CS212558B1 - Způsob optimalizace a regulace procesu biosyntézy L-lysinu - Google Patents

Abstract

Vynález obecně chrání výrobní postup biosyntézy L-lysinu pomocí mikrobiálních kmenů majících schopnost hromadit do živného média L-lysin ve vysoké koncentraci a velkou produkční rychlostí za využití nového způsobu regulace rychlosti metabolismu produkčního mikroorganismu vedoucího k optimalizaci vztahu mezi aerační kapacitou fermentační aparatury a požadavky mikroorganismu na kyslík během růstu i v průběhu produkční fáze fermentačního procesu. Principem je regulace intenzity metabolismu během růstu produkčního mikroorganismu pomocí změn pH podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech, nebo podle koncentrace rozpuštěného kyslíku v půdě, event. podle průběhu křivky samotného pH.

Description

Vynález se týká výrobního postupu biosyntézy L-lyslnu pomocí mikrobiálních kmenů majících schopnost hromadit do živného média L-lysin ve vysoké koncentraci a velkou produkční rychlostí za využiti nového způsobu regulace rychlosti metabolismu produkčního mikroorganismu vedoucího k optimalizaci vztahu mezi aerační kapacitou fermentační aparatury a požadavky mikroorganismu na kyslík během růstu i v průběhu produkční fáze fermentačalho procesu. Cílem vynálezu je zajistit vysoké výtěžky lysinu ve velkoobjemovém výrobním zařízení při relativně nízkých nákladech na suroviny o spotřebovanou energii.

Je známo, že L-lysin je základní aminokyselinou, která v krystalické formě nebo jako technický preparát získaný usuSením feraentované půdy nachází stále širší uplatněni jako přísada do krmiv hospodářských zvířat a drůbeže. Uplatňuje se však též v humánní medicíně a perspektivně se počítá, že najde využití i při výživě člověka jako doplněk rostlinných bílkovin.

Biosyntetická příprava L-lysinu je již dlouho Široce studována. V patentové literatuře je popsána řada typů bakterií a zároveň řada fermentačních postupů, pomocí nichž je dosahováno na různých substrátech vysokých výtěžků lysinu. Z hlavních patentů vymezujících genetické vlastnosti kmenů, způsob jejich přípravy i fermentační postupy je možno uvést: US pat. č. 2 979 439, franc. pat. č. > 533 688, US pat. č. 3 707 442 a západoněmecký patent číslo 2 321 461. Poslední dva patenty představují nejnovějSÍ etapu vývoje ve výzkumu biosyntézy lysinu, kdy lysin je v obzvláště vysokých výtěžcích produkován bakteriálními kmeny resistentními vůči analogům lysinu nebo threoninu, resp. mutantami zároveň resistentními i auxotrofními. NejvySší výtěžky uváděné v patentové literatuře se pohybuji od 60 až do 90 g/1 lysinu v půdě.

Popisované výsledky jsou viak dosahovány, jak vyplývá z uváděných příkladů, jen v laboratoři nebo laboratorních fermentorech. Pokud jsou v literatuře (např. SSSR pat. číslo 1 906 624) uváděny v příkladech výsledky dosažené v provozních zařízeních, jsou publikované výtěžky značně nižií (25 až 40 g/1). Tato okolnost je způsobena tím, že přenos výsledků z laboratorního měřítka do výrobního zařízení (scele-up) představuje samostatný komplex problémů, který v dosud známých patentech není řeěen.

Hlavní problém, který se uplatňuje nejvýrazněji při biosyntéze lysinu vysokoprodukčníai kmeny, je zajištěni dostatečného přenosu kyslíku v provozním feraentačním zařízení během růstu organismu. Jak uvádějí někteří sovětStí autoři (např. Bekker Κ., E., Viestur U. S., Liepin G. K., Lacars A. K.: Lisin-polučenije i primeněnije v životnovodstve, Nauka, Moskva 1973), je totiž charakteristickým fyziologickým znakem mikrobiálních kmenů produkujících L-lysin vysoká potřeba kyslíku během růstu a naopak nízká potřeba kyslíku v produkční fázi biosyntetického procesu, kdy biomasa již nepřirůstá, ale pouze produkuje L-lysin. Z uvedeného vyplývá, že růstová fáze představuje při biosyntetlckám procesu úzký profil z hlediska zajištění přenosu potřebného množství kyslíku do půdy. Obzvláil je to patrné při fermentacích, při nichž mé být dosaženo vysoká produkce a velké produkční rychlosti, kdy je třeba, aby živná půda obsahovala organický dusík - ve formě volných aminokyselin - ve vysoké koncentraci, aby doSlo k dostatečnému a rychlému nárůstu biomasy. NaSe pokusy potvrdily, že když probíhá růst za limitace kyslíkem, naroste biomasa s nízkou produkční aktivitou, s kterou nelže dosáhnout vysoké produkce a rovněž stupeň konverze uhlíkového zdroje na lysin je velmi nízký.

Z publikovaných údajů citovaných sovětských autorů i z výsledků naSich pokusů vyplývá, že pro nelimitovaný nárůst cca 1 % sušiny biomasy (10 g/1 such. váhy) je zapotřebí zajistit přenos kyslíku do živné půdy rychlostí 2,0 až 3,2 g 0₂/l/hod, zatímco pro optimální tvorbu lysinu tímto množstvím biomasy v produkční fázi feraentačního procesu stačí rychlost přestupu kyslíku 1,1 až 1,8 g 0₂/l/hod. Protože pro dosažení produkční rychlosti 0,85 až 1,5 g lysinu/l/hod, které je u Špičkových fermentací dosahována v laboratorních fermentorech při použití vyšlechtěných vyeokoprodukčních kmenů, je zapotřebí, aby nárůst kultury produkčního mikroorganismu dosáhl výše odpovídající 20 až 35 g suSiny blomasy/1, vyplývá z toho, že pro nelimitovaný růst tohoto množství biomasy je nutno zajistit přenos kyslíku rychlostí 6,4 až 11,2 g 02/l/hod a pro produkční fázi rychlostí 3,5 až 6,3 g 02/l/hod.

Za těchto podmínek je velice obtížné v běžné provozní fermentační aparatuře dosáhnout v růstové fázi biosyntetického procesu dostatečného přenosu kyslíku pro nárůst biomasy v požadovaném množství. Vysoký přenos kyslíku do živné půdy je možno sice zajistit do jisté míry zvýSenou intenzitou míchání, konstrukcí a vnitřním vybavením fermentačních tanků nebo přetlakem v tanku apod., avšak limity těchto možností v provozním měřítku jsou úzké a dány jak ekonomií, tak fyziologií produkčních organismů. Poměrně vysoká citlivost produkčních organismů na smykové namáhání pohybem míchadla limituje možnost využít vysokých obvodových rychlostí míchadla ke zvýšení přenosu kyslíku. Rovněž z ekonomického hlediska je nevýhodné, zajišťovat kyslíkem nelimitovaný růst mikroorganismu pomocí vyšších parametrů fermentoru, a to hlavně proto, že zvýšená potřeba kyslíku je jen v růstové fázi, která představuje asi 20 až 25 % času z celkové kultivační doby. V produkční fázi je naopak výhodné, když kultivace probíhá při mírné limitaci kyslíkem, což se příznivě obráží ve specifické spotřebě sacharózy a spotřebě energie a chladicí vody.

Zjistili jsme nyní, že dostatečné zásobování kyslíkem vysokoprodukčních mutant bakteriálních kmenů ve velkoobjemových fermentorech s aerační kapacitou 3 až 7 g 02/l/hod je možno zajistit pro vysoký nárůst biomasy odpovídající 15 až 35 g suš./l, který je daný přítomností 1,1 až 2,5 g/1 alfa-aminodusíku v živné půdě. Podle našeho vynálezu se kyslíkem nelimitovaný růst tohoto množství biomasy zajišťuje cílenými změnami pH živné půdy, kterými se účelně reguluje intenzita metabolismu, zvláště dýchání v růstové fázi, a tím se příznivě ovlivňuje produkční aktivita buněk pro celou dobu fermentace. Po ukončení růstu se v dalším průběhu biosyntézy pH půdy již udržuje automatickým dávkováním roztoku alkálie na konstantní, fyziologicky optimální hodnotě, což vede v táto fázi fermentačního procesu i při mírné limitaci dýchání kyslíkem k maximální Intenzitě bioayntézy'L-lysinu. Popsaný princip vynálezu zajišťující kyslíkem nelimitovaný nárůst velkého množství biomasy umožňuje maximální využití aerační kapacity fermentoru a v důsledku toho dosažení vysoké produkce L-lysinu.

Postupem podle vynálezu se využívá maximálně aerační kapacita fermentoru k zajištění vysokých výtěžků L-lysinu tím, že podle aerační kapacity se dávkuje množství aminodusíku do živné půdy, a to tak, aby množství narostlé biomasy, které je obsahem aminokyselin v půdě určeno, bylo takové, aby jeho potřeba kyslíku v produkční fázi fermentačního procesu, tj. při snížených nárocích na kyslík, odpovídala možnostem přenosu kyslíku v daném fermentoru. Toho se dociluje tím, že k přípravě živné půdy se použije takového množství aminokyselin, aby na každý 1 g přenášeného kyslíku na 1 1 půdy/hod připadlo 0,2 až 0,6 g, s výhodou 0,3 až 0,4 g alfa-aminodusíku.

K regulaci metabolismu pomocí pH dle naěeho vynálezu se s výhodou využívá samovolného poklesu pH živné půdy a periodických úprav pH v průběhu růstu mikroorganismu. K samovolnému poklesu pH živné půdy dochází vlivem metabolické činnosti produkčního mikroorganismu, kdy pH klesá k hodnotám 5,0, případně až 4,0. Klesání pH má ze následek postupně zpomalování metabolismu, zvláště dýchání, což se projevuje zmenšenou spotřebou kyslíku. Hladina rozpuštěného O2 v půdě proto nejdříve v důsledku růstu mikroorganismu a intenzivního dýchání klesá, v dalším časovém úseku pak úměrně s poklesem pH, kdy se metabolismus zpomaluje, opět stoupá. Aby se zabránilo přílišnému zpomalení metabolismu, je nutno v určité fázi poklesu pH upravit jeho hodnotu na 6,5 až 8,0, s výhodou na 6,9 až 7,2, čímž se metabolismus znovu oživí a spotřeba kyslíku se zvýší, to znamená, že hladina rozpuštěného O2 opět začne klesat až do doby, kdy v důsledku opětného zpomalení metabolismu nízkým pH se živná půda začne kyslíkem dosycovat. Tyto cykly se periodicky opakují po celou dobu růstu mikroorganismu a projevují se charakteristickým průběhem křivek na zápisu měřených hodnot CO2 ve výstupu vzduchu, resp. kyslíku v půdě i samotného pH půdy. Volbou délky cyklů, tj. časových intervalů mezi jednotlivými úpravami pH, je možno udržovat hladinu rozp« O2 tak, aby se pohybovala v rozmezí 10 až 100 56, s výhodou 20 až 60 % nasycení. Pro dosažení ekonomicky optimálního efektu je však nutné, aby délka cyklu byla volena nejen z hlediska zajištění vyšší hladiny rozp. 0₂ v půdě, ale též s ohledem na to, aby metabolismus nebyl zpomalen příliš, neboť v tom případě dochází též ke zpomalení, event. zastavení biosyntézy L-lysinu.

Podle našeho vynálezu se v růstové fázi metabolismus optimálně reguluje pomocí pH tím, že první úprava pH a délky časových úseků mezi dalšími úpravami pH se určují podle průběhu křivky C0₂ ve výstupu vzduchu. Na této křivce je možno velmi dobře sledovat zvyšující se obsah C0₂ v důsledku růstu biomasy, i pokles vývoje C0₂ vlivem zpomalení dýchání při nízkém pH. Právš poklesu koncentrace C0₂ ve výstupu vzduchu se dle našeho postupu využívá ke kvantitativní indikaci útlumu metabolismu a k určení vhodného okamžiku pro úpravu pH. Při konstantním vzdušnění se úpravy pH roztokem alkálie provádějí vždy, když koncentrace C0₂ ve výstupu vzduchu poklesne na 80 až 30 %, s výhodou na 70 až 50 % předchozího maxima.

Regulaci metabolismu pomocí pH je možno též provádět podle průběhu křivky rozp. 0₂.

Na této křivce je útlum metabolismu indikován zastavením poklesu a naopak stoupáním koncentrace rozp. O₂ v půdě. První úprava pH se provede, když pokles koncentrace rozp. O₂, ke kterému dochází v důsledku růstu mikroorganismu, se zastaví nebo koncentrace rozp. 0₂ začne mírně stoupat, další úpravy se provádějí vždy tehdy, když útlum metabolismu, při kterém koncentrace rozp. O₂ stoupá, trvá minimálně jednu polovinu, maximálně trojnásobek doby, po kterou metabolismus na začátku daného cyklu nebyl výrazněji brzděn a koncentrace rozp.

O₂ v půdě klesala. S výhodou se volí doba úpravy tak, aby časové úseky poklesu a vzestupu koncentrace O₂ v půdě byly stejné.

Postupem dle vynálezu lze provádět regulaci metabolismu pomocí pH též podle průběhu vlastní křivky pH. Samovolný pokles pH, způsobený metabolickou činností mikroorganismu, není rovnoměrný, ale úměrně s klesající hodnotou pH a útlumem metabolismu se zpomaluje. Toho se využívá při našem postupu k řízení periodických úprav pH v růstové fázi biosyntetického procesu tak, že pH se upravuje vždy, když gradient poklesu křivky pH se zmenší na 20 až 5 %, o výhodou na 10 % své předchozí maximální hodnoty.

Popsaná regulace metabolismu a tím i rozpuštěného kyslíku v půdě se provádí podle jedné ze tří uvedených křivek, podle toho, jaké veličina je při fermentaci měřena, po celou dobu růstové fáze, která v závislosti na daném fermentačním zařízení trvá 18 až 30 hodin, obyčejně 20 až 24 hodin. V následující produkční fázi není nutné již vzhledem k menší spotřebě kyslíku intenzitu metabolismu brzdit, a proto se pH udržuje kontinuálními nebo semikontinuálními úpravami pH roztokem alkálie na úrovni v rozmezí fyziologicky optimálních hodnot 6,5 až 8,0, s výhodou 6,9 až 7,2. Při netlumené intenzitě metabolismu klesne hladina rozp.

0₂ na hodnotu 1 až 10 % nasycení, která je dostačující pro docílení vysoké produkční rychlosti.

Postupem podle vynálezu se dosáhne v konvenčních provozních fermentorech velkých produkčních rychlostí a vysokých výtěžků, které odpovídají výsledkům dosahovaným v laboratorních fermentorech s velmi vysokým přenosem kyslíku.

Následující příklady blíže objasňují způsob biosyntézy L-lysinu podle vynálezu, aniž jej omezují pouze na uvedená provedení. V příkladech pod bodem A. uvádíme táž kontrolní fermentace, při kterých nebyl využíván postup podle vynálezu.

Příklady provedení

Příklad 1

Kulturou kmene Brevibacterium flavum CB byla inokulována živná půda ve dvou očkovacích tancích.

Složení inokulační půdy:

sacharóza	75 kg
melasa	60 kg
corn-steep (60 %)	90 kg
těch. biotin (1 %)	15 g
thyamin	0,6 g
sójový olej	6 kg
voda	ad 3 000

pH 7,0

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 20 hodin za stálého míchání a vzduSnění.

Do 2 fermentorů o obsahu 50 m-^ s aerační kapacitou 5,2 g 0₂/l/hod byla připravena živná půda tohoto složeni:

sacharóza	6 300 kg
melasa (50 % šach.)	1 080 kg
hydrolyzét areí. m. (5,2 g NH2-N/1)	9 000 1
corn-steep (60 %)	300 kg
kyselina fosforečné (83 %)	30 kg
síran hořečnatý kryst.	9 kg
těch. biotik (1 %)	0,15 kg
thi amin	0,006 kg

sójový olej 30 kg voda ad 30 000 1 pH 6,9

Po sterilizaci byla živné půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduSnění 20 vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpěňování sójovým olejem.

V tanku A, kde nebyl feraentační proces regulován podle naieho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí hodnot 7,1 až 7,2 dávkováním 25% roztoku čpavku. V průběhu kultivace byly přidány 2 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy Fermentace trvala 65 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 3 mg/ml.

V tanku B, kde byl aplikován postup dle našeho vynálezu, byla od 0. do 24. hodiny kultivace prováděna diskontinuální úprava pH 25% roztokem čpavku podle hodnot CO₂ v odcházejících plynech a po 24. hodině kultivace bylo pH až do konce fermentace udržováno automaticky dávkováním čpavku v rozmezí hodnot 7,1 až 7,2. V průběhu kultivace byly přidány 4 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy. V 63. hodině kultivace, kdy hladina sacharózy v půdě klesla na nulovou hodnotu, byl fermentační proces ukončen.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 1 Kontrolní fermentace

hodina kultivace	co2 %	pH	sušina biomasy g/1
0	0	7,2	2,0
8	3,0	7,2	4,6
12	7,2	7,2	13,2
16	11,6	7,2	22,0
20	12,4	7,2	29,8
24	12,3	7,2	31,0
48	8,7	7,2	26,0
65	5,8	7,2	23,2

Tabulka 2 Fermentace podle vynálezu

hodina kultivace	co2 %	pH	úprava pH	sušina biomasy g/1
0	0	6,8		2,0
6	1,0	7,1		2,3
8	3,1	6,7		4,2
9	4,0	6,4		-
10	4,5 (max.)	6,1		-
11	3,5	6,0	7,2	8,5
12	5,8	6,5		-
13	7,5	6,0
14,25	8,0 (max.)	5,7		-
15	6,3	5,5	7,2	i 6P6
16	8,6	6,1		-
16,50	9,5 (max.)	5,75		-
17,75	5,8	5,3	7,2	22,0
18,50	9,0	6,75		-
19,50	10,5 (max.)	5,55		-
20,25	5,8	5,1	7,2	26,2
21	10,0	6,0
21,50	11,4 (max.)	5,25		-
22,50	5,8	5,0	7,2	30,0.
23	10,5	5,9
23,50	12,0 (max.)	5,5		-
24	8,2	5,6	7,2	31 ,0
25	12,1	7,2	aut. úprava	-
48	10,6	7,2		29,8
63	7,8	7,3		27,2

212558 6 Tabulka 3 Dosažené výsledky

	Fermentace A	B
doba kultivace (hod)	65	63
objem p&dy (m^)	36	36
L-lysin (g/1)	48,7	66,2
výtěžek L-lysinu (kg)	1 753,2	2 515,6
spotřebovaná sacharóza (kg)	8 345,0	9 745,0
konverze (%)	21 ,01	25,81
spotřeba šach. na 1 kg lysinu	4,76	3,87

Příklad 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum ABC/100 byla inokulovéna živné půda ve 2 očkovacích tancích.

Složení inokulační půdy:

sacharóza corn-steep (60 %) hydrolyzét araě. mouky (5,2 g NH₂-N/1) těch. biotin (1 56) sójový olej voda pH 6,9 kg 90 kg

240 1 g 6 kg ad 3 000 1

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 24 hodin za stélého míchání a vzduSnění.

Do 2 fermentorů o obsahu 50 uč s aerační kapacitou 3,9 g 0₂/l/hod byla připravena živná půda tohoto složení:

sacharóza	5 000 kg
melasa	540 kg
hydrolyzét araS. mouky
(5,2 g NH2-N/1)	6 750 1
corn-steep (60 %)	300 kg
kyselina fosforečné (83 %)	30 kg
síran hořečnatý kryst.	9 kg
tech. biotin (1 %)	0,15
sójový olej	30 kg

voda ad 30 000 1 pH 6,8

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduSníní 20 vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpěňování sójovým olejem.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle naěeho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0 dávkováním 25% čpavku. V průběhu kultivace byly přidány 3 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy. Fermentace trvale

2,2558 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 2,5 mg/ml. V tanku B byl podle naSeho vynálezu aplikován způsob regulace metabolismu dle průběhu křivky rozpuštěného kysli ku· Od 0· do 24. hodiny kultivace byla prováděna úprava pH 25% roztokem čpavku v několikahodinových intervalech. První úprava byla provedena v 9. hodině kultivace, kdy se zastavil pokles hladiny rozp. Og. Dálky časových intervalů mezi jednotlivými úpravami pH v dalším průběhu růstová fáze byly voleny tak, aby tvořily vždy dvojnásobek doby, po kterou koncentrace rozp. Og v půdě v daném intervalu měla klesající trend. Od 24. hodiny kultivace bylo pH upravováno automaticky v rozmezí hodnot 6,9 až 7,0. Y průběhu kultivace byly přidány 4 příkray ě , 000 litrů 70% roztoku sacharózy. V 65. hodině kultivace, kdy hladina sacharózy v půdě klesla na nulu, byl fermentační proces ukončen.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a feraentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 4 a 5. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.

Tabulka 4 Kontrolní fermentace

hodina kultivace	rozp. Og % nasyc.	PH	sušina biomasy .....· e/i
0	100	6,8	2,1
8	58	6,9	....... 4,0
,2	3	6,9	7,3
,6	2	6,9	20,1
20	2	6,9	25,8
24	2	6,9	26,8
48	,4	6,9	23,4
65	28	7,0	20,7

Tabu 1 k a 5 * Fermentace podle vynálezu
hodina kultivace	rozp. Og % nasyc.	PH	úprava pH	sušina biomasy e/i
0	100	6,8		2,1
4	98	7,0		-
6	87	6,8		-
8	62	6,2		4,1
,0	51	5,6		-
11,5	41	5,3		-
12,0	40	5,3	7,0	6,9
,3	16	6,2
13,75	14 (min.)	5,75		-
’4,5	21	5,4		-
15,5	58	5,2	7,0	17,2
16	30	6,0
16,5	21 (min.)	5,75		-
16,75	21 (min.)	5,6		-
17,75	54	5,3	7,0	20,4

pokračováni tabulky 5

hodina kultivace	rosp. Oo % nasye.	PH	úprava pH	suěina bioaaey «/X
1B	28	6.5
18,75	21 (min)	5,6		-
19,5	32	5,4		-
19,75	*3	5,4	7,0	23,4
20	28	6,5
20,75	15 (min.)	5,5
21	15 (min.)	5,4
21,5	20	5,25		-
22	34	5,2	7,0	26,0
22,5	15	6,0		W
23	10 (min.)	5,5		-
23,5	18	5,3		-
24	31	5,25	7,0	27,0
25	3	7,0	aut, úprava
65	10	7,2		25,2

Tabulka 6 Dosažená výsledky

	Perme» A	i t a o e B
doba kultivace (hod)	65	65
objem půdy (m3)	37	38
L-lyein (g/1)	44,9	55,3
výtěžek lysinu (kg)	1 661,3	2 101,4
spotřebovaná eaoharóza (kg)	7 445,0	8 145,0
konverze (%)	22,31	25,79
spotřeba sacharózy na 1 kg lysinu	4,48	3,88

Příklad

Kulturou kmene Brevibaoterlum flavum CB/2 byla lnokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.

Složení inokulační p&dys eaoharóza corn-eteep (60 %) melasa (50 % šach.) těch. biotln (1 %) thiamln sójový olej voda pH 6,9 ad kg 75 kg 50 kg 12.5 g

0,5 g 5 kg

500 l

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 22 hod «a stálého míchání a vzdušnění, fermentorů o obsahu 50 m^ s aerační kapacitou 6,1 tohoto složení:

Do ná půda sacharóza hydrolyzát araS. mouky (5,2 g NHg-H/l) corn-ateep (60 %) kyselina fosforečná (83 %) síran hořečnatý kryst. těch. blotin (1 %} thiamin sójový olej voda pH 6,7 g Og/l/hod byla připravena živ·

000	ke
100	1
300	ke
30	ke
9	ke

0,15 kg 0,006 kg kg ad 23 000 1

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduěnšnl 20 a? vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpčnovánl sójovým olejem.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle našeho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0 dávkováním 25% čpavku,

V průběhu kultivace po spotřebování základního uhlíkového zdroje obsaženého v půdě bylo zahájeno semikontlnuálnl dávkování zředěného roztoku melasy o sacharizaci 45 %· Celkem bylo přidáno 7 příkrmů & 1 500 1. Fermentace trvala 70 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 7,3 mg/ml.

V tanku B byl podle naěeho vynálezu aplikován způsob regulace metabolismu podle průběhu křivky pH. Od 0. do 24. hodiny kultivace byla prováděna úprava pH 25% roztokem čpavku v několikahodinových intervalech. Hodiny kultivace, v kterých se prováděly úpravy pH, byly určovány podle gradientu poklesu křivky pH. Podrobný popis průběhu křivek pH a úprava pH je v tabulce 8. Od 24. hodiny kultivace bylo pH upravováno automaticky v rozmezí hodnot 6,9 až 7,0. V průběhu kultivace bylo přidáno 9 příkrmů λ 1 500 litrů zředěné melasy o sacharizáci 45 %. V 70. hodině kultivace, kdy hladina cukru v půdě klesla na nulu, byl fermentační proces ukončen.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v .tabulkách 7 a 8. Dosažená výsledky jsou shrnuty v tabulce 9.

Tabulka 7 Kontrolní fermentace

hodina kultivace	PH	sušina biomasy e/i
0	6,7	2,3
8	6,9	5,6
12	6,9	14,8
16	6,9	24,3
20	6,9	34,0
24	6,9	34,4
48	6,9	29,4
70	6,9	24,7

Tabulka 8 Fermentace podle vynálezu

hodina kultivace	pH	delta pH	úprava pH	sušina biomasy g/1
0	6,7	-		2,4
4	7,0	-		-
6	6,85	0,037		-
8	6,25	0,15		4,6
9	5,75	0,25 (max.)		-
10	5,3	0,225		-
11	5,1	0,10		-
11,5	5,05	0,05 (min.)	7,0	11,0
12	6,35	0,55
12,5	6,0	0,35		-
13	5,7	0,30		-
13,5	5,45	0,25		-
14	5,25	0,20		-
14,5	5,1	0,15		-
15	5,0	0,10	7,0	18,4
15,5	6,25	0,75		-
16	5,75	0,50		-
16,5	5,45	0,30		-
17	5,2	0,25		-
17,5	5,0	0,20		-
18	4,9	0,10	7,0	23,8
18,5	6,2	0,90
19	6,7	0,50		-
19.5	5,4	0,30		-
20	5,25	0,15	7,0	28,6
20,5	6,25	0,65		-
21	5,8	0,45		-
21,5	5,6	0,20		-
22	5,5	0,10		-
22,5	5,45	0,05	7,0	33,0
23	6,3	0,70		-
23,5	5,95	0,35		-
24	5,7	0,25		-
24,5	5,55	0,15		-
25	5,50	0,05	7,0	35,0
48	6,95	-	aut. úprava	32,3
70	7,2	-		. 28,8

Tabulka 9 Dosažené výsledky

	Fermentace
A	B
doba kultivace (hod)	70	70
objem půdy (m^)	37	40
L-lysin (g/1)	50,6	65,0
výtěžek L-lysinu (kg)	1 872,2	2 600,0
spotřebovaná sacharóza (kg)	8 825,0	10 175,0
konverze (%)	21 ,21	25,55
spotřeba saoharózy na 1 kg lysinu	4,71	3,91

Claims (5)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob optimalizace a regulace procesu biosyntézy L-lysinu ve velkoobjemovém fermentačním zařízeni s aerační kapacitou 3 až 7 g 0₂/l/hod při kultivaci vyšlechtěných mikrobiálních kmenů schopných produkovat L-lysin velkou rychlostí a ve vysoké koncentraci na půdách obsahujících zdroj uhlíku, amonné soli nebo močovinu, fosfor, hořčík, stimulátory biosyntézy a aminokyseliny potřebné pro růst, vyznačený tím, že při přípravě živné půdy se použije s ohledem na aerační kapacitu daného fermentoru vysokého množství aminokyselin, a to takového, aby na každý 1 g přenášeného kyslíku na 1 1 půdy za hodinu připadlo 0,2 až 0,6 g, s výhodou 0,3 až 0,4 g alfa-aminodusíku, během růstu mikroorganismu se reguluje intenzita metabolismu podle koncentrace CO₂ ve výstupu vzduchu nebo podle průběhu křivky rozpuštěného kyslíku v půdě nebo podle průběhu křivky pH, pomocí cyklicky se opakujících změn pH živné půdy v rozmezí hodnot 4,0 až 8,0, a tím se udržuje hladina rozp. 0₂ v rozmezí 10 až 100 %, s výhodou 20 až 60 % nasycení, a po ukončení růstu mikroorganismu v průběhu produkční fáze je intenzita biosyntézy L-lysinu udržována na maximální úrovni kontinuálními nebo semikontinuálními úpravami pH v rozmezí fyziologicky optimálních hodnot pH 6,5 až 8,0, s výhodou 6,9 až 7,2, a tím je dosaženo pro dané množství biomasy limitující hladiny kyslíku v rozmezí 1 až 10 % nasycení.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že cyklicky se opakujících změn pH se dosáhne tím, že se využívá samovolného poklesu pH půdy vlivem metabolické činnosti produkčního mikroorganismu na hodnoty pH 6,0 až 4,0, s výhodou na 5,7 až 5,2, a periodicky prováděných úprav pH alkálií na hodnoty 6,5 až 8,0, s výhodou na 6,9 až 7,2.
3. 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačený tím, že první úprava pH a délky časových úseků mezi dalšími úpravami pH v růstové fázi se určují podle průběhu křivky CO₂ ve výstupu vzduchu, a to tak, že pH se upraví alkálií vždy, když při konstantním vzdušněni koncentrace C0₂ ve vzduchu odcházejících z tanku poklesne na 80 až 30 %, s výhodou na 70 až 50 % předchozího maxima.
4. 4. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačený tím, že první úprava pH a délky časových úseků mezi dalšími úpravami pH v růstové fázi se určují podle průběhu křivky rozp. O₂ v půdě, a to tak, že první úprava pH se provede, když pokles koncentrace rozp. 0₂ se zastaví nebo koncentrace rozp. 0₂ začne mírně stoupat, a každá další úprava vždy tehdy, když délka časového úseku, po který křivka rozp. O₂ po projití minimem stoupá, se rovná 0,5 až 3,0násobku časového úseku, po který křivka rozp. 0₂ v tomtéž cyklu klesala, s výhodou se volí doba úpravy tak, aby časové úseky poklesu a vzestupu koncentrace rozp. O₂ byly stejné.
5. 5. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačený tím, že první úprava pH a délky časových úseků mezi dalšími úpravami pH v růstové fázi se určují podle průběhu křivky pH, a to tak, že hodnota pH se upraví alkálií vždy, když gradient poklesu křivky pH se zmenší na 20 až 5 %, s výhodou na 10 % své předchozí maximální hodnoty.

   Severografia, n. p.. závod 7, Most