CS209684B1

CS209684B1 - Method of the fermentation manufacture of the l-lysine

Info

Publication number: CS209684B1
Application number: CS522079A
Authority: CS
Inventors: Stanislav Ulbert; Alexandr Hano; Michal Bucko; Karel Culik; Jiri Plachy; Jindrich Chromik; Peter Synovec; Emil Miklas; Leonid Ivanov; Jan Salka
Original assignee: Stanislav Ulbert; Alexandr Hano; Michal Bucko; Karel Culik; Jiri Plachy; Jindrich Chromik; Peter Synovec; Emil Miklas; Leonid Ivanov; Jan Salka
Priority date: 1979-07-26
Filing date: 1979-07-26
Publication date: 1981-12-31

Description

Vynález se týká způsobu fermentační výroby L-lysinu pomocí vyšlechtěných mutant bakterii, který ekonomizuje výrobní proces lysinu tím, že umožňuje ve velkoobjemovém výrobním zařízení dosáhnout vysokého stupně využití uhlíkatého substrátu pří biosyntéze lysinu a poskytuje vyfermentovanou půdu s vysokým obsahem L-lysinu takové kvality, že při izolací krystalického a zejména pak technického preparátu lysinu je dosahováno vysoké výtěžnosti a zlepšené kvality prepar átu.The present invention relates to a method for fermenting L-lysine by breeding bacterial mutants, which economizes the lysine production process by enabling high-volume production equipment to achieve a high degree of carbon substrate utilization in lysine biosynthesis and providing fermented soil with high L-lysine content of such quality that the isolation of the crystalline and especially the technical preparation of lysine results in a high yield and improved quality of the preparation.

Lysin je jednou z aminokyselin, jejíž biosyntetická výroba v průmyslovém měřítku je v současné době nejvíce zvládnuta.Lysine is one of the amino acids whose biosynthetic production on an industrial scale is currently the most controlled.

Ve světě se nyní vyrábí několik desítek tisíc tun lysinu ve formě lysin-hydrochlorid-dihydrátu,anebo technického preparátu, který se získá usušením fermentované půdy.Several tens of thousands of tons of lysine are now produced in the world in the form of lysine hydrochloride dihydrate or a technical preparation obtained by drying the fermented soil.

Je známa celá řada postupů využívajících k biosyntetické přípravě L-lysinu různých vyšlechtěných mutant bakterií produkujících lysin při kultivací na uhlohydrátech či jiných uhlíkatých zdrojích, jak je popisují např. US pat. c. 2 979 439, US pat. č.A variety of methods are known using a variety of breeding mutants of lysine-producing bacteria for cultivation on carbohydrates or other carbon sources for the biosynthetic preparation of L-lysine, such as described in US Pat. No. 2,979,439, U.S. Pat. C.

707 441, franc. pat. č. 1 533 688 a franc. pat. č. 2 033 199.707,441, franc. U.S. Pat. No. 1 533 688 and French. U.S. Pat. No. 2,033,199.

Ve všech postupech je vždy hlavní surovinou ve složení živné půdy uhlíkatý zdroj, takže jeho spotřeba výrazně ovlivňuje celkové náklady na vyráběný preparát lysinu. Celkové náklady jsou také silně závislé na výtěžku pří izolaci lysinu z fermentované půdy, který je ovlivňován složením fermentační kapaliny po ukončené biosyntéze. Za hlavní ekonomizační faktory při zvyšování efektivnosti biosyntézy L-lysinu je nutno proto považovat zvyšování stupně využití uhlíkatého zdroje, to znamená konverze, a zvyšování výtěžku při izolaci krystalického nebo technického preparátu L-lysinu.In all processes, the main raw material in the nutrient composition is a carbon source, so its consumption significantly affects the total cost of the lysine preparation produced. The total cost is also strongly dependent on the recovery yield of lysine from the fermented soil, which is influenced by the composition of the fermentation liquid after the biosynthesis has been completed. Therefore, the main economizing factors in increasing the efficiency of L-lysine biosynthesis are to increase the degree of utilization of the carbon source, i.e. conversion, and increase the yield of the crystalline or technical L-lysine preparation.

Limity zvyšování konverze jsou dány předně fyziologií pródukčního kmene, ale jsou výrazně ovlivňovány též technickými a technologickými parametry. Výše výtěžků při izolaci lysinu z fermentované půdy je určena v prvé řadě vlastním izolačním postupem.The limits of the conversion increase are given primarily by the physiology of the production strain, but they are also significantly influenced by technical and technological parameters. The recovery yield of lysine from the fermented broth is determined primarily by the actual isolation process.

Z tohoto hlediska je nejvýhodnější izolační postup, při kterém je získáván technický preparát lysinu dehydratací vyfermentované půdy. Výtěžky při použití tohoto postupu jsou však silně ovlivňovány složením fermentační kapaliny po ukončení biosyntézy.From this point of view, the most preferred isolation process is that a technical preparation of lysine is obtained by dehydrating the fermented soil. However, the yields of this procedure are strongly influenced by the composition of the fermentation liquid after completion of the biosynthesis.

Proto pří fermentaci je nutno volit takový postup, který zajišťuje vyfermentovanou půdu takové kvality, aby se její dehydratací získal technický preparát L-lysinu nelepivý a nehygroskopický, ve vysokém výtěžku. Pří řešení problematiky ekonomizace biosyntetické výroby L-lysinu se proto hledalo komplexní řešení optimalizace fermentačního postupu s ohledem na oba výše uvedené aspekty.Therefore, during fermentation, it is necessary to select a process which ensures fermented soil of such a quality that its dehydration gives a technical preparation of L-lysine non-sticky and non-hygroscopic, in high yield. Therefore, when solving the problem of economizing the biosynthetic production of L-lysine, a comprehensive solution was sought for the optimization of the fermentation process with respect to both of the above aspects.

Vycházelo se z těchto poznatků: hlavní produkční fáze fermentace, ťj.It was based on the following findings: the main production phase of fermentation, i.

po ukončení růstu produkčního mikroorganismu, se vyznačuje tím, že spotřeba kyslíku je výrazně nižší než při růstu mikroorganismu, jak uvádějí např. sovětští autoři Bekker Μ. E., a spol. v práci: Lisin-rpolučenije i prímeněnije v životnovodstve,after the growth of the production microorganism has ceased, it is characterized by the fact that the oxygen consumption is significantly lower than during the growth of the microorganism, as reported by the Soviet authors Bekker ker. E., et al. at work: Lisin-rpolučenije i prenomenenije in life-support,

Nauka, Moskva 1 973 , nadbytek kyslíku v půdě v hlavní produkční fázi způsobuje, že dochází k neekonomickému prodýchávání uhlíkatého zdroje na C02, a tím k jeho nevratným ztrátám, mírná limitace biosyntetického procesu kyslíkem v hlavní produkční fázi je z hlediska rychlosti biosyntézy lysinu příznivá, ale je při ní rovněž dosahováno nižší konverze a dochází při ní k rychlejšímu zastavení biosyntetického procesu, silná limitace biosyntetického procesu kyslíkem, obzvláště ve spojení s mechanickým namáháním buněk způsobeným intenzívním mícháním, tj. shear-efektem, vede k předčasnému ukončení biosyntézy lysinu v důsledku «silné destrukce biomasy.The doctrine, Moscow 1973, an excess of oxygen in the soil in the main production phase results in uneconomical inhalation of the carbon source to CO2 and thus irreversible losses, a slight limitation of the biosynthetic process by oxygen in the main production phase is favorable in terms of the rate of lysine biosynthesis. but it also achieves a lower conversion and quicker biosynthetic process, a strong limitation of the biosynthetic process by oxygen, especially in conjunction with the mechanical stress of the cells due to the intensive agitation, ie the shear effect, leads to premature termination of lysine biosynthesis due to strong destruction of biomass.

Z uvedeného vyplývá, že vysokého stupně konverze lze dosáhnout pří optimálním zásobení buněk kyslíkem. To je však v praxi velmi obtížné zabezpečit, zejména proto, že dynamika metabolismu, a tím i potřeba kyslíku, se v závislosti na stáří buněk mění.Accordingly, a high degree of conversion can be achieved with optimal oxygen supply to the cells. However, this is very difficult to ensure in practice, especially since the dynamics of metabolism, and hence the need for oxygen, vary depending on the age of the cells.

Nyní bylo zjištěno, že nízký výtěžek lysinu z C-zdroje při vedení procesu za nedostatku kyslíku je způsoben tím, že za těchto podmínek dochází k dísbalanci mezí spotřebou uhlíkového zdroje a tvorbou lysinu, což se projevuje hromaděním uhlíkatých intermediátů ve fermentované půdě. Zjistilo se též, že horší zpracovatelnost vyfermentované půdy na krystalický lysin a především na technický preparát lysinu je způsobena právě uhlíkatými intermediáty nahromaděnými ve fermentované půdě v průběhu biosyntézy.It has now been found that the low yield of lysine from the C-source in the oxygen-deficient process is due to the fact that, under these conditions, there is a deviation of the carbon source consumption and lysine formation resulting in accumulation of carbon intermediates in the fermented soil. It has also been found that the worse workability of fermented soil to crystalline lysine and especially to the technical preparation of lysine is due to the carbon intermediates accumulated in the fermented soil during biosynthesis.

Při dehydrataci vyfermentované půdy za zvýšené teploty reagují totiž intermediáty s L-lysinem a ztěžují tak průběh sušení a snižují celkový výtěžek lysinu. Dochází při tom k nalepování produktu na sušicí zařízení. Kvalita technického preparátu je zhoršena v důsledku jeho lepivosti a hygroskop ično s t í.When dehydrating the fermented soil at elevated temperatures, the intermediates react with L-lysine, making drying more difficult and reducing the overall yield of lysine. The product is adhered to the drying device. The quality of the technical preparation is deteriorated due to its stickiness and hygroscopicity.

Na základě těchto poznatků se podařilo vyřešit optimální režim řízení biosyntézy, při kterém je v hlavní produkční fázi fermentace biosyntetický proces záměrně limitován kyslíkem za účelem dosažení vysoké produkční rychlosti a zároveň jsou odstraněny negativní důsledky této limitace, způsobené hromaděním uhlíkatých intermediátů v půdě. Dociluje se toho tím, že v hlavní produkční fázi je metabolismus uhlíkatého zdroje aktivně regulován tak, aby disbalance mezi spotřebou C-zdroje a tvorbou L-lysinu byla periodicky korigována, to znamená, aby docházelo k periodické utílizaci intermediátů produkčním mikroorganismem a k jejich využití pro tvorbu L-lysinu.Based on these findings, an optimal biosynthesis control regime has been solved, in which the biosynthetic process is deliberately limited by oxygen in the main production phase of fermentation in order to achieve a high production rate while eliminating the negative consequences of this limitation caused by accumulation of carbon intermediates in the soil. This is accomplished by actively regulating the carbon source metabolism in the main production phase so that the disbalance between C-source consumption and L-lysine formation is periodically corrected, that is, the intermediates are periodically quenched by the production microorganism and used to produce L-lysine.

Tím se dosáhne vysoké konverze C-zdroje na lysin, a to i v podmínkách velkoobjemových fermentorů, zvýšení celkového výtěžku lysinu udržením vysoké produkční rychlosti až do konce fermentace, výrazného zlepšení vlastností fermentované půdy z hlediska zpracovatelnosti při přípravě pevného produktu L-lysinu a úspor na spotřebě tlakovéhovzduchu.This results in a high conversion of the C-source to lysine, even under large-scale fermenters, an increase in the overall lysine yield by maintaining a high production rate until the end of the fermentation, a significant improvement in the fermentability properties of the L-lysine solid product and consumption of compressed air.

Postup podle vynálezu spočívá v tom, že po ukončení růstové fáze se režim vzdušnění změní tak, aby biosyntéza probíhala pří mírné limitaci kyslíkem. Vhodné vzdušnění se. nastaví podle materiálové bilance CO2 v odcházejících plynech snížením průtoku vzduchu na hodnotu, pří které kvantita CO2 vznikajícího při biosyntéze za časovou jednotku poklesne o 5-25 %, s výhodou o 15-20 procent oproti množství CO2, které bylo produkováno za časovou jednotku na konci růstové fáze.The process according to the invention consists in that after the growth phase the aeration regime is changed so that the biosynthesis proceeds with a slight oxygen limitation. Appropriate aeration. set according to the material balance of CO2 in the outgoing gases by reducing the air flow to a value at which the amount of CO2 resulting from biosynthesis per unit of time decreases by 5-25%, preferably by 15-20 percent, compared to the amount of CO2 produced per unit of time at the end growth phase.

V průběhu hlavní produkční fáze fermentace se utilízace základního C-zdroje a utilizace uhlíkatých intermediátů periodicky reguluje tak, že vždy po spotřebování 0,5-10, s výhodou 1-3 hmotnostních procent základního C-zdroje vzhledem k objemu půdy,During the main production phase of the fermentation, the utilization of the basic C-source and the utilization of the carbon intermediates are periodically regulated such that each time 0.5-10, preferably 1-3 weight percent of the basic C-source is consumed relative to the soil volume,

e. přeruší dávkování C-zdroje. Koncentrace základního C-zdroje ve fermentované půdě se ponechá klesnout na nulovou hodnotu, což je doprovázeno prudkým poklesem koncentrace CO2 v odcházejících plynech, a sice o 40-60 procent.e. interrupt dosing of the C-source. The concentration of the basic C-source in the fermented soil is allowed to drop to zero, which is accompanied by a sharp decrease in the concentration of CO2 in the outgoing gases, namely by 40-60 percent.

V následující fázi fermentace jsou utilizovány uhlíkaté intermediáty nahromaděné v půdě, koncentrace CO2 při tom dále pozvolna klesá v závislosti na snižování koncentrace intermediátu v půdě. Obnovení dávkování základního C-zdroje se provede tehdy, když koncentrace CO2 v odcházejících plynech poklesne na 30-15 %, s výhodou na 25-20 2 vztaženo ke koncentraci CO2 naměřené při utílizaci C-zdroje před poklesem jeho koncentrace na nulovou hodnotu. Poslední perioda utilízace uhlíkatých intermediátů se prodlouží tak, aby koncentrace CO2 v odcházejících plynech poklesla až na 10-5 2 předchozího maxima.In the subsequent fermentation phase, carbonaceous intermediates accumulated in the soil are utilized, while the CO2 concentration decreases further as the concentration of the intermediate in the soil decreases. The metering of the basic C-source is carried out when the CO2 concentration in the outgoing gases drops to 30-15%, preferably to 25-20% relative to the CO2 concentration measured during the C-source stabilization before the concentration of the C-source drops to zero. The last period of utilization of the carbon intermediates will be extended so that the concentration of CO2 in the outgoing gases drops to 10-5 2 of the previous maximum.

Tím se zajistí, že zbytková koncentrace uhlíkatých intermediátů, která negativně ovlivňuje zpracování vyfermentované půdy dehydratací na technický preparát lysinu i přípravu krystalického lysinu, se maximálně sniž í.This ensures that the residual concentration of the carbonaceous intermediates, which adversely affects the treatment of the fermented soil by dehydration to both the lysine technical preparation and the crystalline lysine preparation, is reduced as much as possible.

Vhodná limitace kyslíkem se v průběhu hlavní produkční fáze během časových úseků utilízace základního C-zdroje zajíštuje korigováním vzdušnění. Vzdušnění se postupně snižuje tak, aby původní hodnota koncentrace CO2, která byla nastavena na začátku hlavní produkční fáze, byla v první třetině hlavní produkční fáze konstantní a pak postupně klesala až na 70-50 % hodnoty CO2 na začátku hlavní produkční fáze.Appropriate oxygen limitation is ensured during the main production phase during the periods of utilization of the basic C-source by correcting the aeration. The aeration gradually decreases so that the initial value of CO2 concentration, which was set at the beginning of the main production phase, is constant in the first third of the main production phase and then gradually decreases to 70-50% of the CO2 value at the beginning of the main production phase.

Následující příklady blíže objasňují způsob biosyntézy L-lysínu podle vynálezu, aniž jej omezují pouze na uvedená provedení. V příkladech pod bodem A uvádíme kontrolní fermentace, při kterých nebyl využíván postup podle vynálezu.The following examples illustrate the L-lysine biosynthesis process of the present invention in more detail without limiting it to the embodiments. In the examples under point A, control fermentations were used in which the process according to the invention was not used.

Příklady provedeníExamples

Příklad 1Example 1

Kulturou kmene Brevíbacterium flavum CB byla inokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.Culture of Brevíbacterium flavum CB was inoculated in 2 inoculation tanks.

Složení ínokulační půdy:Composition of the flocculation soil:

sacharóza sucrose 1 10 1 10 kg kg melasa /50% šach./ molasses / 50% chess / 60 60 kg kg corn-steep JbG7,J corn-steep JbG7, J 90 90 kg kg těch. biotin /1 % / those. biotin / 1% / 15 15 Dec g G thiamin thiamine 0,6 0.6 g G s0jový olej soya oil 6 6 kg kg voda water ad 3 ad 3 000 000 1 1 pH 6,9 pH 6.9 Kultivace inokula Inoculum cultivation probíhala při it was going on 29 ¹ 29 ¹ ³C po ³ C Mon dobu 20 hodin za stál for 20 hours standing ého míchání a and mixing vzd' give up usnění falling asleep Do 2 fermentorů 0 Up to 2 fermenters 0 obsahu 50 m 3 capacity 50 m 3 byla was při- at-

pravena živná půda tohoto složení:the nutrient medium of the following composition:

sacharóza sucrose 4 4 300 300 kg kg melasa /50% šach./ molasses / 50% chess / 540 540 kg kg hydrolysát araš. mouky peanut hydrolysate. flour /5,4 g NH₂-N/1/(5.4 g NH ₂ -N / 1) 7 7 200 200 1 1 corn-steep /60%/ corn-steep 300 300 kg kg kys. fosforečná /83%/ Phosphoric acid / 83% / 30 30 kg kg síran horečnatý kryst. magnesium sulfate crystals. 9 9 kg kg těch. biotin / 1 % / those. biotin / 1% / 0,15 0.15 kg kg thiamin thiamine 0 0 ,006 , 006 kg kg sój ový olej soybean oil 30 30 kg kg voda ad water ad 30 30 000 000 1 1

pH 6,9pH 6.9

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za míchání a vzdušnění způsobem, jak je blíže specifikován v tabulkách č. 1 a 2, při tlaku 198 kPa. Růst mikroorganismu probíhal v obou pokusech do 20. hod. kultivace. Během fermentace bylo pH udržováno dávkováním čpavku v rozmezí hodnot 6,0-7,0 a podle potřeby bylo prováděno odpěňování sojovým olejem.After sterilization, the broth in both fermenters was inoculated with culture from seed tanks. The cultivation was carried out at 29 ° C under stirring and aeration as specified in Tables 1 and 2 at a pressure of 198 kPa. The growth of the microorganism was carried out in both experiments until 20 o'clock of cultivation. During fermentation, the pH was maintained by ammonia dosing in the range of 6.0-7.0, and soybean oil defoaming was performed as necessary.

V tanku A, kde nebyl fermentaení proces regulován podle postupu vynálezu, bylo konstantní vzdušnění /20 m^/mín./ po celou dobu fermentace. Přídavky sacharózy do fermentované kapaliny byly aplikovány běžně používaným způsobem tak, aby koncentrace sacharózy v půdě neklesla před koncem fermentace na nulu. Celkem bylo provedeno 5 příkrmů a 1000 litrů 70%ního roztoku sacharózy .In tank A, where the fermentation process was not regulated according to the process of the invention, there was constant aeration (20 m ^ / min) throughout the fermentation. Additions of sucrose to the fermented liquid were applied in a conventional manner so that the concentration of sucrose in the soil did not drop to zero before the end of the fermentation. A total of 5 baby foods and 1000 liters of 70% sucrose solution were made.

V tanku B byl podle našeho vynálezuHe was in tank B according to our invention

Tabulka 1 Kontrolní fermentace v hlavní, produkční fází regulován metabolismus sacharózy a uhlíkatých intermedíátů a byl měněn režim vzdušnění podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech. Bylo provedeno 5 příkrmů 70%ního roztoku sacharózy a sice 3x a 1000 1 a 2x á 500 1. Příkrmy byly aplikovány tak, že celkem 14,75 hod. byly utilízovány íntermediáty.Table 1 Control of fermentation in the main, production phase regulated the metabolism of sucrose and carbonate intermediates, and the aeration regime was varied according to the CO2 concentration in the outgoing gases. Five side dishes of 70% sucrose solution were made, namely 3x and 1000 l and 2x and 500 l respectively. The side dishes were applied in such a way that for a total of 14.75 hours the intermediates were utilized.

Vyfermentovaná půdy z obou fermentorů byly zpracovaný na technický preparát L-lysínu dehydratací.The fermented soils from both fermenters were processed to the technical preparation of L-lysine by dehydration.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem dle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách č. 1 a 2. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 3The values of the monitored quantities for the control fermentation and fermentation according to the invention are given in Tables 1 and 2. The results obtained are summarized in Table 3.

hod . kult. hours cult. sacharóza sucrose př íkrm sachar. kg for example, sacchar. kg ^co2 7, ^co 2 7, vzdušnění /min. aeration / min. před příkrm. mg/ml before side dish. mg / ml po příkrm, mg/ml after side dish, mg / ml 0 0 136,8 136.8 - - 0 0 20 20 May 24 24 41,0 41.0 60,3 60.3 7 00 7 00 1 2 1 2 20 20 May 30 30 35,2 35.2 55,0 55.0 700 700 1 2 1 2 20 20 May 38 38 2 7,3 2 7.3 46,0 46.0 700 700 1 2 1 2 20 20 May 45 45 18,2 18.2 35,3 35.3 7 00 7 00 1 1 1 1 20 20 May 54 54 8,0 8.0 25,0 25.0 700 700 10 10 20 20 May 65 65 0 0 - - - - 8 8 20 20 May

Tabulka 2 Fermentace podle vynálezu Table 2 Fermentation according to the invention hod . kult. hours cult. sacharóza sucrose příkrm sachar . kg příkrm sachar. kg 00₂ 7_a 00 ₂ 7 _a vzdušnění 111^ / min . aeration 111 ^ / min. před příkrm. mg /m 1 before the side dish. mg / m 1 po příkrm. mg/ml after side dish. mg / ml 0 0 137,3 137.3 - - 0 0 20 20 May 20 20 May .... před .... před korekcí vzdušnění .......... air correction .......... ..... 12 ..... 12 20 20 May 20 20 May .... po korekci vzdušnění ............ .... after air correction ............ ...... 14,6 ...... 14.6 13 13 24 24 4 2,3 4 2,3 61,7 61.7 7 00 7 00 14,7 14.7 1 3 13 30 30 32,0 32.0 51 ,0 51, 0 700 700 14,5 14.5 13 13 3 6 3 6 23,3 23.3 - - - - 14,6 14.6 13 13 3 9,5 3 9,5 3,0 3.0 - - - - 14,2 14.2 13 13 40 40 0 0 - - - - 11,1 11.1 13 13 40,5 40.5 0 0 - - - - 8,0 8.0 1 3 13 41 41 0 0 - - - - 7 , 1 7, 1 13 13 4 2 4 2 0 0 - - - - 6, 2 6, 2 13 13 43 43 0 0 - - - - 5,5 5.5 1 3 13 44 44 0 0 - - - - 4,6 4.6 13 13 4 5 4 5 0 0 18,3. 18.3. 7 00 7 00 2,9 2.9 13 13 4 5,5 4 5,5 - - - - 13,5 13.5 11 11 4 6 4 6 - - - - - - 14 14 1 1 1 1 50 50 0 0 - - - - I 3 , 3 I 3, 3 1 1 1 1 5 0,5 5 0,5 0 0 - - - - 6,5 6.5 1 1 1 1 5 1 5 1 0 0 4, 9 4, 9 1 1 1 1

Z pokračování tab. č. 2.From the continuation of Tab. No 2.

hod . kult. hours cult. sacharoza sucrose příkrm sachar . kg příkrm sachar. kg ^C°2 % ^C ° 2% vzdušnění /min. aeration / min. před př íkr m. mg/ml before m. mg / ml PO příkrm. mg/ml AFTER side dish. mg / ml 52 52 0 0 - - - - 3.8 3.8 11 11 52,5 52.5 0 0 - - 1 1 3,4 3.4 1 1 1 1 53 53 0 0 10,0 10.0 350 350 2,8 2.8 1 1 1 1 53,5 53.5 - - - - - - 6,5 6.5 8 8 54 54 - - - - - - 1 1 1 1 8 8 55 55 - - - - - - 1 1 1 1 8 8 55,5 55.5 0 0 - - - - 10 10 8 8 5 6 5 6 0 0 - - - - 4 4 8 8 57 57 0 0 - - - - 3,2 3.2 8 8 58 58 0 0 9,2 9.2 350 350 2,0 2,0 8 8 59 59 - - - - - - 7,5 7.5 6 6 60 60 - - - - - - 7,5 7.5 6 6 ¢0,75 ¢ 0.75 0 0 - - - - 4,5 4,5 6 6 62 62 0- 0- - - - - 2,5 2.5 6 6 63 63 0 0 - - - - 2,0 2,0 6 6 64 64 0 0 - - 1,7 1.7 6 6 65 65 0 0 - - - - •0,7 • 0.7 6 6

Tabulka 3 Dosažené výsledky.Table 3 Results achieved.

FermentaceFermentation

AAND

B(B)

doba kultivace /hod./ cultivation time / hour / 65 65 65 65 objem půdy /m^/ soil volume / m ^ / 39 39 38 38 L-lysin /g/1/ L-lysine (g / l) 4 6,9 4 6,9 59,7 59.7 výtěžek lysinu /kg/ Lysine yield / kg / 1829,1 1829.1 2 2 68,6 2 2 68.6 spotřebovaná sacharoza /kg/ sucrose consumed / kg / 8210 8210 7510 7510 konverze /%/ conversion /%/ 22,3 22.3 30,21 30.21 spotřeba sacharózy na consumption of sucrose per 1 kg lysinu 1 kg of lysine 4,49 4.49 3,31 3.31 technický preparát lysinu /kg/ technical preparation of lysine / kg / 6378,8 6378.8 67 90,4 67 90.4 obsah L-lysinu v těch. prepar. content of L-lysine in those. prepar. /kg/šarže/ / kg / batch / 1505,4 1505.4 1 98 2,8 1 98 2.8 obsah L-lysinu v těch. prepar. content of L-lysine in those. prepar. /z/ /of/ 23,6 23.6 29,2 29.2 výtěžek L-lysinu na ferm, půdu yield of L-lysine per ferm, soil /Z/ /OF/ 82,3 82.3 8? ,4 8? , 4

hygroskopičnost konečného produktu pří 65% relat. vlhkosti a teplotě 25 °C /přírůstek váhy v %/24 hod./ 10,2 0hygroscopicity of the final product at 65% relative. humidity and temperature 25 ° C / weight gain in% / 24 hours / 10.2 0

Příklad 2Example 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum AEC/100 byla ínokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.Culture medium of Corynebacterium glutamicum AEC / 100 was inoculated in 2 seed tanks.

Složení inokulační půdy:Inoculation soil composition:

sacharoza 90 kg corn.steep IbQll 90 kg hydrolyzát araš. mouky /5,4 g NH2-N/1/ 240 1 těch. biotín /1%/ 15 g sojový olej 6 kg voda ad 3000 1 pH 6,85sucrose 90 kg corn.steep IbQll 90 kg Pean hydrolyzate. flour / 5.4 g NH 2 -N / 1/240 1 th. biotin / 1% / 15 g soybean oil 6 kg water ad 3000 l pH 6.85

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 26 hodin za stálého míchání a vzdušnění.The inoculum was cultured at 29 ° C for 26 hours with stirring and aeration.

Do 2 fermentorů 0 objemu 50 m^ To 2 fermenters with a volume of 50 m m byl. was. a při and during pravena půda tohoto složení: the soil of this composition: sacharó za sacharó za 5000 5000 kg kg melasa /50% šach./ molasses / 50% chess / 250 250 kg kg hydrolyzát aras. mouky aras hydrolyzate. flour /5,4 g NH₂-N/1/(5.4 g NH ₂ -N / 1) 6500 6500 1 1 corn-steep /60%/ corn-steep 300 300 kg kg kys. fosforečná /83%/ Phosphoric acid / 83% / 30 30 kg kg síran hořečnatý kryst. magnesium sulfate crystals. 9 9 . kg . kg těch. biotin /1 %/ those. biotin / 1% / 0, 15 0, 15 kg kg sojový olej soybean oil 30 30 kg kg voda ad30 water ad30 000 000 1 1 pH 6,9 pH 6.9 Po sterilizaci byla živná půda After sterilization, the broth was cultured v obou in both fermentorech inokulována kulturou fermentors inoculated with culture z očko- z očko- vacích tanků. Kultivace probíhala tanks. Cultivation took place při at tep- pulse- lot-ě 29 °C za míchání a vzdušnění 29 ° C with stirring and aeration způso bera způso bera

jak je blíže specifikováno v tabulkách č .as specified in Tables no.

a 2, při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo pH udržováno dávkováním čpavku z rozmezí hodnot 6,0-7,0 a podle potřeby bylo prováděno odpěňování sojovým olejem. Růst mikroorganismu probíhal v obou pokusech do 20 hod. kultivace.and 2, at a pressure of 198 kPa. During fermentation, the pH was maintained by adding ammonia from the range of 6.0-7.0, and soybean oil defoaming was performed as necessary. The growth of the microorganism was carried out in both experiments within 20 hours of cultivation.

Tabulka 4 Kontrolní fermentace.Table 4 Control fermentation.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle vynálezu, bylo konstantní vzdušnění /20 m^/min./ po celou dobu fermen táce. Během fermentace bylo aplikováno 5 příkrmů zředěného roztoku melasy o sacharizací 40 %, tak aby fermentační proces neprobíhal bez měřitelné koncentrace sacharozy v pudě.In tank A, where the fermentation process was not regulated according to the invention, there was constant aeration (20 m m / min) throughout the fermentation. During the fermentation, 5 feedstocks of a 40% dilute molasses solution were applied so that the fermentation process did not proceed without a measurable sucrose concentration in the soil.

V tanku B byl podle našeho vynálezu v hlavní produkční fází regulován metabolismus uhlíkového zdroje a uhlíkatých intermediátů a byl měněn režim vzdušnění podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech. Během fermentace byly provedeny 4 příkrmy roztoku melasy o sacharizaci 40 %, Příkrmy byly aplikovány tak, že celkem 17 hodin byly utílizovány uhlíkaté intermediáty.In tank B, according to our invention, the metabolism of the carbon source and carbon intermediates was regulated in the main production phase and the aeration regime was changed according to the CO2 concentration in the outgoing gases. During the fermentation, 4 feeds of a molasses solution with 40% saccharization were carried out. The feeds were applied so that the carbon intermediates were calibrated for a total of 17 hours.

Vyfermentováné půdy z obou fermentorů byly. zpracovány na technický preparát L-lysinu dehydratací.The fermented soils from both fermenters were. processed to technical preparation of L-lysine by dehydration.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem dle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách č. 4 a 5. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce čís. 6The values of the monitored values for the control fermentation and the fermentation according to the invention are given in Tables 4 and 5. The results obtained are summarized in Table no. 6

hod . kult . hours cult. s acharoza with acharoza příkrmy sachar . kg příkrmy sachar. kg C°₂ %C ° ₂ % vzdušněn í n?/min' aerated n / min ' před př íkr m. mg/ml before m. mg / ml po př íkrm. mg/ml after př íkrm. mg / ml 0 0 153,2 153.2 - - - - 0 0 20 20 May 1 6 1 6 146,2 146.2 - - - - 8,5 8.5 20 20 May 20 20 May 118,0 118.0 - - - - 10,0 10.0 20 20 May 24 24 100,3 100.3 - - - - 10,0 10.0 20 20 May 3 6 3 6 2tí , 7 2, 7 - - - - 9.7 9.7 20 20 May 42 42 10,2 10.2 22, 1 22, 1 400 400 9,5 9.5 20 20 May 46 46 0,8 0.8 12,0 12.0 400 400 9,3 9.3 20 20 May 49 49 0,2 0.2 11,8 11.8 400 400 9, 1 9, 1 20 20 May 54 54 0 0 11,2 11.2 400 400 7,5 7.5 20 20 May 60 60 0,2 0.2 10,8 10.8 400 400 8,0 8.0 20 20 May 65 65 0 0 - - - - 6,5 6.5 20 20 May

Tabu Taboo 1 k a 5 1 k and 5 Fermentace dle vynálezu Fermentation according to the invention hod . hours sacharóza příkrm sucrose baby food C0₂ C0 ₂ v zdusněn í suffocation kult. cult. před př íkrm mg/ml before feeding mg / ml po s ach ar . . příkrm. mg/ml kg po s ach ar. . side dish. mg / ml kg 7. 7. /min / min 0 0 15 2,8 15 2,8 - - 0 0 20 20 May 1 6 1 6 144,0 144.0 8 , 7 8, 7 20 20 May 20 20 May před korekcí vzdušnění ............ before air correction ............ ..... 10,2 ..... 10.2 20 20 May 20 20 May po korekci vzdušnění .............. after air correction .............. ..... 12,5 ..... 12.5 1 3 13 21 21 113,0 113.0 - - 12,4 12.4 13 13 3 0 3 0 75,4 75.4 12,4 12.4 i 3 i 3 3 6 3 6 31,2 31.2 - - 12,5 12.5 1 3 13 3 9 3 9 5 , 2 5, 2 - - 12,3 12.3 13 13 3 9,5 3 9,5 2,0 2,0 .. .. 12,0 12.0 13 13 4 0 4 0 0 0 - - 9,6 9.6 13 13 4 0,5 4 0,5 0 0 - - 6,0 6.0 1.3 1.3 4'» 4 '» 0 0 - - 1 , 9 1, 9 1 3 13 4 5 4 5 0 0 11,5 -0^ 11.5 -0 ^ 1 , 5 1, 5 1 3 13

pokračování tab, č. 5.continued tab, no. 5.

hod. ku 1f.. hrs to 1f .. sacharoza sucrose příkrmy s achar. kg baby food with achar. kg C0₂ %C0 ₂ % vzdušnění /min aeration / min před př íkrm. mg/ml before feeding. mg / ml PO₍ p ř íkrm. mg /mlPO ₍ eg mg / ml) 45,5 45.5 - - - - - - 11,0 11.0 10 10 46 46 - - - - - - 11,5 11.5 1 0 1 0 4 7 4 7 0 0 - - - - 9,0 9.0 10 10 50 50 0 0 - - - - 2,5 2.5 10 10 50,5 50.5 0 0 10,7 10.7 400 400 1 ,8 1, 8 1 0 1 0 51 51 - - - - - - 9,6 9.6 8 8 52,5 52.5 0 0 - - - - 8,5 8.5 8 8 53 53 0 0 - - - - 4,5 4,5 8 8 54 54 0 0 - - - - 2,8 2.8 8 8 55 55 0 0 10,3 10.3 400 400 2,0 2,0 8 8 56 56 - - - - 8,5 8.5 7 7 57 57 0 0 - - - - 7 ,5 7, 5 7 7 53 53 0 0 - - - - 2,5 2.5 7 7 59 59 0 0 9,6 9.6 400 400 1 , 6 1, 6 7 7 60 60 - - - - - - 7 ,0 7, 0 6 6 61 61 0 0 - - - - 5,0 5.0 6 6 62 62 0 0 - - - - 1 ,8 1, 8 6 6 63 63 0 0 - - - - 1 ,3 13 6 6 65 65 0 0 - - - - 0,5 0.5 6 6

T.a bulka 6 T.a bulka 6 Dosažené výsledky. Achieved results. A AND K erm. entace K erm. entace B (B)

doba kultivace /hod./ cultivation time / hour / 65 65 65 65 objem půdy /m3/ soil volume / m3 / 3 9 3 9 38 38 L-lysin /g/I/ L-lysine (g / l) 44,2 44.2 50,0 50.0 spotřebovaná sacharoza /kg/ sucrose consumed / kg / 7 115 7 115 671 5 671 5 výtěžek lysinu /kg/ Lysine yield / kg / 1723,8 1723.8 1900,0 1900.0 konverze /%/ conversion /%/ 24,2 24.2 28,3 28.3 spotřeba sacharozy na consumption of sucrose per 1 kg lysinu 1 kg of lysine 4,13 4.13 3 , 5: 3, 5:

technický preparát lysinu /kg/ obsah L-lysinu v techn. prep.technical preparation of lysine / kg / content of L-lysine in techn. prep.

/kg/šarže/ obsah L-lysinu v techn./ kg / batch / L-lysine content in techn.

pr e par, / % / výtěžek. L-lysinu na ferm. půdu /%/ hygroskopičnost konečnéhovapor, (%) yield. L-lysine on ferm. soil /% / hygroscopicity of the final

Claims

Process for the production of L-lysine by breeding mutant bacteria characterized by the fact that after the end of the growth phase, it can be mixed with:

nr fit.ok of air to the value at which the amount of carbon dioxide produced during the hiosynthesis over a period of time ranging from 5 to 25% by weight, preferably between 15 and 20% vol.

II compared to the amount produced per unit of time at the end of the growth phase, during which the utilization of the basic carbon source and the carbon intermediates is controlled during the main production phase so that each time 0.5 to 10% by weight, preferably 1 to 3% by weight , the base carbon source is discontinued until its value drops to zero, while the concentration of carbon dioxide in the outgoing gases decreases by 40-60% by volume, in the next stage carbon intermediates are utilized, after which the dosage of the base carbon source is restored when the concentration The CO2 in the waste gases is reduced to 30 to 15% by volume, preferably 25 to 20% by volume, based on the carbon dioxide concentration detected when the carbon source is utilized before the carbon source is reduced to zero, the last periodic carbon utilization of the intermediates is allowed to proceed until the concentration of carbon dioxide in the off-gases has dropped to 10 to 5% by volume from the previous maximum.