JPH05244969A - アミノ酸の発酵製造方法 - Google Patents

アミノ酸の発酵製造方法

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JPH05244969A
JPH05244969A JP4247942A JP24794292A JPH05244969A JP H05244969 A JPH05244969 A JP H05244969A JP 4247942 A JP4247942 A JP 4247942A JP 24794292 A JP24794292 A JP 24794292A JP H05244969 A JPH05244969 A JP H05244969A
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Abstract

(57)【要約】 【目的】 使用された炭素源（糖）のより高い変化率で
進行し、かつバイオマス不含の乾燥物で高いアミノ酸濃
度が達成されるアミノ酸の発酵製造方法を提供する。 【構成】 激しい成長期に引き続いて、バクテリア培養
が株構成および培地内で調達される他の必要とする補充
物の量に基づき代謝できるよりも少ない、同化し得る炭
素源を供給する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、例えばＬ−リシンまた
はＬ−トレオニンのようなアミノ酸の発酵製造の改良さ
れた方法に関する。Ｌ−リシンは必須アミノ酸でありか
つ広範に動物飼料補助剤として使用される。
【０００２】
【従来の技術】多くのアミノ酸の取得は一般には生合成
法で行われかつ技術の現状から可なり以前から公知であ
る。生産者として使用されるバクテリア株は、これらの
アミノ酸を短時間に高い濃度で培地内で析出する能力に
すぐれている。培養基の高い初期濃度をさけるためには
ふつうフィードバッチ法を行う。
【０００３】使用される生産株の極めて高い物質交換容
量により、発酵過程を、酸素要求量および発熱の最大値
が経済的に代替できる範囲を有するように行うことが決
定的に重要である。
【０００４】それゆえ、生物の代謝活性を、一方で酸素
供給および熱の導出を保証し、他方でバイオマスおよび
生産物生成の配分を平衡せしめるように制御する様々の
戦略が使用される。
【０００５】チェコスロバキャ特許第２１２ ５５８号
明細書から、成長期での代謝の活性をｐＨ変化を介して
バイオマスの全含有率をα−アミノ窒素を介して調整す
る不連続的に栄養を供給する方法が公知である。
【０００６】アメリカ特許第１ １５７ ０５９号明細書
には、トレオニン濃度を栄養供給のための基準として利
用し、かつ減少する化合物の含有率を３〜５％に保持す
る、不連続的に栄養を供給する方法が記載されている。
【０００７】フランス特許第８３０３４８７号明細書か
ら、極めて微細に調整される方法が公知である。この方
法においては、２つの連続的に供給すべき供給溶液が存
在する。第１の供給溶液は、ロイシンリン酸溶液であ
り、補助剤添加を介して、物質交換の強度もまたバイオ
マスの生成について制限されるように配量する。第２の
供給溶液は、糖溶液であり、実際の糖濃度が５〜１５ｇ
／ｌを保持するように供給する。これから、培養はロイ
シン／リン酸塩の補充による制限のため栄養供給期間中
あらゆる時点で、培地提供されるよりも少ない糖を消費
することが明らかである。
【０００８】この方法は、Ｃ制限もまた著しいＣ過剰も
回避すべき、幾つか記録された見解と同じである。例え
ば東ドイツ特許第２６９１６７号明細書：Ｈａｄｊ Ｓ
ａｓｓｉ ｅｔａｌ．，“Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ．Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．８，頁５８３〜５８６
（１９８８）は、このためにさらにグルコース９０〜１
４０ｇ／ｌを提案している。従って、代謝の活性は常に
Ｃ源のそれと別の量で制御される。
【０００９】
【発明が解決しょうとする課題】従って、本発明の課題
は、使用された炭素源（糖）のより高い転化率で進行
し、かつバイオマス不含の乾燥物で高いアミノ酸濃度が
達成されるアミノ酸の発酵製造方法を提供することであ
った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記課題は本発明によ
り、１種以上のアミノ酸を生産するブレビバクテリウム
またはコリネバクテリウム属の菌株を培地で培養し、発
酵終了時に１種以上のアミノ酸を培養液から単離するこ
とによる、アミノ酸の発酵製造方法において、バクテリ
ア培養に激しい成長期（生産期中）に引き続いて、該バ
クテリア培養が株構成および培養基内で調達される他の
必要とする補充物の量に基づき代謝できるよりも少な
い、同化し得る炭素源を供給することにより解決され
る。
【００１１】発酵培養基はそのほかは一般に公知のよう
に構成されている。
【００１２】該培養基は、炭素源例えば同化し得る糖、
サッカロース、グルコース、糖密または澱粉加水分解物
およびアンモニウムイオンの他に、栄養要求性生産体の
場合には、１種以上の栄養要求性菌株に基づき必要とす
る有機補充物の源として錯体成分、例えばα−アミノ窒
素源としてプロテイン加水分解物、ビタミンならびに無
機塩を含有する。発酵の開始での激しい成長は、一般に
対数的成長期である。このことは必要により補充物およ
び／または炭素源の制限により短縮することができる。
【００１３】またそれに引き続いて、なお細胞成長があ
る。しかしその範囲は激しい成長と称する期間の数分の
１であるにすぎない。
【００１４】有利には、Ｌ−リシンおよび／またはＬ−
トレオニンを生成する株を使用する。
【００１５】発酵環境は、温度が２５〜４０℃、有利に
は３０〜３６℃、ｐＨ値が６〜８、有利には７〜７．５
およびアンモニウムイオン濃度が０．５〜８ｇ／ｌであ
るように選定する。混合物を撹拌し、十分に酸素を供給
する。
【００１６】特にアミノ酸栄養要求性リシン分泌者の場
合には、糖の代謝をアミノ酸の供給量を介して制御す
る。
【００１７】その濃度ないしはほかの必要とする補充物
の濃度は、成長期の後有利にはそれぞれ０〜０．１ｇ／
ｌ特に０〜０．０５ｇ／ｌである。
【００１８】例えばロイシン栄養要求性リシン分泌者の
場合には連続的に供給すべき栄養供給媒体中の糖／ロイ
シンの割合を、ロイシン供給を介してバイオマス生成を
制限し、しかし同時に所定のロイシン濃度で転化できる
糖のただ一部のみを提供するように選定する。
【００１９】有利には激しい成長期に引続いて利用でき
る糖の濃度は０〜＜３ｇ／ｌに、しかし特に０〜１ｇ／
ｌに達する。
【００２０】しかし発酵液中の濃度０ｇ／ｌは、場合に
よって必要とする補充物また炭素源に関しても、これら
の物質を連続的に供給しないことを意味するものでな
い。むしろ、これらの化合物を、直接バクテリア培養か
ら採取される量で供給することを表わす。この本発明に
よる方法により行う発酵は上述の従来方法に対して一連
の全く決定的な利点を有する： １．代謝活性、ひいてはまた培養の酸素需要および発熱
に直接かつ遅滞なく栄養供給の配量速度を介して影響を
与えかつ発酵器容量に適合させることができる。
【００２１】２．発酵液は全乾燥物中の高い生成物含
量、ひいてはまた高い純度ですぐれている。バクテリア
培養に全栄養供給期間にわたってそれが転化できるより
も少ない培地を提供し、従って炭素源が一次制限される
ことにより、副生成物の方向への流れを妨げる。
【００２２】３．発酵は補充物を介して一次制限を伴う
発酵進行に対してより高い収率を有する。
【００２３】４．生成物監視において、該発酵を直ぐに
かつ追従時間もなく最適でないしは平坦で中断すること
ができ、その総体収率は正味収率の各時点に相応する。
【００２４】５．発酵液の直接蒸発を行う後処理計画で
は、技術的故障の際発酵内容物を直ちに後処理に、高い
残余糖含有物により生成物品質を損うことなく、供給す
ることができる。
【００２５】
【実施例】次に実施例により本発明を詳細に説明する。
【００２６】例 １（比較例） 撹拌機および通気系を有する発酵容器に以下の成分： 水 ４５４０ｇ 糖密 ２６ｇ グルコース １２５ｇ コーングルテン加水分解物（硫酸） ３５ｇ 生産者バイオマスの加水分解物（硫酸） ３２０ｇ 硫酸アンモニウム ４５ｇ リン酸８５％ ７ｇ 硫酸マグネシウム ３ｇ ほかに鉱物塩、痕跡ならびにビオチンおよびチアミンを
含有する無菌の溶液５．１ｋｇを入れ、アンモニア溶液
でｐＨ７．３に調整した。この溶液に３３〜３５℃で、
遺伝マーカーｌｅｕ-、オキサリシン耐性およびアミノ
エチル耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミシウ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）ＤＭ３４６−１の保存種０．６ ｌを加えた。
該保存種は３３℃およびｐＨ７で撹拌および通気の下
に、糖密４．４重量％のサッカロース２重量％および硫
酸アンモニウム３％および大豆粉加水分解物（硫酸）１
４％を有する培地中でリン酸０．０５％および硫酸マグ
ネシウム０．０２％ならびにビタミンビオチンおよびチ
アミンを添加して１５時間の保温により調製した。
【００２７】充分な撹拌、通気およびアンモニア水溶液
で約７．３の値にｐＨ調整で、対数的成長期の終了後主
発酵器内でアンモニア水溶液で中和した以下の培養基を
従来の方法で３２時間以内で連続的に、発酵液中で測定
できる糖濃度が５〜３５ｇ／ｌ（サッカロースおよびグ
ルコースで酵素により測定）になるように配量した： 水 １２５０ｇ 糖密 ９４ｇ グルコース １４６５ｇ グルテン加水分解物（硫酸） ３９ｇ 生産者バイオマスの加水分解物（硫酸） ２６５ｇ 硫酸アンモニウム ３１ｇ リン酸８５％ ４ｇ 硫酸マグネシウム ２ｇ ほかに鉱物塩、痕跡ならびにビオチンおよびチアミン。
【００２８】発酵の終了時点で、すなわち発酵培養基中
の全同化し得る糖が消費つくされた後、糖のリシンへの
転化率は、ＬｙｓｘＨＣｌとして計算して３５％、バイ
オマス不含の濃縮発酵溶液のリシン塩基含有率は４５％
であった。
【００２９】例 ２ 接種物の調製、主発酵器に装入した培地、ならびに培養
条件は例１に示した条件と同じである。また培地２は以
下の修正をのぞいて同一の成分からなっていた： 水 １５６０ｇ 糖密 ７５ｇ グルコース １１７０ｇ 本試験では、栄養供給培地を例１におけると同じ配量速
度で加えた。同化し得る糖の経過分析は、本発明方法に
基づき、全栄養供給時間中に同化し得る糖の測定できる
濃度を３ｇ／ｌより下に、しかしほとんどもっぱら１ｇ
／ｌより下に保持したことを示した。発酵液でのアミノ
酸分析器によるロイシンの分析は、栄養供給時間中培地
１に装入したロイシン量の消費の後ではどの時点でも
０．０５ｇ／ｌより大きいロイシン濃度が測定されなか
ったことを示した。
【００３０】発酵終了後糖のリシンへの転化率（Ｌｙｓ
ｘＨＣｌとして計算）は４０％、バイオマス不含の濃縮
発酵液のリシン塩基含有率は５４％であった。
【００３１】例 ３ 以下の組成： サッカロース ３２０ｋｇ 糖密 ２０ｋｇ グルテン加水分解物 ２３０ｋｇ ２５％硫酸アンモニウム水溶液 １５０ｋｇ クエン酸・Ｈ2Ｏ ２．３ｋｇ リン酸（８９％） ６．６ｋｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．８ｋｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ７５ｇ ＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ １１３ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ １１３ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．６ｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．６ｇ ビオチン １．１ｇ チアミン・ＨＣｌ ０．８ｇ ＮＨ4ＯＨ（２〜３％） １０１０ｋｇ 水 ２２５８ｋｇ ｐＨ：７．０ を有する無菌の培養基３９８０ｋｇを１０ｍ3反応器に
入れた。
【００３２】該容器を３３℃で撹拌し充分に通気した。
遺伝マーカーロイシン栄養要求性およびアミノエチルシ
ステン耐性を有する株ＤＭ２８２−２の接種物（糖密６
％、大豆粉加水分解物１４％、硫酸アンモニア１％およ
びリン酸０．１％を有する培地でｐＨ７および３０℃で
１６時間保温後）２５０ ｌを１０ｍ3反応器に移した
後、ｐＨをアンモニア水溶液で７．０に保持し、通気
を、溶解した酸素が常に飽和１５％より上にあるように
調整した。
【００３３】培養が約３０の光学的密度（５３５ｎｍ）
に成長した後、以下の組成： サッカロース ９４０ｋｇ 糖密 ５０ｋｇ グルテン加水分解物 １８０ｋｇ ２５％硫酸アンモニウム水溶液 ８０ｋｇ クエン酸・Ｈ2Ｏ １ｋｇ リン酸（８９％） ２．８ｋｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｋｇ ＦｅＳＯ4・Ｈ2Ｏ ４８ｋｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ４８ｋｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．４ｋｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．３ｇ ビオチン ０．６ｇ チアミン・ＨＣｌ ０．４ｇ ＮＨ4ＯＨ（２５％） ８０ｋｇ 水 ７４０ｋｇ ｐＨ：７．５ を有する生成培地を３０ ｌ／ｈの配量速度で配量し
た。
【００３４】生産期間中、ｐＨ値を７．３に保持した。
成長培地に装入した糖の消費後、本発明に基づき栄養供
給期間中、同化し得る糖の濃度は１ｇ／ｌを上回わら
ず、測定し得るロイシン濃度は０．０５ｇ／ｌ未満であ
った。
【００３５】発酵終了時に、糖のリシン（Ｌｙｓ・ＨＣ
ｌとして）への転化率は３２．３％、バイオマス不含の
濃縮発酵液のリシン塩基含有率は５４．７％であった。
【００３６】例 ４（比較例） 接種物の調製、操作パラメータ、ならびに成長期および
生産期での培地は例３に記載した条件と同じであった。
もちろん今度は配量速度約１００ ｌ／ｈで栄養供給し
た。それによって成長培地に存在していた糖量の消費
後、同化し得る糖の測定できる濃度は栄養供給期間中常
に明らかに５ｇ／ｌより上にあったが、ロイシンの測定
し得る濃度はなお依然として０．０５ｇ／ｌの下にとど
まっていた。糖のリシンへの転化率(Ｌｙｓ・ＨＣｌと
して計算)は発酵終了時点で３０．９％で、バイオマス
不含の発酵液のリシン塩基含有率は４３．５％であっ
た。
【００３７】例 ５（比較例） 培養、成長および生産培地の組成は、グルコースを成長
培地でサッカロース２５ｇ／ｌに、生産培地ではサッカ
ロース５６４ｇ／ｌに代えた点以外は、例１の培地と同
じであった。接種物の調製を含む保温パラメータも同様
に同じであった。撹拌機および通気機構を有する小型発
酵器に無菌の成長培養地０．８２ｋｇ（０．８ ｌ）を
装入した。
【００３８】この溶液に３３〜３５℃でコリネバクテリ
ウム・グルタミンウムＤＳＭ５７１５の保存種０．１
ｌを加えた。約３０（５３５ｎｍ）の光学的濃度に到達
した後、生産培地５３３ｇ（４３０ｍｌ）を２４時間以
内で連続的に配量した。
【００３９】栄養供給期間中、測定し得る糖含有率は常
に発酵培地中５ｇ／ｌより上にあり、成長培地に存在し
ていた糖量の消費の後、ロイシンの含有率は常に０．０
５ｇ／ｌより下であった。発酵終了後、培地中にＬｙｓ
ｘＨＣｌとしてのリシン７４ｇを検出したが、このこと
は２７５ｇの全サッカロース使用で２７％の転化率に相
応する。全乾燥物のリシン含有率は３０．５％であっ
た。
【００４０】例 ６ すべての培地および保温パラメータが例５の条件と同じ
であり、同様に株ＤＳＭ５７１５を有する試験で、生産
培地を今度は３９時間以内で連続的に配量した。
【００４１】本発明による方法に基づき、栄養供給時間
中に成長培地に存在したＣおよびロイシン源の消費後、
実際のサッカロース濃度は１ｇ／ｌより下にあり、該ロ
イシン濃度は０．０５ｇ／ｌより下にあった。発酵の終
了時点で、培地内でリシン（リシンｘＨＣｌとして）８
９ｇが検出され、転化率は３２％であった。全乾燥物中
のリシン塩基含有率は３６．３％であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハインツ フリードリッヒ ドイツ連邦共和国 ハーナウ ９ グリュ ナウシュトラーセ ４ (72)発明者 ヴォルフガング デーゲナー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト １ ジーベン ヒューゲル ６

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １種以上のアミノ酸を生産するブレビバ
    クテリウムまたはコリネバクテリウム属の菌株を培地内
    で培養し、発酵終了時に１種以上のアミノ酸を培養液か
    ら単離することによるアミノ酸の発酵製造方法におい
    て、バクテリア培養に激しい成長期に引き続いて、該バ
    クテリア培養が株構成および培地内で調達される他の必
    要とする補充物の量に基づき代謝することができるより
    も少ない、同化し得る炭素源を供給することを特徴とす
    るアミノ酸の発酵製造方法。
  2. 【請求項２】 激しい成長期に引き続いて、炭素源の濃
    度を０〜＜３ｇ／ｌにする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 栄養要求性菌株を使用し、かつ場合によ
    り多数の栄養要求性株に基づき配量すべき有機化合物の
    少なくとも１種を激しい成長期の後それぞれ０〜０．１
    ｇ／ｌの濃度に制限する請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 Ｌ−リシンおよび／またはＬ−トレオニ
    ンを産生する株を使用する請求項１から３までのいずれ
    か１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 コリネバクテリウム・グルタミシウムの
    ロイシン−栄養要求性株を使用する請求項４記載の方
    法。
JP4247942A 1991-09-17 1992-09-17 アミノ酸の発酵製造方法 Expired - Lifetime JP2965799B2 (ja)

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