
SEQ ID NO：21：PaceA-h3F 5’-gaggcggatcactagtagcactctgactacctctg-3’
SEQ ID NO：22：PaceA-h3R 5’-aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc-3’
实施例9：aceA基因启动子插入hom基因下游的菌株的制备及其赖氨酸生产力的对比
用实施例8中制备的pDZ-hom-PaceA载体根据与实施例3相同的方法来转化谷氨酸棒杆菌KCCM11016P。通过实施PCR来选择相应的菌株以获得L-赖氨酸生产菌株，在所述菌株中，aceA基因启动子插入到染色体上的hom基因终止密码子下游以使得从此启动子的转录可以在与hom基因初始转录的方向相反的方向发生，该菌株命名为KCCM11016P：：hom-PaceA。利用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20作为引物进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的KCCM11016P：：hom-PaceA菌株。
通过与实施例4相同的方法来培养用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P以及所制备的KCCM11016P：：hom-PaceA菌株，并测量从培养溶液中回收到的L-赖氨酸的浓度。当未加入乙酸盐时，谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株和KCCM11016P：：hom-PaceA培养溶液中L-赖氨酸的浓度如表7所示。
表7：L-赖氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐外，用同样的方法培养菌株以对比L-赖氨酸生产。培养溶液中L-赖氨酸的浓度显示在表8中。
表8：L-赖氨酸生产的变化(加入5g/L乙酸盐)
如表7所示，在不存在乙酸盐时，KCCM11016P：：hom-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力与亲本菌株KCCM11016P并无不同。
然而，如表8所示，在存在乙酸盐时，KCCM11016P：：hom-PaceA菌株的L-赖氨酸生产力要比亲本菌株KCCM11016P高出超过2.6％。
实施例10：用于抑制murE基因表达的载体的制备
UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2，6-二氨基庚二酸连接酶(murE，NCgl2083)在体细胞合成中使用内消旋-2，6-二氨基庚二酸(其是赖氨酸生物合成的前体)。减弱murE基因活性可降低碳源向体细胞合成的流入并增加碳源向赖氨酸合成通路的流入以提高赖氨酸产量。
在谷氨酸棒杆菌中，murE基因(NCgl2083)与NCgl2076至NCgl2082的七个基因形成操纵子。该操纵子的转录以NCgl2076基因的方向从NCgl2083murE开始。因此，转录终止子存在于NCgl2076基因的下游。因此，将aceA基因启动子插入到murE基因终止密码子的下游，使得为了在乙酸盐存在的情况下选择性抑制murE基因的表达，可以在与murE基因转录的初始方向相反的方向发生转录。为了维持除位于操纵子第一区域的murE基因之外其他七个基因的表达，将murE操纵子启动子进一步添加到NCgl2082基因ORF的上游。
在实施例10中，通过将aceA基因启动子插入至murE基因终止密码子的下游制备了重组载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的murE基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，并合成引物，所述引物被设计为在片段的5’端具有XbaI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有XhoI限制性酶识别位点(SEQ ID NO：23和24)。使用合成的引物进行PCR，以获得包括从murE基因起始密码子起第1267位核苷酸至第1566位核苷酸(即终止密码子)之间共300个碱基对的DNA片段。此外，还合成了设计为在片段的5’端具有XhoI限制性酶识别位点和在片段的3’段具有XbaI限制性酶识别位点(SEQ ID NO：25和26)的引物。使用合成的引物进行PCR，以获得包括从murE基因终止密码子下游第10个核苷酸起的292个碱基对的DNA片段。在与实施例2相同的条件下实施PCR。用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR产物与已用XbaI进行限制性酶切而准备好的用于染色体导入的pDZ载体进行克隆来制备pDZ-murE载体。
SEQ ID NO：23：mur-m1F 5’-ccggggatcctctagaaaccctcgttcagaggtgc-3’
SEQ ID NO：24：mur-m1R 5’-ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag-3’
SEQ ID NO：25：mur-m2F 5’-ag ctcgagatgatcacaatgacccttgg-3’
SEQ ID NO：26：mur-m2R 5’-gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc-3’
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceA基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端具有XhoI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：27和28)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约500碱基对的如SEQ ID NO：1碱基序列所示的启动子区域。此外，为了获得谷氨酸棒杆菌来源的murE操纵子的启动子区域，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，以及合成了设计为在片段的3’端具有XhoI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：29和30)。使用合成的引物进行PCR，以获得包括位于murE基因ORF下游的300个碱基的DNA片段。
用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR扩增产物与用XhoI限制性酶处理pDZ-murE载体而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-murE-PaceA-PmurE载体。
SEQ ID NO：27：mur-m3F 5’-tcatcagcagcactctgactacctctg-3’
SEQ ID NO：28：mur-m3R 5’-agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc-3’
SEQ ID NO：29：mur-m4F 5’-agagtgctgctgatgatcctcgatttg-3’
SEQ ID NO：30：mur-m4R 5’-ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg-3’
实施例11：aceA基因启动子插入至murE基因下游的菌株的制备及其赖氨酸生产力的对比
用实施例10中制备的pDZ-murE-PaceA-PmurE载体根据与实施例3相同的方法来转化谷氨酸棒杆菌KCCM11016P。
通过实施PCR来选择相应的菌株以获得L-赖氨酸生产菌株，在所述菌株中，aceA基因启动子插入到染色体上的murE基因终止密码子下游以使得从此启动子的转录可以在与murE基因初始转录的方向相反的方向进行，该菌株命名为KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE。利用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：26作为引物进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE菌株。
通过与实施例4相同的方法来培养用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11016P以及所制备的KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE菌株，并测量从培养溶液中回收的L-赖氨酸的浓度。当未加入乙酸盐时，谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株和KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE菌株培养溶液中的赖氨酸浓度如表9所示。
表9：L-赖氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐，用同样的方法培养菌株以对比L-赖氨酸生产。培养溶液中L-赖氨酸的浓度显示在表10中。
表10：L-赖氨酸生产的变化(加入5g/L乙酸盐)
如表9所示，在不存在乙酸盐时，KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE菌株的L-赖氨酸生产力与亲本菌株KCCM11016P的并无不同。
然而，如表10所示，在存在乙酸盐时，KCCM11016P：：murE-PaceA-PmurE菌株的L-赖氨酸生产力要比亲本菌株KCCM11016P高超过2.8％。
实施例12：用于抑制dapA基因表达的载体的制备
可以减弱与L-苏氨酸生物合成通路使用相同底物的L-赖氨酸生物合成通路来提高L-赖氨酸的产量。减弱L-赖氨酸生物合成通路的方法的示例是为了降低二氢吡啶二羧酸合酶(dapA，NCgl1896)的酶活性，该酶参与从天冬氨酸生产赖氨酸。
在谷氨酸棒杆菌中，dapA基因与ORF4(NCgl1895)基因形成dapA-ORF4操纵子，因此dapA基因的转录终止子位于ORF4基因的下游。此外，据报道启动子存在于dapA-ORF4操纵子的上游，其是dapA基因的上游，并且第二启动子存在于ORF4基因的上游(Patek等，Biotechnology letters，19：1113-1117，1997)。因此，将aceA基因启动子插入到dapA基因终止密码子下游，以使得转录可以在与dapA基因转录的初始方向相反的方向发生，以在乙酸盐存在的情况下选择性地抑制dapA基因的表达。为了维持ORF4基因的表达，将ORF4基因上游约100个碱基对的启动子区域序列加入到ORF4基因ORF的上游。
在实施例12中，通过将aceA基因启动子插入到dapA基因终止密码子的下游制备了重组载体。
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的dapA基因的片段，使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板，并合成引物(SEQ ID NO：31和32)，所述引物被设计为在片段的5’端具有XbaI限制性酶识别位点以及在片段的3’端具有XbaI限制性酶识别位点。使用合成的引物进行PCR，以获得包括从dapA基因起始密码子起第606位核苷酸至第906位核苷酸(即终止密码子)之间共301个碱基对的DNA片段。此外，还合成了设计为在片段的5’端具有SpeI限制性酶识别位点和在片段的3’端具有XbaI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NO：33和34)。通过PCR，获得了DNA片段，其进一步包括从dapA基因起始密码子起第809个核苷酸与终止密码子下游第2个核苷酸之间约100个碱基对的启动子区域以维持ORF4基因表达，和dapA基因终止密码子下游中的213个碱基对。在与实施例2相同的条件下进行PCR。用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将这两个PCR产物与已用XbaI进行限制性酶切而准备好的用于染色体导入的pDZ载体进行克隆来制备pDZ-dapA载体。
SEQ ID NO：31：dapA-d1F 5’-ccggggatcctctaga tgtttggcttgctttgggc-3’
SEQ ID NO：32：dapA_d1R 5’-gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3’
SEQ ID NO：33：dapA-d2F 5’-ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc-3’
SEQ ID NO：34：dapA-d2R 5’-gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag-3’
为了获得谷氨酸棒杆菌来源的aceA基因的启动子片段，合成了设计为在片段的5’端和3’端具有SpeI限制性酶识别位点的引物(SEQ ID NOs：35和36)。使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P的染色体DNA作为模板以及合成的引物来进行PCR以扩增约500碱基对的如SEQID NO：1所示的启动子区域。用In-fusion克隆试剂盒(TAKARA，日本)将PCR产物与用SpeI限制性酶处理pDZ-dapA载体而获得的DNA片段进行克隆以制备pDZ-dapA-PaceA载体。
SEQ ID NO：35：PaceA-d3F 5’-acgttgatgc actagt agcactctgactacctctg-3’
SEQ ID NO：36：PaceA-d3R 5’-agttctataa actagt ttcctgtgcggtacgtggc-3’
实施例13：aceA基因启动子插入至dapA基因下游的菌株及其苏氨酸生产力的对比
为了验证在L-苏氨酸生产菌株中抑制dapA基因表达的效果，用与实施例3相同的方法将实施例12中制备的pDZ-dapA-PaceA载体转化进L-苏氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11222P菌株(韩国专利号2013-0061570)中。通过进行PCR来挑选其中aceA基因启动子插入到染色体上dapA基因终止密码子下游以使得转录可以在与dapA基因转录的初始方向相反的方向发生的菌株，将其命名为KCCM11222P：：dapA-PaceA。利用SEQ ID NO：31和SEQID NO：34作为引物进行PCR来分析所获得的目的区域的核苷酸序列，以此来核实所制备的KCCM11222P：：dapA-PaceA菌株。
如下所述的方法培养谷氨酸棒杆菌KCCM11222P菌株(用作亲本菌株)和所制备的KCCM11222P：：dapA-PaceA菌株。
将各个菌株分别接种至其中含有25ml种子培养基的250ml有转角挡板烧瓶中，随后在30℃以200rpm振荡培养20小时。之后，将1ml种子培养溶液加入至含有24ml生产培养基的250ml有转角挡板烧瓶中，随后在30℃以200rpm振荡培养48小时。相应的种子培养基和生产培养基的组成如下所述。
<种子培养基(pH7.0)>
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，尿素1.5g，KH2PO44g，K2HPO48g，MgSO4·7(H2O)0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺2000μg(以1L蒸馏水为参准)。
<生产培养基(pH7.0)>
葡萄糖100g，(NH4)2SO440g，大豆蛋白2.5g，玉米浆固体5g，尿素3g，KH2PO41g，MgSO4·7(H2O)0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺1000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3000μg，CaCO330g(以1L蒸馏水为参准)。
在培养之后，用HPLC来测量L-苏氨酸的浓度。当未加入乙酸盐的时候，谷氨酸棒杆菌KCCM11222P和KCCM11222P：：dapA-PaceA培养溶液中的L-苏氨酸浓度显示在表11中。
表11：L-苏氨酸生产的变化(未加入乙酸盐)
此外，除了在生产培养基中加入5g/L的乙酸盐外，用同样的方法培养菌株以对比L-苏氨酸的生产。培养缓冲液中L-苏氨酸的浓度显示在表12中。
表12：L-苏氨酸生产的变化(加入5g/L的乙酸盐)
如表11中所示，在不存在乙酸盐的情况下，KCCM11222P：：dapA-PaceA的L-苏氨酸生产力与亲本菌株KCCM11222P并无不同。
然而，如表12中所示，在存在乙酸盐时，KCCM11222P：：dapA-PaceA的L-苏氨酸生产力比亲本菌株KCCM11222P高出了超过50％。
[登录号]
研究中心名称：韩国典型培养物保藏中心(国际)
登录号：KCCM11432P
登录日期：2013年6月12日
如上所述，根据本发明的一个或多个上述具体实施方式，由于通过在合适的时间加入乙酸盐以弱化目的基因的表达，可以以高产量来生产目的L-氨基酸，乙酸盐诱导型启动子可被用于高效地生产L-氨基酸。
应当被理解的是，本文中所述的示例性实施方式应当被认为仅是描述而不是限制的目的。各个实施方式中的特征或方面的描述通常应当认为也适合于其他实施方式中的其他相似特征或方面。
当参考附图对本发明的一个或多个具体实施方式进行描述时，将被本领域普通技术人员理解的是本文中可对形式或细节进行各种改变而不会背离如所述权利要求所定义的本发明的精神和范围。

Claims (3)

1.生产L-氨基酸的方法，该方法包括：
培养能够生产L-氨基酸的重组棒杆菌微生物，其中该重组棒杆菌微生物是通过将启动子插入到染色体中目的基因的终止密码子的下游转化的，所述启动子以SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的核苷酸序列所示，
其中所述终止密码子的下游介于所述目的基因的所述终止密码子与转录终止子的上游之间。
2.如权利要求1的生产L-氨基酸的方法，其中所述目的基因是选自如下组中的至少一种基因：编码丙酮酸脱氢酶亚基E1(NCgl2167)的基因，编码高丝氨酸脱氢酶(NCgl1136)的基因，编码UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶(NCgl2083)基因以及编码二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)(NCgl1896)的基因。
3.如权利要求1的生产L-氨基酸的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸或L-苏氨酸。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법
CN105734004B (zh) * 2016-03-02 2020-06-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其制备方法、应用
KR101925930B1 (ko) * 2017-07-24 2019-02-26 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
JP7018128B2 (ja) 2018-03-09 2022-02-09 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規なプロモーター及びこれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
KR102134418B1 (ko) * 2019-06-17 2020-07-16 씨제이제일제당 주식회사 L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법
KR102207867B1 (ko) * 2020-01-21 2021-01-26 씨제이제일제당 주식회사 Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700661A (en) * 1991-02-09 1997-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene expression regulatory DNA

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649379B1 (en) * 1987-06-12 2003-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and deregulated enzyme for threonine production
CN1117152C (zh) * 1994-03-04 2003-08-06 味之素株式会社 生产l－赖氨酸的方法
CZ293268B6 (cs) * 1995-06-07 2004-03-17 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantní DNA, bakterie a způsob výroby L-lyzinu
ES2218009T3 (es) * 1999-02-20 2004-11-16 Degussa Ag Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos utilizando bacterias corineformes.
US20040121428A1 (en) * 1999-12-24 2004-06-24 Masakazu Sugimoto Process for producing l-amino acid and novel gene
AU2002230431A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Archer-Daniels-Midland Company Corynebacterium glutamicum promoters
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
DE10224088A1 (de) * 2002-05-31 2003-12-11 Degussa Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien die ein abgeschwächtes mez-Gen enthalten
JP2004261150A (ja) * 2003-03-04 2004-09-24 Ajinomoto Co Inc 目的物質の製造法
JP2005006564A (ja) 2003-06-19 2005-01-13 Japan Tobacco Inc 硝酸イオン誘導性プロモーター
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700661A (en) * 1991-02-09 1997-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Gene expression regulatory DNA

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of the Isocitrate Lyase Gene from corynebacterium glutamicum and Biochemical Analysis of the Enzyme;DIETER J.et al.;<JOURNAL OF BACTERIOLOGY>;19940630;第176卷(第12期);图2 *
Cloning,sequence analysis,expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase;DIETER J;<MICROBIOLOGY>;19991231;第145卷;摘要,第507页右栏第2段 *
Conditional Silencing of the Escherichiacoli pykF Gene Results from Artificial Convergent Transcription Protected from Rho-Dependent Termination;Alexander A. Krylov et al;<Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology>;20100106;第18卷;摘要,第2页左栏第2段 *
dapA基因缺失对大肠杆菌L-苏氨酸产量的影响;张力等;<甘肃农业大学学报>;20110831;第46卷(第4期);摘要 *
Effect of pyruvate dehydrogenase complex deficiency on L-lysine production with Corynebactuerium glutamicum;Bastian Blombach等;<Microbiology and Biotechnology>;20070930;第76卷(第3期);摘要 *
谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除;饶志明等;<中国生物工程杂志>;20060111;第27卷(第1期);第59页左栏第2段-右栏第1段，第62页第2.4节 *

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