SK279888B6 - Spôsob fermentačnej výroby aminokyselín - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu fermentačnej výroby aminokyselín, ako je napríklad L-lyzín alebo L-treonín. L-lyzín je esenciálna aminokyselina a vo veľkom rozsahu sa používa ako prísada do krmív.

Doterajší stav techniky

Rad aminokyselín sa obyčajne vyrába biosyntetickým postupom, ktorý je dlhý čas známy z doterajšieho stavu techniky. Bakteriálne kmene používané ako produkčné mikroorganizmy sa vyznačujú schopnosťou vylučovať tieto aminokyseliny v krátkom čase a vo vysokej koncentrácii do kultivačného média. Aby nebolo nutné používať vysokú počiatočnú koncentráciu substrátu, používa sa spravidla postup Fed-Batch (dávkovanie vsádzky).

Vďaka veľmi vysokej kapacite látkovej výmeny použitých produkčných kmeňov má rozhodujúci význam viesť fermentačný proces tak, aby maximálna hodnota spotreby kyslíka a vývoja tepla mala rádovo veľkosť, ktorá je hospodárna. Boli preto používané rôzne stratégie umožňujúce riadiť metabolickú aktivitu mikroorganizmov tak, aby bolo možné zaistiť na jednej strane zásobovanie kyslíkom a odvádzanie tepla a na druhej strane, aby bolo vyvážené rozdelenie tvorby abiomasy produktu.

Z CS patentového spisu č. 212 558 je známy spôsob diskontinuálneho prikrmovania, pri ktorom sa metabolická aktivita v rastovej laze nastavuje zmenami pH a celkový obsah biomasy reguláciou alfa-aminodusíka.

V SU patentovom spise č. 1 157 059 je opísaný spôsob diskontinuálneho prikrmovania, pri ktorom slúži koncentrácia treonínu ako kritérium pre prikrmovanie a pri ktorom sa obsah redukujúcej zlúčeniny udržuje na 3 až 5 %.

Veľmi dobre vyladený postup je známy z FR patentového spisu č. 8 303 487. Pri tomto postupu sa používajú dva kontinuálne pridávané násadové roztoky: roztok leucín/fosfát, ktorý sa dávkuje tak, že sa dodávkou prísady obmedzuje nielen intenzita látkovej výmeny, ale tiež tvorba biomasy a roztoku cukru, ktorý sa dávkuje tak, aby sa okamžitá koncentrácia cukru udržovala na hodnote v rozmedzí od 5 do 15 g/1. Z toho je zrejmé, že v dôsledku obmedzenia prísadou leucím'fosfát v priebehu fázy prikrmovania sa v každom okamihu spotrebuje menej cukru, než je v kultivačnom médiu k dispozícii. Tento výrobný postup je v súlade s niekoľkokrát dokumentovaným názorom, že je treba sa vyhnúť tak obmedzeniu uhlíka ako silnému prebytku uhlíka (napríklad DD patentový spis 269 167).

Hadj Sassi a ďalšie, Biotechn. Letters, zv. 10, č. 8, str. 583 až 586 (1988) na to navrhujú dokonca použitie glukózy v koncentrácii 90 až 140 g/1. Metabolická aktivita sa teda vždy reguluje hodnotou inej veličiny, ako je zdroj uhlíka.

Úlohou vynálezu je vyvinúť spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, ktorý by prebiehal s vyšším stupňom konverzie nasadzovaného zdroja uhlíka (cukru) a pri ktorom by sa dosahovala v suchej hmote, zbavenej biomasy, vyššia koncentrácia aminokyselín.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultivuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, produkujúci jednu alebo viac aminokyselín, v živnom prostredí a na konci fermentácie sa z kultivačnej kvapaliny izoluje aminokyselina alebo aminokyseliny, ktorého podstata spočíva v tom, že bakteriálna kultúra má v nadväznosti na fáze silného rastu, t. j. v produkčnej fáze, k dispozícii menej využiteľný zdroj uhlíka, ako by mohla v dôsledku konštrukcie kmeňa a množstva inak potrebných prísad, prítomných v živnom prostredí, metabolizovať.

Fermentačné (živné) médium má inak všeobecne známe zloženie. Popri zdroji uhlíka, ako sú asimilovateľné cukry, sacharóza, glukóza, melasa alebo škrobové hydrolyzáty a amónne ióny obsahuje pri auxotrofiiých producentoch komplexné zložky, ako zdroj organických prísad, ktoré sú potrebné v dôsledku jednej alebo viacerých auxotrofií. Týmito zložkami sú napríklad proteínové hydrolyzáty, ako zdroj alfa-aminokyselín, vitamíny a anorganické soli. Pri silnom raste na počiatku fermentácie dochádza spravidla k logaritmickému rastu. Logaritmickú rastovú fázu je možné podľa potreby skrátiť obmedzením prísad a/alebo zdroja uhlíka.

Aj v nadväznosti na túto fázu dochádza k rastu buniek. Jeho rozsah robí však len nepatrný zlomok rastu prebiehajúceho vo fáze, ktorá je označovaná termínom fáza rýchleho rastu.

Prednostne sa používajú kmene, ktoré produkujú L-lyzín a/alebo L-treonín.

Fermentačné prostredie sa volí tak, aby teplota ležala v rozmedzí od 25 do 40 °C, prednostne od 30 do 36 °C, hodnota pH v rozmedzí od 6 do 8, prednostne od 7 do 7,5 a koncentrácia amónnych iónov v rozmedzí od 0,5 do 8 g/1. Suspenzia sa mieša a dostatočne zásobuje kyslíkom. Najmä pri producentoch lyzínu auxotrofhých proti aminokyselinám je možné metabolizáciu cukru riadiť množstvom pridávanej aminokyseliny. Jej koncentrácie, prípadne koncentrácie iných potrebných prísad je po rastovej fáze výhodne v rozmedzí od 0 do 0,1 g/1, najmä od 0 do 0,05 g/1.

Tak napríklad pri produkčnom mikroorganizme produkujúceho lyzín, ktorý je auxotrothý proti leucínu sa volí pomer cukru k leucínu v kontinuálne pridávanom prikrmovacom médiu tak, aby sa tvorba biomasy limitovala zásobovaním leucinom, ale zároveň sa dodáva len zlomok cukru, ktorý by mohol byť pri danej koncentrácii leucínu konvergovaný.

Koncentrácia využiteľných cukrov po fáze silného rastu robí výhodne 0 až menej ako 3 g/1, osobitne však 0 až ^{1 g/1}Koncentrácia 0 g/1 vo fermentačnom médiu neznamená však ani vo vzťahu k pripadne potrebným doplnkovým prísadám, ani vo vzťahu k zdroju uhlíka, že by sa tieto látky kontinuálne neprivádzali. Znamená to skôr, že sa tieto zlúčeniny privádzajú v množstvách, ktoré sú bakteriálnymi kultúrami bezprostredne spotrebované.

Fermentačný postup podľa vynálezu má rad rozhodujúcich výhod oproti bežným postupom, ktoré boh uvedené:

1. Metabolická aktivita a tým aj potreba kyslíka a vývoj tepla v kultúre môžu byť ovplyvňované priamo a bez prieťahov rýchlosťou dávkovania prikrmovacieho média a môžu byť prispôsobené kapacite ťermentora.

2. Feimentačná suspenzia obsahuje väčšie množstvo produktu v celkovej sušine a má teda vyššiu Čistotu. Tým, že bakteriálna kultúra má po celý časový úsek, v ktorom sa uskutočňuje prikrmovanie k dispozícii menej substrátu, ako by mohla konvergovať, dochádza k tomu, že zdroj uhlíka predstavuje hlavné obmedzenie. Tým sa zabraňuje konverzii na vedľajšie produkty.

3. Oproti priebehu fermentácie, pri ktorej sa hlavné obmedzovanie uskutočňuje prostredníctvom doplnkových prísad, má fermentácia podľa vynálezu vyššie výťažky.

4. Pri monitorovaní produktu sa môže fermentácia priamo a bez dobehu prerušiť v optimálnej fáze, tzn. v oblasti plató; hrubý výťažok pritom v každom časovom okamihu zodpovedá čistému výťažku.

5. Pri spracovaní fermentačného produktu, ktoré sa vykonáva priamym odparením vzniknutej suspenzie, sa môže pri technických poruchách obsah fermentora priamo viesť na spracovanie, bez toho, aby došlo k zhoršeniu kvality produktu vysokým zvyškovým obsahom cukru.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a v žiadnom ohľade neobmedzujú rozsah vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 (porovnávací)

Do fermentačnej nádoby, ktorá je opatrená miešadlom a prevzdušňovacím systémom sa predloží 5,1 kg sterilného roztoku obsahujúceho nasledujúce zložky:

voda	4540 g
melasa	26 g
glukóza	125 g
hydrolyzovaný kukuričný lepok	35 g
(pomocou kyseliny sírovej)
hydrolyzát produkovanej biomasy	320 g
(pomocou kyseliny sírovej)
síran amónny	45 g
kyselina fosforečná 85 %	7 g
síran horečnatý	3 g

ďalšie minerálne soli, stopové látky, ako tiež biotín a tiamín.

Hodnota pil zmesi sa prídavkom roztoku amoniaku nastaví na 7,3. K vzniknutému roztoku sa pri teplote 33 až 35 °C pridá 0,6 1 očkovacej kultúry Corynebacterium glulamicum DM 346-1, ktorá nesie genetický markér lcu~, ktorý je oxalyzín-rezistentný a aminoetyl-rezistentný. Očkovacia kultúra sa pripraví 15 hodinovou inkubáciou pri 33 °C a pH 7 za miešania a prevzdušňovania v médiu obsahujúcom 4,4 % hmotnostného melasy, prídavné 2 % sacharózy a ďalej 14 % hydrolyzovanej sójovej múky (pomocou kyseliny sírovej), za prísady 3 % síranu amónneho, 0,05 % kyseliny fosforečnej a 0,02 % síranu horečnatého, ako tiež vitamínov biotinu a tiamínu.

Po skončení logaritmickej rastovej fázy v hlavnom fermentore sa za dostatočného miešania, prevzdušňovania a upravovania hodnoty pH na približne 7,3 pomocou vodného roztoku amoniaku obvyklým spôsobom počas 32 hodín kontinuálne pridáva nasledujúce médium, ktoré je neutralizované vodným roztokom amoniaku tak, aby merateľná koncentrácia cukru vo fermentačnej suspenzii ležala v roz medzí od 5 do 35 g/1 (podľa enzymatického stanovenia na sacharózu a glukózu):

voda 1250g melasa 94g glukóza 1465g hydrolyzovaný kukuričný lepok 39g (pomocou kyseliny sírovej) hydrolyzát produkovanej biomasy265 g (pomocou kyseliny sírovej) síran amónny31 g kyselina fosforečná 85 % 4g síran horečnatý 2g ďalšie minerálne soli, stopové látky, ako tiež biotín a tiamín.

Na konci fermentácie, po spotrebovaní celého množstva asimilovateľného cukru vo fermentačnom médiu robí stupeň konverzie cukru na lyzín približne 35 %, rátané ako hydrochlorid lyzínu. Obsah lyzínovej bázy v odparenom fermentačnom roztoku, zbavenom biomasy, je približne 45 %.

Príklad 2

Príprava inokula, zloženie média v hlavnom fermentore a kultivačné podmienky sú rovnaké ako v príklade 1. Tiež médium 2 je tvorené rovnakými zložkami, s výnimkou nasledujúcich modifikácií: voda 1560 g melasa 75 g glukóza 1170 g

Pri tomto pokuse sa prikrmovacie médium dávkuje rovnakou rýchlosťou ako v príklade 1. Priebežné analýzy na asimilovateľný cukor ukazujú, že je v súlade so znakmi tohto vynálezu po celý čas prikrmovania udržovaná merateľná koncentrácia asimilovateľných cukrov nižšia ako 3 g/1, dokonca takmer výlučne nižšia ako 1 g/1. Analýzy na leucín vo fermentačnej suspenzii, ktoré sa uskutočňujú pomocou analyzátora aminokyselín, ukazujú, že v priebehu prikrmovania nie je po spotrebovaní leucínu, ktorý bol predložený v médiu 1, v žiadnom okamihu koncentrácia leucinu vyššia ako 0,05 g/1.

Na konci fermentácie robí stupeň konverzie cukru na lyzín (rátané ako hydrochlorid lyzínu) 40 %. Obsah lyzínovej bázy v odparenom fermentačnom roztoku, ktorý bol zbavený biomasy, je približne 54 %.

Príklad 3

Do reaktora s objemom 10 m3 sa predloží 3 980 kg ste-

rilného média, ktoré má nasledujúce zloženie:
sacharóza	320	kg
melasa	20	kg
hydrolyzovaný kukuričný škrob	230	kg
25 % vodný síran amónny	150	kg
monohydrát kyseliny citrónovej	2,3	kg
kyselina fosforečná 89 %	6,6	kg
síran horečnatý - heptahydrát	2,8	kg
chlorid vápenatý - dihydrát	75	g
síran železnatý - monohydrát	113	g
síran mangánatý - monohydrát	113	g
síran zinočnatý - heptahydrát	5,6	g
síran meďnatý - pentahydrát	0,6	g
biotín	1,1	g
tiamínhydrochlorid	0,8	g
hydroxid amónny (2 až 3 %)	1010	kg

voda 2258 kg pH: 7,0.

Obsah reaktora sa mieša pri 33 °C a dostatočne prevzdušňuje. Po pridaní 250 1 inokula kmeňa DM 282-2, ktorý nesie leucín-auxotrofný a aminoetylcysteín-rezistentný genetický marker (po 16 hodinách inkubácie v médiu sa 6 % melasy, 14 % hydrolyzátu sójovej múky, 1 % síranu amónneho a 0,1 % kyseliny fosforečnej, pri pH 7 a 30 °C) do reaktora s objemom 10 m³ sa hodnota pH udržuje pridávaním vodného amoniaku na 7,0 a prevzdušňovanie sa nastaví tak, aby obsah rozpusteného kyslíka bol vždy vyšší ako zodpovedá 15% nasýteniu.

Keď kultúra narastie na optickú hustotu (pri 535 nm) približne 30, pridáva sa produkčné médium nasledujúceho zloženia rýchlosťou 30 1/h:

sacharóza	940	kg
melasa	50	kg
hydrolyzovaný kukuričný lepok	180	kg
25 % vodný síran amónny	80	kg
kyselina citrónová - monohydrát	1	kg
kyselina fosforečná 89%	2,8	kg
síran horečnatý - heptahydrát	1,2	kg
síran železnatý - monohydrát	48	g
síran mangánatý - monohydrát	48	g
síran zinočnatý - heptahydrát	2,4	g
síran meďnatý - pentahydrát	0,3	g
biotín	0,6	g
tiamínhydrochlorid	0,4	g
hydroxid amónny 25 %	80	kg
voda	740	kg

pH: 7,5.

V priebehu produkčnej fázy sa hodnota pH udržuje na 7,3. Po spotrebovaní cukru predloženého do rastového média sa v súladu s charakteristikou tohto vynálezu v priebehu fázy prikrmovania udržuje koncentrácia asimilovateľného cukru na hodnote nižšej ako 1 g/1, pričom merateľná koncentrácia leucínu je nižšia ako 0,05 g/1.

Po skončení fermentácie je stupeň konverzie cukru na lyzín (rátané ako hydrochlorid lyzínu) približne 32,3 %. Obsah lyzínovej bázy v odparenom fermentačnom roztoku, ktorý sa získa oddelením biomasy, je 54,7 %.

Príklad 4 (porovnávací)

Výroba inokula, parametre postupu a médiá použité v rastovej fáze a v produkčnej fáze sú rovnaké ako v príklade

3. Rýchlosť dávkovania vo fáze prikrmovanie je približne 100 1/h. Tým sa dosiahne, že po spotrebovaní cukru, prítomného v predloženom rastovom médiu je merateľná koncentrácia asimilovateľného cukru v priebehu času prikrmovania vždy výrazne nižšia ako 5 g/1. Merateľná koncentrácia leucínu však zostáva na hodnote nižšej ako 0,05 g/1. Stupeň konverzie cukru na lyzín (vztiahnuté na hydrochlorid lyzínu je na konci fermentácie približne 30,9 %). Obsah lyzínovej bázy v roztoku získanom po oddelení biomasy je 43,5 %.

Príklad 5 (porovnávací)

Médiá na výrobu inokula pre rastovú fázu a pre produkčnú fázu majú rovnaké zloženie ako médiá použité v príklade 1, s tým rozdielom, že sa glukóza nahradí v rastovom médiu sacharózou v množstve 25 g/1 a v produkčnom médiu sacharózou v množstve 564 g/1. Podmienky inkubácie, vrátane prípravy inokula, sú tiež rovnaké. V malom fermentore s miešadlom a zavzdušňovaním sa predloží 0,82 kg (0,8 1) sterilného rastového média.

K tomuto roztoku sa pri teplote 33 až 35 °C pridá 0,1 1 očkovacej kultúry Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Po dosiahnutí optickej hustoty približne 30 (535 nm) sa v priebehu 24 hodín kontinuálne pridáva produkčné médium (celkom 533 g, tzn. 430 ml).

Počas fázy prikrmovania leží merateľný obsah cukru vo fermentačnom médiu vždy pod 5 g/1 a obsah leucínu je po spotrebovaní leucínu predloženého v rastovom prostredí vždy nižší ako 0,05 g/1.

Na konci fermentácie sa v médiu stanovilo 74 g lyzínu (vyjadrené ako hydrochlorid lyzínu), čo pri celkovej násade sacharózy 275 g zodpovedá stupňu konverzie 27 %. Obsah lyzínu v celkovej sušine je približne 30,5 %.

Príklad 6

Opakuje sa pokus s kmeňom DSM 5715, pričom všetky médiá a všetky parametre inkubácie sú zhodné s podmienkami uvedenými v príklade 5. Produkčné médium sa v tomto prípade kontinuálne dávkuje počas 39 hodín.

V súlade s charakteristikou tohto vynálezu je v priebehu času prikrmovania, po spotrebovaní zdroja uhlíka a zdroja leucínu, ktoré boli predložené v rastovom prostredí, okamžitá koncentrácia sacharózy vždy nižšia ako 1 g/1 a okamžitá koncentrácia leucínu vždy nižšia ako 0,05 g/1. Na konci fermentácie je v médiu obsiahnutých 89 g lyzínu (vyjadrené ako hydrochlorid lyzínu), čo zodpovedá stupňu konverzie 32 %. Obsah lyzínovej bázy v celkovej sušine je 36,3 %.

Claims (5)

1. Spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultivuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, produkujúci jednu alebo viac aminokyselín v živnom prostredí a na konci fermentácie sa z kultivačnej kvapaliny izoluje aminokyselina alebo aminokyseliny, vyznačujúci sa tým, že bakteriálna kultúra má po fáze silného rastu k dispozícii menej využiteľný zdroj uhlíka na to, aby mohla v dôsledku konštrukcie kmeňa a množstiev iných potrebných doplnkových prísad, ktoré sú prítomné v živnom prostredí, metabolizovať.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že po fáze silného rastu je koncentrácia zdroja uhlíka v rozmedzí od 0 do menej ako 3 g/1.

3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa používajú auxotrotné kmene baktérií a koncentrácia aspoň jednej organickej látky, ktorá sa pridáva v dôsledku prípadne viacnásobnej auxotrofie kmeňa, sa po fáze silného rastu udržuje na hodnote obmedzenej na rozmedzí 0 až 0,1 g/1.

4. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 3, vyzná č u j ú c i sa tým, že sa používa kmeň produkujúci L-lyzín a/alebo L-treonin.

5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , žc sa používa leucín-auxotrofný kmeň Corynebacterium glutamicum.