CS212558B1

CS212558B1 - Method of optimization and regulation of L-lysine biosynthesis process

Info

Publication number: CS212558B1
Application number: CS522179A
Authority: CS
Inventors: Michal Bucko; Stanislav Ulbert; Alexander Hano; Karel Culik; Jindrich Chromik; Emil Miklas; Heinrich Hoffbauer; Leonid Ivanov; Julius Papay; Ladislav Pipich
Original assignee: Michal Bucko; Stanislav Ulbert; Alexander Hano; Karel Culik; Jindrich Chromik; Emil Miklas; Heinrich Hoffbauer; Leonid Ivanov; Julius Papay; Ladislav Pipich
Priority date: 1979-07-26
Filing date: 1979-07-26
Publication date: 1982-03-26

Abstract

Vynález obecně chrání výrobní postup biosyntézy L-lysinu pomocí mikrobiálních kmenů majících schopnost hromadit do živného média L-lysin ve vysoké koncentraci a velkou produkční rychlostí za využití nového způsobu regulace rychlosti metabolismu produkčního mikroorganismu vedoucího k optimalizaci vztahu mezi aerační kapacitou fermentační aparatury a požadavky mikroorganismu na kyslík během růstu i v průběhu produkční fáze fermentačního procesu. Principem je regulace intenzity metabolismu během růstu produkčního mikroorganismu pomocí změn pH podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech, nebo podle koncentrace rozpuštěného kyslíku v půdě, event. podle průběhu křivky samotného pH.The invention generally protects a production process for the biosynthesis of L-lysine using microbial strains capable of accumulating L-lysine in a nutrient medium at a high concentration and high production rate using a new method of regulating the metabolic rate of the production microorganism leading to the optimization of the relationship between the aeration capacity of the fermentation apparatus and the microorganism's oxygen requirements during growth and during the production phase of the fermentation process. The principle is to regulate the metabolic intensity during the growth of the production microorganism by changing the pH according to the concentration of CO2 in the exhaust gases, or according to the concentration of dissolved oxygen in the soil, or possibly according to the course of the pH curve itself.

Description

Vynález se týká výrobního postupu biosyntézy L-lyslnu pomocí mikrobiálních kmenů majících schopnost hromadit do živného média L-lysin ve vysoké koncentraci a velkou produkční rychlostí za využiti nového způsobu regulace rychlosti metabolismu produkčního mikroorganismu vedoucího k optimalizaci vztahu mezi aerační kapacitou fermentační aparatury a požadavky mikroorganismu na kyslík během růstu i v průběhu produkční fáze fermentačalho procesu. Cílem vynálezu je zajistit vysoké výtěžky lysinu ve velkoobjemovém výrobním zařízení při relativně nízkých nákladech na suroviny o spotřebovanou energii.The invention relates to a production process for the biosynthesis of L-lysine using microbial strains capable of accumulating L-lysine in a nutrient medium in high concentration and at a high production rate, using a new method of regulating the metabolic rate of the production microorganism, leading to the optimization of the relationship between the aeration capacity of the fermentation apparatus and the microorganism's oxygen requirements during growth and during the production phase of the fermentation process. The aim of the invention is to ensure high yields of lysine in a large-scale production facility at relatively low costs for raw materials and energy consumed.

Je známo, že L-lysin je základní aminokyselinou, která v krystalické formě nebo jako technický preparát získaný usuSením feraentované půdy nachází stále širší uplatněni jako přísada do krmiv hospodářských zvířat a drůbeže. Uplatňuje se však též v humánní medicíně a perspektivně se počítá, že najde využití i při výživě člověka jako doplněk rostlinných bílkovin.It is known that L-lysine is an essential amino acid, which in crystalline form or as a technical preparation obtained by drying fermented soil is increasingly used as an additive to livestock and poultry feed. However, it is also used in human medicine and is expected to find use in human nutrition as a supplement to vegetable proteins.

Biosyntetická příprava L-lysinu je již dlouho Široce studována. V patentové literatuře je popsána řada typů bakterií a zároveň řada fermentačních postupů, pomocí nichž je dosahováno na různých substrátech vysokých výtěžků lysinu. Z hlavních patentů vymezujících genetické vlastnosti kmenů, způsob jejich přípravy i fermentační postupy je možno uvést: US pat. č. 2 979 439, franc. pat. č. > 533 688, US pat. č. 3 707 442 a západoněmecký patent číslo 2 321 461. Poslední dva patenty představují nejnovějSÍ etapu vývoje ve výzkumu biosyntézy lysinu, kdy lysin je v obzvláště vysokých výtěžcích produkován bakteriálními kmeny resistentními vůči analogům lysinu nebo threoninu, resp. mutantami zároveň resistentními i auxotrofními. NejvySší výtěžky uváděné v patentové literatuře se pohybuji od 60 až do 90 g/1 lysinu v půdě.The biosynthetic preparation of L-lysine has long been widely studied. The patent literature describes a number of types of bacteria and a number of fermentation processes that achieve high yields of lysine on various substrates. The main patents defining the genetic properties of the strains, the method of their preparation and the fermentation processes include: US Pat. No. 2,979,439, French Pat. No. > 533,688, US Pat. No. 3,707,442 and West German Patent No. 2,321,461. The last two patents represent the latest stage of development in research into lysine biosynthesis, where lysine is produced in particularly high yields by bacterial strains resistant to lysine or threonine analogues, or by mutants that are both resistant and auxotrophic. The highest yields reported in the patent literature range from 60 to 90 g/l lysine in soil.

Popisované výsledky jsou viak dosahovány, jak vyplývá z uváděných příkladů, jen v laboratoři nebo laboratorních fermentorech. Pokud jsou v literatuře (např. SSSR pat. číslo 1 906 624) uváděny v příkladech výsledky dosažené v provozních zařízeních, jsou publikované výtěžky značně nižií (25 až 40 g/1). Tato okolnost je způsobena tím, že přenos výsledků z laboratorního měřítka do výrobního zařízení (scele-up) představuje samostatný komplex problémů, který v dosud známých patentech není řeěen.However, the described results are achieved, as follows from the examples given, only in the laboratory or laboratory fermenters. If the results achieved in production facilities are given in the literature (e.g. USSR Pat. No. 1 906 624) in the examples, the published yields are considerably lower (25 to 40 g/1). This circumstance is caused by the fact that the transfer of results from the laboratory scale to the production facility (scale-up) represents a separate complex of problems, which is not solved in the patents known so far.

Hlavní problém, který se uplatňuje nejvýrazněji při biosyntéze lysinu vysokoprodukčníai kmeny, je zajištěni dostatečného přenosu kyslíku v provozním feraentačním zařízení během růstu organismu. Jak uvádějí někteří sovětStí autoři (např. Bekker Κ., E., Viestur U. S., Liepin G. K., Lacars A. K.: Lisin-polučenije i primeněnije v životnovodstve, Nauka, Moskva 1973), je totiž charakteristickým fyziologickým znakem mikrobiálních kmenů produkujících L-lysin vysoká potřeba kyslíku během růstu a naopak nízká potřeba kyslíku v produkční fázi biosyntetického procesu, kdy biomasa již nepřirůstá, ale pouze produkuje L-lysin. Z uvedeného vyplývá, že růstová fáze představuje při biosyntetlckám procesu úzký profil z hlediska zajištění přenosu potřebného množství kyslíku do půdy. Obzvláil je to patrné při fermentacích, při nichž mé být dosaženo vysoká produkce a velké produkční rychlosti, kdy je třeba, aby živná půda obsahovala organický dusík - ve formě volných aminokyselin - ve vysoké koncentraci, aby doSlo k dostatečnému a rychlému nárůstu biomasy. NaSe pokusy potvrdily, že když probíhá růst za limitace kyslíkem, naroste biomasa s nízkou produkční aktivitou, s kterou nelže dosáhnout vysoké produkce a rovněž stupeň konverze uhlíkového zdroje na lysin je velmi nízký.The main problem, which is most pronounced in the biosynthesis of lysine by high-producing strains, is ensuring sufficient oxygen transfer in the operating fermentation equipment during the growth of the organism. As stated by some Soviet authors (e.g. Bekker Κ., E., Viestur U. S., Liepin G. K., Lacars A. K.: Lisin-polučenie i primeněnije v životnovodstve, Nauka, Moscow 1973), a characteristic physiological feature of microbial strains producing L-lysine is a high oxygen requirement during growth and, conversely, a low oxygen requirement in the production phase of the biosynthetic process, when the biomass no longer grows, but only produces L-lysine. From the above, it follows that the growth phase represents a narrow profile in the biosynthetic process in terms of ensuring the transfer of the necessary amount of oxygen to the soil. This is particularly evident in fermentations where high production and high production rates are required, where the nutrient medium must contain high concentrations of organic nitrogen - in the form of free amino acids - to achieve sufficient and rapid biomass growth. Our experiments have confirmed that when growth occurs under oxygen limitation, biomass grows with low production activity, which does not allow high production, and the degree of conversion of the carbon source to lysine is also very low.

Z publikovaných údajů citovaných sovětských autorů i z výsledků naSich pokusů vyplývá, že pro nelimitovaný nárůst cca 1 % sušiny biomasy (10 g/1 such. váhy) je zapotřebí zajistit přenos kyslíku do živné půdy rychlostí 2,0 až 3,2 g 0₂/l/hod, zatímco pro optimální tvorbu lysinu tímto množstvím biomasy v produkční fázi feraentačního procesu stačí rychlost přestupu kyslíku 1,1 až 1,8 g 0₂/l/hod. Protože pro dosažení produkční rychlosti 0,85 až 1,5 g lysinu/l/hod, které je u Špičkových fermentací dosahována v laboratorních fermentorech při použití vyšlechtěných vyeokoprodukčních kmenů, je zapotřebí, aby nárůst kultury produkčního mikroorganismu dosáhl výše odpovídající 20 až 35 g suSiny blomasy/1, vyplývá z toho, že pro nelimitovaný růst tohoto množství biomasy je nutno zajistit přenos kyslíku rychlostí 6,4 až 11,2 g 02/l/hod a pro produkční fázi rychlostí 3,5 až 6,3 g 02/l/hod.From the published data of the cited Soviet authors and from the results of our experiments it follows that for an unlimited increase of approximately 1% of dry biomass (10 g/1 dry weight) it is necessary to ensure the transfer of oxygen to the nutrient medium at a rate of 2.0 to 3.2 g 0 ₂ /l/hour, while for optimal formation of lysine by this amount of biomass in the production phase of the fermentation process an oxygen transfer rate of 1.1 to 1.8 g 0 ₂ /l/hour is sufficient. Since in order to achieve a production rate of 0.85 to 1.5 g lysine/l/hour, which is achieved in laboratory fermenters using bred high-yield production strains, it is necessary for the growth of the production microorganism culture to reach a level corresponding to 20 to 35 g dry biomass/l, it follows that for unlimited growth of this amount of biomass, it is necessary to ensure oxygen transfer at a rate of 6.4 to 11.2 g 02/l/hour and for the production phase at a rate of 3.5 to 6.3 g 02/l/hour.

Za těchto podmínek je velice obtížné v běžné provozní fermentační aparatuře dosáhnout v růstové fázi biosyntetického procesu dostatečného přenosu kyslíku pro nárůst biomasy v požadovaném množství. Vysoký přenos kyslíku do živné půdy je možno sice zajistit do jisté míry zvýSenou intenzitou míchání, konstrukcí a vnitřním vybavením fermentačních tanků nebo přetlakem v tanku apod., avšak limity těchto možností v provozním měřítku jsou úzké a dány jak ekonomií, tak fyziologií produkčních organismů. Poměrně vysoká citlivost produkčních organismů na smykové namáhání pohybem míchadla limituje možnost využít vysokých obvodových rychlostí míchadla ke zvýšení přenosu kyslíku. Rovněž z ekonomického hlediska je nevýhodné, zajišťovat kyslíkem nelimitovaný růst mikroorganismu pomocí vyšších parametrů fermentoru, a to hlavně proto, že zvýšená potřeba kyslíku je jen v růstové fázi, která představuje asi 20 až 25 % času z celkové kultivační doby. V produkční fázi je naopak výhodné, když kultivace probíhá při mírné limitaci kyslíkem, což se příznivě obráží ve specifické spotřebě sacharózy a spotřebě energie a chladicí vody.Under these conditions, it is very difficult to achieve sufficient oxygen transfer in the growth phase of the biosynthetic process in a conventional operational fermentation apparatus for the growth of biomass in the required amount. High oxygen transfer to the nutrient medium can be ensured to a certain extent by increased mixing intensity, design and internal equipment of fermentation tanks or by overpressure in the tank, etc., but the limits of these possibilities on an operational scale are narrow and are given by both economics and physiology of production organisms. The relatively high sensitivity of production organisms to shear stress caused by the movement of the stirrer limits the possibility of using high peripheral speeds of the stirrer to increase oxygen transfer. It is also disadvantageous from an economic point of view to ensure oxygen-unlimited growth of the microorganism by using higher fermenter parameters, mainly because the increased need for oxygen is only in the growth phase, which represents about 20 to 25% of the total cultivation time. In the production phase, on the contrary, it is advantageous if cultivation takes place under mild oxygen limitation, which is positively reflected in the specific sucrose consumption and the consumption of energy and cooling water.

Zjistili jsme nyní, že dostatečné zásobování kyslíkem vysokoprodukčních mutant bakteriálních kmenů ve velkoobjemových fermentorech s aerační kapacitou 3 až 7 g 02/l/hod je možno zajistit pro vysoký nárůst biomasy odpovídající 15 až 35 g suš./l, který je daný přítomností 1,1 až 2,5 g/1 alfa-aminodusíku v živné půdě. Podle našeho vynálezu se kyslíkem nelimitovaný růst tohoto množství biomasy zajišťuje cílenými změnami pH živné půdy, kterými se účelně reguluje intenzita metabolismu, zvláště dýchání v růstové fázi, a tím se příznivě ovlivňuje produkční aktivita buněk pro celou dobu fermentace. Po ukončení růstu se v dalším průběhu biosyntézy pH půdy již udržuje automatickým dávkováním roztoku alkálie na konstantní, fyziologicky optimální hodnotě, což vede v táto fázi fermentačního procesu i při mírné limitaci dýchání kyslíkem k maximální Intenzitě bioayntézy'L-lysinu. Popsaný princip vynálezu zajišťující kyslíkem nelimitovaný nárůst velkého množství biomasy umožňuje maximální využití aerační kapacity fermentoru a v důsledku toho dosažení vysoké produkce L-lysinu.We have now found that sufficient oxygen supply of high-production mutant bacterial strains in large-volume fermenters with an aeration capacity of 3 to 7 g 02/l/hour can be ensured for a high biomass increase corresponding to 15 to 35 g dry matter/l, which is given by the presence of 1.1 to 2.5 g/l alpha-amino nitrogen in the nutrient medium. According to our invention, oxygen-unlimited growth of this amount of biomass is ensured by targeted changes in the pH of the nutrient medium, which effectively regulate the intensity of metabolism, especially respiration in the growth phase, and thus favorably affect the production activity of the cells for the entire fermentation period. After the end of growth, the pH of the soil is maintained in the further course of biosynthesis by automatic dosing of an alkali solution at a constant, physiologically optimal value, which leads to the maximum intensity of L-lysine biosynthesis in this phase of the fermentation process even with a slight limitation of oxygen respiration. The described principle of the invention, ensuring oxygen-unlimited growth of a large amount of biomass, allows for maximum use of the aeration capacity of the fermenter and, as a result, achieving high production of L-lysine.

Postupem podle vynálezu se využívá maximálně aerační kapacita fermentoru k zajištění vysokých výtěžků L-lysinu tím, že podle aerační kapacity se dávkuje množství aminodusíku do živné půdy, a to tak, aby množství narostlé biomasy, které je obsahem aminokyselin v půdě určeno, bylo takové, aby jeho potřeba kyslíku v produkční fázi fermentačního procesu, tj. při snížených nárocích na kyslík, odpovídala možnostem přenosu kyslíku v daném fermentoru. Toho se dociluje tím, že k přípravě živné půdy se použije takového množství aminokyselin, aby na každý 1 g přenášeného kyslíku na 1 1 půdy/hod připadlo 0,2 až 0,6 g, s výhodou 0,3 až 0,4 g alfa-aminodusíku.The process according to the invention makes maximum use of the aeration capacity of the fermenter to ensure high yields of L-lysine by dosing the amount of amino nitrogen into the nutrient medium according to the aeration capacity, so that the amount of biomass grown, which is determined by the amino acid content in the medium, is such that its oxygen requirement in the production phase of the fermentation process, i.e. at reduced oxygen requirements, corresponds to the oxygen transfer possibilities in the given fermenter. This is achieved by using such an amount of amino acids for the preparation of the nutrient medium that for every 1 g of transferred oxygen per 1 l of medium/hour, there is 0.2 to 0.6 g, preferably 0.3 to 0.4 g of alpha-amino nitrogen.

K regulaci metabolismu pomocí pH dle naěeho vynálezu se s výhodou využívá samovolného poklesu pH živné půdy a periodických úprav pH v průběhu růstu mikroorganismu. K samovolnému poklesu pH živné půdy dochází vlivem metabolické činnosti produkčního mikroorganismu, kdy pH klesá k hodnotám 5,0, případně až 4,0. Klesání pH má ze následek postupně zpomalování metabolismu, zvláště dýchání, což se projevuje zmenšenou spotřebou kyslíku. Hladina rozpuštěného O2 v půdě proto nejdříve v důsledku růstu mikroorganismu a intenzivního dýchání klesá, v dalším časovém úseku pak úměrně s poklesem pH, kdy se metabolismus zpomaluje, opět stoupá. Aby se zabránilo přílišnému zpomalení metabolismu, je nutno v určité fázi poklesu pH upravit jeho hodnotu na 6,5 až 8,0, s výhodou na 6,9 až 7,2, čímž se metabolismus znovu oživí a spotřeba kyslíku se zvýší, to znamená, že hladina rozpuštěného O2 opět začne klesat až do doby, kdy v důsledku opětného zpomalení metabolismu nízkým pH se živná půda začne kyslíkem dosycovat. Tyto cykly se periodicky opakují po celou dobu růstu mikroorganismu a projevují se charakteristickým průběhem křivek na zápisu měřených hodnot CO2 ve výstupu vzduchu, resp. kyslíku v půdě i samotného pH půdy. Volbou délky cyklů, tj. časových intervalů mezi jednotlivými úpravami pH, je možno udržovat hladinu rozp« O2 tak, aby se pohybovala v rozmezí 10 až 100 56, s výhodou 20 až 60 % nasycení. Pro dosažení ekonomicky optimálního efektu je však nutné, aby délka cyklu byla volena nejen z hlediska zajištění vyšší hladiny rozp. 0₂ v půdě, ale též s ohledem na to, aby metabolismus nebyl zpomalen příliš, neboť v tom případě dochází též ke zpomalení, event. zastavení biosyntézy L-lysinu.The regulation of metabolism by pH according to our invention advantageously uses the spontaneous decrease in pH of the nutrient medium and periodic pH adjustments during the growth of the microorganism. The spontaneous decrease in pH of the nutrient medium occurs due to the metabolic activity of the production microorganism, when the pH decreases to values of 5.0, or even 4.0. The decrease in pH results in a gradual slowing down of metabolism, especially respiration, which is manifested by a reduced oxygen consumption. The level of dissolved O2 in the soil therefore first decreases due to the growth of the microorganism and intensive respiration, and then increases again in proportion to the decrease in pH, when metabolism slows down. In order to prevent excessive slowing down of metabolism, it is necessary to adjust its value to 6.5 to 8.0, preferably to 6.9 to 7.2 at a certain stage of the pH decrease, which will revive the metabolism and increase oxygen consumption, i.e. the level of dissolved O2 will start to decrease again until the time when, due to the repeated slowing down of metabolism by low pH, the nutrient medium will start to be saturated with oxygen. These cycles are repeated periodically throughout the entire growth period of the microorganism and are manifested by the characteristic course of the curves on the recording of the measured values of CO2 in the air outlet, or oxygen in the soil and the pH of the soil itself. By choosing the length of the cycles, i.e. the time intervals between individual pH adjustments, it is possible to maintain the level of dissolved O2 so that it ranges from 10 to 100%, preferably 20 to 60% saturation. However, to achieve an economically optimal effect, it is necessary that the cycle length be chosen not only from the point of view of ensuring a higher level of dissolved O2, but also from the point of view of ensuring a higher level of dissolved O2. 0 ₂ in the soil, but also with regard to ensuring that the metabolism is not slowed down too much, because in that case the biosynthesis of L-lysine also slows down or stops.

Podle našeho vynálezu se v růstové fázi metabolismus optimálně reguluje pomocí pH tím, že první úprava pH a délky časových úseků mezi dalšími úpravami pH se určují podle průběhu křivky C0₂ ve výstupu vzduchu. Na této křivce je možno velmi dobře sledovat zvyšující se obsah C0₂ v důsledku růstu biomasy, i pokles vývoje C0₂ vlivem zpomalení dýchání při nízkém pH. Právš poklesu koncentrace C0₂ ve výstupu vzduchu se dle našeho postupu využívá ke kvantitativní indikaci útlumu metabolismu a k určení vhodného okamžiku pro úpravu pH. Při konstantním vzdušnění se úpravy pH roztokem alkálie provádějí vždy, když koncentrace C0₂ve výstupu vzduchu poklesne na 80 až 30 %, s výhodou na 70 až 50 % předchozího maxima.According to our invention, in the growth phase, metabolism is optimally regulated by pH, in that the first pH adjustment and the length of time periods between further pH adjustments are determined according to the course of the C0 ₂ curve in the air outlet. On this curve, it is possible to follow very well the increasing C0 ₂ content due to biomass growth, as well as the decrease in C0 ₂ development due to the slowing down of respiration at low pH. According to our procedure, the decrease in the C0 ₂ concentration in the air outlet is used to quantitatively indicate the attenuation of metabolism and to determine the appropriate moment for pH adjustment. With constant aeration, pH adjustments with an alkali solution are always carried out when the C0 ₂ concentration in the air outlet drops to 80 to 30%, preferably to 70 to 50% of the previous maximum.

Regulaci metabolismu pomocí pH je možno též provádět podle průběhu křivky rozp. 0₂.Regulation of metabolism using pH can also be carried out according to the course of the 0 ₂ dissolution curve.

Na této křivce je útlum metabolismu indikován zastavením poklesu a naopak stoupáním koncentrace rozp. O₂ v půdě. První úprava pH se provede, když pokles koncentrace rozp. O₂, ke kterému dochází v důsledku růstu mikroorganismu, se zastaví nebo koncentrace rozp. 0₂začne mírně stoupat, další úpravy se provádějí vždy tehdy, když útlum metabolismu, při kterém koncentrace rozp. O₂ stoupá, trvá minimálně jednu polovinu, maximálně trojnásobek doby, po kterou metabolismus na začátku daného cyklu nebyl výrazněji brzděn a koncentrace rozp.On this curve, the inhibition of metabolism is indicated by the cessation of the decrease and, conversely, the increase in the concentration of dissolved O ₂ in the soil. The first pH adjustment is made when the decrease in the concentration of dissolved O ₂ , which occurs as a result of the growth of the microorganism, stops or the concentration of dissolved O ₂ begins to increase slightly, further adjustments are always made when the inhibition of metabolism, during which the concentration of dissolved O ₂ increases, lasts at least one half, at most three times the time during which the metabolism was not significantly inhibited at the beginning of the given cycle and the concentration of dissolved O 2

O₂ v půdě klesala. S výhodou se volí doba úpravy tak, aby časové úseky poklesu a vzestupu koncentrace O₂ v půdě byly stejné.O ₂ in the soil decreased. The treatment time is preferably chosen so that the time periods of decrease and increase in the O ₂ concentration in the soil are the same.

Postupem dle vynálezu lze provádět regulaci metabolismu pomocí pH též podle průběhu vlastní křivky pH. Samovolný pokles pH, způsobený metabolickou činností mikroorganismu, není rovnoměrný, ale úměrně s klesající hodnotou pH a útlumem metabolismu se zpomaluje. Toho se využívá při našem postupu k řízení periodických úprav pH v růstové fázi biosyntetického procesu tak, že pH se upravuje vždy, když gradient poklesu křivky pH se zmenší na 20 až 5 %, o výhodou na 10 % své předchozí maximální hodnoty.The process according to the invention can also be used to regulate metabolism by pH according to the course of the pH curve itself. The spontaneous decrease in pH caused by the metabolic activity of the microorganism is not uniform, but slows down proportionally with the decreasing pH value and the attenuation of metabolism. This is used in our process to control periodic pH adjustments in the growth phase of the biosynthetic process so that the pH is adjusted whenever the gradient of the pH curve decrease decreases to 20 to 5%, preferably to 10% of its previous maximum value.

Popsaná regulace metabolismu a tím i rozpuštěného kyslíku v půdě se provádí podle jedné ze tří uvedených křivek, podle toho, jaké veličina je při fermentaci měřena, po celou dobu růstové fáze, která v závislosti na daném fermentačním zařízení trvá 18 až 30 hodin, obyčejně 20 až 24 hodin. V následující produkční fázi není nutné již vzhledem k menší spotřebě kyslíku intenzitu metabolismu brzdit, a proto se pH udržuje kontinuálními nebo semikontinuálními úpravami pH roztokem alkálie na úrovni v rozmezí fyziologicky optimálních hodnot 6,5 až 8,0, s výhodou 6,9 až 7,2. Při netlumené intenzitě metabolismu klesne hladina rozp.The described regulation of metabolism and thus of dissolved oxygen in the soil is carried out according to one of the three curves, depending on which quantity is measured during fermentation, throughout the growth phase, which, depending on the given fermentation equipment, lasts 18 to 30 hours, usually 20 to 24 hours. In the following production phase, it is no longer necessary to inhibit the intensity of metabolism due to the lower oxygen consumption, and therefore the pH is maintained by continuous or semi-continuous pH adjustments with an alkali solution at a level within the physiologically optimal values of 6.5 to 8.0, preferably 6.9 to 7.2. With an uninhibited intensity of metabolism, the level of dissolved oxygen decreases.

0₂ na hodnotu 1 až 10 % nasycení, která je dostačující pro docílení vysoké produkční rychlosti.0 ₂ to a value of 1 to 10% saturation, which is sufficient to achieve a high production rate.

Postupem podle vynálezu se dosáhne v konvenčních provozních fermentorech velkých produkčních rychlostí a vysokých výtěžků, které odpovídají výsledkům dosahovaným v laboratorních fermentorech s velmi vysokým přenosem kyslíku.The process according to the invention achieves high production rates and high yields in conventional commercial fermenters, which correspond to the results achieved in laboratory fermenters with very high oxygen transfer.

Následující příklady blíže objasňují způsob biosyntézy L-lysinu podle vynálezu, aniž jej omezují pouze na uvedená provedení. V příkladech pod bodem A. uvádíme táž kontrolní fermentace, při kterých nebyl využíván postup podle vynálezu.The following examples illustrate in more detail the method of biosynthesis of L-lysine according to the invention, without limiting it to the embodiments shown. In the examples under point A. we also present control fermentations in which the method according to the invention was not used.

Příklady provedeníDesign examples

Příklad 1Example 1

Kulturou kmene Brevibacterium flavum CB byla inokulována živná půda ve dvou očkovacích tancích.The nutrient medium in two inoculation tanks was inoculated with a culture of the Brevibacterium flavum CB strain.

Složení inokulační půdy:Composition of inoculation medium:

sacharóza sucrose 75 kg 75 kg melasa molasses 60 kg 60 kg corn-steep (60 %) corn-steep (60%) 90 kg 90 kg těch. biotin (1 %) tech. biotin (1%) 15 g 15 grams thyamin thiamine 0,6 g 0.6g sójový olej soybean oil 6 kg 6 kg voda water ad 3 000 about 3,000

pH 7,0pH 7.0

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 20 hodin za stálého míchání a vzduSnění.The inoculum was cultivated at 29°C for 20 hours with constant stirring and aeration.

Do 2 fermentorů o obsahu 50 m-^ s aerační kapacitou 5,2 g 0₂/l/hod byla připravena živná půda tohoto složeni:The following nutrient medium was prepared in 2 fermenters with a capacity of 50 m-^ and an aeration capacity of 5.2 g 0 ₂ /l/hour:

sacharóza sucrose 6 300 kg 6,300 kg melasa (50 % šach.) molasses (50% s.h.) 1 080 kg 1,080 kg hydrolyzét areí. m. (5,2 g NH₂-N/1) are hydrolyzate. m. (5.2 g NH ₂ -N/1) 9 000 1 9,000 1 corn-steep (60 %) corn-steep (60%) 300 kg 300 kg kyselina fosforečné (83 %) phosphoric acid (83%) 30 kg 30 kg síran hořečnatý kryst. magnesium sulfate cryst. 9 kg 9 kg těch. biotik (1 %) tech. biotic (1%) 0,15 kg 0.15 kg thi amin thi amin 0,006 kg 0.006 kg

sójový olej 30 kg voda ad 30 000 1 pH 6,9soybean oil 30 kg water ad 30,000 1 pH 6.9

Po sterilizaci byla živné půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduSnění 20 vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpěňování sójovým olejem.After sterilization, the nutrient medium in both fermenters was inoculated with the culture from the seed tanks. The cultivation was carried out at 29 °C with constant stirring and aeration of 20 air/min at a pressure of 198 kPa. During the fermentation, defoaming with soybean oil was carried out as needed.

V tanku A, kde nebyl feraentační proces regulován podle naieho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí hodnot 7,1 až 7,2 dávkováním 25% roztoku čpavku. V průběhu kultivace byly přidány 2 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy Fermentace trvala 65 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 3 mg/ml.In tank A, where the fermentation process was not regulated according to our invention, the pH was automatically maintained within the range of 7.1 to 7.2 throughout the fermentation period by dosing a 25% ammonia solution. During the cultivation, 2 additional feeds and 1,000 liters of 70% sucrose solution were added. The fermentation lasted 65 hours and at the end the residual sugar in the fermented soil was 3 mg/ml.

V tanku B, kde byl aplikován postup dle našeho vynálezu, byla od 0. do 24. hodiny kultivace prováděna diskontinuální úprava pH 25% roztokem čpavku podle hodnot CO₂ v odcházejících plynech a po 24. hodině kultivace bylo pH až do konce fermentace udržováno automaticky dávkováním čpavku v rozmezí hodnot 7,1 až 7,2. V průběhu kultivace byly přidány 4 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy. V 63. hodině kultivace, kdy hladina sacharózy v půdě klesla na nulovou hodnotu, byl fermentační proces ukončen.In tank B, where the procedure according to our invention was applied, from the 0th to the 24th hour of cultivation, discontinuous pH adjustment was carried out with a 25% ammonia solution according to the CO ₂ values in the outgoing gases, and after the 24th hour of cultivation, the pH was maintained automatically by dosing ammonia in the range of 7.1 to 7.2 until the end of fermentation. During the cultivation, 4 additional foods and 1,000 liters of 70% sucrose solution were added. At the 63rd hour of cultivation, when the sucrose level in the soil dropped to zero, the fermentation process was terminated.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.The values of the monitored variables for the control fermentation and fermentation according to the process according to the invention are given in Tables 1 and 2. The results achieved are summarized in Table 3.

Tabulka 1 Kontrolní fermentaceTable 1 Control fermentation

hodina kultivace an hour of cultivation co₂ % every ₂ % pH pH sušina biomasy g/1 dry biomass g/1 0 0 0 0 7,2 7.2 2,0 2.0 8 8 3,0 3.0 7,2 7.2 4,6 4.6 12 12 7,2 7.2 7,2 7.2 13,2 13.2 16 16 11,6 11.6 7,2 7.2 22,0 22.0 20 20 12,4 12.4 7,2 7.2 29,8 29.8 24 24 12,3 12.3 7,2 7.2 31,0 31.0 48 48 8,7 8.7 7,2 7.2 26,0 26.0 65 65 5,8 5.8 7,2 7.2 23,2 23.2

Tabulka 2 Fermentace podle vynálezuTable 2 Fermentation according to the invention

hodina kultivace hour of cultivation co₂ % every ₂ % pH pH úprava pH pH adjustment sušina biomasy g/1 dry biomass g/1 0 0 0 0 6,8 6.8 2,0 2.0 6 6 1,0 1.0 7,1 7.1 2,3 2.3 8 8 3,1 3.1 6,7 6.7 4,2 4.2 9 9 4,0 4.0 6,4 6.4 - - 10 10 4,5 (max.) 4.5 (max.) 6,1 6.1 - - 11 11 3,5 3.5 6,0 6.0 7,2 7.2 8,5 8.5 12 12 5,8 5.8 6,5 6.5 - - 13 13 7,5 7.5 6,0 6.0 14,25 14.25 8,0 (max.) 8.0 (max.) 5,7 5.7 - - 15 15 6,3 6.3 5,5 5.5 7,2 7.2 i 6_P6 i 6 _P 6 16 16 8,6 8.6 6,1 6.1 - - 16,50 16.50 9,5 (max.) 9.5 (max.) 5,75 5.75 - - 17,75 17.75 5,8 5.8 5,3 5.3 7,2 7.2 22,0 22.0 18,50 18.50 9,0 9.0 6,75 6.75 - - 19,50 19.50 10,5 (max.) 10.5 (max.) 5,55 5.55 - - 20,25 20.25 5,8 5.8 5,1 5.1 7,2 7.2 26,2 26.2 21 21 10,0 10.0 6,0 6.0 21,50 21.50 11,4 (max.) 11.4 (max.) 5,25 5.25 - - 22,50 22.50 5,8 5.8 5,0 5.0 7,2 7.2 30,0. 30.0. 23 23 10,5 10.5 5,9 5.9 23,50 23.50 12,0 (max.) 12.0 (max.) 5,5 5.5 - - 24 24 8,2 8.2 5,6 5.6 7,2 7.2 31 ,0 31 .0 25 25 12,1 12.1 7,2 7.2 aut. úprava auto. edit - - 48 48 10,6 10.6 7,2 7.2 29,8 29.8 63 63 7,8 7.8 7,3 7.3 27,2 27.2

212558 6 Tabulka 3 Dosažené výsledky212558 6 Table 3 Results achieved

Fermentace A Fermentation A B B doba kultivace (hod) cultivation time (hours) 65 65 63 63 objem p&dy (m^) volume of soil (m^) 36 36 36 36 L-lysin (g/1) L-lysine (g/1) 48,7 48.7 66,2 66.2 výtěžek L-lysinu (kg) L-lysine yield (kg) 1 753,2 1,753.2 2 515,6 2,515.6 spotřebovaná sacharóza (kg) sucrose consumed (kg) 8 345,0 8,345.0 9 745,0 9,745.0 konverze (%) conversion (%) 21 ,01 21 .01 25,81 25.81 spotřeba šach. na 1 kg lysinu consumption of chess. per 1 kg of lysine 4,76 4.76 3,87 3.87

Příklad 2Example 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum ABC/100 byla inokulovéna živné půda ve 2 očkovacích tancích.The culture of the Corynebacterium glutamicum ABC/100 strain was inoculated into the nutrient medium in 2 inoculation tanks.

Složení inokulační půdy:Composition of inoculation medium:

sacharóza corn-steep (60 %) hydrolyzét araě. mouky (5,2 g NH₂-N/1) těch. biotin (1 56) sójový olej voda pH 6,9 kg 90 kgsucrose corn-steep (60%) rice flour hydrolysate (5.2 g NH ₂ -N/1) biotin (1 56) soybean oil water pH 6.9 kg 90 kg

240 1 g 6 kg ad 3 000 1240 1 g 6 kg ad 3,000 1

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 24 hodin za stélého míchání a vzduSnění.The inoculum was cultivated at 29°C for 24 hours with constant mixing and aeration.

Do 2 fermentorů o obsahu 50 uč s aerační kapacitou 3,9 g 0₂/l/hod byla připravena živná půda tohoto složení:The following nutrient medium was prepared in 2 fermenters with a capacity of 50 cu with an aeration capacity of 3.9 g 0 ₂ /l/hour:

sacharóza sucrose 5 000 kg 5,000 kg melasa molasses 540 kg 540 kg hydrolyzét araS. mouky araS. flour hydrolysate (5,2 g NH₂-N/1) (5.2 g _NH2 -N/1) 6 750 1 6,750 1 corn-steep (60 %) corn-steep (60%) 300 kg 300 kg kyselina fosforečné (83 %) phosphoric acid (83%) 30 kg 30 kg síran hořečnatý kryst. magnesium sulfate cryst. 9 kg 9 kg tech. biotin (1 %) tech. biotin (1%) 0,15 0.15 sójový olej soybean oil 30 kg 30 kg

voda ad 30 000 1 pH 6,8water ad 30,000 1 pH 6.8

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduSníní 20 vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpěňování sójovým olejem.After sterilization, the nutrient medium in both fermenters was inoculated with the culture from the seed tanks. The cultivation was carried out at 29 °C with constant stirring and aeration of 20 air/min at a pressure of 198 kPa. During the fermentation, defoaming with soybean oil was carried out as needed.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle naěeho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0 dávkováním 25% čpavku. V průběhu kultivace byly přidány 3 příkrmy a 1 000 litrů 70% roztoku sacharózy. Fermentace trvaleIn tank A, where the fermentation process was not regulated according to our invention, the pH was automatically maintained in the range of 6.9 to 7.0 throughout the fermentation period by dosing 25% ammonia. During the cultivation, 3 additional feeds and 1,000 liters of 70% sucrose solution were added. Fermentation was continuous

2,2558 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 2,5 mg/ml. V tanku B byl podle naSeho vynálezu aplikován způsob regulace metabolismu dle průběhu křivky rozpuštěného kysli ku· Od 0· do 24. hodiny kultivace byla prováděna úprava pH 25% roztokem čpavku v několikahodinových intervalech. První úprava byla provedena v 9. hodině kultivace, kdy se zastavil pokles hladiny rozp. Og. Dálky časových intervalů mezi jednotlivými úpravami pH v dalším průběhu růstová fáze byly voleny tak, aby tvořily vždy dvojnásobek doby, po kterou koncentrace rozp. Og v půdě v daném intervalu měla klesající trend. Od 24. hodiny kultivace bylo pH upravováno automaticky v rozmezí hodnot 6,9 až 7,0. Y průběhu kultivace byly přidány 4 příkray ě , 000 litrů 70% roztoku sacharózy. V 65. hodině kultivace, kdy hladina sacharózy v půdě klesla na nulu, byl fermentační proces ukončen.2.2558 hours and at the end the residual sugar in the fermented soil was 2.5 mg/ml. In tank B, according to our invention, a method of regulating metabolism according to the course of the dissolved oxygen curve was applied. From 0 to 24 hours of cultivation, pH adjustment was carried out with a 25% ammonia solution at intervals of several hours. The first adjustment was carried out at the 9th hour of cultivation, when the decrease in the dissolved Og level stopped. The time intervals between individual pH adjustments in the further course of the growth phase were chosen so that they always formed twice the time during which the concentration of dissolved Og in the soil in a given interval had a decreasing trend. From the 24th hour of cultivation, the pH was adjusted automatically in the range of values 6.9 to 7.0. During the cultivation, 4,000 liters of 70% sucrose solution were added. At the 65th hour of cultivation, when the sucrose level in the soil dropped to zero, the fermentation process was completed.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a feraentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách 4 a 5. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.The values of the monitored variables in the control fermentation and fermentation according to the process according to the invention are given in Tables 4 and 5. The results achieved are summarized in Table 6.

Tabulka 4 Kontrolní fermentaceTable 4 Control fermentation

hodina kultivace an hour of cultivation rozp. Og % nasyc. dissol. Og % sat. PH PH sušina biomasy .....· e/i dry biomass .....· e/i 0 0 100 100 6,8 6.8 2,1 2.1 8 8 58 58 6,9 6.9 ....... 4,0 ....... 4.0 ,2 ,2 3 3 6,9 6.9 7,3 7.3 ,6 ,6 2 2 6,9 6.9 20,1 20.1 20 20 2 2 6,9 6.9 25,8 25.8 24 24 2 2 6,9 6.9 26,8 26.8 48 48 ,4 ,4 6,9 6.9 23,4 23.4 65 65 28 28 7,0 7.0 20,7 20.7

Tabu 1 k a 5 * Fermentace podle vynálezu Table 1 to 5 * Fermentation according to the invention hodina kultivace an hour of cultivation rozp. Og % nasyc. dissol. Og % sat. PH PH úprava pH pH adjustment sušina biomasy e/i dry biomass e/i 0 0 100 100 6,8 6.8 2,1 2.1 4 4 98 98 7,0 7.0 - - 6 6 87 87 6,8 6.8 - - 8 8 62 62 6,2 6.2 4,1 4.1 ,0 ,0 51 51 5,6 5.6 - - 11,5 11.5 41 41 5,3 5.3 - - 12,0 12.0 40 40 5,3 5.3 7,0 7.0 6,9 6.9 ,3 ,3 16 16 6,2 6.2 13,75 13.75 14 (min.) 14 (min.) 5,75 5.75 - - ’4,5 ’4.5 21 21 5,4 5.4 - - 15,5 15.5 58 58 5,2 5.2 7,0 7.0 17,2 17.2 16 16 30 30 6,0 6.0 16,5 16.5 21 (min.) 21 (min.) 5,75 5.75 - - 16,75 16.75 21 (min.) 21 (min.) 5,6 5.6 - - 17,75 17.75 54 54 5,3 5.3 7,0 7.0 20,4 20.4

pokračováni tabulky 5continuation of table 5

hodina kultivace an hour of cultivation rosp. Oo % nasye. rosp. Oo % nasye. PH PH úprava pH pH adjustment suěina bioaaey «/X bioaaey substance «/X 1B 1B 28 28 6.5 6.5 18,75 18.75 21 (min) 21 (minutes) 5,6 5.6 - - 19,5 19.5 32 32 5,4 5.4 - - 19,75 19.75 *3 *3 5,4 5.4 7,0 7.0 23,4 23.4 20 20 28 28 6,5 6.5 20,75 20.75 15 (min.) 15 (min.) 5,5 5.5 21 21 15 (min.) 15 (min.) 5,4 5.4 21,5 21.5 20 20 5,25 5.25 - - 22 22 34 34 5,2 5.2 7,0 7.0 26,0 26.0 22,5 22.5 15 15 6,0 6.0 W W 23 23 10 (min.) 10 (min.) 5,5 5.5 - - 23,5 23.5 18 18 5,3 5.3 - - 24 24 31 31 5,25 5.25 7,0 7.0 27,0 27.0 25 25 3 3 7,0 7.0 aut, úprava auto, modification 65 65 10 10 7,2 7.2 25,2 25.2

Tabulka 6 Dosažená výsledkyTable 6 Results achieved

Perme» A Perm» A i t a o e B i t a o e B doba kultivace (hod) cultivation time (hours) 65 65 65 65 objem půdy (m3) soil volume (m3) 37 37 38 38 L-lyein (g/1) L-lyein (g/1) 44,9 44.9 55,3 55.3 výtěžek lysinu (kg) lysine yield (kg) 1 661,3 1,661.3 2 101,4 2,101.4 spotřebovaná eaoharóza (kg) consumed eaoharose (kg) 7 445,0 7,445.0 8 145,0 8,145.0 konverze (%) conversion (%) 22,31 22.31 25,79 25.79 spotřeba sacharózy na 1 kg lysinu sucrose consumption per 1 kg of lysine 4,48 4.48 3,88 3.88

PříkladExample

Kulturou kmene Brevibaoterlum flavum CB/2 byla lnokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.The culture of the Brevibacterium flavum CB/2 strain was inoculated into the nutrient medium in 2 inoculation tanks.

Složení inokulační p&dys eaoharóza corn-eteep (60 %) melasa (50 % šach.) těch. biotln (1 %) thiamln sójový olej voda pH 6,9 ad kg 75 kg 50 kg 12.5 gComposition of inoculation powder corn-etape (60%) molasses (50% sugar) biotln (1%) thiamin soya oil water pH 6.9 per kg 75 kg 50 kg 12.5 g

0,5 g 5 kg0.5g 5kg

500 l500 liters

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 22 hod «a stálého míchání a vzdušnění, fermentorů o obsahu 50 m^ s aerační kapacitou 6,1 tohoto složení:The inoculum was cultivated at 29 °C for 22 hours with constant mixing and aeration, in fermenters with a capacity of 50 m^ with an aeration capacity of 6.1 of the following composition:

Do ná půda sacharóza hydrolyzát araS. mouky (5,2 g NHg-H/l) corn-ateep (60 %) kyselina fosforečná (83 %) síran hořečnatý kryst. těch. blotin (1 %} thiamin sójový olej voda pH 6,7 g Og/l/hod byla připravena živ·In the soil sucrose hydrolysate of araS. flour (5.2 g NHg-H/l) corn-ateep (60%) phosphoric acid (83%) magnesium sulfate crystal tech. blotin (1%} thiamine soybean oil water pH 6.7 g Og/l/hour was prepared live

000 000 ke to 100 100 1 1 300 300 ke to 30 30 ke to 9 9 ke to

0,15 kg 0,006 kg kg ad 23 000 10.15 kg 0.006 kg kg ad 23,000 1

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za stálého míchání a vzduěnšnl 20 a? vzduchu/min při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo prováděno podle potřeby odpčnovánl sójovým olejem.After sterilization, the nutrient medium in both fermenters was inoculated with the culture from the seed tanks. The cultivation was carried out at 29 °C with constant stirring and aeration of 20 a? air/min at a pressure of 198 kPa. During the fermentation, de-oiling was carried out as needed with soybean oil.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle našeho vynálezu, bylo pH po celou dobu fermentace automaticky udržováno v rozmezí 6,9 až 7,0 dávkováním 25% čpavku,In tank A, where the fermentation process was not regulated according to our invention, the pH was automatically maintained in the range of 6.9 to 7.0 throughout the fermentation period by dosing 25% ammonia,

V průběhu kultivace po spotřebování základního uhlíkového zdroje obsaženého v půdě bylo zahájeno semikontlnuálnl dávkování zředěného roztoku melasy o sacharizaci 45 %· Celkem bylo přidáno 7 příkrmů & 1 500 1. Fermentace trvala 70 hodin a na konci byl zbytkový cukr ve vyfermentované půdě 7,3 mg/ml.During cultivation, after the basic carbon source contained in the soil was consumed, semi-continuous dosing of a diluted molasses solution with a saccharification of 45% was started. A total of 7 supplements were added & 1,500 l. Fermentation lasted 70 hours and at the end the residual sugar in the fermented soil was 7.3 mg/ml.

V tanku B byl podle naěeho vynálezu aplikován způsob regulace metabolismu podle průběhu křivky pH. Od 0. do 24. hodiny kultivace byla prováděna úprava pH 25% roztokem čpavku v několikahodinových intervalech. Hodiny kultivace, v kterých se prováděly úpravy pH, byly určovány podle gradientu poklesu křivky pH. Podrobný popis průběhu křivek pH a úprava pH je v tabulce 8. Od 24. hodiny kultivace bylo pH upravováno automaticky v rozmezí hodnot 6,9 až 7,0. V průběhu kultivace bylo přidáno 9 příkrmů λ 1 500 litrů zředěné melasy o sacharizáci 45 %. V 70. hodině kultivace, kdy hladina cukru v půdě klesla na nulu, byl fermentační proces ukončen.In tank B, according to our invention, a method of regulating metabolism according to the course of the pH curve was applied. From the 0th to the 24th hour of cultivation, pH adjustment was carried out with a 25% ammonia solution at intervals of several hours. The hours of cultivation in which pH adjustments were carried out were determined according to the gradient of the decrease in the pH curve. A detailed description of the course of the pH curves and pH adjustment is in Table 8. From the 24th hour of cultivation, the pH was adjusted automatically in the range of values 6.9 to 7.0. During the cultivation, 9 additional feeds of λ 1,500 liters of diluted molasses with a saccharification of 45% were added. In the 70th hour of cultivation, when the sugar level in the soil dropped to zero, the fermentation process was terminated.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem podle vynálezu jsou uvedeny v .tabulkách 7 a 8. Dosažená výsledky jsou shrnuty v tabulce 9.The values of the monitored variables in the control fermentation and fermentation according to the process according to the invention are given in Tables 7 and 8. The results achieved are summarized in Table 9.

Tabulka 7 Kontrolní fermentaceTable 7 Control fermentation

hodina kultivace an hour of cultivation PH PH sušina biomasy e/i dry biomass e/i 0 0 6,7 6.7 2,3 2.3 8 8 6,9 6.9 5,6 5.6 12 12 6,9 6.9 14,8 14.8 16 16 6,9 6.9 24,3 24.3 20 20 6,9 6.9 34,0 34.0 24 24 6,9 6.9 34,4 34.4 48 48 6,9 6.9 29,4 29.4 70 70 6,9 6.9 24,7 24.7

Tabulka 8 Fermentace podle vynálezuTable 8 Fermentation according to the invention

hodina kultivace an hour of cultivation pH pH delta pH delta pH úprava pH pH adjustment sušina biomasy g/1 dry biomass g/1 0 0 6,7 6.7 - - 2,4 2.4 4 4 7,0 7.0 - - - - 6 6 6,85 6.85 0,037 0.037 - - 8 8 6,25 6.25 0,15 0.15 4,6 4.6 9 9 5,75 5.75 0,25 (max.) 0.25 (max.) - - 10 10 5,3 5.3 0,225 0.225 - - 11 11 5,1 5.1 0,10 0.10 - - 11,5 11.5 5,05 5.05 0,05 (min.) 0.05 (min.) 7,0 7.0 11,0 11.0 12 12 6,35 6.35 0,55 0.55 12,5 12.5 6,0 6.0 0,35 0.35 - - 13 13 5,7 5.7 0,30 0.30 - - 13,5 13.5 5,45 5.45 0,25 0.25 - - 14 14 5,25 5.25 0,20 0.20 - - 14,5 14.5 5,1 5.1 0,15 0.15 - - 15 15 ^5,05.0 0,10 0.10 7,0 7.0 18,4 18.4 15,5 15.5 6,25 6.25 0,75 0.75 - - 16 16 5,75 5.75 0,50 0.50 - - 16,5 16.5 5,45 5.45 0,30 0.30 - - 17 17 5,2 5.2 0,25 0.25 - - 17,5 17.5 5,0 5.0 0,20 0.20 - - 18 18 4,9 4.9 0,10 0.10 7,0 7.0 23,8 23.8 18,5 18.5 6,2 6.2 0,90 0.90 19 19 6,7 6.7 0,50 0.50 - - 19.5 19.5 5,4 5.4 0,30 0.30 - - 20 20 5,25 5.25 0,15 0.15 7,0 7.0 28,6 28.6 20,5 20.5 6,25 6.25 0,65 0.65 - - 21 21 5,8 5.8 0,45 0.45 - - 21,5 21.5 5,6 5.6 0,20 0.20 - - 22 22 5,5 5.5 0,10 0.10 - - 22,5 22.5 5,45 5.45 0,05 0.05 7,0 7.0 33,0 33.0 23 23 6,3 6.3 0,70 0.70 - - 23,5 23.5 5,95 5.95 0,35 0.35 - - 24 24 5,7 5.7 0,25 0.25 - - 24,5 24.5 5,55 5.55 0,15 0.15 - - 25 25 5,50 5.50 0,05 0.05 7,0 7.0 35,0 35.0 48 48 6,95 6.95 - - aut. úprava auto edit 32,3 32.3 70 70 7,2 7.2 - - . 28,8 . 28.8

Tabulka 9 Dosažené výsledkyTable 9 Results achieved

Fermentace Fermentation A A B B doba kultivace (hod) cultivation time (hours) 70 70 70 70 objem půdy (m^) volume of soil (m^) 37 37 40 40 L-lysin (g/1) L-lysine (g/1) 50,6 50.6 65,0 65.0 výtěžek L-lysinu (kg) L-lysine yield (kg) 1 872,2 1,872.2 2 600,0 2,600.0 spotřebovaná sacharóza (kg) sucrose consumed (kg) 8 825,0 8,825.0 10 175,0 10,175.0 konverze (%) conversion (%) 21 ,21 21 ,21 25,55 25.55 spotřeba saoharózy na 1 kg lysinu sauharose consumption per 1 kg of lysine 4,71 4.71 3,91 3.91

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

A method for optimizing and controlling the L-lysine biosynthesis process in a large-volume fermenter with an aeration capacity of 3 to 7 g 0 ₂ / l / h in the cultivation of bred microbial strains capable of producing L-lysine at high speed and high concentration on carbon source soils; ammonium salts or urea, phosphorus, magnesium, biosynthesis stimulators and amino acids required for growth, characterized in that, in the preparation of the nutrient medium, large amounts of amino acids are used with respect to the aeration capacity of the fermenter, such that 1 liter of soil per hour accounted for 0.2 to 0.6 g, preferably 0.3 to 0.4 g of alpha-amino nitrogen. During the growth of the microorganism, the metabolic rate is regulated according to the CO ₂ concentration in the air outlet or the dissolved oxygen curve soil, or according to the course of the pH curve, by cyclically repeating pH changes of the broth in the soil within the range of 4.0 to 8.0, thereby maintaining the sol. 0 ₂ ranging from 10 to 100%, preferably 20 to 60% saturation, and after the growth of the microorganism during the production phase, the intensity of the L-lysine biosynthesis is maintained at the maximum, continuous or semicontinuous pH adjustments in the range of physiological pH optimum 6.5 to 8.0, preferably 6.9 to 7.2, thereby achieving a oxygen-limiting level of 1 to 10% saturation for a given amount of biomass.

2. Method according to claim 1, characterized in that cyclically repeated pH changes are achieved by utilizing a spontaneous decrease in the pH of the soil as a result of the metabolic activity of the producing microorganism to a pH of 6.0 to 4.0, preferably 5.7 to 4.0. 5.2, and periodically adjusting the pH of the alkalis to 6.5 to 8.0, preferably 6.9 to 7.2.

3. The method according to claim 1, wherein the first pH adjustment and the length of time intervals between further pH adjustments in the growth phase are determined according to the course of the CO ₂ curve in the air outlet, such that the pH is adjusted by alkali each time with a constant air concentration of CO ₂ in the air leaving the tank, it drops to 80 to 30%, preferably to 70 to 50% of the previous maximum.

4. The method according to claim 1, wherein the first pH adjustment and the length of time intervals between further pH adjustments in the growth phase are determined according to the course of the spread curve. O ₂ in the soil, so that the first pH adjustment is carried out when the concentration of dec. 0 ₂ stops or the concentration of sol. 0 ₂ starts to rise slightly, and any further adjustment always occurs when the length of time that the curve expands. O ₂ rises after passing the minimum, is equal to 0.5 to 3.0 times the time period over which the spline curve. 0 ₂ in the same cycle, decreasing, preferably selected treatment time so that time periods decrease and increase in the concentration disp. O ₂ were the same.

5. A method according to claim 1 or 2, wherein the first pH adjustment and the length of time intervals between further pH adjustments in the growth phase are determined according to the course of the pH curve, such that the pH value is adjusted by alkaline each time The pH is reduced to 20 to 5%, preferably to 10% of its previous maximum value.

Severografia, n. P. Plant 7, Most