ES2322193T3 - Microorganismo del genero corynebacterium que tiene resistencia a kanamicina y productividad de l-lisina potenciada y metodo de produccion de l-lisina usando el mismo. - Google Patents
Microorganismo del genero corynebacterium que tiene resistencia a kanamicina y productividad de l-lisina potenciada y metodo de produccion de l-lisina usando el mismo. Download PDFInfo
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Abstract
Un microorganismo del género Corynebacterium capaz de producir L-lisina y resistente a kanamicina, donde el microorganismo es una variante de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 que es resistente a S-(2-amino etil) cisteína, ácido alpha-amino-a-hidroxi valérico, metil lisina y azida sódica, y tiene una necesidad de leucina y una necesidad de pérdida de homoserina y donde el microorganismo es Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP4103 (Nº de acceso KCCM-10707P).
Description
Microorganismo del género Corynebacterium
que tiene resistencia a kanamicina y productividad de
L-lisina potenciada y método de producción de
L-lisina usando el mismo.
La presente invención se refiere a un
microorganismo del género Corynebacterium que tiene resistencia a
kanamicina y es capaz de producir L-lisina y a un
método de producción de L-lisina usando el
mismo.
Las bacterias Coryneformes son
microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium y
Brevibacterium.
La L-lisina es un aminoácido
esencial ampliamente utilizado en alimentos para animales,
suministros médicos y alimentos. En particular, se describió que la
cantidad de L-lisina utilizada en 2004 fue de
aproximadamente 0,8 millones de toneladas y se espera que la
demanda de L-lisina aumente continuamente en un
promedio de aproximadamente 10% anual en el futuro.
La L-lisina se produce por
fermentación directa usando un microorganismo tal como E.
coli, Corynebacteria o similares, y así el desarrollo de
microorganismos productores que tienen un rendimiento mejorado o una
productividad de L-lisina mejorada por la mejora de
un proceso de fermentación tiene un gran efecto económico.
La L-lisina es producida por
métodos conocidos usando bacterias tales como varios tipos de
mutantes auxotrópicos, varios tipos de bacterias resistentes a
fármacos, varios tipos de bacterias sensibles a fármacos y varios
tipos de bacterias resistentes a antibióticos. De estos métodos, es
conocido que un método que utiliza bacterias resistentes a
antibióticos incluye un método que utiliza varias bacterias
resistentes a varios antibióticos tales como rifampicina y
streptomicina, etc. (Véase, por ejemplo la Patente de EE.UU. N1
4.623.623).
Sin embargo, no se han descrito bacterias que
tengan resistencia a kanamicina, un tipo de antibiótico basado en
aminoglucósidos, y que produzcan L-lisina.
Los inventores de la presente invención
dirigieron una intensa investigación sobre un método para
producir
L-lisina utilizando un microorganismo del género Corynebacterium por fermentación directa para reducir el coste de producción de L-lisina y aumentar el rendimiento de L-lisina, y encontraron que la productividad de L-lisina puede ser mejorada dando resistencia a kanamicina al microorganismo del género Corynebacterium, completando, de este modo, la presente invención.
L-lisina utilizando un microorganismo del género Corynebacterium por fermentación directa para reducir el coste de producción de L-lisina y aumentar el rendimiento de L-lisina, y encontraron que la productividad de L-lisina puede ser mejorada dando resistencia a kanamicina al microorganismo del género Corynebacterium, completando, de este modo, la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un
microorganismo del género Corynebacterium que tiene resistencia a
kanamicina y capaz de producir L-lisina.
La presente invención también proporciona un
método para producir L-lisina con un alto
rendimiento utilizando el microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un microorganismo del género Corynebacterium capaz de
producir L-lisina y resistente a kanamicina.
Un microorganismo del género Corynebacterium
según la presente invención es una variante de Corynebacterium
glutamicum KFCC10881 que es resistente a
S-(2-amino etil)cisteína, ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, metil lisina y azida sódica, y tiene una necesidad de
leucina y una necesidad de pérdida de homoserina, el variante es
resistente a kanamicina, y es Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103 (depositado en el Centro de
Cultivo de Microorganismos de Corea y con el Nº de Acceso acordado
KCCM-10707P).
El microorganismo del género Corynebacterium se
puede obtener induciendo mutación en un microorganismo del género
Corynebacterium capaz de producir L-lisina
utilizando un método de mutagénesis conocido y después, cultivar el
producto resultante en presencia de kanamicina. La mutación se puede
inducir exponiendo el microorganismo del género Corynebacterium
capaz de producir L-lisina a un agente mutagénico,
por ejemplo, radiación radiactiva o compuestos mutagénicos. Además,
se puede usar la mutagénesis dirigida a sitio, pero la mutagénesis
no se limita a esos métodos.
Corynebacterium glutamicum
KFCC1088-CJP5103 (Nº de acceso
KCCM-10707P) según una realización de la presente
invención puede producirse dando resistencia a kanamicina a una cepa
pariente, Corynebacterium glutamicum KFCC1088, utilizando un
agente mutagénico,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
En particular,
10^{7}-10^{8}/ml de la cepa pariente se tratan
con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
que es un mutágeno, a 30ºC durante 30 minutos para alcanzar una
concentración final de 500 \mug/ml, y las bacterias que crecen en
una placa de agar con medio mínimo que contiene kanamicina, que
tiene una concentración de 5 mg/l, se separan para obtener el
mutante que tiene resistencia a kanamicina. Además, el mutante según
la actual realización de la presente invención se puede obtener
cultivando el mutante que tiene resistencia a kanamicina, comparar
la productividad de
L-lisina de las bacterias con una otra, y seleccionar las bacterias que tienen productividad de L-lisina mejorada.
L-lisina de las bacterias con una otra, y seleccionar las bacterias que tienen productividad de L-lisina mejorada.
La cepa pariente, Corynebacterium
glutamicum KFCC1088, y el mutante que tiene resistencia a
kanamicina obtenido de la misma tienen características descritas a
continuación:
Cepa pariente, Corynebacterium
glutamicum KFCC1088: tiene resistencia a
S-(2-amino-etil)cisteína,
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, resistencia a metil lisina, y resistencia a la azida
sódica, y tiene una necesidad de pérdida de homoserina y tiene una
necesidad de leucina.
Mutante, Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103: tiene resistencia a
S-(2-amino-etil)cisteína,
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, resistencia a metil lisina, y resistencia a la azida
sódica, y tiene una necesidad de pérdida de homoserina y tiene una
necesidad de leucina y resistencia a kanamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
En la actual realización de la presente
invención, kanamicina es un tipo de antibiótico basado en
aminoglucósidos, e interfiere con la síntesis de proteínas
uniéndose al ribosoma que participa en la biosíntesis de proteínas,
teniendo, por tanto, capacidad antibiótica.
Como se describe más arriba, el microorganismo
de la presente invención tiene resistencia a kanamicina, y una
productividad de L-lisina mejorada. En el proceso
para dar resistencia a kanamicina a la cepa pariente, se considera
que se inactiva un gen que participa en la biosíntesis de
menaquinona y, como resultado, se obtiene una cepa mutante cuya
actividad de transporte de electrones está reducida. Debido a la
actividad de transporte de electrones reducida, se considera que
también se reduce la necesidad de oxígeno de la bacteria y, por
consiguiente, aumenta el rendimiento de producción del
L-aminoácido. Sin embargo, un mecanismo del
microorganismo según la actual realización de la presente invención
no está limitado a esos mecanismos específicos.
La presente invención también proporciona un
método para producir L-lisina, que incluye cultivar
el microorganismo según una realización de la presente invención; y
recoger L-lisina del cultivo.
En el método según la actual realización de la
presente invención, el microorganismo del género
Corynebacterium puede cultivarse usando cualquier condición
de cultivo y método conocido en el estado de la técnica. Un ejemplo
de un medio de cultivo para cultivar la cepa Corynebacterium
es el medio de cultivo descrito en el Manual de Métodos para
Bacteriología General de la Sociedad Americana de Bacteriología
(Washington D.C., EE.UU., 1981). Las fuentes de carbohidratos que
se pueden usar en el medio incluyen las siguientes: azúcares y
carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa,
maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas como aceite de soja,
aceite de girasol, aceite de castor, y aceite de coco; ácidos grasos
tales como ácido palmítico, ácido esterárico y ácido linolénico;
alcoholes tales como glicerol, etanol, y ácidos orgánicos tales
como ácido acético. Los ejemplos de fuentes de azúcar arriba
mencionadas pueden ser usadas solas o en combinación. Ejemplos de
fuentes de nitrógeno incluyen los siguientes: peptona, extractos de
levaduras, extractos de carne, extractos de malta, licor de maíz
macerado, harina de soja, y urea o compuestos orgánicos tales como
sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato
de amonio, y nitrato de amonio. Ejemplos de fuentes de fósforo
incluyen los siguientes: fosfato de dihidrógeno potásico, fosfato de
hidrógeno dipotásico, o sus correspondientes sales sódicas. Además,
el medio de cultivo puede incluir sales metálicas, tales como
sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que es necesario para el
crecimiento. Además, se pueden usar materiales esenciales para el
crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas, además de los
ingredientes arriba mencionados. Además, en el medio de cultivo se
pueden usar precursores apropiados. Los ingredientes de arriba
pueden ser añadidos al medio de cultivo durante el cultivo en lotes
o de forma continua.
El pH del medio de cultivo puede ser controlado
usando un compuesto básico tal como hidróxido sódico, hidróxido
potásico o amoniaco, o un compuesto ácido tal como ácido fosfórico o
ácido sulfúrico. Además, el uso de un agente anti espumante tal
como el éster de ácido graso de poliglicol puede suprimir la
formación de espuma. Se puede inyectar en el medio oxígeno o un gas
que contenga oxígeno, con el fin de mantener una condición
aeróbica. La temperatura del medio de cultivo puede ser de 20 a
45ºC, preferiblemente de 25 a 40ºC. El cultivo se puede realizar
hasta que se produzca una cantidad deseada de
L-lisina, ero es deseable que el cultivo se realice
durante 10 a 160 horas.
El cultivo puede realizarse de forma continua
usando un método de lote, de lote de alimentación, de lote de
alimentación repetido o en lotes. Estos métodos son bien conocidos
en el estado de la técnica, y la presente invención no se limita a
los mismos.
\newpage
El L-aminoácido puede ser
recogido del cultivo tratando el medio de cultivo con un ácido
sulfúrico o un ácido hidroclorhídrico y después, en combinación con
métodos tales como cromatografía de intercambio aniónico,
concentración, por sales, precipitación en el punto isoeléctrico,
etc.
Ahora, la presente invención se describirá en
más detalle en referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos
tienen propósito ilustrativo, y no pretenden limitar el alcance de
la presente invención.
Ejemplo
1
Un mutante de Corynebacterium glutamicum
KFCC1 088 que tiene resistencia a kanamicina y productividad
de
L-lisina mejorada se seleccionó del producto obtenido al mutagenizar Corynebacterium glutamicum KFCC1088, como bacteria pariente, con un mutágeno químico, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
L-lisina mejorada se seleccionó del producto obtenido al mutagenizar Corynebacterium glutamicum KFCC1088, como bacteria pariente, con un mutágeno químico, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
Primero, se tratan
10^{7}-10^{8}/ml de la bacteria pariente con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
a 30ºC durante 30 minutos para alcanzar una concentración final de
500 \mum/ml. Después, el microorganismo mutagenizado se cultivó
en una placa de agar con medio mínimo que contiene kanamicina que
tiene una concentración de 5 mg/l para separar las bacterias en
crecimiento. Además, se cultivaron los mutantes separados, y se
midió la productividad de L-lisina de los mismos
para seleccionar las bacterias que tienen una capacidad de
productividad de L-lisina máxima a partir de los
mutantes separados.
El mutante obtenido, que tiene resistencia a
kanamicina, se llamó Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103, depositado el 16 de Noviembre de
2005 en el Centro de Cultivo de Microorganismos de Corea (KCCM), y
tenía el Nº de acceso KCCM-10707P.
El mutante obtenido en el Ejemplo 1 y las
bacterias parientes tienen las siguientes características.
Bacteria pariente, Corynebacterium
glutamicum KFCC10881: resistencia a
S-(2-amino-etil)cisteína,
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, resistencia a metil lisina, resistencia a la azida sódica,
y una necesidad de pérdida de homoserina y una necesidad de
leucina.
Mutante, Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103: resistencia a
S-(2-amino-etil)cisteína,
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, resistencia a metil lisina, resistencia a la azida sódica,
y una necesidad de pérdida de homoserina y una necesidad de leucina
y resistencia a kanamicina.
Después, se realizó un experimento de
resistencia a kanamicina con respecto al mutante resistente a
kanamicina seleccionado, Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103, y la bacteria pariente. Primero,
se cultivaron los dos microorganismos en un medio líquido Luria
Bertani (LB) durante 16 horas, y después las células se lavaron
usando dos veces suero salino normal estéril. Después, las células
lavadas fueron correctamente diluidas y el producto resultante se
cultivó en una placa agar con medio mínimo que contiene kanamicina,
que tiene una concentración de 5 mg/l, durante cuatro días para
medir la productividad de cada microorganismo. Una composición de
la placa agar con medio mínimo es la misma que sigue: 10 g de
glucosa, 2 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g de urea, 1,0 g
de KH_{2}PO_{4}, 3,0 g de K_{2}HPO_{4}, 0,5 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10
mg de MnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 100 \mug de biotina, 100 \mug
de tiamina\cdotHCl, 100 \mug de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 80
\mug de Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O, 40 \mug de
(NH_{4})_{6}MoO_{27}\cdot4H_{2}O, 10 \mug de
ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O, 300 \mug de CuSO_{4}\cdot7
H_{2}O, 10 \mug de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 1 mg de
FeCl_{3}\cdot6H_{2}O, 20 g de agar, 0,1 g de
L-leucina si es necesario, 0,1 g de
L-treonina si es necesario, 0,1 g de
L-metionina si es necesario, por 1 L de agua
destilada (pH 7,0).
Los resultados de la medida de la productividad
del mutante y de la bacteria pariente en un medio que contiene
kanamicina se muestran en la Tabla 1.
Ejemplo
2
Corynebacterium glutamicum KFCC10881 y
Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP4103
se inocularon en un frasco de esquinas deflectoras que contiene 25
ml del medio de siembra de más abajo; y el producto resultante se
cultivó a 30ºC durante 20 horas mientras se agitaba a 200 rpm.
Después, se inoculó 1 ml del medio de cultivo obtenido en un frasco
con esquinas deflectoras de 250 ml que contiene 25 ml del medio de
producción de más abajo, y el producto resultante se cultivó a 32ºC
durante 96 horas mientras se agitaba a 220 rpm.
Tras la terminación del cultivo, se midió la
producción de L-lisina por cromatografía líquida de
alta presión (HPLC). Las cantidades de L-lisina en
el cultivo de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 y
Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP4103
se representaron como sal de hidrocloruro de la
L-lisina y fueron de 44,5 g/l y 48,1 g/l,
respectivamente.
20 g de azúcar sin refinar, 10 g de peptona, 5 g
de extracto de levadura, 1,5 g de urea, 4 g de KH_{2}PO_{4}, 8
g de K_{2}HPO_{4}, 0.5 g de MgSO_{4} 7 H_{2}O, 100 \mug de
biotina, 1.000 \mug de HCl de tiamina, 2.000 \mug de
pantotenato cálcico, 2.000 \mug de nicotinamida (1 L de agua
destilada base).
100 g de azúcar sin refinar, 40 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de
sólidos de maíz macerado, 3 g de urea, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5
g de MgSO_{4} 7 H_{2}O, 100 \mug de biotina, 1.000 \mug de
HCl de tiamina, 2.000 \mug de pantotenato cálcico, 3.000 \mug de
nicotinamida, 30 g de CaCO_{3} (1 L de agua destilada base).
Ejemplo
3
Añadiendo hidrocloruro a 1 L de un caldo de
fermentación de lisina obtenido cultivando Corynebacterium
glutamicum KFCC10881 y Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103 en un medio que contiene melazas y
azúcar sin refinar, el pH del caldo de fermentación se ajustó a pH
2,0, y los iones de Ca se transformaron en CaSO_{4} y CaCl_{2}.
Después, el medio de cultivo se añadió a una resina de intercambio
catiónico (Diaion SK-L10), que se reprodujo en
forma de amoniaco, haciendo fluir el medio de cultivo hacia la
dirección ascendente. Tras eliminar las bacterias residuales del
interior de la resina de intercambio catiónico lavando con agua
desmineralizada, se recogió la lisina altamente concentrada
eluyendo la resina con hidróxido de amonio 2N. La solución recogida
se concentró y cristalizó enfriando a 20ºC, mientras se ajunta el pH
a 5,0. Se obtuvo un primer producto húmedo por separación con
centrifugado de una pasta de cristalización completa y se obtuvo un
segundo producto húmedo al concentra en lote y cristalizar la
solución madre. Se obtuvieron 44 g de un producto de lisina seco
con 98,5% de contenido en lisina al combinar el primer y segundo
productos húmedos y secar el producto combinado.
Ejemplo
4
Añadiendo ácido sulfúrico a 1 L de un cultivo de
fermentación de lisina obtenido cultivando Corynebacterium
glutamicum KFCC10881 y de Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103 en un medio que contiene melazas
y azúcar sin refinar, el pH del caldo de fermentaciones ajustó a pH
2,0. Después, el medio de cultivo se añadió a una resina de
intercambio catiónico (Diaion SK-L10), que se
reprodujo en forma de amoniaco, haciendo fluir el medio de cultivo
hacia la dirección ascendente. Tras eliminar las bacterias
residuales del interior de la resina de intercambio catiónico
lavando con agua desmineralizada, se recogió la lisina altamente
concentrada eluyendo la resina con hidróxido de amonio 2N. La
solución recogida se concentró y cristalizó enfriando a 20ºC,
mientras se ajunta el pH a 5,0 usando hidrocloruro. Se obtuvo un
primer producto húmedo por separación con centrifugado de una pasta
de cristalización completa y se obtuvo un segundo producto húmedo al
concentra en lote y cristalizar la solución madre. Se obtuvieron 45
g de un producto de lisina seco con 99% de contenido en lisina al
combinar el primer y segundo productos húmedos y secar el producto
combinado.
El microorganismo según la presente invención
tiene productividad de L-lisina.
En el método para producir
L-lisina usando el microorganismo según la presente
invención, se puede producir L-lisina a alto
rendimiento.
Aunque particularmente se ha mostrado y descrito
en referencia a las realizaciones ilustrativas del mismo, aquellos
expertos en la materia entenderán que se pueden hacer varios cambios
en la forma y detalles al respecto sin salirse del alcance de la
presente invención, tal como se define en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (2)
1. Un microorganismo del género Corynebacterium
capaz de producir L-lisina y resistente a
kanamicina, donde el microorganismo es una variante de
Corynebacterium glutamicum KFCC10881 que es resistente a
S-(2-amino etil)cisteína, ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxi
valérico, metil lisina y azida sódica, y tiene una necesidad de
leucina y una necesidad de pérdida de homoserina y donde el
microorganismo es Corynebacterium glutamicum
KFCC10881-CJP4103 (Nº de acceso
KCCM-10707P).
2. Un método para producir
L-lisina que comprende cultivar el microorganismo
del género Corynebacterium según la reivindicación 1, y recoger la
L-lisina del cultivo.
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