JP6824918B2 - L−アミノ酸の生産方法 - Google Patents
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Description
献1と2014年7月18日に出願された特許文献2の利益を主張し、その内容全体が本
明細書に参照として組み込まれる。
本発明の一つまたはそれ以上の実施例は、遺伝子転写阻害方法を用いたL−アミノ酸の
生産方法に関する。
されたピルビン酸(pyruvate)は、オキサロ酢酸 (oxaloacetate
)を経てアスパラギン酸(aspartate)に転換される。当該アスパラギン酸は、
各生合成経路を経てトレオニン(Threonine)、メチオニン(Methioni
ne)、イソロイシン(Isoleucine)及びリジン(Lysine)のようなアミ
ノ酸類に転換される(図1)。したがって、アミノ酸生合成の過程で分岐点に位置した遺
伝子の発現を阻害することにより、副産物の生産を減らし、目的とするアミノ酸の生産を
増大させることができる。
で生産することができる菌株として開発するためには、微生物内の種々の代謝過程に関連
する遺伝子の発現を選択的に調節することができなければならない。最近、遺伝子の発現
を低下させるための「人工的収束転写(artificial convergent transcription)」とい
う技術が報告された(非特許文献1)。前記人工的収束転写技術は、目的遺伝子の転写タ
ーミネータ(transcription terminator)の下流に当該遺伝子転写方向の逆方向に進行す
るプロモーターを挿入することにより、各プロモーター由来のRNAポリメラーゼ複合体
(RNA polymerase complex)が転写過程中に、互いに衝突を起こして、目的遺伝子の発現
を低下させる技術である。
行するように挿入し、酢酸が存在する条件で選択的に目的遺伝子の発現を阻害する技術を
開発し、これを分岐点に位置する遺伝子の発現を阻害するのに効果的に適用して、L−ア
ミノ酸の生産性の向上したコリネ型微生物を提供することができることを確認し、本発明
を完成した。
ことにより、L−アミノ酸を生産する方法を提供することにある。
1)酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入して形
質転換された、L−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階;及び
2)前記培養段階において酢酸を添加することにより、培養中、前記目的遺伝子の発現を
低下させ、前記組換えコリネ型微生物のL−アミノ酸生産能を強化する段階;
を含むL−アミノ酸の生産方法を提供する。
[1]1)酢酸誘導性プロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入させて形質転換された、L−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階;及び
2)上記培養段階で酢酸を添加することにより、培養中、上記目的遺伝子の発現を低下させ、上記組換えコリネ型微生物のL−アミノ酸生産能を強化する段階;
を含むL−アミノ酸の生産方法。
[2]上記終止コドンの下流は、上記目的遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流との間であることを特徴とする、上記[1]に記載のL−アミノ酸の生産方法。
[3]上記酢酸誘導性プロモーターは、配列番号1または配列番号2の塩基配列を有することを特徴とする、上記[1]に記載のL−アミノ酸の生産方法。
[4]上記目的遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットE1をコードする遺伝子(NCgl12167)、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(NCgl1136)、UDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子(NCgl2083)及びジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子(NCgl1896)からなる群から一つ以上の遺伝子が選択されることを特徴とする、上記[1]に記載のL−アミノ酸の生産方法。
[5]上記L−アミノ酸は、L−リジンまたはL−トレオニンであることを特徴とする、上記[4]に記載のL−アミノ酸の生産方法。
以下、本発明に係る実施例を添付した図面を参照して詳しく説明し、明細書の全体で、各図面に提示された同一な参照符号は同一な部材を示す。これに関連し、これら実施例は、他の具体的な形で実施することもでき、これらに限定的なものではないことを理解しなければならない。したがって、これら実施例は、本発明の態様を説明するために、単に図面を参照して記載したものに過ぎない。「少なくとも1つ」のような表現が構成要素のリストに先行して記載された場合には、全構成要素のリストを変更するものであり、そのリストの各構成要素を変更するものではない。以下、本発明を詳しく説明する。
1)酢酸誘導性プロモーターを染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に導入して形
質転換された、L−アミノ酸生産能を有する組換えコリネ型微生物を培養する段階;及び
2)前記培養段階において酢酸を添加することにより、培養中、前記目的遺伝子の発現
を低下させ、前記組換えコリネ型微生物のL−アミノ酸生産能を強化する段階;
を含むL−アミノ酸の生産方法を提供する。
promoter)」とは、酢酸が存在する条件で発現誘導活性を有するプロモーター
を意味する。
ckA、NCgl2656)とホスホトランスアセチラーゼ(phosphotrans
acetylase、pta、NCgl2657)により、またはスクシニルCoA:酢
酸CoA−トランスフェラーゼ(succinyl−CoA: acetate CoA
−transferase、actA、NCgl2480)により、アセチルCoA(a
cetyl CoA)に転換された後、グリオキシル酸回路のイソクエン酸リアーゼ(i
socitrate lyase、aceA、NCgl2248)の作用を経て代謝され
る。大腸菌では、アセチルCoAシンテターゼ(acetyl−CoA synthet
ase、acs、b4069)により酢酸がアセチルCoAに転換される(非特許文献2
)。酢酸代謝に関与する前記遺伝子は、酢酸が存在する条件で発現が誘導される。したが
って、これら遺伝子プロモーターを用いる場合、酢酸が存在する条件で特異的に遺伝子の
発現を誘導することができる。
lyase)をコードする遺伝子(aceA、NCgl2248)のプロモーターまた
は酢酸キナーゼ(acetate kinase)をコードする遺伝子(ackA、NC
gl2656)とホスホトランスアセチラーゼ(phosphotransacetyl
ase)をコードする遺伝子(pta、NCgl2657)オペロンのプロモーター、即
ち、pta遺伝子の上流プロモーターが挙げられる。より具体的には、前記酢酸誘導性プ
ロモーター中、aceA遺伝子プロモーターは、配列番号1で記載される塩基配列を有し
、aceA遺伝子の上流486個の塩基対(base pairs)とオープンリーディ
ングフレーム(open reading frame、ORF)のN−末端から36個
の塩基対を含む。
2で記載される塩基配列を有し、pta遺伝子の上流の340個の塩基対を含む。
ることは自明である。その例として、配列番号1または2の塩基配列を含むか、又は前記
配列番号1または2の塩基配列の保存配列を含みながら、1つ以上の位置で1つまたは多
数個(タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体
的には、2〜20個、好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜5個)の塩基が置換、
欠失、挿入、付加、または逆転された塩基配列を含むことができるが、前記誘導性プロモ
ーターの機能を維持または強化させることができるものであれば、配列番号1または2の
塩基配列に対し、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に
好ましくは97%以上の相同性を有する塩基配列を含むことができ、前記塩基の置換、欠
失、挿入、付加、または逆転などには、前記誘導性プロモーターの機能を維持する限り、
天然に生じる変異体配列または人為的な変異配列も含むことができる。
るが、点数(score)、同一性(identity)、類似度(similarit
y)などの媒介変数(parameter)を計算するBLAST2.0を利用する当業
者によく知られている方法で決定することができるが、特にこれに限定されない。
’方向をいい、前記用語「下流(downstream)」は、3’方向を意味する。
ine)、メチオニン(Methionine)、イソロイシン(Isoleucine
)及びリジン(Lysine)などのアミノ酸類の生合成過程に関与する遺伝子であり、
特に、生合成経路で分岐点に位置する遺伝子になり得る。
するのに関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットE1(pyruvate d
ehydrogenase subunit E1、aceE、NCgl2167)遺伝
子、アスパラギン酸からホモセリン(homoserin)を生成するホモセリンデヒド
ロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase、hom、NCgl1
136)遺伝子、そして、リジンの前駆体であるメソ−2,6−ジアミノピメリン酸(m
eso−2,6−Diaminopimelate)を利用して菌体の合成に用いるUD
P−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸
リガーゼ(UDP−N−acetylmuramoylalanyl−D−glutam
ate−2,6−diaminopimelate ligase、murE、NCgl
2083)遺伝子などが生合成経路の分岐点に位置する。
コリン酸合成酵素(dihydrodipicolinate synthase、da
pA、NCgl1896)遺伝子、メチオニンの場合は、ホモセリンからトレオニンの生
成に関与するホモセリンキナーゼ(homoserine kinase、 thrB、
NCgl1137)遺伝子が分岐点である。ピルビン酸由来のアミノ酸であるアラニン(
Alanine)、バリン(Valine)の場合、ピルビン酸をアセチルCoA(ac
etyl CoA)に転換するのに関連するピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットE
1(pyruvate dehydrogenase subunit E1、aceE
、NCgl2167)遺伝子が分地点に位置する。
1をコードする遺伝子(aceE、NCgl2167)、ホモセリンデヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子(hom、NCgl1136)、UDP−N−アセチルムラモイルアラ
ニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子(m
urE、NCgl2083)またはジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子(
dapA、NCgl1896)からなる群から選択され得るが、これに限定されるもので
はない。
hydrogenase subunit E1、aceE、NCgl2167)は、解
糖系の最終代謝物であるピルビン酸をTCA回路(tricarboxylic aci
d cycle)に流入させるのに関与するPDHC(pyruvate dehydr
ogenase complex)の構成タンパク質の一つである。したがって、ace
E遺伝子の発現量を低下させることにより、TCA回路への炭素源の流入を弱化させ、リ
ジン生合成の方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができる。
hom、NCgl1136)は、アスパラギン酸セミアルデヒド(aspartate
semialdehyde)からホモセリン(homoserine)を合成する酵素で
ある。アスパラギン酸セミアルデヒドは、リジン生合成経路の中間前駆体の一つであるた
め、hom遺伝子の活性を低下させることにより、ホモセリン合成経路への炭素源の流入
を弱化させ、リジン生合成の方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させること
ができる。
リン酸リガーゼ(UDP−N−acetylmuramoylalanyl−D−glu
tamate−2,6−diaminopimelate ligase、murE、N
Cgl2083)は、菌体の合成に関与する酵素であり、メソ−2,6−ジアミノピメリ
ン酸(meso−2,6−Diaminopimelate)を菌体の合成のために用い
る。メソ−2,6−ジアミノピメリン酸は、また、リジン生合成の前駆体として用いられ
、murE遺伝子の活性を低下させることにより、菌体の合成への炭素源の流入を弱化さ
せ、リジン生合成経路への炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができ
る。
hase、dapA、NCgl1896)は、アスパラギン酸セミアルデヒド(aspa
rtate semialdehyde)を用いてリジンの生成に関与する酵素である。
アスパラギン酸セミアルデヒドは、トレオニン生合成経路の中間前駆体の一つであるため
、dapA遺伝子の活性を低下させることにより、リジン合成経路への炭素源の流入を弱
化させ、トレオニン生合成の方に炭素源の流入を増やしてトレオニンの生産を増加させる
ことができる。
ンのうち、アミノ酸を指定せずに、タンパク質の合成過程が終了したことを知らせる信号
として作用するコドンであり、一般に、UAA、UAG、UGAの3つが終止コドンとし
て用いられる。
ator)」とは、GC塩基が多く存在する逆反復配列(inverted repea
t sequence)を意味し、ヘアピンループ(hairpin loop)を形成
することにより、遺伝子の転写を終結させる。
導性プロモーターを目的遺伝子の終止コドンの下流、好ましくは、終止コドンと転写ター
ミネータの上流との間に導入させることができる。酢酸誘導性プロモーターを用いること
により、目的遺伝子の発現を低下させられる時点で酢酸により目的遺伝子を逆方向に転写
させて、RNAポリメラーゼ複合体(RNA polymerase complex)
が転写過程中に衝突を起こすようにして目的遺伝子発現を低下させる。
具体的には、培養前または培養中であってもよい。
を含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードす
るタンパク質が発現できるようにすることを意味する。導入されたポリヌクレオチドは、
宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染
色体外に位置することができる。また、前記ポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコー
ドするDNA及びRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現
できるものであれば、どのような形で導入されてもよい。
Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacteri
um)属、アスロバクター属(Arthrobacter sp.)、及びミクロバクテ
リウム属(Microbacterium sp. )の微生物を含む概念である。この
ようなコリネ型微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・サ
ーモアミノゲネス(thermoaminogenes)、ブレビバクテリウム・フラー
ウム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム(lactofermentum)及びこれらから製造されたL−アミノ酸
を生産する突然変異体または菌株などを挙げることができ、好ましくは、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムであるが、これらの例に限定されるものではない。
ミクムKCCM11016P菌株(旧寄託番号KFCC10881、特許文献3参照)、
コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10770P菌株(特許文献4参照)、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムKCCM11347P菌株(旧寄託番号KFCC1075
0、特許文献5参照)を使用した。
3P菌株を使用しており、これは、バインダー(Binder)などの報告によりコリネ
バクテリウム・グルタミクム野生株(ATCC13032)を親株にして、リジン生産効
率に関連する遺伝子の3種(pyc(P458S)、hom(V59A)、lysC(T
311I))に対して変異を導入することにより、リジン生産能を有するようになった菌
株である(非特許文献3)。
2P菌株を使用しているが、これは、L−トレオニン生産菌株である(特許文献6)。
るプロモーターが導入されたコリネ型微生物は、すべて親株に比べてL−リジンまたはL
−トレオニン生産能が増加した。
件及び培養方法を使用することができる。
Methods for General Bacteriology by the
American Society for Bacteriology(Washin
gton D.C.、USA、1981)に公知された培地がある。
クトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油
、ヒマシ油、ココナッツ油などのような油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノ
ール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有
機酸が含まれる。これら物質は、個別にまたは混合物として用いることができる。
浸漬液、大豆、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も
、個別にまたは混合物として用いることができる。
これに相応するナトリウムを含有する塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫
酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有しなければならない。最後に、前記物
質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられる。また、培養培地
に適切な前駆体が用いられる。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法により回分式
または連続式で添加することができる。
合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のpHを調節
することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用い気泡の生
成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素−含
有気体(例えば、空気)を注入する。培養の温度は、通常20℃〜45℃、好ましくは2
5℃〜40℃である。培養時間は、所望のL−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続
けることができるが、好ましくは、10〜160時間である。
工程のような連続式または回分式で行うことができる。このような培養方法は、当業界に
おいて周知であり、任意の方法を用いることができる。
ことができる。
含むことができ、前記精製または回収方法は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分
式、連続式または流加式培養方法等に応じて、当該分野で公知となった適切な方法を用い
て培養液から目的とするL−アミノ酸を精製または回収することができる。
、イソロイシン、リジン、バリンまたはアラニンからなる群から選択されたものの一つで
あってもよく、好ましくはリジンまたはトレオニンである。
的に説明するためのものであり、本発明の範囲はこのような実施例に限定されるものでは
ない。
イソクエン酸リアーゼ(isocitrate lyase、aceA、NCgl22
48)は、グリオキシル酸回路(glyoxylate cycle)の主要な酵素であ
り、その遺伝子は、酢酸が存在する条件で発現される。また、酢酸キナーゼ(aceta
te kinase、ackA、NCgl2656)とホスホトランスアセチラーゼ(p
hosphotransacetylase、pta、NCgl2657)も酢酸の代謝
過程に関与する酵素としてオペロンを形成しており、酢酸が存在する条件で発現が強化さ
れる。前記のようなaceA遺伝子とpta−ackAオペロンのプロモーター部位は、
既に公知となっている(非特許文献2)。
るために、aceA遺伝子プロモーター及びpta−ackオペロンのプロモーター、即
ち、pta遺伝子の上流プロモーター部位を選定した。アメリカ国立衛生研究所の遺伝子
バンク(NIH GenBank)に登録されたaceA遺伝子(NCBI登録番号NC
gl2248)の塩基配列を基にして、aceA遺伝子の上流486個の塩基対(bas
e pair)とオープンリーディングフレーム(open reading fram
e、ORF)のN−末端から36個の塩基対を含む塩基配列(配列番号1)を確保した。
また、アメリカ国立衛生研究所の遺伝子バンクに登録されたpta遺伝子(NCBI登録
番号NCgl2657)の塩基配列を基にしてpta遺伝子の上流340個の塩基対を含
む塩基配列(配列番号2)を確保した。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットE1(pyruvate dehydrog
enase subunit E1、aceE、NCgl2167)は、解糖系の最終代
謝物であるピルビン酸をTCA回路(tricarboxylic acid cycl
e)に流入させることに関与するPDHC(pyruvate dehydrogena
se complex)の構成タンパク質の一つである。したがって、aceE遺伝子の
発現量を低下させることによりTCA回路への炭素源の流入を弱化させ、リジン生合成の
方に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させることができる(非特許文献4)。
方向の逆方向に進行させることで、、酢酸が存在する条件の下で選択的にaceE遺伝子
の発現を阻害するようにした(図2)。
h software; CLC bio、Denmark)を使用し、aceE遺伝子
の転写ターミネータ(transcription terminator)を予測した
。転写ターミネータは、GC塩基が多く存在する逆反復(inverted repea
t)配列であり、この部位においてヘアピンループ(hairpin loop)を形成
して遺伝子の転写を終結させる。aceE遺伝子の転写ターミネータを予測した結果、a
ceE遺伝子の終止コドン(stop codon)から下流に21番目の塩基から56
番目の塩基まで36個の塩基対(base pair)がヘアピンループ(hairpi
n loop)構造をなして転写ターミネータとして予測された。これに基づいた本実施
例では、aceE遺伝子転写ターミネータの上流または下流にaceA遺伝子プロモータ
ーを挿入して、aceE遺伝子転写方向の逆方向に進行することができるベクター2種を
作製した。
製
aceE遺伝子終止コドンの下流、即ち、終止コドンと転写ターミネータの上流との間
に、aceA遺伝子プロモーターを挿入するためのベクターを作製した。
リネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、断片
の5’末端に制限酵素XbaI認識部位と3’末端に制限酵素SpeI認識部位を挿入し
たプライマー(配列番号3及び4)を合成した。合成したプライマーを用いてPCRを行
い、、aceE遺伝子開始コドン(start codon)から2474番目の塩基か
ら終止コドンである2769番目の塩基まで296 bpを含むDNA断片を得た。また
、断片の5’末端に制限酵素SpeI認識部位と3’末端に制限酵素XbaI認識部位を
挿入したプライマー(配列番号5及び6)を合成し、PCRを行い、aceE遺伝子終止
コドンの下流300 bpを含むDNA断片を確保した。ポリメラーゼはPfuUltr
aTM High−FidelityDNAポリメラーゼ(Stratagene)を用
いて、PCR条件は、変性95℃、30秒;アニーリング55℃、30秒;及び重合72
℃、30秒を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
DZベクター(特許文献4)を、In−fusion Cloning Kit(TAK
ARA、JP)を利用し、クローニングしてpDZ−aceE1ベクターを作製した。
配列番号4: aceE-P1R 5’- ttgagactagttattcctcaggagcgtttg -3’
配列番号5: aceE-P2F 5’- gaataactagtctcaagggacagataaatc -3’
配列番号6: aceE-P2R 5’- gcaggtcgactctagagaccgaaaagatcgtggcag -3’
ために、断片の5’末端及び3’末端にそれぞれSpe I制限酵素部位を挿入したプラ
イマー(配列番号7及び8)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM1
1016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いPCRを行い、配列番
号1の塩基配列を有する約500bpのプロモーター部位を増幅した。前記PCR増幅産
物とpDZ−aceE1ベクターを制限酵素SpeIで処理して得たDNA切片を、In
−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、クローニン
グしてpDZ−aceE1−PaceAベクターを作製した。
配列番号8: PaceA-P3R 5’- ctgaggaataactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
製
aceE遺伝子転写ターミネータの下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入するため
のベクターを作製した。
ネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、断片の
5’末端に制限酵素XbaI認識部位と3’末端に制限酵素SpeI認識部位を挿入した
プライマー(配列番号9及び10)を合成した。合成したプライマーを用いてPCRを行
い、、aceE遺伝子の開始コドンから2538番目の塩基から終止コドンの下流62番
目の塩基まで294 bpを含むDNA断片を得た。また、断片の5’末端に制限酵素S
peI認識部位と3’末端に制限酵素XbaI認識部位を挿入したプライマー(配列番号
11及び12)を用いてPCRを行い、aceE遺伝子終止コドンの下流69番目の塩基
から362番目の塩基まで294 bpを含むDNA断片を確保した。ポリメラーゼはP
fuUltraTM High−FidelityDNAポリメラーゼ(Stratag
ene)を用い、PCR条件は、変性95℃、30秒;アニーリング55℃、30秒;及
び重合72℃、30秒を30回繰り返した後、72℃で7分間重合反応を行った。
pDZベクターを、In−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP
)を利用し、クローニングしてpDZ−aceE2ベクターを作製した。
配列番号10: aceE-P4R 5’- gagctactagtacgacgaatcccgccgccagacta -3’
配列番号11: aceE-P5F 5’- gtcgtactagtagctctttttagccgaggaacgcc -3’
配列番号12: aceE-P5R 5’- gcaggtcgactctagacatgctgttggatgagcac -3’
ために、断片の5’末端及び3’末端にそれぞれ制限酵素SpeI認識部位を挿入したプ
ライマー(配列番号13及び14)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムKC
CM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いてPCRを行い
、配列番号1の塩基配列を有する約500 bpのプロモーター部位を増幅した。前記P
CR増幅産物とpDZ−aceE2ベクターを制限酵素SpeIで処理して得たDNA切
片を、In−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、
クローニングしてpDZ−aceE2−PaceAベクターを作製した。
配列番号14: PaceA-P6R 5’- gattcgtcgtactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
前記実施例2で作製したベクターpDZ−aceE1−PaceAとpDZ−aceE
2−PaceAを、それぞれ電気パルス法を用いてL−リシン生産菌株であるコリネバク
テリウム・グルタミクムKCCM11016Pに形質転換させ(非特許文献5)、染色体
上のaceE遺伝子終止コドンの下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入してaceE
遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株を、PCRを行い分離することにより、L−リ
ジンを生産する菌株を獲得し、これをそれぞれコリネバクテリウム・グルタミクムKCC
M11016P:: aceE1−PaceAとコリネバクテリウム・グルタミクムKC
CM11016P:: aceE2−PaceAと命名した。コリネバクテリウム・グル
タミクムKCCM11016P:: aceE1−PaceAはCorynebacte
rium glutamicum CA01−2271の名称で韓国微生物保存センター
に2013年6月12日に寄託番号KCCM11432Pとして国際寄託した。作製した
菌株は、KCCM11016P:: aceE1−PaceAの場合、配列番号3と配列
番号6、KCCM11016P:: aceE2−PaceAの場合、配列番号9と配列
番号12をプライマーとして用いてPCRを行うことにより、目的部位に対する塩基配列
の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
較
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016P菌株及び実
施例3で作製したL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM
11016P:: aceE1−PaceAとKCCM11016P:: aceE2−
PaceAを、L−リジン生産のために下記のような方法で培養した。
クテリウム・グルタミクム親株KCCM11016PとKCCM11016P:: ac
eE1−PaceA、KCCM11016P:: aceE2−PaceAを接種し、3
0℃で20時間、200rpmで振とう培養した。下記生産培地24mlを含有する25
0 mlのコーナー−バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で72時間
、200rpmで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通り
である。
グルコース20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4
g、K2HPO4 8g、MgSO47H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミ
ンHCl1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド20
00μg(蒸留水1Lを基準)
グルコース100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロ
コシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4
1g、MgSO4 7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン HCl10
00μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド3000μg、C
aCO3 30g(蒸留水1Lを基準)。
etate)を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM110
16PとKCCM11016P:: aceE1−PaceA、KCCM11016P:
: aceE2−PaceAに対する培養液中のL−リジン濃度は、以下の表1の通りで
ある。
ジン生産能を比較した。培養液中のL−リジン濃度は、以下の表2の通りである。
ceE1−PaceA、KCCM11016P :: aceE2−PaceA菌株は、
親株KCCM11016Pとリジン生産能に変化がないことを確認した。
:: aceE1−PaceA菌株の場合、親株KCCM11016Pに比べてリジン
の生産能が3.6%以上、KCCM11016P :: aceE2−PaceA菌株の
場合は親株KCCM11016Pに比べて、リジンの生産能が2.5%以上向上したこと
を確認することができた。
P :: aceE2−PaceAを比較すると、aceE遺伝子の転写ターミネータの
上流側、即ち、終止コドンと転写ターミネータの上流との間に、aceAプロモーターを
挿入したKCCM11016P :: aceE1−PaceAの場合は、リジンの生産
においてより効果的であることから、挿入部位として遺伝子終止コドンの下流、即ち、終
止コドンと転写ターミネータ上流との間を用いることが遺伝子発現をより効果的に阻害す
ることが分かる。
酢酸キナーゼ(acetate kinase、ackA、NCgl2656)とホス
ホトランスアセチラーゼ(phosphotransacetylase、pta、NC
gl2657)は、酢酸代謝過程に関与する酵素としてオペロンを形成しており、イソク
エン酸リアーゼと同様に酢酸が存在する条件で発現が強化される。したがって、これら遺
伝子プロモーターを用いる場合、酢酸が存在する条件で特異的に遺伝子の発現を誘導する
ことができる。
ta−ackオペロンのプロモーター、即ち、pta遺伝子の上流プロモーター部位を利
用するためのベクターを作製した。
止コドンと転写ターミネータの上流との間にpta遺伝子プロモーターを挿入して、ac
eE遺伝子転写方向の逆方向に進行させることができるベクターを作製した。
バクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、実施例2
と同様の方法でpDZ−aceE1ベクターを作製した。
めに、断片の5’末端及び3’末端にそれぞれ制限酵素SpeI認識部位を有するように
考案したプライマー(配列番号15及び16)を合成した。コリネバクテリウム・グルタ
ミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いてP
CRを行い、配列番号2の塩基配列を有する約340 bpのプロモーター部位を増幅し
た。前記PCR増幅産物とpDZ−aceE1ベクターを制限酵素SpeIで処理して得
たDNA切片を、In−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し
、クローニングしてpDZ−aceE1−Pptaベクターを作製した。
配列番号16: Ppta-P7R 5’- ctgaggaataactagtacatcgcctttctaatttc-3’
能の比較
前記実施例5で作製したベクターpDZ−aceE1−Pptaを実施例3と同様の方
法で、L−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016
Pに形質転換させ、染色体上のaceE遺伝子終止コドンの下流にpta遺伝子プロモー
ターを挿入して、aceE遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をPCRを行い分離
することにより、L−リジンを生産する菌株を獲得してKCCM11016P :: a
ceE1−Pptaと命名した。作製菌株KCCM11016P :: aceE1−P
ptaは、配列番号3と配列番号6をプライマーとして用いてPCRを行うことにより、
目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
度を測定した。酢酸を添加していない場合、培養液中のL−リジン濃度は下記の表3の通
りである。
ジン生産能を比較した。培養液中のL−リジン濃度は、以下の表4の通りである。
eE1−Ppta菌株は、親株KCCM11016Pとリジン生産能に変化がないことを
確認した。
:: aceE1−Ppta菌株は、親株KCCM11016Pに比べてリジンの生産能
が2.4%以上向上したことを確認することができた。
P:: aceE1−Ppta菌株よりリジン生産能がより良いことから、酢酸が存在す
る条件でaceA遺伝子プロモーターを用いることがpta遺伝子プロモーターを用いる
ことより、目的遺伝子の発現をより効果的に阻害することが分かる。
前記実施例2で作製したベクターpDZ−aceE1−PaceAを、実施例3と同様
の方法でL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC1075
0、KCCM10770P及びCJ3P3種の菌株に形質転換させ、染色体上のaceE
遺伝子終止コドンの下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入して、aceE遺伝子転写
方向の逆方向に進行させた菌株をPCRを行い分離することにより、L−リジンを生産す
るKFCC10750 :: aceE1−PaceA、KCCM10770P ::
aceE1−PaceAとCJ3P :: aceE1−PaceA3種の菌株を獲得し
た。作製した菌株は、配列番号3と配列番号6をプライマーとして用いてPCRを行うこ
とにより、目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
を測定した。酢酸を添加していない場合、培養液中のL−リジン濃度は以下の表5の通り
である。
ジン生産能を比較した。培養液中のL−リジン濃度は以下の表6の通りである。
eE1−PaceA、KCCM10770P :: aceE1−PaceA及びCJ3
P :: aceE1−PaceAの3種の菌株は、親株とリジン生産能に変化がないこ
とを確認した。
CC10750 :: aceE1−PaceA菌株は、親株比5%、KCCM1077
0P :: aceE1−PaceA菌株は、親株比2.8%、 CJ3P :: ac
eE1−PaceA菌株は、親株比15%がそれぞれ向上したことを確認することができ
た。
L−リジン生合成経路と同様の基質を用いるL−トレオニン生合成経路を弱化させて、
L−リジン生産能力を増加させることができる。L−トレオニン生合成経路を弱化させる
ために、アスパラギン酸からホモセリン(homoserin)を生成するホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase、hom、NCg
l1136)の酵素活性を減少させる方法が挙げられる。
−thrBオペロンを形成しており、転写ターミネータはthrB遺伝子の下流に存在す
る。そして、hom−thrBオペロンの上流、即ち、hom遺伝子の上流にプロモータ
ーが存在し、さらにthrB遺伝子ORFの上流にも2番目のプロモーターが存在するこ
とが報告されている(非特許文献6)。したがって、hom遺伝子終止コドンの下流にa
ceA遺伝子プロモーターを挿入して、hom遺伝子転写方向の逆方向に進行させて、酢
酸が存在する条件で選択的にhom遺伝子の発現を阻害するようにし、thrB遺伝子の
発現を維持するためにthrB遺伝子ORFの上流に2番目のプロモーター配列を追加し
た。
eA遺伝子プロモーターを挿入するための組換えベクターを作製した。
バクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、断片の5
’末端に制限酵素XbaI認識部位と3’末端に制限酵素SpeI認識部位を有するよう
に考案したプライマー(配列番号17及び18)を合成した。合成したプライマーを用い
てPCRを行い、hom遺伝子の開始コドンから1039番目の塩基から終止コドンであ
る1338番目の塩基まで300 bpを含むDNA断片を得た。hom遺伝子発現の阻
害のために、hom−thrBオペロンの間にaceAプロモーターが挿入されても、t
hrB遺伝子は発現が維持されなければならない。そこで、hom遺伝子終止コドンの下
流300 bpを含むDNA断片の作製時、32 bpのthrBプロモーター配列をD
NA断片の5’側に挿入したプライマー(配列番号19及び20)を合成した。このプラ
イマー(配列番号19及び20)を用いてPCRを行い、断片の5’末端に制限酵素Sp
eI認識部位と3’末端に制限酵素XbaI認識部位を有する344 bpのDNA断片
を確保した。PCRは、実施例2と同様の条件で行った。
pDZベクターを、In−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP
)を利用し、クローニングしてpDZ−homベクターを作製した。
配列番号18: hom-h1R 5’- gaggcggatcactagtttagtccctttcgaggcgg -3’
配列番号19: hom-h2F 5’- actagtgatccgcctcgaaagggac -3’
配列番号20: hom-h2R 5’- gcaggtcgactctagagactgcggaatgttgttgtg -3’
ために、断片の5’末端及び3’末端にそれぞれ制限酵素SpeI認識部位を挿入したプ
ライマー(配列番号21及び22)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムKC
CM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いてPCRを行い
、配列番号1の塩基配列を有する約500 bpのプロモーター部位を増幅した。前記P
CR増幅産物とpDZ−homベクターを制限酵素SpeIで処理して得たDNA切片を
、In−fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、クロ
ーニングしてpDZ−hom−PaceAベクターを作製した。
配列番号22: PaceA-h3R 5’- aagggactaaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
能の比較
前記実施例8で作製したベクターpDZ−hom−PaceAを実施例3と同様の方法
で、L−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016P
に形質転換させ、染色体上のhom遺伝子終止コドンの下流にaceA遺伝子プロモータ
ーを挿入して、hom遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をPCRを行い分離する
ことにより、L−リジンを生産するKCCM11016P :: hom−PaceAを
獲得した。作製した菌株KCCM11016P :: hom−PaceAは、配列番号
17と配列番号20をプライマーとして用いてPCRを行うことにより、目的部位に対す
る塩基配列の分析を通じてその塩基配列を最終確認した。
したKCCM11016P :: hom−PaceA菌株を、L−リジン生産のために
、実施例4と同様の方法で培養し、そこから回収したL−リジンの濃度を測定した。酢酸
を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016PとKC
CM11016P :: hom−PaceAに対する培養液中のL−リジン濃度は、以
下の表7の通りである。
ジン生産能を比較した。培養液中のL−リジン濃度は、以下の表8の通りである。
om−PaceA菌株は、親株KCCM11016Pとリジン生産能に変化がないことを
確認した。
: hom−PaceA菌株は、親株KCCM11016Pに比べてリジンの生産能が2
.6%以上向上することを確認することができた。
UDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメ
リン酸リガーゼ(UDP−N−acetylmuramoylalanyl−D−glu
tamate−2,6−diaminopimelate ligase、murE、N
Cgl2083)は、リジン生合成の前駆体として用いられるメソ−2,6−ジアミノピ
メリン酸(meso−2,6−Diaminopimelate)を利用して菌体の合成
に利用するが、murE遺伝子の活性を低下させることにより、菌体の合成への炭素源の
流入を弱化させ、リジン生合成経路に炭素源の流入を増やしてリジンの生産を増加させる
ことができる。
NCgl2076からNCgl2082までの7個の遺伝子と共にオペロンをなしている
。オペロンの転写は、NCgl2083 murE遺伝子から始めてNCgl2076遺
伝子の方向に進められる。したがって、転写ターミネータは、NCgl2076遺伝子の
下流に存在する。murE遺伝子終止コドンの下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入
して、murE遺伝子転写方向の逆方向に進行させ、酢酸が存在する条件で選択的にmu
rE遺伝子の発現を阻害するようにして、オペロンの最初に位置するmurE遺伝子以外
の残りの7個の遺伝子の発現を維持するために、NCgl2082遺伝子ORFの上流に
murEオペロンのプロモーターを追加で挿入した。
するための組換えベクターを作製した。
ネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、断片の
5’末端に制限酵素XbaI認識部位と3’末端に制限酵素XhoI認識部位を有するよ
うに考案したプライマー(配列番号23及び24)を合成した。合成したプライマーを用
いてPCRを行い、murE遺伝子の開始コドンから1267番目の塩基から終止コドン
である1566番目の塩基まで300 bpを含むDNA断片を得た。また、断片の5’
末端に制限酵素XhoI認識部位と3’末端に制限酵素XbaI認識部位を有するように
考案したプライマー(配列番号25及び26)を合成し、PCRを行い、murE遺伝子
終止コドンの下流10番目の塩基から292 bpを含むDNA断片を確保した。PCR
は、実施例2と同様の条件で行った。前記2つのPCR増幅産物と予め制限酵素XbaI
で切断して準備した染色体導入用pDZベクターを、In−fusion Clonin
g Kit(TAKARA、JP)を利用し、クローニングしてpDZ−murEベクターを作製
した。
配列番号24: mur-m1R 5’- ttgtgatcatctcgagctatccttcttccgtagtaag -3’
配列番号25: mur-m2F 5’- agctcgagatgatcacaatgacccttgg -3’
配列番号26: mur-m2R 5’- gcaggtcgactctagacatgagcataaatgtcagc -3’
ために、断片の5’末端に制限酵素XhoI認識部位を有するように考案したプライマー
(配列番号27及び28)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11
016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いてPCRを行い、配列番
号1の塩基配列を有する約500 bpのプロモーター部位を増幅した。また、コリネバ
クテリウム・グルタミクム由来のmurEオペロンのプロモーター部位を確保するために
、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、
断片の3 ’末端に制限酵素XhoI認識部位を有するように考案したプライマー(配列
番号29及び30)を合成した。合成したプライマーを用いてPCRを行い、murE遺
伝子ORFの上流の300 bpを含むDNA断片を得た。前記2つのPCR増幅産物と
pDZ−murEベクターを制限酵素XhoIで処理して得たDNA切片を、In−fu
sion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、クローニングしてpDZ−
murE−PaceA−PmurEベクターを作製した。
配列番号28: mur-m3R 5’- agaaggatagctcgagttcctgtgcggtacgtggc -3’
配列番号29: mur-m4F 5’- agagtgctgctgatgatcctcgatttg -3’
配列番号30: mur-m4R 5’- ttgtgatcatctcgagggttttctctcctccacagg -3’
生産能の比較
前記実施例10で作製したベクターpDZ−murE−PaceA−PmurEを実施
例3と同様の方法でL−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCC
M11016Pに形質転換させ、染色体上のmurE遺伝子終止コドンの下流にaceA
遺伝子プロモーターを挿入して、murE遺伝子転写方向の逆方向に進行させた菌株をP
CRを行い、分離することにより、L−リジンを生産するKCCM11016P ::
murE−PaceA−PmurEを獲得した。作製した菌株KCCM11016P :
: murE−PaceA−PmurEは、配列番号23と配列番号26をプライマーと
用いてPCRを行うことにより、目的部位に対する塩基配列の分析を通じてその塩基配列
を最終確認した。
されたKCCM11016P :: murE−PaceA−PmurEをL−リジン生
産のために、実施例4と同様の方法で培養し、そこから回収したL−リジンの濃度を測定
した。酢酸を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM1101
6PとKCCM11016P :: murE−PaceA−PmurEに対する培養液
中のL−リジン濃度は以下の表9の通りである。
ジン生産能を比較した。培養液中のL−リジン濃度は、以下の表10の通りである。
urE−PaceA−PmurE菌株は、親株KCCM11016Pとリジン生産能に変
化がないことを確認した。
:: murE−PaceA−PmurE菌株は、親株KCCM11016Pに比べてリ
ジンの生産能が2.8%以上向上したことを確認することができた。
L−トレオニン生合成経路と同様の基質を用いるL−リジン生合成経路を弱化させるこ
とにより、L−トレオニン生産能力を増加させることができる。L−リジン生合成経路を
弱化させるために、アスパラギン酸からリジンの生成に関与するジヒドロジピコリン酸合
成酵素(dihydrodipicolinate synthase、dapA、NCgl1896)遺伝子の活性を減少させる方
法が挙げられる。
895)遺伝子とdapA−ORF4オペロンを形成しており、したがって、転写ターミ
ネータは、ORF4遺伝子の下流に存在する。そして、dapA−ORF4オペロンの上
流、即ち、dapA遺伝子の上流にプロモーターが存在し、さらにORF4遺伝子の上流
にもプロモーター配列が存在することが報告されている(非特許文献7)。したがって、
dapA遺伝子終止コドンの下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入して、dapA遺
伝子転写方向の逆方向に進行させ、酢酸が存在する条件で選択的にdapA遺伝子の発現
を阻害するようにし、ORF4遺伝子の発現を維持するためにORF4遺伝子の上流のプ
ロモーター部位100 bp配列をORF4遺伝子ORFの上流に追加した。
するための組換えベクターを作製した。
ネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、断片の
5’末端に制限酵素XbaI認識部位と3’末端に制限酵素SpeI認識部位を有するよ
うに考案したプライマー(配列番号31及び32)を合成した。合成したプライマーを用
いてPCRを行い、dapA遺伝子の開始コドンから606番目の塩基から終止コドンで
ある906番目の塩基まで301 bpを含むDNA断片を得た。また、断片の5’末端
に制限酵素SpeI認識部位と3’末端に制限酵素XbaI認識部位を挿入したプライマ
ー(配列番号33及び34)を合成してPCRを行い、ORF4遺伝子の発現を維持する
ことができるように、dapA遺伝子の開始コドンから809番目の塩基から終止コドン
の下流2番目の塩基まで100 bpのプロモーター配列をさらに含み、dapA遺伝子
終止コドンの下流213 bpを含むDNA断片を確保した。PCRは、実施例2と同様
の条件で進めた。前記2つのPCR増幅産物と、予め制限酵素XbaIで切断して準備し
た染色体導入用pDZベクターを、In−fusion Cloning Kit(TA
KARA、JP)を利用し、クローニングしてpDZ−dapAベクターを作製した。
配列番号32: dapA-d1R 5’- gttgatgcactagtttatagaactccagcttt-3’
配列番号33: dapA-d2F 5’- ttctataaactagtgcatcaacgtaggagatcc -3’
配列番号34: dapA-d2R 5’- gcaggtcgactctagacgttctgggaaccctgag -3’
るために、断片の5’末端及び3’末端にそれぞれ制限酵素SpeI認識部位を挿入した
プライマー(配列番号35及び36)を合成した。コリネバクテリウム・グルタミクムK
CCM11016Pの染色体DNAを鋳型とし、合成したプライマーを用いてPCRを行
い、配列番号1の塩基配列を有する約500 bpのプロモーター部位を増幅した。前記
PCR増幅産物と、pDZ−dapAベクターを制限酵素SpeIで処理して得たDNA
切片を、In-fusion Cloning Kit(TAKARA、JP)を利用し、クローニングしてpDZ−da
pA−PaceAベクターを作製した。
配列番号36: PaceA-d3R 5’- agttctataaactagtttcctgtgcggtacgtggc -3’
ニン生産能の比較
L−トレオニン生産株において、dapA遺伝子発現阻害効果を確認するために、L−
トレオニン生産株であるKCCM11222P(特許文献7)に前記実施例12で作製し
たベクターpDZ−dapA−PaceAを実施例3と同様の方法で形質転換させ、染色
体上のdapA遺伝子の下流にaceA遺伝子プロモーターを挿入してdapA遺伝子転
写方向の逆方向に進行させた菌株をPCRを行い分離することにより、L−トレオニンを
生成するKCCM11222P :: dapA −PaceAを獲得した。作製した菌
株KCCM11222P :: dapA−PaceAは、配列番号31と配列番号34
をプライマーとして用いてPCRを行うことにより、目的部位に対する塩基配列の分析を
通じてその塩基配列を最終確認した。
したKCCM11222P :: dapA−PaceA菌株は、L−トレオニン生産の
ために下記のような方法で培養した。
して、30℃で20時間、200rpmで振とう培養した。その後、生産培地24 ml
を含有する250mlのコーナー−バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種して、3
0℃で48時間、200rpmで振とう培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それ
ぞれ下記の通りである。
グルコース20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4
g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チア
ミンHCl 1000μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド
2000μg (蒸留水1Lを基準)
グルコース100g、(NH4)2SO4 20g、大豆タンパク質2.5g、トウモロ
コシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5 g、尿素3 g、KH2P
O4 1g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン HCl10
00μg、カルシウム−パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド3000μg、C
aCO3 30g(蒸留水1Lを基準)。
酸を添加していない場合、コリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11222PとK
CCM11222P:: dapA−PaceAに対する培養液中のL−トレオニン濃度
は、以下の表11の通りである。
レオニン生産能を比較した。培養液中のL−トレオニン濃度は、以下の表12の通りであ
る。
apA−PaceA菌株は、親株KCCM11222Pに比べてもトレオニン生産能に変
化がないことを確認した。
P:: dapA−PaceA菌株の場合、親株KCCM11222Pに比べてトレオニ
ン生産能が50%以上向上したことを確認することができた。
国際寄託機関)
受託番号:KCCM11432P
受託日:2013.06.12
間内に酢酸を添加することにより、目的遺伝子の発現を低下させ、目的とするL−アミノ
酸を高収率で生産することができるため、L−アミノ酸の生産に効果的に利用することが
できる。
れるものではないと理解するべきである。各実施例で説明した特徴及び特性は、他の実施
例において他の類似した特徴や特性を利用することができるものであると通常理解しなけ
ればならない。
Claims (3)
- 配列番号1または配列番号2のヌクレオチド配列で表されるプロモーターを、染色体内の目的遺伝子の終止コドンの下流に前記目的遺伝子の転写に対して反対の向きに導入させて形質転換された、L−アミノ酸を生産する組換えコリネ型微生物を培養する段階であって、前記目的遺伝子が、L−アミノ酸の生合成経路の分岐点に位置する遺伝子であり、前記L−アミノ酸が、L−リジンまたはL−トレオニンである、段階を含むL−アミノ酸の生産方法。
- 前記終止コドンの下流は、前記目的遺伝子の終止コドンと転写ターミネータの上流との間であることを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸の生産方法。
- 前記目的遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼサブユニットE1をコードする遺伝子(NCgl12167)、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(NCgl1136)、UDP−N−アセチルムラモイルアラニル−D−グルタミン酸−2,6−ジアミノピメリン酸リガーゼをコードする遺伝子(NCgl2083)及びジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子(NCgl1896)からなる群から一つ以上の遺伝子が選択されることを特徴とする、請求項1に記載のL−アミノ酸の生産方法。
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