KR101609413B1 - Ｌｅｄ 광원을 이용한 5-아미노레불린산의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광합성 세균의 배양시에 LED 광원으로부터 발생되는 빛을 조사하는 단계를 포함하는 5-아미노레불린산의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 ALA의 생산방법을 이용하면 광합성 세균으로부터 ALA를 생산하는 최적의 조건을 제공할 수 있으므로, ALA 생산성 증대에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＬＥＤ 광원을 이용한 5-아미노레불린산의 생산방법{Process for preparing 5-aminolevulinic acid}

본 발명은 LED 광원을 이용한 5-아미노레불린산의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 광합성 세균의 배양시에 LED 광원으로부터 발생되는 빛을 조사하는 단계를 포함하는 5-아미노레불린산의 생산방법에 관한 것이다.

5-아미노레불린산(5-Aminolevulinic acid, ALA)은 5-아미노레불린산생성효소에 의해 숙시닐CoA와 글리신에서 2-아미노-3-옥소아디핀산을 거쳐 생합성되고, C₅H₉NO₃의 화학식으로 표현되며, 131.13의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 2분자의 5-아미노레불린산은 포스포빌리노겐생성효소에 의해 탈수 축합되어 포르포빌리노겐을 형성하는데, 상기 포스포빌리노겐은 헴, 피코빌린, 담즙색소,시아노코바레민 등 테트라피롤화합물의 생합성 중간체가 된다고 알려져 있고, 5-아미노레불린산이 산화적 탈아미노반응을 받아 2-옥소글루타르산세미알데히드가 되었다가 숙신산으로 되돌아가는 대사경로가 알려져 있다.

상기 ALA는 홍색황세균, 녹색세균의 클로로비움 속 균주(Chlorobium sp.), 황홍색세균의 크로마튬 속 균주(Chromatium sp.), 비유황홍세균의 로도스피릴륨 속 균주(Rhodospirillum sp.), 로도박터 속 균주(Rhodobacter sp.) 등의 광합성 세균에서 생성되는데, 광합성에 필요한 엽록소를 생산하는 과정에서 필요한 테트라피롤(tetrapyrrole)의 전구체로서 사용되는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 ALA는 생물체에 투여되었을 때 피롤(pyrrole)을 합성하게 되고, 이는 빛을 받아서 활성산소를 방출하므로 식물의 잎에 살포하면 세포막을 파괴하여 고사에 이르게 하는 제초 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, 이처럼 광합성 세균에서 ALA를 생산하기 위하여는 광합성 세균의 배양시에 2 내지 3일간 지속적으로 빛을 조사하여야 하기 때문에, 배양기간이 길어지고, 배양시간이 증가함에 따라 오염 발생율이 높아진다는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 ALA의 생산성을 증대시킬 수 있는 ALA의 생산방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, LED 광원으로부터 발생되는 빛을 광합성 세균의 배양시에 조사할 경우, ALA의 생산성을 증대시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 생산성이 증대된 5-아미노레불린산의 생산방법을 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 생산성이 증대된 5-아미노레불린산의 생산방법을 제공한다. 보다 구체적으로 본 발명의 생산성이 증대된 5-아미노레불린산의 생산방법은 (a) LED 광원으로부터 발생되는 빛을 조사하면서 광합성 세균을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 배양물로부터 5-아미노레불린산을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "LED(Light Emitting Diode) 광원"이란, 다이오드(2극 구조의 반도체)를 많이 나열해 놓고 특정 부분만 전기를 흐르게 하여 빛을내는 발광 다이오드를 의미하는데, 열을 내지 않기 때문에 내구성이 길고 유리로 둘러 쌀 필요가 없는 등의 장점을 가지고 있다. LED 광원은 800 내지 920nm의 파장을 갖는 빛을 발생시키는데, 본 발명의 목적상 상기 LED 광원은 ALA를 생산하는 광합성 세균의 배양시 빛을 조사하는 수단으로 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "광합성 세균(photosynthetic bacteria)"이란, 엽록소 대신 박테리오클로로필을 포함하여, 이산화탄소와 수소화합물을 재료로 광합성을 수행할 수 있는 세균을 의미한다. 상기 광합성 세균은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 홍색황세균, 녹색황세균 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 클로로비움 속 균주(Chlorobium sp.), 크로마튬 속 균주(Chromatium sp.), 로도스피릴륨 속 균주(Rhodospirillum sp.), 로도박터 속 균주(Rhodobacter sp.) 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 로도박터 속 균주가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "배양물"이란, LED 광원으로부터 발생되는 빛을 조사하면서 광합성 세균이 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 배양된 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다.

본 발명의 용어 "5-아미노레불린산(5-Aminolevulinic acid, ALA)"이란, 5-아미노레불린산생성효소에 의해 숙시닐CoA와 글리신에서 2-아미노-3-옥소아디핀산을 거쳐 생합성되고, C₅H₉NO₃의 화학식으로 표현되며, 131.13의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 2분자의 5-아미노레불린산은 포스포빌리노겐생성효소에 의해 탈수 축합되어 포르포빌리노겐을 형성하는데, 상기 포스포빌리노겐은 헴, 피코빌린, 담즙색소,시아노코바레민 등 테트라피롤화합물의 생합성 중간체가 된다고 알려져 있고, 5-아미노레불린산이 산화적 탈아미노반응을 받아 2-옥소글루타르산세미알데히드가 되었다가 숙신산으로 되돌아가는 대사경로가 알려져 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양함이 바람직하다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

한편, ALA의 전구체를 배지에 가하여 배양된 광합성 세균에서 ALA의 생산성을 향상시킬 수도 있는데, 상기 전구체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 공지된 유기산의 전구체를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 부틸산, 프로피온산, 설퓨린산, 숙신산, 아세트산, 피루브산 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 숙신산, 아세트산, 피루브산 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다

아울러, 배양물로부터 ALA를 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 부틸산 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.

한편, 상기 배양시 배지에 포함된 글루코스 농도를 조절함으로써, ALA의 생산성을 향상시킬 수도 있는데, 상기 글루코스의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 160mM의 농도로 배지에 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 20 내지 160mM의 농도로 배지에 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 40mM의 농도로 배지에 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 다양한 파장의 빛을 조사하면서, 광합성 세균의 일종인 Rhodobacter sphaeroides를 배양하고, 시간의 경과에 따른 증식수준을 측정한 결과, 850nm의 파장을 갖는 빛을 조사한 경우, 광합성 세균이 가장 높은 증식수준을 나타내었으며(도 1), 상기 배양된 각 광합성 세균에서 생산된 ALA의 생산량을 비교한 결과, 850nm의 파장을 갖는 빛을 조사한 경우에 가장 높은 ALA 생산성을 나타내었다(도 2). 또한, 상기 850nm의 파장을 갖는 빛을 조사하면서 Rhodobacter sphaeroides를 배양할 때, 다양한 유기산의 전구체를 배지에 가하면서 상기 균주로부터 생산되는 ALA의 생산성을 비교한 결과, 숙신산, 아세트산, 피루브산을 가할 경우에 우수한 우수한 ALA 생산성을 나타내었고, 특히 피루브산을 가할 경우에 가장 우수한 ALA 생산성을 나타내었으다(도 3). 상기 850nm의 파장을 갖는 빛을 조사하면서 Rhodobacter sphaeroides를 배양할 때, 배지에 탄소원으로 포함된 글루코스의 농도를 변화시키면서 상기 균주로부터 생산되는 ALA의 생산성을 비교한 결과, 배지내 글루코스의 농도가 40mM인 경우에 가장 우수한 ALA 생산성을 나타냄을 확인하였다(도 4).

본 발명의 ALA의 생산방법을 이용하면 광합성 세균으로부터 ALA를 생산하는 최적의 조건을 제공할 수 있으므로, ALA 생산성 증대에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 조사되는 빛의 파장에 따른 광합성 세균의 증식수준을 나타내는 그래프이다.
도 2는 조사되는 빛의 파장에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 배지에 첨가된 유기산 전구체에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 배지에 첨가된 글루코스의 농도에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 파장별 광합성 세균의 증식수준 변화

광합성 홍색 세균인 Rhodobacter sphaeroides KCTC 1434을 혐기배양하기 위하여, 상기 균주를 초기 pH가 6.8 로 조절된 배양배지(Glucose 60 mM/ℓ, Succinate 60 mM/ℓ, (NH₄)₂HPO₄ 20 mM/ℓ, MgSO₄·7H₂O 1mM/ℓ, Corn streep liquor 0.3mM/ℓ, levulinic acid 5 mM/ℓ, Glycine 10 mM/ℓ)에 접종하고, 조사하는 빛의 파장을 달리하여 각각 200rpm 및 30℃에서 5일간 진탕배양하였다. 이때, 대조군으로는 2개의 60W 백열등의 빛을 조사한 그룹을 사용하고, 실험군으로는 각각 410, 530, 630, 730 및 850nm 파장의 빛을 조사한 그룹을 사용하였으며, 상기 각 빛의 세기는 5mW로 하였다. 상기 배양이 종료된 후, 배양액을 취하여 10배 희석한 다음, 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 흡광도(O.D600)를 측정하였다(도 1). 도 1은 조사되는 빛의 파장에 따른 광합성 세균의 증식수준을 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 광합성 세균의 배양시 조사된 빛의 파장에 따라 상기 세균의 증식수준이 변화됨을 확인하였고, 특히 850nm 파장의 빛을 조사한 경우에 상기 세균이 가장 높은 수준으로 증식함을 알 수 있었다.

실시예 2: 파장별 5- 아미노레불린산(ALA)의 생산량 변화

상기 실시예 1의 방법으로 광합성 세균을 배양하면서, 배양 2일째에 각각의 분취된 배양액시료 1 ml을 13,000rpm으로 15분간 원심분리하고, 이로부터 상등액을 수득한 다음, 상기 상등액을 10배 희석하였다. 이어, 공지된 방법(Mauzerall & Granick의 절차)에 따라, 상기 희석된 시료 0.75 ml에 초산완충액 1ml 및 acetylacetone 0.04 ml을 혼합하고, 열 중탕에서 15분간 반응시킨 후 냉각시켜 modified Ehrilich's 반응액 1.75ml을 가하여 20분간 방치시키고, 분광광도계를 이용하여 556 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 측정된 흡광도를 보정곡선에 적용하여, 상기 시료에 포함된 ALA의 농도를 결정하였다(도 2). 도 2는 조사되는 빛의 파장에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 광합성 세균의 배양시 조사된 빛의 파장에 따라 상기 세균에서 생산된 ALA의 함량이 변화됨을 확인하였고, 특히 850nm 파장의 빛을 조사한 경우에 상기 세균에서 생산된 ALA의 함량이 가장 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3: 전구체에 따른 5- 아미노레불린산(ALA)의 생산량 변화

상기 실시예 1 및 2의 결과에 따라, 850nm 파장의 빛을 조사하고, ALA 생합성 전구체로 사용되는 다양한 유기산(Butyric acid, propionic acid, sulfuric acid, succinic acid, acetic acid, pyruvic acid)을 최종 농도 5 mM로 포함하는 배양배지를 사용하여 2일 동안 배양한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 광합성 홍색 세균을 배양하고, 이로부터 생산된 ALA의 함량을 실시예 2의 방법으로 확인하였다(도 3). 도 3은 배지에 첨가된 유기산 전구체에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 유기산 전구체에 따라 ALA의 생산량이 다양하게 변화됨을 확인하였고, 숙신산(succinic acid), 아세트산(acetic acid) 및 피루브산(pyruvic acid)을 포함하는 배지를 사용할 경우, 대조군 보다도 ALA의 생산량이 현저하게 증가하였으며, 특히 피루브산을 포함하는 배지를 사용할 경우, 상기 세균에서 생산된 ALA의 함량이 가장 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4: 탄소원의 농도에 따른 광합성 세균의 증식수준 및 ALA 의 생산량 변화

상기 실시예 1 및 2의 결과에 따라, 850nm 파장의 빛을 조사하고, 다양한 농도의 글루코스를 포함하는 배양배지를 사용하여 2일 동안 배양한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 광합성 홍색 세균을 배양하고, 세균의 증식수준 변화와 이로부터 생산된 ALA의 함량을 확인하였다(도 4). 도 4는 배지에 첨가된 글루코스의 농도에 따른 광합성 세균에서 생산되는 5-아미노레불린산의 생산량을 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 배지에 포함된 글루코스의 농도에 따라, 광합성 세균의 증식수준 뿐만 아니라 ALA의 생산량이 변화됨을 확인하였다. 즉, 배지내에 글루코스의 농도를 40mM의 농도로 증가시킬 때까지는 글루코스의 농도에 비례하여 광합성 세균의 증식수준 및 ALA의 생산량이 증가하였으나, 배지내에 40mM보다 높은 농도로 글루코스를 포함할 경우에는 오히려 광합성 세균의 증식수준 및 ALA의 생산량이 감소함을 알 수 있었다.

Claims (10)

1. (a) LED 광원으로부터 발생되는 빛을 조사하면서 광합성 세균을 숙신산, 아세트산, 피루브산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유기산 전구체 및 30 내지 60mM의 글루코스를 포함하는 배지를 사용하여 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및
   (b) 상기 배양물로부터 5-아미노레불린산(ALA)을 회수하는 단계를 포함하는, 5-아미노레불린산(ALA)의 생산방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 LED 광원으로부터 발생되는 빛은 800 내지 920nm의 파장을 갖는 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 LED 광원으로부터 발생되는 빛은 850nm의 파장을 갖는 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 광합성 세균은 클로로비움 속 균주(Chlorobium sp.), 크로마튬 속 균주(Chromatium sp.), 로도스피릴륨 속 균주(Rhodospirillum sp.), 로도박터 속 균주(Rhodobacter sp.) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 균주인 것인 방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 배양은 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항에 있어서,
   상기 배양은 40mM의 글루코스를 포함하는 배지를 사용하여 수행하는 것인 방법.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 ALA의 회수는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
    
    

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