CS209684B1 - Způsob fermentační výroby L-lysinu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu fermentační výroby L-lysinu pomocí vyšlechtěných mutant bakterii, který ekonomizuje výrobní proces lysinu tím, že umožňuje ve velkoobjemovém výrobním zařízení dosáhnout vysokého stupně využití uhlíkatého substrátu pří biosyntéze lysinu a poskytuje vyfermentovanou půdu s vysokým obsahem L-lysinu takové kvality, že při izolací krystalického a zejména pak technického preparátu lysinu je dosahováno vysoké výtěžnosti a zlepšené kvality prepar átu.

Lysin je jednou z aminokyselin, jejíž biosyntetická výroba v průmyslovém měřítku je v současné době nejvíce zvládnuta.

Ve světě se nyní vyrábí několik desítek tisíc tun lysinu ve formě lysin-hydrochlorid-dihydrátu,anebo technického preparátu, který se získá usušením fermentované půdy.

Je známa celá řada postupů využívajících k biosyntetické přípravě L-lysinu různých vyšlechtěných mutant bakterií produkujících lysin při kultivací na uhlohydrátech či jiných uhlíkatých zdrojích, jak je popisují např. US pat. c. 2 979 439, US pat. č.

707 441, franc. pat. č. 1 533 688 a franc. pat. č. 2 033 199.

Ve všech postupech je vždy hlavní surovinou ve složení živné půdy uhlíkatý zdroj, takže jeho spotřeba výrazně ovlivňuje celkové náklady na vyráběný preparát lysinu. Celkové náklady jsou také silně závislé na výtěžku pří izolaci lysinu z fermentované půdy, který je ovlivňován složením fermentační kapaliny po ukončené biosyntéze. Za hlavní ekonomizační faktory při zvyšování efektivnosti biosyntézy L-lysinu je nutno proto považovat zvyšování stupně využití uhlíkatého zdroje, to znamená konverze, a zvyšování výtěžku při izolaci krystalického nebo technického preparátu L-lysinu.

Limity zvyšování konverze jsou dány předně fyziologií pródukčního kmene, ale jsou výrazně ovlivňovány též technickými a technologickými parametry. Výše výtěžků při izolaci lysinu z fermentované půdy je určena v prvé řadě vlastním izolačním postupem.

Z tohoto hlediska je nejvýhodnější izolační postup, při kterém je získáván technický preparát lysinu dehydratací vyfermentované půdy. Výtěžky při použití tohoto postupu jsou však silně ovlivňovány složením fermentační kapaliny po ukončení biosyntézy.

Proto pří fermentaci je nutno volit takový postup, který zajišťuje vyfermentovanou půdu takové kvality, aby se její dehydratací získal technický preparát L-lysinu nelepivý a nehygroskopický, ve vysokém výtěžku. Pří řešení problematiky ekonomizace biosyntetické výroby L-lysinu se proto hledalo komplexní řešení optimalizace fermentačního postupu s ohledem na oba výše uvedené aspekty.

Vycházelo se z těchto poznatků: hlavní produkční fáze fermentace, ťj.

po ukončení růstu produkčního mikroorganismu, se vyznačuje tím, že spotřeba kyslíku je výrazně nižší než při růstu mikroorganismu, jak uvádějí např. sovětští autoři Bekker Μ. E., a spol. v práci: Lisin-rpolučenije i prímeněnije v životnovodstve,

Nauka, Moskva 1 973 , nadbytek kyslíku v půdě v hlavní produkční fázi způsobuje, že dochází k neekonomickému prodýchávání uhlíkatého zdroje na C02, a tím k jeho nevratným ztrátám, mírná limitace biosyntetického procesu kyslíkem v hlavní produkční fázi je z hlediska rychlosti biosyntézy lysinu příznivá, ale je při ní rovněž dosahováno nižší konverze a dochází při ní k rychlejšímu zastavení biosyntetického procesu, silná limitace biosyntetického procesu kyslíkem, obzvláště ve spojení s mechanickým namáháním buněk způsobeným intenzívním mícháním, tj. shear-efektem, vede k předčasnému ukončení biosyntézy lysinu v důsledku «silné destrukce biomasy.

Z uvedeného vyplývá, že vysokého stupně konverze lze dosáhnout pří optimálním zásobení buněk kyslíkem. To je však v praxi velmi obtížné zabezpečit, zejména proto, že dynamika metabolismu, a tím i potřeba kyslíku, se v závislosti na stáří buněk mění.

Nyní bylo zjištěno, že nízký výtěžek lysinu z C-zdroje při vedení procesu za nedostatku kyslíku je způsoben tím, že za těchto podmínek dochází k dísbalanci mezí spotřebou uhlíkového zdroje a tvorbou lysinu, což se projevuje hromaděním uhlíkatých intermediátů ve fermentované půdě. Zjistilo se též, že horší zpracovatelnost vyfermentované půdy na krystalický lysin a především na technický preparát lysinu je způsobena právě uhlíkatými intermediáty nahromaděnými ve fermentované půdě v průběhu biosyntézy.

Při dehydrataci vyfermentované půdy za zvýšené teploty reagují totiž intermediáty s L-lysinem a ztěžují tak průběh sušení a snižují celkový výtěžek lysinu. Dochází při tom k nalepování produktu na sušicí zařízení. Kvalita technického preparátu je zhoršena v důsledku jeho lepivosti a hygroskop ično s t í.

Na základě těchto poznatků se podařilo vyřešit optimální režim řízení biosyntézy, při kterém je v hlavní produkční fázi fermentace biosyntetický proces záměrně limitován kyslíkem za účelem dosažení vysoké produkční rychlosti a zároveň jsou odstraněny negativní důsledky této limitace, způsobené hromaděním uhlíkatých intermediátů v půdě. Dociluje se toho tím, že v hlavní produkční fázi je metabolismus uhlíkatého zdroje aktivně regulován tak, aby disbalance mezi spotřebou C-zdroje a tvorbou L-lysinu byla periodicky korigována, to znamená, aby docházelo k periodické utílizaci intermediátů produkčním mikroorganismem a k jejich využití pro tvorbu L-lysinu.

Tím se dosáhne vysoké konverze C-zdroje na lysin, a to i v podmínkách velkoobjemových fermentorů, zvýšení celkového výtěžku lysinu udržením vysoké produkční rychlosti až do konce fermentace, výrazného zlepšení vlastností fermentované půdy z hlediska zpracovatelnosti při přípravě pevného produktu L-lysinu a úspor na spotřebě tlakovéhovzduchu.

Postup podle vynálezu spočívá v tom, že po ukončení růstové fáze se režim vzdušnění změní tak, aby biosyntéza probíhala pří mírné limitaci kyslíkem. Vhodné vzdušnění se. nastaví podle materiálové bilance CO2 v odcházejících plynech snížením průtoku vzduchu na hodnotu, pří které kvantita CO2 vznikajícího při biosyntéze za časovou jednotku poklesne o 5-25 %, s výhodou o 15-20 procent oproti množství CO2, které bylo produkováno za časovou jednotku na konci růstové fáze.

V průběhu hlavní produkční fáze fermentace se utilízace základního C-zdroje a utilizace uhlíkatých intermediátů periodicky reguluje tak, že vždy po spotřebování 0,5-10, s výhodou 1-3 hmotnostních procent základního C-zdroje vzhledem k objemu půdy,

e. přeruší dávkování C-zdroje. Koncentrace základního C-zdroje ve fermentované půdě se ponechá klesnout na nulovou hodnotu, což je doprovázeno prudkým poklesem koncentrace CO2 v odcházejících plynech, a sice o 40-60 procent.

V následující fázi fermentace jsou utilizovány uhlíkaté intermediáty nahromaděné v půdě, koncentrace CO2 při tom dále pozvolna klesá v závislosti na snižování koncentrace intermediátu v půdě. Obnovení dávkování základního C-zdroje se provede tehdy, když koncentrace CO2 v odcházejících plynech poklesne na 30-15 %, s výhodou na 25-20 2 vztaženo ke koncentraci CO2 naměřené při utílizaci C-zdroje před poklesem jeho koncentrace na nulovou hodnotu. Poslední perioda utilízace uhlíkatých intermediátů se prodlouží tak, aby koncentrace CO2 v odcházejících plynech poklesla až na 10-5 2 předchozího maxima.

Tím se zajistí, že zbytková koncentrace uhlíkatých intermediátů, která negativně ovlivňuje zpracování vyfermentované půdy dehydratací na technický preparát lysinu i přípravu krystalického lysinu, se maximálně sniž í.

Vhodná limitace kyslíkem se v průběhu hlavní produkční fáze během časových úseků utilízace základního C-zdroje zajíštuje korigováním vzdušnění. Vzdušnění se postupně snižuje tak, aby původní hodnota koncentrace CO2, která byla nastavena na začátku hlavní produkční fáze, byla v první třetině hlavní produkční fáze konstantní a pak postupně klesala až na 70-50 % hodnoty CO2 na začátku hlavní produkční fáze.

Následující příklady blíže objasňují způsob biosyntézy L-lysínu podle vynálezu, aniž jej omezují pouze na uvedená provedení. V příkladech pod bodem A uvádíme kontrolní fermentace, při kterých nebyl využíván postup podle vynálezu.

Příklady provedení

Příklad 1

Kulturou kmene Brevíbacterium flavum CB byla inokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.

Složení ínokulační půdy:

sacharóza		1 10	kg
melasa /50% šach./		60	kg
corn-steep JbG7,J		90	kg
těch. biotin /1 % /		15	g
thiamin		0,6	g
s0jový olej		6	kg
voda	ad 3	000	1
pH 6,9
Kultivace inokula	probíhala při	29 1	3C po
dobu 20 hodin za stál	ého míchání a	vzd'	usnění
Do 2 fermentorů 0	obsahu 50 m 3	byla	při-

pravena živná půda tohoto složení:

sacharóza	4	300	kg
melasa /50% šach./		540	kg
hydrolysát araš. mouky
/5,4 g NH2-N/1/	7	200	1
corn-steep /60%/		300	kg
kys. fosforečná /83%/		30	kg
síran horečnatý kryst.		9	kg
těch. biotin / 1 % /		0,15	kg
thiamin	0	,006	kg
sój ový olej		30	kg
voda ad	30	000	1

pH 6,9

Po sterilizaci byla živná půda v obou fermentorech inokulována kulturou z očkovacích tanků. Kultivace probíhala při 29 °C za míchání a vzdušnění způsobem, jak je blíže specifikován v tabulkách č. 1 a 2, při tlaku 198 kPa. Růst mikroorganismu probíhal v obou pokusech do 20. hod. kultivace. Během fermentace bylo pH udržováno dávkováním čpavku v rozmezí hodnot 6,0-7,0 a podle potřeby bylo prováděno odpěňování sojovým olejem.

V tanku A, kde nebyl fermentaení proces regulován podle postupu vynálezu, bylo konstantní vzdušnění /20 m^/mín./ po celou dobu fermentace. Přídavky sacharózy do fermentované kapaliny byly aplikovány běžně používaným způsobem tak, aby koncentrace sacharózy v půdě neklesla před koncem fermentace na nulu. Celkem bylo provedeno 5 příkrmů a 1000 litrů 70%ního roztoku sacharózy .

V tanku B byl podle našeho vynálezu

Tabulka 1 Kontrolní fermentace v hlavní, produkční fází regulován metabolismus sacharózy a uhlíkatých intermedíátů a byl měněn režim vzdušnění podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech. Bylo provedeno 5 příkrmů 70%ního roztoku sacharózy a sice 3x a 1000 1 a 2x á 500 1. Příkrmy byly aplikovány tak, že celkem 14,75 hod. byly utilízovány íntermediáty.

Vyfermentovaná půdy z obou fermentorů byly zpracovaný na technický preparát L-lysínu dehydratací.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem dle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách č. 1 a 2. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce č. 3

hod . kult.	sacharóza	př íkrm sachar. kg	co2 7,	vzdušnění /min.
před příkrm. mg/ml	po příkrm, mg/ml
0	136,8	-		0	20
24	41,0	60,3	7 00	1 2	20
30	35,2	55,0	700	1 2	20
38	2 7,3	46,0	700	1 2	20
45	18,2	35,3	7 00	1 1	20
54	8,0	25,0	700	10	20
65	0	-	-	8	20

Tabulka 2 Fermentace podle vynálezu
hod . kult.	sacharóza	příkrm sachar . kg	002 7a	vzdušnění 111^ / min .
před příkrm. mg /m 1	po příkrm. mg/ml
0	137,3	-		0	20
20	.... před	korekcí vzdušnění ..........	..... 12	20
20	.... po korekci vzdušnění ............	...... 14,6	13
24	4 2,3	61,7	7 00	14,7	1 3
30	32,0	51 ,0	700	14,5	13
3 6	23,3	-	-	14,6	13
3 9,5	3,0	-	-	14,2	13
40	0	-	-	11,1	13
40,5	0	-	-	8,0	1 3
41	0	-	-	7 , 1	13
4 2	0	-	-	6, 2	13
43	0	-	-	5,5	1 3
44	0	-	-	4,6	13
4 5	0	18,3.	7 00	2,9	13
4 5,5		-	-	13,5	11
4 6	-	-	-	14	1 1
50	0	-	-	I 3 , 3	1 1
5 0,5	0	-	-	6,5	1 1
5 1	0			4, 9	1 1

Z pokračování tab. č. 2.

hod . kult.	sacharoza	příkrm sachar . kg	C°2 %	vzdušnění /min.
před př íkr m. mg/ml	PO příkrm. mg/ml
52	0	-	-	3.8	11
52,5	0	-	1	3,4	1 1
53	0	10,0	350	2,8	1 1
53,5	-	-	-	6,5	8
54	-	-	-	1 1	8
55	-	-	-	1 1	8
55,5	0	-	-	10	8
5 6	0	-	-	4	8
57	0	-	-	3,2	8
58	0	9,2	350	2,0	8
59	-	-	-	7,5	6
60	-	-	-	7,5	6
¢0,75	0	-	-	4,5	6
62	0-	-	-	2,5	6
63	0	-	-	2,0	6
64	0	-		1,7	6
65	0	-	-	•0,7	6

Tabulka 3 Dosažené výsledky.

Fermentace

A

B

doba kultivace /hod./	65	65
objem půdy /m^/	39	38
L-lysin /g/1/	4 6,9	59,7
výtěžek lysinu /kg/	1829,1	2 2 68,6
spotřebovaná sacharoza /kg/	8210	7510
konverze /%/	22,3	30,21
spotřeba sacharózy na
1 kg lysinu	4,49	3,31
technický preparát lysinu /kg/	6378,8	67 90,4
obsah L-lysinu v těch. prepar.
/kg/šarže/	1505,4	1 98 2,8
obsah L-lysinu v těch. prepar.
/z/	23,6	29,2
výtěžek L-lysinu na ferm, půdu
/Z/	82,3	8? ,4

hygroskopičnost konečného produktu pří 65% relat. vlhkosti a teplotě 25 °C /přírůstek váhy v %/24 hod./ 10,2 0

Příklad 2

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum AEC/100 byla ínokulována živná půda ve 2 očkovacích tancích.

Složení inokulační půdy:

sacharoza 90 kg corn.steep IbQll 90 kg hydrolyzát araš. mouky /5,4 g NH2-N/1/ 240 1 těch. biotín /1%/ 15 g sojový olej 6 kg voda ad 3000 1 pH 6,85

Kultivace inokula probíhala při 29 °C po dobu 26 hodin za stálého míchání a vzdušnění.

Do 2 fermentorů 0 objemu 50 m^	byl.	a při
pravena půda tohoto složení:
sacharó za	5000	kg
melasa /50% šach./	250	kg
hydrolyzát aras. mouky
/5,4 g NH2-N/1/	6500	1
corn-steep /60%/	300	kg
kys. fosforečná /83%/	30	kg
síran hořečnatý kryst.	9	. kg
těch. biotin /1 %/	0, 15	kg
sojový olej	30	kg
voda ad30	000	1
pH 6,9
Po sterilizaci byla živná půda	v obou
fermentorech inokulována kulturou	z očko-
vacích tanků. Kultivace probíhala	při	tep-
lot-ě 29 °C za míchání a vzdušnění	způso bera

jak je blíže specifikováno v tabulkách č .

a 2, při tlaku 198 kPa. Během fermentace bylo pH udržováno dávkováním čpavku z rozmezí hodnot 6,0-7,0 a podle potřeby bylo prováděno odpěňování sojovým olejem. Růst mikroorganismu probíhal v obou pokusech do 20 hod. kultivace.

Tabulka 4 Kontrolní fermentace.

V tanku A, kde nebyl fermentační proces regulován podle vynálezu, bylo konstantní vzdušnění /20 m^/min./ po celou dobu fermen táce. Během fermentace bylo aplikováno 5 příkrmů zředěného roztoku melasy o sacharizací 40 %, tak aby fermentační proces neprobíhal bez měřitelné koncentrace sacharozy v pudě.

V tanku B byl podle našeho vynálezu v hlavní produkční fází regulován metabolismus uhlíkového zdroje a uhlíkatých intermediátů a byl měněn režim vzdušnění podle koncentrace CO2 v odcházejících plynech. Během fermentace byly provedeny 4 příkrmy roztoku melasy o sacharizaci 40 %, Příkrmy byly aplikovány tak, že celkem 17 hodin byly utílizovány uhlíkaté intermediáty.

Vyfermentováné půdy z obou fermentorů byly. zpracovány na technický preparát L-lysinu dehydratací.

Hodnoty sledovaných veličin u kontrolní fermentace a fermentace postupem dle vynálezu jsou uvedeny v tabulkách č. 4 a 5. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce čís. 6

hod . kult .	s acharoza	příkrmy sachar . kg	C°2 %	vzdušněn í n?/min'
před př íkr m. mg/ml	po př íkrm. mg/ml
0	153,2	-	-	0	20
1 6	146,2	-	-	8,5	20
20	118,0	-	-	10,0	20
24	100,3	-	-	10,0	20
3 6	2tí , 7	-	-	9.7	20
42	10,2	22, 1	400	9,5	20
46	0,8	12,0	400	9,3	20
49	0,2	11,8	400	9, 1	20
54	0	11,2	400	7,5	20
60	0,2	10,8	400	8,0	20
65	0	-	-	6,5	20

Tabu	1 k a 5	Fermentace dle vynálezu
hod .	sacharóza příkrm	C02	v zdusněn í
kult.	před př íkrm mg/ml	po s ach ar . . příkrm. mg/ml kg	7.	/min
0	15 2,8	-	0	20
1 6	144,0		8 , 7	20
20		před korekcí vzdušnění ............	..... 10,2	20
20		po korekci vzdušnění ..............	..... 12,5	1 3
21	113,0	-	12,4	13
3 0	75,4		12,4	i 3
3 6	31,2	-	12,5	1 3
3 9	5 , 2	-	12,3	13
3 9,5	2,0	..	12,0	13
4 0	0	-	9,6	13
4 0,5	0	-	6,0	1.3
4'»	0	-	1 , 9	1 3
4 5	0	11,5 -0^	1 , 5	1 3

pokračování tab, č. 5.

hod. ku 1f..	sacharoza	příkrmy s achar. kg	C02 %	vzdušnění /min
před př íkrm. mg/ml	PO( p ř íkrm. mg /ml
45,5	-	-	-	11,0	10
46	-	-	-	11,5	1 0
4 7	0	-	-	9,0	10
50	0	-	-	2,5	10
50,5	0	10,7	400	1 ,8	1 0
51	-	-	-	9,6	8
52,5	0	-	-	8,5	8
53	0	-	-	4,5	8
54	0	-	-	2,8	8
55	0	10,3	400	2,0	8
56		-	-	8,5	7
57	0	-	-	7 ,5	7
53	0	-	-	2,5	7
59	0	9,6	400	1 , 6	7
60	-	-	-	7 ,0	6
61	0	-	-	5,0	6
62	0	-	-	1 ,8	6
63	0	-	-	1 ,3	6
65	0	-	-	0,5	6

T.a bulka 6	Dosažené výsledky.
		A	K erm. entace	B

doba kultivace /hod./	65	65
objem půdy /m3/	3 9	38
L-lysin /g/I/	44,2	50,0
spotřebovaná sacharoza /kg/	7 115	671 5
výtěžek lysinu /kg/	1723,8	1900,0
konverze /%/	24,2	28,3
spotřeba sacharozy na
1 kg lysinu	4,13	3 , 5:

technický preparát lysinu /kg/ obsah L-lysinu v techn. prep.

/kg/šarže/ obsah L-lysinu v techn.

pr e par, / % / výtěžek. L-lysinu na ferm. půdu /%/ hygroskopičnost konečného

Claims (1)

1. Způsob f erine n t ační výroby L-lysinu pomocí vyšlechtěných mutant bakterií vyznácuiící se tím, že po ukončení růstové fáze mi k r .) o z ga n i smu s e s n ?.:

   nr fit.ok vzduchu na hodnotu, pří které množství kysličníku uhlí čitého, vznikajícího při hiosyntéze, za čas o v o u j e d n o t k u p o k 1 e s n e o 5 až 2 5 % o b j e. m o vvc.h, s vvhodou o 15 a.ž 20 % objemových

   II oproti množství, produkovanému za časovou jednotku na konci růstové fáze, načež se v průběhu hlavní produkční fáze reguluje utilizace základního uhlíkatého zdroje a uhlíkatých intermediátů tak, že se vždy po spotřebování 0,5 až 10 % hmotnostních, s výhodou 1 až 3 X hmotnostních, základního uhlíkatého zdroje jeho dávkování přeruší, až jeho hodnota klesne na nulovou hodnotu za současného poklesu koncentrace kysličníku uhličitého v odcházejících plynech o 40 až 60 % objemových, v následující fázi se nechají utilizovat uhlíkaté intermediáty, načež se dávkování základního uhlíkatého zdroje obnoví, když koncentrace CO2 v odpadních plynech poklesnfe na 30 až 15 % objemových, s výhodou 25 až 20 Z objemovýcl vztaženo na koncentraci kysličníku uhličitého, zjištěnou při utilízací uhlíkatého zdroje před poklesem jeho koncentrace na nulovou hodnotu, přičemž poslední periodická utilizace uhlíkatých intermediátů se nechá probíhat tak dlouho, dokud koncentrace kysličníku uhličitého v odcházejícícl plynech neklesne na 10 až 5 % objemových oproti předcházejícímu maximu.