WO2012002572A1 - 有用物質の製造方法 - Google Patents

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WO2012002572A1
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望 鎌田
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日本水産株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing useful substances using microorganisms.
  • Non-patent Documents 1 and 2 As a method for producing useful substances using microorganisms, production of L-amino acids, nucleic acids, unsaturated fatty acids, etc. by fermentation is well known (Non-patent Documents 1 and 2). These useful substances are produced by utilizing the metabolism of microorganisms using a carbohydrate such as glucose and / or an oxide of hydrocarbon as a substrate.
  • Microorganism culture methods for producing useful substances include batch culture in which all medium components including the substrate are added to the initial culture medium and culturing, and a part of the substrate is added to the initial culture medium inoculated with the microorganism and the culture is started.
  • the remaining substrate is intermittently or continuously added to the medium and fed to the fed-batch culture, the fresh medium containing the substrate is supplied to the fermentor at a constant rate, and the same amount of the culture solution is continuously added to the tank.
  • a continuous culture in which the cells are cultured while being discharged outside is known.
  • the production medium for industrially producing useful substances has an oxidation of carbohydrates and / or hydrocarbons such as glucose and starch saccharified as a substrate for the useful substances at the time of inoculation with microorganisms. Things are included. There is no known method for starting the culture of microorganisms without adding carbohydrates such as glucose and saccharified starch and / or hydrocarbon oxides to the initial medium.
  • the present invention relates to a method for efficiently producing a target useful substance using microorganisms, and in particular, an object of the present invention is to provide a method for shortening the culture period required for production of a useful substance and increasing the production efficiency of the useful substance. .
  • the present inventors have found that in the method for producing useful substances by microbial culture, the total concentration of carbohydrates and hydrocarbon oxides is 0. Using less than 4% by weight, it has been found that useful substances can be produced efficiently by adding carbohydrate and / or hydrocarbon oxides after microorganisms have started logarithmic growth. completed.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following inventions.
  • a method for producing a useful substance by microbial culture comprising a step of pre-culturing microorganisms, a step of inoculating the obtained pre-cultured liquid into a primary culture initial medium, wherein the oxidation of carbohydrates and hydrocarbons in the primary culture initial medium
  • a main culture step in which the total concentration of the product is less than 0.4% by weight in terms of carbon equivalent, and a carbohydrate and / or hydrocarbon oxide is added after the microorganism has started logarithmic growth.
  • useful substances can be efficiently produced by microorganisms.
  • FIG. 1 shows (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraene in a culture system in which glucose was added to the initial medium in Example 1 and a culture system in which glucose was not added to the initial medium. It is the figure which showed transition of the glucose concentration in the culture medium in the acid production experiment.
  • FIG. 2 shows (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraene in a culture system in which glucose was added to the initial medium in Example 1 and a culture system in which glucose was not added to the initial medium. It is the figure which showed transition of the ratio of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid to the total fatty acid in the acid production experiment.
  • the present invention is a method for producing a useful substance by microbial culture, which includes a microorganism pre-culturing step, a step of inoculating the obtained pre-cultured liquid into the main culture initial medium, and a carbohydrate in the main culture initial medium. And a main culture step in which a carbohydrate and / or hydrocarbon oxide is added after the microorganism has started logarithmic growth, and the total concentration of the hydrocarbon oxide and the hydrocarbon oxide is less than 0.4% by weight in carbon equivalent It is the said manufacturing method.
  • the useful substance produced according to the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can be produced by microorganisms, and includes amino acids, nucleic acids, unsaturated fatty acids, lipids, proteins, peptides, vitamins, sugars, sugar alcohols, alcohols, organics. Examples include acids, antibiotics and physiologically active substances.
  • L-glutamic acid As amino acids, L-glutamic acid, L-lysine, L-threonine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-asparagine, L-aspartic acid, L -Histidine, L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, L-citrulline, L-proline, L-serine, methionine, L-alanine, L-cysteine, cystine, homoserine and the like. Guanosine, inosinic acid, guanylic acid, xanthylic acid, cytidylic acid and the like.
  • Proteins include lipase, phospholipase, protease, transglutaminase, amylase, isoamylase, glucose isomerase, glucosidase, pullulanase, polygalacturonase, mannose isomerase, arabinofuranosidase, rhamnosidase, mannosidase, cyclodextrin producing enzyme, glucose dehydrogenase, Glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, glucose oxidase, sialyltransferase, fucosyltransferase, N-acetylglucosaminyltransferase, galactosyltransferase, mannosyltransferase, N-acetylgalactosaminidase, N-acylamino acid racemase, D- Aminoacylase, L-fe Lucerin dehydrogenase,
  • Vitamins include ascorbic acid, riboflavin, thiamine, niacin, biotin, cyanocobalamin, vitamin A, vitamin D, vitamin K, carotenoids, etc.
  • sugars include glucosamine, N-acetylglucosamine, xylose, ribose, fructooligosaccharides Galactooligosaccharides, mannan oligosaccharides, chitin, chitosan, hyaluronic acid, viscous polysaccharides and the like
  • sugar alcohols include xylitol, erythritol, galactitol, mannitol, sorbitol and the like.
  • alcohols include ethanol, butanol, glycerol
  • organic acids include acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, succinic acid, citric acid, kojic acid, fumaric acid, malic acid, gluconic acid, itaconic acid, formic acid, propion.
  • antibiotics include benzoquinone antibiotics Substances and anthracycline antibiotics.
  • physiologically active substances include nicotinamide adenine dinucleotide, flavin adenine dinucleotide, orotic acid, shikimic acid, folic acid, hydroxycitric acid, cerebroside, astaxanthin, S-adenosylmethionine, S-methylmethionine sulfonium chloride, retinoids, cerebroside , Coenzyme A, coenzyme Q10, inositol, choline, carnitine, pyrroloquinoline quinone, gibberellin, abscisic acid, polyhydroxyalkanoate, cyclosporin A, mevalotin, polyglutamic acid, polylysine, mannosylerythritol lipid, and the like.
  • the unsaturated fatty acid includes (6Z, 9Z, 12Z) -6,9,12-octadecatrienoic acid, (8Z, 11Z, 14Z) -8,11,14-icosatrienoic acid, (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid, (4Z, 7Z, 11Z, 14Z, 17Z) -4,7,11,14,17-docosapentaenoic acid, (9Z, 12Z, 15Z) -9,12,15-octadecatrienoic acid, (6Z, 9Z, 12Z, 15Z) -6,9,12,15-octadecatetraenoic acid, (8Z, 11Z, 14Z, 17Z) -8,11, 14,17-eicosatetraenoic acid, (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z) -5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid
  • the unsaturated fatty acid includes (8Z, 11Z, 14Z) -8,11,14-icosatrienoic acid, (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid, (5Z , 8Z, 11Z) -5,8,11-icosatrienoic acid, and lipids include triacyl glycerides, diacyl glycerides, monoacyl glycerides, phosphatidyl cholines, phosphatidyl serines, phosphatidyl ethanolamines, phosphatidylinositols containing the above unsaturated fatty acids.
  • Phosphatidic acid lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylserine, lysophosphatidylethanolamine, lysophosphatidylinositol, lysophosphatidic acid.
  • the useful substance produced by the microorganism may be a single substance or a mixture of two or more kinds. Moreover, the substance which contains the said useful substance as a structural component may be sufficient.
  • the microorganism used in the present invention is not particularly limited, and any microorganism can be used as long as it is used for producing a useful substance by fermentation. Moreover, even if it is a microorganism which has not been utilized for fermentation production until now, as long as it has the capability to produce a useful substance, the method of the present invention can be applied. In addition, even microorganisms that do not originally have the ability to produce useful substances have been given the ability to produce useful substances by breeding using mutations or recombinant DNA techniques, which are methods known to those skilled in the art. Even microorganisms can be used in the method of the present invention.
  • microorganisms used in the present invention include Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Erwinia, Pseudomonas, Rhodobacter, Salmonella, Vibrio, Xanthomonas, Desulfurococcus, Thermo Coccus spp.
  • Cryptococcus Acinetobacter, Geobacillus, Natrialba, Exigobacteria, Sphingomonas, Thermobifida, Leuconostoc, Lactobacillus, Acidiphyllium, Nocardio Cis genus, Streptomyces genus, Amycolata genus, Pseudonocardia genus, Thermomonospora genus, Streptoverticium genus, Gordonia genus, Amycolatopsis genus, Pyrococcus genus, Thermococcus genus, Thermoplasma genus, Thermos genus, Pedeococcus, Saccharomyces, Chizosaccharomyces, Candida, Torlaspora, Klaberiberyces, Pichia, Pseudozyma, Debariomyces, Pachisoren, Mortierella, Mortierella, Genus Conidiobora, Phytium, Phyt
  • Mortierella spp. are preferred, Mortierella subsp. Are more preferred, and Mortierella alpina is particularly preferred.
  • microorganisms having the ability to produce lipids containing (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid as constituent fatty acids Mortierella, Conidiobora, Phytium, Phytophthra , Penicillium genus, Cladosporium genus, Mucor genus, Fusarium genus, Aspergillus genus, Rhodorula genus, Entomoftra genus, Echinosporandium genus and Saproregnia genus.
  • examples of the microorganism belonging to the genus Mortierella subgenus Mortierella elongata, Mortierella excigua, Mortierella figlophyra, Mortierella alpina and the like are Specifically, Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella excigua IFO 8571, Mortierella figrophila IFO 5941, Mortierella alpina IFO 8568, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 32222, ATCC 42430, CBS 219.35, CBS 223.37, CBS 224.37, CBS 66, CBS 527.72, CBS 529.72, CBS 608.70, CBS 754.68, and the like.
  • strains can be obtained from the National Institute of Biotechnology and Resource Resources (NBRC), the American Type Culture Collection, ATCC, and the Central Bureau room Schematicures (CBS).
  • NBRC National Institute of Biotechnology and Resource Resources
  • ATCC American Type Culture Collection
  • CBS Central Bureau room Schematicures
  • the pre-culture of microorganisms is performed in a medium suitable for the microorganisms to be used under conditions that provide the number of cells necessary for main culture.
  • Inoculation of the obtained preculture liquid into the primary culture initial culture medium can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the culture method. Specifically, vegetative cells, spores and / or mycelia of microbial strains, or seed cells obtained by culturing in advance or vegetative cells, spores and / or mycelia recovered from seed cultures in a liquid medium or solid medium Inoculate and culture.
  • citrus molasses, beet molasses, beet juice, sugarcane juice containing these substances can be used as a carbon source by the microorganisms to be cultured, or those commonly used by those skilled in the art. Any of these can be used.
  • the total concentration of the initial carbohydrate and hydrocarbon oxide may be less than 0.4 wt% in terms of carbon equivalent, preferably 0.2 wt% or less, more preferably 0.1 wt% or less, and even more preferably Is 0.05% by weight or less, particularly preferably 0% by weight, that is, substantially no carbohydrate and / or hydrocarbon oxide may be added to the initial medium.
  • 0.4 wt% in terms of carbon equivalent means 1 wt% for glucose, 0.95 wt% for sucrose, 0.77 wt% for ethanol, and 1.02 wt% for glycerol.
  • main culture initial culture medium is substantially supplemented with carbohydrates and / or hydrocarbon oxides” in the present invention. "It is not.”
  • the primary culture medium is substantially free of carbohydrates and / or It corresponds to “the hydrocarbon oxide is not added”.
  • carbohydrate and / or hydrocarbon oxides are added. Add to medium.
  • the adaptation period and logarithmic growth period of microorganisms vary depending on the microorganisms used for the fermentative production of useful substances, culture media, culture conditions, etc., but those skilled in the art will know the number of cells, turbidity of the culture solution, Measure the amount of wet cells, etc., measure the pH of the culture solution, dissolved oxygen concentration, etc., the carbon dioxide concentration in the gas discharged from the culture device, etc.
  • the adaptation phase and logarithmic growth phase can be confirmed.
  • the time when the number of cells begins to increase exponentially is the time when the adaptive phase shifts to the logarithmic growth phase.
  • the time when the consumed oxygen begins to increase exponentially is the time when the adaptive phase shifts to the logarithmic growth phase.
  • the number of times of feeding the carbohydrate and / or hydrocarbon oxide may be plural as long as it is one or more, and the carbohydrate and / or hydrocarbon oxide may be added to the medium continuously or intermittently. it can.
  • the total amount of added carbohydrate and / or hydrocarbon oxide is not particularly limited.
  • Nitrogen sources commonly used in microbial culture such as peptone, yeast extract, malt extract, meat extract, casamino acid, corn steep liquor, soy protein, defatted soybean, cottonseed cass, casein hydrolysis
  • Natural nitrogen sources such as urea, various fermented bacterial cells, and digested products thereof, organic nitrogen sources such as urea, and nitrates such as sodium nitrate and ammonium nitrate, inorganic or organic acids such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • Inorganic nitrogen sources such as ammonium salts and ammonia can be used alone or in combination or in combination with the nitrogen source.
  • trace amounts of phosphate ions, potassium ions, sodium ions, magnesium ions, calcium ions, metal ions such as iron, copper, zinc, manganese, nickel, cobalt, and vitamins such as biotin and thiamine can be used as a nutrient source.
  • an antifoaming agent such as adecanate or silicone can be added.
  • a method of culturing an existing microorganism specifically, solid culture, stationary culture, shaking culture, aeration and agitation culture, or the like can be used.
  • the culture operation method any of so-called batch culture, fed-batch culture, repeated batch culture, continuous culture, and the like can be used.
  • an agitating means for example, an impeller (agitating blade), an air lift fermenter, a pump-driven circulation of a fermentation broth, or a combination of these means can be used.
  • the production method of the present invention can be carried out by the above-described culture method, but it is industrially advantageous to perform the main culture by aeration and agitation culture in a liquid medium.
  • a tank for performing aeration stirring culture for example, a stirring tank such as a jar fermenter and a tank can be used, but is not limited thereto.
  • a gas containing oxygen such as air or a gas not containing oxygen such as argon and nitrogen may be aerated or a mixture of these gases may be aerated.
  • a gas containing oxygen such as air or a gas not containing oxygen such as argon and nitrogen may be aerated or a mixture of these gases may be aerated.
  • Such gas may be appropriately selected according to the conditions of the culture system.
  • the culture temperature varies depending on the microorganism used, but is usually 5 to 100 ° C., preferably 10 to 50 ° C., more preferably 15 to 40 ° C. Moreover, as one aspect, after the microorganism is grown at a temperature suitable for the growth of the microorganism and cultured, the culture is continued at a temperature suitable for the production of the target substance to increase the productivity of the target substance.
  • the culture period is usually 5 hours to 10 days, preferably 5 hours to 5 days, more preferably 5 hours to 3 days.
  • the culture period of the main culture for producing subsequent useful substances is usually 5 hours to 30 days, preferably 5 hours to 20 days, more preferably 5 hours to 15 days.
  • the production amount of a desired useful substance, the nutrient component in the medium, and the remaining amount of the substrate component can be used as a judgment criterion at the end of the main culture.
  • the culture medium for cultivating the microorganisms may have a pH of 3 to 9, and the pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • the microorganism is cultured, and the target substance is accumulated in the microorganism cell body, the cell surface, or the medium.
  • the culture solution itself containing microbial cells or a concentrate thereof can be used as the final target substance, but useful substances can be collected and purified as necessary.
  • the target useful substance When the target useful substance is accumulated on the microbial cell body or on the microbial cell surface, the microbial cell body is recovered from the culture solution by a usual method such as centrifugation or filtration, and the microbial cell body itself is regarded as the final target substance.
  • the target substance can be recovered with a solvent, etc., and the usual purification method of the target substance, such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, crystallization, etc.
  • the target substance can also be purified using In addition, even when the target substance is accumulated in the culture medium, the culture solution itself from which the microbial cells have been separated and the concentrate thereof can be used as the final target substance.
  • the target substance can also be purified.
  • Microorganisms that produce unsaturated fatty acids or lipids that are useful substances include the genus Mortierella, Conidiobolus, Phytium, Phytofutra, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula And microorganisms belonging to the genus Entomoftra, Echinosporandium, and Saproregnia. These microorganisms accumulate unsaturated fatty acids or lipids, which are useful substances, in the microbial cells.
  • microorganisms that catabolize carbohydrate and / or hydrocarbon oxides with exo-amylase have low activity of degrading high-molecular-weight ⁇ -glycans represented by starch, and carbohydrate and / or hydrocarbon oxides are metabolized. Since the rate of catabolism is reduced, it is preferable that the initial culture medium is substantially free of carbohydrates and / or hydrocarbon oxides.
  • Microorganisms that catabolize these carbohydrate and / or hydrocarbon oxides with exo-amylase were added when the carbohydrate and / or hydrocarbon oxides added after the microorganisms started logarithmic growth were sugars It is particularly preferred because it can react quickly with sugars.
  • the microbial cells are preferably dried after sterilization if desired. Drying can be performed by oven heating, freeze drying, hot air drying, or the like. From dry cells or wet cells, lipids containing unsaturated fatty acids can be obtained using techniques well known to those skilled in the art. For example, after dry cells are extracted with an organic solvent such as hexane, the organic solvent is distilled off from the extract under reduced pressure to obtain a lipid containing a high concentration of unsaturated fatty acids mainly composed of triglycerides. .
  • Unsaturated fatty acids in lipids can be directly separated, but can be easily separated from other lipid components by using esters with lower alcohols, such as methyl esters. Moreover, only a desired unsaturated fatty acid can be easily separated from other unsaturated fatty acids. Such separation techniques are well known to those skilled in the art.
  • the microbial cell of the present invention can be used as it is or after being dried.
  • the unsaturated fatty acid obtained by the production method of the present invention and a lipid containing the unsaturated fatty acid can also be used in various ways. These can be used for foods and drinks including supplements, nutritional compositions, animal feeds (especially pet foods), seafood aquaculture feeds, powdered milk, etc., using techniques well known to those skilled in the art. it can.
  • Example 1 Production of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid by a culture system in which glucose is added to the initial medium, Mortierella alpina 1S-4 strain was used. 100 ⁇ L of the frozen spore solution is inoculated into 100 mL of a medium of yeast extract 1.0 w / w%, hydrous glucose 2.0 w / w%, pH 6.3, and precultured under the conditions of reciprocal shaking 100 rpm and temperature 28 ° C. One stage) was started and cultured for 3 days.
  • the initial culture medium for main culture (2.67 w / w% hydrous glucose, 5.0 w / w% defatted soybean flour, 0.3 w / w% K 2 HPO 4 , 0.05 w / w% MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.05 w / w% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, pH 6.0) was inoculated with 25 L of seed culture (second stage), and adjusted to a total volume of 4000 L of initial culture.
  • the culture was started at a temperature of 26 ° C. and an internal pressure of 0.10 MPa. Water content of 5.33% on the first day of culture, 5.33% on the second day of culture, 4.00% on the third day of culture, 4.00% on the fourth day of culture and 2.67% on the fifth day As a result of feeding glucose and adding a total of 24.0% hydrous glucose, glucose in the medium was completely depleted on the 12th day of culture.
  • the production amount of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid on the 12th day of culture is 17.7 g / L, accounting for the total fatty acids (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5. , 8,11,14-icosatetraenoic acid was 42.4%.
  • the initial culture medium for main culture (5.0 w / w% defatted soybean flour, 0.3 w / w% K 2 HPO 4 , 0.05 w / w% MgCl 2 .6H 2 O, 0.05 w / w% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, the pH 6.0), was inoculated seed culture (second stage) 25L, tailored to initial culture volume of total 4000 L.
  • the culture was started at a temperature of 26 ° C. and an internal pressure of 0.10 MPa. Water content of 5.33% on the first day of culture, 5.33% on the second day of culture, 5.33% on the third day of culture, 4.00% on the fourth day of culture, and 4.00% on the fifth day As a result of feeding glucose and adding a total of 24.0% hydrous glucose as in ⁇ 1>, glucose in the medium was completely depleted on the 9th day of culture.
  • the production amount of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5,8,11,14-icosatetraenoic acid on the 12th day of culture is 18.3 g / L, accounting for the total fatty acids (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5.
  • Example 2 ⁇ 1> Production of (8Z, 11Z, 14Z) -8,11,14-icosatrienoic acid by cultivation with glucose added to the initial medium
  • the Mortierella alpina S14 strain was used. Mortierella alpina S14 strain was inoculated into 100 mL of medium of about 1 platinum loop, yeast extract 1.0 w / w%, hydrous glucose 2.0 w / w%, pH 6.3, and reciprocal shaking 100 rpm, temperature 28 ° C. Pre-culture (first stage) was started and cultured for 3 days.
  • the initial medium of the main culture (2.00 w / w% hydrous glucose, 4.32 w / w% defatted soybean flour, 0.3 w / w% K 2 HPO 4 , 0.05 w / w% MgSO 4 .7H 2 O, 0.05 w / w% CaSO 4 .2H 2 O, pH 6.3) was inoculated with 25 L of seed culture (second stage), and adjusted to a total volume of 4000 L of initial culture.
  • the culture was started at a temperature of 26 ° C. and an internal pressure of 0.10 MPa.
  • On the first day of culture 4.00%, 5.00% on the second day of culture, 6.00% on the third day of culture, and 6.00% of hydrous glucose on the sixth day of culture were fed.
  • As a result of adding 0.0% hydrous glucose and further adding 1.00% disodium succinate and 0.021% NaOH on the 4th day of culture the residual glucose concentration in the medium on the 13th day of culture was 0. .75%.
  • Mortierella alpina S14 strain was used. Mortierella alpina S14 strain was inoculated into 100 mL of medium of about 1 platinum loop, yeast extract 1.0 w / w%, hydrous glucose 2.0 w / w%, pH 6.3, and reciprocal shaking 100 rpm, temperature 28 ° C. Pre-culture (first stage) is started and cultured for 3 days.
  • Culturing is started at a temperature of 26 ° C. and an internal pressure of 0.10 MPa.
  • 6.00%, 5.00% on the second day of culture, 6.00% on the third day of culture, and 6.00% hydrous glucose on the sixth day of culture were fed.
  • 0.0% water-containing glucose was added and 1.00% disodium succinate and 0.021% NaOH were added on the 4th day of culture, the glucose in the medium was completely depleted on the 12th day of culture. Eyes.
  • Example 3 Production of (5Z, 8Z, 11Z) -5,8,11-icosatrienoic acid by culturing with addition of glucose to the initial medium
  • Mortierella alpina strain JT180 was used. Mortierella alpina JT180 strain is inoculated into 20 mL of medium of about 1 platinum loop, yeast extract 1.0 w / w%, hydrous glucose 2.0 w / w%, pH 6.0, and reciprocal shaking 100 rpm, temperature 28 ° C. The preculture was started and cultured for 3 days.
  • Mortierella alpina strain JT180 is used. Mortierella alpina JT180 strain is inoculated into 20 mL of medium of about 1 platinum loop, yeast extract 1.0 w / w%, hydrous glucose 2.0 w / w%, pH 6.0, and reciprocal shaking 100 rpm, temperature ° C. Pre-culture is started and cultured for 3 days.

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Abstract

微生物を利用した有用物質の製造方法に関し、微生物の培養期間を短縮し、有用物質の生産性を改善する方法を提供することである。　本培養初発培地として炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度が炭素当量で０．４重量％未満のものを用いることにより、微生物が炭水化物および／または炭化水素の酸化物を消費する速度を向上させ、目的とする有用物質の生産性が向上される。

Description

有用物質の製造方法
　本発明は、微生物を利用した有用物質の製造方法に関するものである。
　微生物を利用した有用物質の製造方法としては、発酵法によるＬ−アミノ酸、核酸、不飽和脂肪酸の製造などがよく知られている（非特許文献１、２）。これらの有用物質は、グルコースなどの炭水化物および／または炭化水素の酸化物を基質とし、微生物の代謝を利用して製造される。有用物質を製造するための微生物の培養方法としては、初発培地に基質を含め全ての培地成分を添加して培養する回分培養、微生物を接種する初発培地に一部の基質を添加し培養を開始した後に、残りの基質を間欠的あるいは連続的に培地に添加し培養する流加培養、発酵槽へ基質を含む新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の培養液を連続的に槽外へ排出しながら培養する連続培養などが知られている。しかしながら、いずれの培養方法においても、有用物質を工業的に製造する生産培地には、微生物を接種する時点において、有用物質の基質となるグルコース、デンプン糖化物などの炭水化物および／または炭化水素の酸化物が含まれている。初発培地にグルコース、デンプン糖化物などの炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加せずに微生物の培養を開始する方法は知られていない。
応用微生物学　改訂版、培風館、１９９３年発行 科学と工業、第７４巻１号、２６（２０００）
　本発明は、微生物を利用した目的とする有用物質を効率よく製造する方法に関し、詳しくは有用物質生産に要する培養期間を短縮し、有用物質の生産効率を高める方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題解決に向け鋭意検討を重ねたところ、微生物培養による有用物質の製造方法において、本培養初発培地として炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度が炭素当量で０．４重量％未満のものを用い、微生物が対数増殖を開始した後に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加することにより有用物質を効率よく製造することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、これに限定される訳ではないが以下の発明を包含する。
　（１）微生物培養による有用物質の製造方法であって、微生物の前培養工程、得られた前培養液を本培養初発培地に接種する工程、ここで本培養初発培地における炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度が炭素当量で０．４重量％未満であり、および微生物が対数増殖を開始した後に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加する本培養工程、を含む前記製造方法。
　（２）本培養初発培地は実質的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物が添加されていないものである、（１）記載の製造方法。
　（３）微生物が対数増殖を開始した後に添加する炭水化物および／または炭化水素の酸化物が糖類である、（１）または（２）記載の製造方法。
　（４）微生物が炭水化物および／または炭化水素の酸化物をエキソ型アミラーゼにより異化する微生物である、（１）ないし（３）のいずれかに記載の製造方法。
　（５）微生物がモルティエレラ属微生物である、（１）ないし（４）のいずれかに記載の製造方法。
　（６）有用物質が高度不飽和脂肪酸である、（１）ないし（５）のいずれかに記載の製造方法。
　本発明により、微生物による有用物質の生産を効率よく行うことができる。
図１は、実施例１での初発培地にグルコースを添加した培養系、および初発培地にグルコースを添加しない培養系における、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産実験での培地中のグルコース濃度の推移示した図である。 図２は、実施例１での初発培地にグルコースを添加した培養系、および初発培地にグルコースを添加しない培養系における、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産実験での総脂肪酸に占める（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の割合の推移を示した図である。
　上記の通り、本発明は、微生物培養による有用物質の製造方法であって、微生物の前培養工程、得られた前培養液を本培養初発培地に接種する工程、ここで本培養初発培地における炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度が炭素当量で０．４重量％未満であり、および微生物が対数増殖を開始した後に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加する本培養工程、を含む前記製造方法である。
　本発明により製造される有用物質は、微生物によって生産することができる物質であれば特に制限されず、アミノ酸、核酸、不飽和脂肪酸、脂質、たんぱく質、ペプチド、ビタミン、糖、糖アルコール、アルコール、有機酸、抗生物質、生理活性物質などが挙げられる。
　アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、メチオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、シスチン、ホモセリンなどが挙げられ、核酸としては、イノシン、グアノシン、イノシン酸、グアニル酸、キサンチル酸、シチジル酸などが挙げられる。
　不飽和脂肪酸としては、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、（４Ｚ，７Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−４，７，１１，１４，１７−ドコサペンタエン酸、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、（６Ｚ，９Ｚ）−６，９−オクタデカジエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ）−８，１１−イコサジエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸などが挙げられ、脂質としては、上記の不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジン酸、カルジオリピンや、ステロールなどが挙げられる。
　たんぱく質としては、リパーゼ、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、トランスグルタミナーゼ、アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコシダーゼ、プルラナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、マンノースイソメラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ラムノシダーゼ、マンノシダーゼ、サイクロデキストリン生成酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、マンオシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、Ｄ−アミノアシラーゼ、Ｌ−フェニルセリン脱水素酵素、カルボニル還元酵素、α−ケト酸還元酵素、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ、コレステロールオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ、フィターゼ、フマラーゼ、ウリカーゼ、カタラーゼ、ホスファターゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、インベルターゼ、アスパラギナーゼ、タンナーゼ、ラクターゼ、ウロキナーゼなどが挙げられ、ペプチドとしては、グルタチオンなどが挙げられる。
　ビタミンとしては、アスコルビン酸、リボフラビン、チアミン、ナイアシン、ビオチン、シアノコバラミン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、カロチノイド類などが挙げられ、糖としては、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、リボース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、粘性多糖類などが挙げられ、糖アルコールとしては、キシリトール、エリスリトール、ガラクチトール、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。
　アルコールとしては、エタノール、ブタノール、グリセロールなどが挙げられ、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、クエン酸、コウジ酸、フマル酸、リンゴ酸、グルコン酸、イタコン酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、アクリル酸、メタクリル酸、ソルビン酸、マレイン酸、桂皮酸、アルドン酸、酒石酸、イソクエン酸、ケトアルドン酸、２−ケトグロン酸などが挙げられ、抗生物質としては、ベンゾキノン系抗生物質、アントラサイクリン系抗生物質などが挙げられる。
　生理活性物質としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、オロト酸、シキミ酸、葉酸、ヒドロキシクエン酸、セレブロシド、アスタキサンチン、Ｓ−アデノシルメチオニン、Ｓ−メチルメチオニンスルホニウムクロライド、レチノイド類、セレブロシド、コエンザイムＡ、コエンザイムＱ１０、イノシトール、コリン、カルニチン、ピロロキノリンキノン、ジベレリン、アブシジン酸、ポリヒドロキシアルカノエート、シクロスポリンＡ、メバロチン、ポリグルタミン酸、ポリリジン、マンノシルエリスリトールリピッドなどが挙げられる。
　好ましくは、不飽和脂肪酸としては、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−６，９，１２−オクタデカトリエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、（４Ｚ，７Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−４，７，１１，１４，１７−ドコサペンタエン酸、（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ）−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸、（６Ｚ，９Ｚ）−６，９−オクタデカジエン酸、（８Ｚ，１１Ｚ）−８，１１−イコサジエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸などであり、脂質としては、上記の不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジン酸、カルジオリピンや、ステロールなどである。
　より好ましくは、不飽和脂肪酸としては、（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸であり、脂質としては、上記の不飽和脂肪酸を含むトリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジン酸である。
　現在微生物を利用して製造されていない物質であっても、微生物を利用して製造することができる場合は、本発明方法を適応することができる。微生物によって生産される有用物質は、単独でも、２種類以上の複数の混合物であってもよい。また、上記有用物質を構成成分として含む物質であってもよい。
　本発明に用いる微生物は特に制限されず、発酵法による有用物質の製造に用いられている微生物であれば、いずれも使用することができる。また、これまで発酵生産に利用されていない微生物であっても、有用物質を生産する能力を有する限り、本発明方法を適応することができる。また、本来有用物質を生産する能力を有しない微生物であっても、当業者に知られた方法である突然変異や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により有用物質を生産する能力が付与された微生物であっても、本発明方法に用いることができる。
　本発明に用いる具体的な微生物としては、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、エルウィニア属、シュードモナス属、ロドバクター属、サルモネラ属、ビブリオ属、キサントモナス属、デスルフロコッカス属、サーモコッカス属、アースロバクター属、エンテロバクター属、アセトバクテリウム属、アセトバクター属、メタノスリックス属、アグロバクテリウム属、ツーグレア属、アルカリジェネス属、エンテロコッカス属、デイノコッカス属、セベキア属、セルロモナス属、クリプトコッカス属、アシネトバクター属、ゲオバチルス属、ナトリアルバ属、エクシグオバクテリウム属、スフィンゴモナス属、サーモビフィダ属、ロイコノストック属、ラクトバチルス属、アシディフィリウム属、ノカルディオプシス属、ストレプトマイセス属、アミコラタ属、シュードノカルディア属、サーモモノスポラ属、ストレプトバーティシリウム属、ゴルドニア属、アミコラトプシス属、パイロコッカス属、サーモコッカス属、サーモプラズマ属、サーマス属、ペデイオコッカス属、サッカロマイセス属、チゾサッカロマイセス属、キャンディダ属、トルラスポラ属、クライベロマイセス属、ピキア属、シュードザイマ属、デバリオマイセス属、パチソレン属、モルティエレラ属、モルティエレラ亜属、コニディオボラス属、フィチウム属、フィトフトラ属、クラドスポリューム属、ロードトルラ属、エントモフトラ属、エキノスポランジウム属、サプロレグニ属、ウルケニア属、シゾキトリウム属、スラウストキトリウム属、モルチエレラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属、リゾプス属、アクレモニウム属、ペニシリウム属、フォーマ属、ミロセシウム属、ホウロクタケ属、ヒポミセス属、フザリウム属、オーリクラリア属、フィシウム属、メニスポロプシス属、サーモマイセス属、セルコスポラ属、ボツリチス属、ステムフィリウム属、モナスカス属、ムコール属、ペスタロッチア属、フレビア属、シゾフィラム属、フロロフレクサス属、キータスボリシア属、クリソスポリウム属に属する微生物などが挙げられ、有用物質の製造に用いる微生物であればこれらに制限されない。
　より具体的には、以下の微生物が挙げられる。例えば生産する有用物質が不飽和脂肪酸または脂質の場合、モルティエレラ属糸状菌が好ましく、モルティエレラ亜属糸状菌がより好ましく、モルティエレラ・アルピナが特に好ましい。例えば、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸を構成脂肪酸として含む脂質の生産能を有する微生物として、モルティエレラ属、コニディオボラス属、フィチウム属、フィトフトラ属、ペニシリウム属、クラドスポリューム属、ムコール属、フザリウム属、アスペルギルス属、ロードトルラ属、エントモフトラ属、エキノスポランジウム属、サプロレグニア属に属する微生物が挙げられる。
　さらに具体的には、モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ、モルティエレラ・エキシグア、モルティエレラ・フィグロフィラ、モルティエレラ・アルピナ等が挙げられる。具体的にはモルティエレラ・エロンガタＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグアＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ３２２２２、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等の菌株を挙げることができる。
　これらの菌株はいずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）、及び米国のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ及び、Ｃｅｎｔｒｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）等から入手することができる。また、（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸または（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸含有脂質の生産の場合、本発明者らが土壌から分離した菌株モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４株、菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭ０２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することができる。（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸または（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸含有脂質の生産の場合は、１Ｓ−４株から常法であるニトロソグアニジン変異法で誘導して得た、Δ５不飽和化活性の欠失した変異株であるモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６０（微工研条寄第３５８９号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−３５８９）、モルティエレラ・アルピナＳ１４株、モルティエレラ・アルピナＩｚ３株などを使用することができる。（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸または（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸含有脂質の生産の場合は、１Ｓ−４株から常法であるニトロソグアニジン変異法で誘導して得た、Δ１２不飽和化活性の欠失した変異株としてモルティエレラ・アルピナＳＡＭ１８６１（微工研条寄第３５９０号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−３５９０）、モルティエレラ・アルピナＭ２０９−７株（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１５７６６）、モルティエレラ・アルピナＪＴ１８０株を使用することができる。
　微生物の前培養は、用いる微生物に適した培地にて、本培養へ必要な菌体数が得られる条件で行う。
　得られた前培養液の本培養初発培地への接種は、培養方法に応じて当業者が適宜選択し得る。具体的には、微生物菌株の栄養細胞、胞子および／または菌糸、又は予め培養して得られた種培養液あるいは種培養より回収した栄養細胞、胞子および／または菌糸を、液体培地あるいは固体培地に接種して培養する。
　本培養培地には、炭水化物または炭化水素の酸化物として、グルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース（スクロース）、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、糖化澱粉等を単独であるいは組み合わせて、さらにはこれらのものを含有するシトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁等、培養する微生物が炭素源として資化できるもの、もしくは当業者に一般的に使用されているものであればこれらに限らず、いずれも使用できる。初発の炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度は、炭素当量で０．４重量％未満であればよく、好ましくは０．２重量％以下、より好ましくは０．１重量％以下、さらに好ましくは０．０５重量％以下、特に好ましくは０重量％、すなわち実質的に初発培地に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加しなければよい。ここで、炭素当量で０．４重量％とは、グルコースでは１重量％、ショ糖では０．９５重量％、エタノールでは０．７７重量％、グリセロールでは１．０２重量％を意味する。前培養からの微量の炭水化物および／または炭化水素の酸化物の持ち込みは、通常は微量であり、本発明でいう「本培養初発培地は実質的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物が添加されていないものである」に該当する。また、微生物に代謝され利用されることを予定していない、炭素源とはならない炭水化物および／炭化水素の酸化物が添加されていたとしても、「本培養初発培地は実質的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物が添加されていないものである」に該当する。
　前培養液を本培養初発培地に接種後、好ましくは微生物の適応期（Ｌａｇ　Ｐｈａｓｅ）が終了後であって対数増殖期（Ｌｏｇ　Ｐｈａｓｅ）に移行した後に、炭水化物および／または炭化水素の酸化物を培地に添加する。微生物の適応期、対数増殖期は、有用物質の発酵生産に用いる微生物、培地、培養条件などにより異なるが、当業者は周知の方法により細胞数、培養液の濁度、培養液あたりの乾燥もしくは湿菌体量などを測定し、また、培養液のｐＨや溶存酸素濃度などや、培養装置から排出されるガス中の二酸化炭素濃度などを測定し、各パラメーターの推移を確認することで微生物の適応期、対数増殖期を確認することができる。例えば細胞数をパラメーターとして用いる場合、細胞数が指数関数的に増加し始める時期が適応期から対数増殖期に移行する時期となる。また、溶存酸素濃度で調べる場合は、消費酸素が指数関数的に増加し始める時期が適応期から対数増殖期に移行する時期となる。
　炭水化物および／または炭化水素の酸化物を流加する回数は１回以上であれば、複数でもよく、また、連続的あるいは間欠的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を培地に添加することができる。添加する炭水化物および／または炭化水素の酸化物の総量は特に制限されない。
　窒素源としては、微生物培養に一般的に使用されているもの、例えば、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス、カゼイン加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等の天然窒素源のほか、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、アンモニア等の無機窒素源を単独で又は複数で、あるいは前記窒素源と組み合わせて使用することができる。
　この他必要に応じて、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンや、鉄、銅、亜鉛、マンガン、ニッケル、コバルト等の金属イオンや、ビオチン、チアミン等のビタミン等を微量栄養源として使用できる。必要に応じて、アデカネート、シリコーン等の消泡剤を添加することもできる。
　本培養は、既存の微生物を培養する方法、具体的には固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等を用いることができる。培養操作法としては、いわゆる回分培養、流加回分培養、反復回分培養及び連続培養等のいずれも使用することができる。なお、攪拌手段としては、例えばインペラー（攪拌羽根）、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循環、またはこれら手段の組み合わせ等を使用することができる。
　本発明の製造方法は、上述の培養方法によって実施することができるが、なかでも液体培地中における通気攪拌培養で本培養を行うことが工業的に有利である。通気攪拌培養を行うための槽としては、例えば、ジャーファーメンター及びタンク等の攪拌槽が使用可能であるが、これらに限られるものではない。
　通気攪拌培養においては、例えば空気等の酸素を含有するガスや、アルゴン及び窒素等の酸素を含有しないガスのいずれを通気してもよく、また、それらのガスを混合して通気してもよく、このようなガスは培養系の条件に合わせて適宜選択すればよい。
　培養温度は、使用する微生物により異なるが、通常、５~１００℃、好ましくは１０~５０℃、より好ましくは１５~４０℃である。また一態様として、微生物の生育に適切な温度で培養して微生物を増殖後、目的物質の生産に適した温度にて培養を続けて、目的物質の生産性を高めることもできる。
　前培養として固体培地や、試験管やフラスコ中の液体培地で培養する場合における培養期間は、通常５時間~１０日間、好ましくは５時間~５日間、より好ましくは５時間~３日間である。続く有用物質を生産する本培養の培養期間は、通常５時間~３０日間、好ましくは５時間~２０日間、より好ましくは５時間~１５日間である。所望の有用物質の生産量や培地中の栄養成分、基質成分の残存量を、本培養終了時の判断基準とすることができる。
　なお、微生物を培養する培地のｐＨは３~９であればよく、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて、ｐＨを調整することができる。
　このように微生物を培養して、微生物菌体内、菌体表面、または培地中に目的物質を蓄積させる。微生物菌体を含む培養液自体やその濃縮物を最終の目的物質とすることもできるが、必要に応じて有用物質を採取、精製することもできる。目的とする有用物質が微生物菌体内や菌体表面に蓄積している場合、遠心分離、ろ過などの通常の方法により培養液から微生物菌体を回収し、微生物菌体自体を最終の目的物質とすることもでき、また溶媒などにより目的物質を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、晶析等、通常の目的物質の精製方法を用いて、目的物質を精製することもできる。また、目的物質が培地中に蓄積している場合でも、微生物菌体を分離した培養液自体やその濃縮物を最終の目的物質とすることもできるが、上述の通常の精製法を用いて、目的物質を精製することもできる。
　有用物質である不飽和脂肪酸または脂質を生産する微生物としては、モルティエレラ属、コニディオボラス属、フィチウム属、フィトフトラ属、ペニシリウム属、クラドスポリューム属、ムコール属、フザリウム属、アスペルギルス属、ロードトルラ属、エントモフトラ属、エキノスポランジウム属、サプロレグニア属に属する微生物を挙げることができ、これらの微生物は有用物質である不飽和脂肪酸または脂質を微生物菌体内に蓄積する。
　特に、炭水化物および／または炭化水素の酸化物をエキソ型アミラーゼにより異化する微生物は、デンプンに代表される高分子量α−グリカンを分解する活性が低く、代謝により炭水化物および／または炭化水素の酸化物を異化する速度が遅くなるため、本培養初発培地に実質的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物が含まれないという状態となり、好ましい。
　これらの炭水化物および／または炭化水素の酸化物をエキソ型アミラーゼにより異化する微生物は、微生物が対数増殖を開始した後に加える炭水化物および／または炭化水素の酸化物が、糖類である場合に、添加された糖類にすぐに反応できるため、特に好ましい。
　培養終了後、当業者によく知られた手法により、例えば特開２０００−６９９８７などの手法を参照して、培地から不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸を含有する脂質、またはこれらを含有する微生物菌体を得ることができる。
　微生物菌体は、所望により殺菌後、好ましくは乾燥する。乾燥は、オーブン加熱、凍結乾燥、熱風乾燥等によって行うことができる。乾燥菌体又は湿菌体から、当業者によく知られた手法を用いて不飽和脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。例えば、乾燥菌体をヘキサン等の有機溶媒で抽出処理後、抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、トリグリセリドを主とする、高濃度の不飽和脂肪酸を含有した脂質が得られる。また、得られたトリグリセリドを主とする脂質に、脱ガム、脱酸、脱色、脱臭など、通常の食用油脂に施す精製処理を行うことにより、高純度の精製食用油脂（トリグリセリド）を得ることができる。
　脂質中の不飽和脂肪酸は直接分離することもできるが、低級アルコールとのエステル、例えばメチルエステルとすることにより、他の脂質成分から容易に分離することができる。また、所望の不飽和脂肪酸のみを他の不飽和脂肪酸から容易に分離することができる。このような分離手法は、当業者によく知られている。
　本発明の微生物菌体は、そのまま、又は乾燥させて、利用することができる。また、本発明の製造方法で得られた不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質も、様々な手法で利用することができる。これらは、例えば、サプリメント、栄養組成物、動物用飼料（特にペットフード）、魚介類養殖用飼料、粉ミルク等を含む飲食品に、当業者によく知られた手法を用いて、利用することができる。
　以下に実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　実施例１
　＜２＞　初発培地にグルコースを添加した培養系による（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４株を用いた。凍結胞子液を、１００μＬ、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地１００ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて前培養（第一段階）を開始し、３日間培養した。次に、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、大豆油０．１ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地３０Ｌを５０Ｌ容培養槽に調製し、これに種培養液（第一段階）２００ｍＬを接種して、前培養（第二段階）を開始し、温度２８℃の条件にて２日間培養した。次に、本培養の初発培地（２．６７ｗ／ｗ％　含水グルコース、５．０ｗ／ｗ％　脱脂大豆粉、０．３ｗ／ｗ％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｗ／ｗ％　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０５ｗ／ｗ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）に、種培養液（第二段階）２５Ｌを接種して、計４０００Ｌの初発培養液量に合わせた。
　温度２６℃、内圧０．１０ＭＰａで培養を開始した。培養１日目に５．３３％、培養２日目に５．３３％、培養３日目に４．００％、培養４日目に４．００％、５日目に２．６７％の含水グルコースの流加を行い、合計２４．０％の含水グルコースを添加した結果、培地中のグルコースが完全に枯渇したのは培養１２日目であった。培養１２日目における（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産量は１７．７ｇ／Ｌ、総脂肪酸に占める（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の割合は４２．４％であった。
　＜２＞　初発培地にグルコースを添加しない培養系による（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナ１Ｓ−４株を用いた。凍結胞子液を、１００μＬ、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地１００ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて前培養（第一段階）を開始し、３日間培養した。次に、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、大豆油０．１ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地３０Ｌを５０Ｌ容培養槽に調製し、これに種培養液（第一段階）２００ｍＬを接種して、前培養（第二段階）を開始し、温度２８度の条件にて２日間培養した。次に、本培養の初発培地（５．０ｗ／ｗ％　脱脂大豆粉、０．３ｗ／ｗ％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｗ／ｗ％　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０５ｗ／ｗ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）に、種培養液（第二段階）２５Ｌを接種して、計４０００Ｌの初発培養液量に合わせた。
　温度２６℃、内圧０．１０ＭＰａで培養を開始した。培養１日目に５．３３％、培養２日目に５．３３％、培養３日日に５．３３％、培養４日目に４．００％、５日目に４．００％の含水グルコースの流加を行い、＜１＞と同様に合計２４．０％の含水グルコースを添加した結果、培地中のグルコースが完全に枯渇したのは培養９日目であった。培養１２日目における（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の生産量は１８．３ｇ／Ｌ、総脂肪酸に占める（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の割合は４５．６％であった。＜１＞初発グルコース添加培養と＜２＞初発グルコース無添加培養における、培地中のグルコース濃度の推移を図１に、総脂肪酸に占める（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸の割合の推移を図２に示す。
　実施例２
　＜１＞　初発培地にグルコースを添加した培養による（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナＳ１４株を用いた。モルティエレラ・アルピナＳ１４株を１白金耳程度、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地１００ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて前培養（第一段階）を開始し、３日間培養した。次に、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、大豆油０．１ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地３０Ｌを５０Ｌ容培養槽に調製し、これに種培養液（第一段階）２００ｍＬを接種して、前培養（第二段階）を開始し、温度２８℃の条件にて２日間培養した。次に、本培養の初発培地（２．００ｗ／ｗ％　含水グルコース、４．３２ｗ／ｗ％　脱脂大豆粉、０．３ｗ／ｗ％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｗ／ｗ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｗ／ｗ％　ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．３）に、種培養液（第二段階）２５Ｌを接種して、計４０００Ｌの初発培養液量に合わせた。
　温度２６℃、内圧０．１０ＭＰａで培養を開始した。培養１日目に４．００％、培養２日目に５．００％、培養３日目に６．００％、培養６日目に６．００％の含水グルコースの流加を行い、合計２３．０％の含水グルコースを添加し、さらに培養４日目に１．００％のコハク酸２ナトリウム、０．０２１％のＮａＯＨを添加した結果、培養１３日目における培地中の残存グルコース濃度は０．７５％であった。
　＜２＞　初発培地にグルコースを添加しない培養系による（８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−８，１１，１４−イコサトリエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナＳ１４株を用いる。モルティエレラ・アルピナＳ１４株を１白金耳程度、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地１００ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度２８℃の条件にて前培養（第一段階）を開始し、３日間培養する。次に、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、大豆油０．１ｗ／ｗ％、ｐＨ６．３の培地３０Ｌを５０Ｌ容培養槽に調製し、これに種培養液（第一段階）２００ｍＬを接種して、前培養（第二段階）を開始し、温度２８℃の条件にて２日間培養する。次に、本培養の初発培地（４．３２ｗ／ｗ％　脱脂大豆粉、０．３ｗ／ｗ％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５ｗ／ｗ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５ｗ／ｗ％　ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．３）に、種培養液（第二段階）２５Ｌを接種して、計４０００Ｌの初発培養液量に合わせる。
　温度２６℃、内圧０．１０ＭＰａで培養を開始する。培養１日目に６．００％、培養２日目に５．００％、培養３日目に６．００％、培養６日目に６．００％の含水グルコースの流加を行い、合計２３．０％の含水グルコースを添加し、さらに培養４日目に１．００％のコハク酸２ナトリウム、０．０２１％のＮａＯＨを添加すると、培地中のグルコースが完全に枯渇するのは培養１２日目である。
　実施例３
　＜１＞　初発培地にグルコースを添加した培養による（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナＪＴ１８０株を用いた。モルティエレラ・アルピナＪＴ１８０株を１白金耳程度、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．０の培地２０ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度℃２８の条件にて前培養を開始し、３日間培養した。次に、本培養の初発培地（２．００ｗ／ｗ％グルコース、１．００ｗ／ｗ％　酵母エキス、ｐＨ６．０）に、前培養液２０ｍＬを接種して、計５Ｌの初発培養液量に合わせた。温度２８℃で２日間培養した後に、培養温度を１９℃に変更し、培養を継続した。培養１日目、培養２日目にそれぞれ１．００％のグルコースの流加を行い、合計４．０％のグルコースを添加し培養を行った結果、培地中のグルコースが完全に枯渇したのは培養６日目であった。
　＜２＞　初発培地にグルコースを添加しない培養系による（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ）−５，８，１１−イコサトリエン酸の生産
　モルティエレラ・アルピナＪＴ１８０株を用いる。モルティエレラ・アルピナＪＴ１８０株を１白金耳程度、酵母エキス１．０ｗ／ｗ％、含水グルコース２．０ｗ／ｗ％、ｐＨ６．０の培地２０ｍＬに接種し、往復振盪１００ｒｐｍ、温度℃度の条件にて前培養を開始し、３日間培養する。次に、本培養の初発培地（２．００ｗ／ｗ％グルコース、１．００ｗ／ｗ％　酵母エキス、ｐＨ６．０）に、前培養液２０ｍＬを接種して、計５Ｌの初発培養液量に合わせる。温度２８℃で２日間培養した後に、培養温度を１９℃に変更し、培養を継続する。培養１日目、培養２日目にそれぞれ１．００％のグルコースの流加を行い、合計４．０％のグルコースを添加し培養を行うと、培地中のグルコースが完全に枯渇するのは培養５日目である。
　以上の結果より、初発培地に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加せず、微生物を培養することで、微生物が炭水化物および／または炭化水素の酸化物を消費する速度を向上させ、有用物質を生産に要する培養期間を短縮することができ、有用物質の生産性が向上することが分かった。

Claims (6)

  1. 　微生物培養による有用物質の製造方法であって、
    　微生物の前培養工程、
    　得られた前培養液を本培養初発培地に接種する工程、ここで本培養初発培地における炭水化物と炭化水素の酸化物の合計の濃度が炭素当量で０．４重量％未満であり、
    　微生物が対数増殖を開始した後に炭水化物および／または炭化水素の酸化物を添加する本培養工程、
    　を含む前記製造方法。
  2. 　本培養初発培地は実質的に炭水化物および／または炭化水素の酸化物が添加されていないものである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　微生物が対数増殖を開始した後に添加する炭水化物および／または炭化水素の酸化物が糖類である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　微生物が炭水化物および／または炭化水素の酸化物をエキソ型アミラーゼにより異化する微生物である、請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　微生物がモルティエレラ属微生物である、請求項１ないし４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 　有用物質が高度不飽和脂肪酸である、請求項１ないし５のいずれかに記載の製造方法。
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