JP2004159553A - L−シスタチオニンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】発酵法による新規なL−シスタチオニンの製造方法を提供する。
【解決手段】炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を程よく含有する発酵培地に、大腸菌のL−シスタチオニン生産性変異株を好気的に培養し発酵液中に著量のL−シスタチオニンを蓄積させ、発酵液からL−シスタチオニンを単離する。
【解決手段】炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を程よく含有する発酵培地に、大腸菌のL−シスタチオニン生産性変異株を好気的に培養し発酵液中に著量のL−シスタチオニンを蓄積させ、発酵液からL−シスタチオニンを単離する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法によるL−シスタチオニンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来からコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属の変異株がL−シスタチオニンを分泌することが知られている(特許公報昭和51−21075)が、蓄積量が低くまだ改善すべき点がある。酵母がシスタチオニンを菌体内に蓄積すること(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、158巻、860頁、1984年)、また大腸菌の変異株がシスタチオニンを分泌することが知られている(日本農芸化学会、1999年度大会要旨集、270頁)が、蓄積量が低くまたその立体構造が考えられる四種の異性体の内どれであるかについては全く証明がなかった。また、酵素法によってL−システインとO−サクシニル−LホモセリンからL−シスタチオニンを合成する方法が知られているが、これらは酵素や原料のコストが高価であるという問題があった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明では、安価な炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含む安価な発酵培地に、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を好気的に培養して、培養液中に蓄積するシスタチオニンがL−体である事を証明し、これを蓄積せしめる経済的に優れたL−シスタチオニンの製造法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養して、培養液中にL−シスタチオニンを蓄積させ、得られた培養液からL−シスタチオニンを単離することでL−シスタチオニンを製造するものである。
【0005】
好適には、上記大腸菌がシスタチオニンβ−リア−ゼ(EC 4.4.1.8)欠失性L−メチオニン要求性変異株である。
【0006】
また、栄養物としてのL−メチオニンを前記培地に所定量、より好ましくは、50〜300μg/mlの濃度で添加する。
【0007】
かかる単離は、得られた培養液を凍結後融解処理することで行われるか、又は得られた培養液を加熱処理することで行われる。
【0008】
発酵培地の炭素源としては、でんぷん加水分解物、ぶどう糖、果糖、糖蜜等、窒素源としては、アンモニア水、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、そして硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ尿素等を用いることが好ましい。
【0009】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はなんらこれらの実施例に限定されるものではない。
【0010】
まず、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養する。このL−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌とは、それを培地に培養したときに、培地中に有意な量のL−シスタチオニンを蓄積する大腸菌をいう。大腸菌に属しL−シスタチオニンを菌体内及び菌体外に蓄積する変異株であれば栄養要求性変異株、代謝調節変異株、各種薬剤耐性変異株、各種薬剤感受性変異株、遺伝子組換え株あるいはそれらを組み合わせて持つ変異株が上げられるが、これに限定されるものではない。
【0011】
本発明で使用する炭素源としては、各種でんぷん加水分解物、糖蜜、コーン・スチープ・リカー、ぶどう糖、果糖、それらを含む天然試料等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0012】
また、本発明で使用する窒素源としては、アンモニア水、尿素、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0013】
そしてまた、本発明で使用する硫黄源としては、各種硫酸塩、各種亜硫酸塩、各種チオ硫酸塩、各種硫化物、チオ尿素、D−、L−あるいはDL−メチオニン、L−システイン、L−シスチン等の含硫アミノ酸類、タンパク質、タンパク質分解物等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0014】
特にメチオニン要求性変異株を用いる場合には、発酵液に添加するL−メチオニン濃度を所定量に、特に50〜300μg/mlに制限すると好結果を得る。
【0015】
その他、本発明で使用する栄養物としては、カリ、リン酸、マンガン、鉄、マグネシウム、ナトリウム、塩素、コバルト、ニッケル等のミネラルの塩類、チアミン、ビオチン、リボフラビン、コバラミン、葉酸等のビタミン等が程良く添加されたものがあげられる。
【0016】
好気的に培養する方法として、振とう培養、通気撹拌培養等が好ましいがこれに限定されるものではない。
【0017】
発酵液はpH5〜8の範囲に調製され、25〜40℃の範囲で発酵される。この発酵は回分式、連続式のいずれでも良い。
【0018】
次に,発酵液からのL−シスタチオニンを単離する。
【0019】
発酵液からL−シスタチオニンを単離するに際して、まず発酵液を加熱もしくは一旦−20℃程度で凍結して後融解する操作を行い、菌の細胞膜のL−シスタチニン透過性をよくしてから、よく撹拌して十分にL−シスタチオニンを細胞外に排出せしめる。
【0020】
もしくは、一旦ろ過または遠心分離で菌体を集めその細胞懸濁液を加熱もしくは凍結後融解して撹拌して十分に細胞外にL−シスタチオニンを排出せしめる。
【0021】
発酵液の上澄に蓄積したものと菌体から溶出された L−シスタチオニンを含む液を合わせて各種のイオン交換樹脂カラムに通塔してL−シスタチオニンを吸着させ、これを希アンモニア水、もしくは希塩酸等で溶出させ、溶出液を減圧濃縮し、これを冷却することによって、L−シスタチオニンの粗結晶を得る事が出来る。
【0022】
得られた粗結晶は洗浄後乾燥され、必要に応じて再結して純度の高い製品を得る。
【0023】
次に本発明にかかるL−シスタチオニンの製造方法を具体的な実施例に基づいて説明する。
【0024】
[実施例1]
殺菌した4重量%グルコ−ス、1重量%ポリペプトン、0.5重量%酵母エキス、pH7の組成の種培地10mlを、殺菌した100ml容の三角フラスコに移し、これに一夜栄養寒天培地で生育させたL−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌、本例ではシスタチオニンβ−リア−ゼ欠失性メチオニン要求性変異株(名称:CAG18475)を接種し、30℃で140rpmの振とう条件で16時間振とう培養した。このCAG18475大腸菌は、ブタペスト条約に基づく微生物の寄託機関である工業技術院微生物工業技術研究所に平成14年6月13日付けで寄託されており、受託番号FERM P−18891が付与されている。
【0025】
得られた種培養液を無菌状態にて8,000rpmの速度で10分間遠心分離し、沈殿した菌体全量を遠心上澄液3.3mlに懸濁し、これを種菌液とした。
【0026】
殺菌した3重量%果糖、0.15重量%リン酸一カリウム(KH2PO4)、0.05重量%リン酸水素二カリウム(K2HPO4)、0.05重量%硫酸マグネシウム(MgSO4・5H2O)、0.007重量%硫酸マンガン(MnSO4・4H2O)、0.01重量%硫酸第一鉄(FeSO4・7H2O)、pH7の組成の発酵培地7mlずつを二十個の殺菌した300ml容の三角フラスコに入れ、それぞれに殺菌した炭酸カルシウム(CaCO3)70mgと殺菌したL−メチオニン(30mg/ml)溶液0.023mlずつを添加し、これに上記の種菌液0.7mlずつを接種して、140rpm、30℃で振とう培養し、培養24時間目に殺菌した30〜40重量%フラクトース0.7mlを添加してさらに24時間培養を継続した。
【0027】
上記の四個のフラスコの培養終了液を集めて混合しそのうち7mlずつを三本の試験管に移した。
【0028】
上記の試験管のうち一本の培養液を撹拌後遠心分離し、上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、0.4mg/mlであった。沈殿した菌体は−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し、7mlの水を加えて撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0029】
上記の三本のうちもう一本の培養液を−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0030】
上記の三本のうちさらにもう一本の培養液を90℃で5分間加熱し、撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0031】
上記の残りの培養液をすべて集め−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解して撹拌後遠心分離して得た上澄液から以下のようにL−シスタチオニンの単離を試みた。
【0032】
上澄液100mlを水で二倍に希釈し、希塩酸を用いてpH3にした。
【0033】
この液を陽イオン交換樹脂ダイアイオンSK#1BのH型カラムに通塔してL−シスタチオニンを吸着させ、水洗後320mlの2NNH4OHで溶出した。
【0034】
この溶出液を減圧下で約50mlまで濃縮し冷蔵庫で冷却したところ白色の沈殿が生じたのでこれを単離し、洗浄後乾燥して70mgのL−シスタチオニンの粗結晶を得た。
【0035】
得られた粗結晶の標品をアミノ酸アナライザー分析したところ、標準のシスタチオニンと溶出時間が一致した。
【0036】
得られた粗結晶の標品を13C−及び1H−NMR分析したところ、得られたシグナルが標準のシスタチオニンのそれと一致した。
【0037】
得られた粗結晶の標品を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、溶出時間が標準のL−シスタチオニンのそれと一致し、シスタチオニンの他の異性体のどれとも一致しなかった。
【0038】
[実施例2]
実施例1の発酵液のL−メチオニン濃度を最終濃度として0、50、100、150、200、250、300、400、500、1000μg/mlに変えて同様に実施した結果、L−メチオニン濃度が50〜300μg/mlに制限した時にL−シスタチオニンが0.5〜1.2mg/ml蓄積した。
【0039】
【発明の効果】
以上の説明により、本発明は安価な原料を含む発酵培地で短時間に著量のL−シスタチオニンを蓄積せしめ容易に製品を得ることが可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法によるL−シスタチオニンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来からコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属の変異株がL−シスタチオニンを分泌することが知られている(特許公報昭和51−21075)が、蓄積量が低くまだ改善すべき点がある。酵母がシスタチオニンを菌体内に蓄積すること(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、158巻、860頁、1984年)、また大腸菌の変異株がシスタチオニンを分泌することが知られている(日本農芸化学会、1999年度大会要旨集、270頁)が、蓄積量が低くまたその立体構造が考えられる四種の異性体の内どれであるかについては全く証明がなかった。また、酵素法によってL−システインとO−サクシニル−LホモセリンからL−シスタチオニンを合成する方法が知られているが、これらは酵素や原料のコストが高価であるという問題があった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明では、安価な炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含む安価な発酵培地に、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を好気的に培養して、培養液中に蓄積するシスタチオニンがL−体である事を証明し、これを蓄積せしめる経済的に優れたL−シスタチオニンの製造法を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養して、培養液中にL−シスタチオニンを蓄積させ、得られた培養液からL−シスタチオニンを単離することでL−シスタチオニンを製造するものである。
【0005】
好適には、上記大腸菌がシスタチオニンβ−リア−ゼ(EC 4.4.1.8)欠失性L−メチオニン要求性変異株である。
【0006】
また、栄養物としてのL−メチオニンを前記培地に所定量、より好ましくは、50〜300μg/mlの濃度で添加する。
【0007】
かかる単離は、得られた培養液を凍結後融解処理することで行われるか、又は得られた培養液を加熱処理することで行われる。
【0008】
発酵培地の炭素源としては、でんぷん加水分解物、ぶどう糖、果糖、糖蜜等、窒素源としては、アンモニア水、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、そして硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ尿素等を用いることが好ましい。
【0009】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はなんらこれらの実施例に限定されるものではない。
【0010】
まず、L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養する。このL−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌とは、それを培地に培養したときに、培地中に有意な量のL−シスタチオニンを蓄積する大腸菌をいう。大腸菌に属しL−シスタチオニンを菌体内及び菌体外に蓄積する変異株であれば栄養要求性変異株、代謝調節変異株、各種薬剤耐性変異株、各種薬剤感受性変異株、遺伝子組換え株あるいはそれらを組み合わせて持つ変異株が上げられるが、これに限定されるものではない。
【0011】
本発明で使用する炭素源としては、各種でんぷん加水分解物、糖蜜、コーン・スチープ・リカー、ぶどう糖、果糖、それらを含む天然試料等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0012】
また、本発明で使用する窒素源としては、アンモニア水、尿素、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0013】
そしてまた、本発明で使用する硫黄源としては、各種硫酸塩、各種亜硫酸塩、各種チオ硫酸塩、各種硫化物、チオ尿素、D−、L−あるいはDL−メチオニン、L−システイン、L−シスチン等の含硫アミノ酸類、タンパク質、タンパク質分解物等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【0014】
特にメチオニン要求性変異株を用いる場合には、発酵液に添加するL−メチオニン濃度を所定量に、特に50〜300μg/mlに制限すると好結果を得る。
【0015】
その他、本発明で使用する栄養物としては、カリ、リン酸、マンガン、鉄、マグネシウム、ナトリウム、塩素、コバルト、ニッケル等のミネラルの塩類、チアミン、ビオチン、リボフラビン、コバラミン、葉酸等のビタミン等が程良く添加されたものがあげられる。
【0016】
好気的に培養する方法として、振とう培養、通気撹拌培養等が好ましいがこれに限定されるものではない。
【0017】
発酵液はpH5〜8の範囲に調製され、25〜40℃の範囲で発酵される。この発酵は回分式、連続式のいずれでも良い。
【0018】
次に,発酵液からのL−シスタチオニンを単離する。
【0019】
発酵液からL−シスタチオニンを単離するに際して、まず発酵液を加熱もしくは一旦−20℃程度で凍結して後融解する操作を行い、菌の細胞膜のL−シスタチニン透過性をよくしてから、よく撹拌して十分にL−シスタチオニンを細胞外に排出せしめる。
【0020】
もしくは、一旦ろ過または遠心分離で菌体を集めその細胞懸濁液を加熱もしくは凍結後融解して撹拌して十分に細胞外にL−シスタチオニンを排出せしめる。
【0021】
発酵液の上澄に蓄積したものと菌体から溶出された L−シスタチオニンを含む液を合わせて各種のイオン交換樹脂カラムに通塔してL−シスタチオニンを吸着させ、これを希アンモニア水、もしくは希塩酸等で溶出させ、溶出液を減圧濃縮し、これを冷却することによって、L−シスタチオニンの粗結晶を得る事が出来る。
【0022】
得られた粗結晶は洗浄後乾燥され、必要に応じて再結して純度の高い製品を得る。
【0023】
次に本発明にかかるL−シスタチオニンの製造方法を具体的な実施例に基づいて説明する。
【0024】
[実施例1]
殺菌した4重量%グルコ−ス、1重量%ポリペプトン、0.5重量%酵母エキス、pH7の組成の種培地10mlを、殺菌した100ml容の三角フラスコに移し、これに一夜栄養寒天培地で生育させたL−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌、本例ではシスタチオニンβ−リア−ゼ欠失性メチオニン要求性変異株(名称:CAG18475)を接種し、30℃で140rpmの振とう条件で16時間振とう培養した。このCAG18475大腸菌は、ブタペスト条約に基づく微生物の寄託機関である工業技術院微生物工業技術研究所に平成14年6月13日付けで寄託されており、受託番号FERM P−18891が付与されている。
【0025】
得られた種培養液を無菌状態にて8,000rpmの速度で10分間遠心分離し、沈殿した菌体全量を遠心上澄液3.3mlに懸濁し、これを種菌液とした。
【0026】
殺菌した3重量%果糖、0.15重量%リン酸一カリウム(KH2PO4)、0.05重量%リン酸水素二カリウム(K2HPO4)、0.05重量%硫酸マグネシウム(MgSO4・5H2O)、0.007重量%硫酸マンガン(MnSO4・4H2O)、0.01重量%硫酸第一鉄(FeSO4・7H2O)、pH7の組成の発酵培地7mlずつを二十個の殺菌した300ml容の三角フラスコに入れ、それぞれに殺菌した炭酸カルシウム(CaCO3)70mgと殺菌したL−メチオニン(30mg/ml)溶液0.023mlずつを添加し、これに上記の種菌液0.7mlずつを接種して、140rpm、30℃で振とう培養し、培養24時間目に殺菌した30〜40重量%フラクトース0.7mlを添加してさらに24時間培養を継続した。
【0027】
上記の四個のフラスコの培養終了液を集めて混合しそのうち7mlずつを三本の試験管に移した。
【0028】
上記の試験管のうち一本の培養液を撹拌後遠心分離し、上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、0.4mg/mlであった。沈殿した菌体は−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し、7mlの水を加えて撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0029】
上記の三本のうちもう一本の培養液を−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0030】
上記の三本のうちさらにもう一本の培養液を90℃で5分間加熱し、撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、1.1mg/mlであった。
【0031】
上記の残りの培養液をすべて集め−20℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解して撹拌後遠心分離して得た上澄液から以下のようにL−シスタチオニンの単離を試みた。
【0032】
上澄液100mlを水で二倍に希釈し、希塩酸を用いてpH3にした。
【0033】
この液を陽イオン交換樹脂ダイアイオンSK#1BのH型カラムに通塔してL−シスタチオニンを吸着させ、水洗後320mlの2NNH4OHで溶出した。
【0034】
この溶出液を減圧下で約50mlまで濃縮し冷蔵庫で冷却したところ白色の沈殿が生じたのでこれを単離し、洗浄後乾燥して70mgのL−シスタチオニンの粗結晶を得た。
【0035】
得られた粗結晶の標品をアミノ酸アナライザー分析したところ、標準のシスタチオニンと溶出時間が一致した。
【0036】
得られた粗結晶の標品を13C−及び1H−NMR分析したところ、得られたシグナルが標準のシスタチオニンのそれと一致した。
【0037】
得られた粗結晶の標品を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、溶出時間が標準のL−シスタチオニンのそれと一致し、シスタチオニンの他の異性体のどれとも一致しなかった。
【0038】
[実施例2]
実施例1の発酵液のL−メチオニン濃度を最終濃度として0、50、100、150、200、250、300、400、500、1000μg/mlに変えて同様に実施した結果、L−メチオニン濃度が50〜300μg/mlに制限した時にL−シスタチオニンが0.5〜1.2mg/ml蓄積した。
【0039】
【発明の効果】
以上の説明により、本発明は安価な原料を含む発酵培地で短時間に著量のL−シスタチオニンを蓄積せしめ容易に製品を得ることが可能となる。
Claims (9)
- L−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養して、培養液中にL−シスタチオニンを蓄積させ、得られた培養液からL−シスタチオニンを単離するL−シスタチオニンの製造法。
- 前記大腸菌がシスタチオニンβ−リア−ゼ(EC 4.4.1.8)欠失性L−メチオニン要求性変異株である請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 栄養物としてのL−メチオニンを前記培地に所定量添加する請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 前記培地への栄養物としてのL−メチオニンの添加濃度が50〜300μg/mlである請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 得られた培養液を凍結後融解処理してL−シスタチオニンを単離する請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 得られた培養液を加熱処理してL−シスタチオニンを単離する請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 前記発酵培地の炭素源として、でんぷん加水分解物、ぶどう糖、果糖、糖蜜等を用いる請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 前記発酵培地の窒素源として、アンモニア水、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等を用いる請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
- 前記発酵培地の硫黄源として、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ尿素等を用いる請求項1に記載のL−シスタチオニンの製造法。
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JP2004159553A true JP2004159553A (ja) | 2004-06-10 |
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