KR910000464B1 - 고농도배양에 의한 단세포단백질의 제조방법 - Google Patents

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Description

고농도배양에 의한 단세포단백질의 제조방법

제1도는 균체의 성장속도가 조단백함량 및 핵산함량에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.

제2도는 본 발명에 있어서 첨가배지의 공급속도를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

본 발명은 고농도배양에 의한 단세포단백질의 제조방법에 관한 것으로서, 특히 단세포단백질을 생산하는 효모를 이용하여 단세포단백질을 제조함에 있어서, 단세포단백질의 성장속도에 따라 영양배지의 공급속도를 조절해주는 연가식 발효공정을 이용하여 고농도의 단세포단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 단세포단백질은 세계적인 식량문제를 해결하기 위한 대체식량의 일종으로서, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 단세포단백질을 산업적으로 생산하기 위해서는 탄화수소류, 알코올류등의 석유화합물이나 펄프패액등의 부산물을 탄소원으로 사용하고, 여기에 다른 필요한 영양소를 첨가한 후, 이를 이용하여 박테리아, 효모등의 미생물을 성장시키게되는 바, 이렇게 하여 생산되는 미생물은 50% 내외의 조단백함량(Kjeldahl 법에 의해 % 로 표시)을 차지하고 있어서 사료용 또는 식품첨가물등의 식용으로 유용하게 사용되고 있다.

종래의 단세포단백질을 생산하는 방법으로서는 회분식, 연속식, 연가식 등의 방법이 알려져 있는데, 이들 방법을 서로 비교해볼 때 회분식 배양 방법은 연속식에 비하여 생산성이 낮다. 그리고 연속식 배양방법은 배양시간이 길기 때문에 균체가 오염될 가능성이 높고, 설비투자비가 고액인 단점이 있어서, 산업적으로 이용하기가 어렵다.

그에 비해 연가식 배양방법은 회분식 배양 방법에 비해 생산성을 높일 수가 있고, 연속식에 비해 쉽게 산업화 시킬 수 있는 장점이 있어서 최근에는 이에 대한 연구 및 산업화시도가 많이 이루어지고 있다.

본 발명에 따른 연가식 배양방법은 균체를 배양시키는 동안 영양배지를 연속적으로 누적 첨가시켜주는 방법으로서, 종래에는 영양배지의 첨가량을 임의로 조절하거나 발효물내 잔존 영양소의 량, 또는 pH 등에 따라 조절하였는바, 이러한 종래의 방법에서는 미생물 성장의 상태를 인식하거나 조절하기가 어렵고, 세포농도, 즉 발효액의 용적당 분리된 미생물의 건조중량(g/l)이 낮으며, 단세포단백질의 핵산함량이 높아서 그 핵산을 파괴시키기 위한 후처리공정이 필요한 등의 문제점이 있었다.

한편, 미생물의 균체자체를 최종생산물로 하는 발효공정에 있어서 균체함량을 증대시킬수록 유리하지만 발효조에서 미생물을 배양시킬 때 미생물의 균체를 최대한으로 증가시키는데는 일정한계가 있다.

즉, 이론적으로 일정함량 (70-80%)이상의 수분을 함유하고 있는 미생물의 균체로만 발효조를 채울경우에 미생물의 종류에 따라 차이는 있지만, 대략 240-280g/l를 최대한계로 보고 있다.

그러나 실제로 미생물을 배양시키는데는 영양소가 적절히 공급되어야 하고 또한 어느정도의 균체량이 되면 물질전달이 불가능하며 생육이 정지상태가 되기 때문에 결국 배양가능한 농도는 그 이하가 된다.

따라서 최근에는 발효공정에 있어 생산성을 증대시키는 방법중의 하나로 고농도 배양기술이 연구되고 있는바, 고농도 배양기술은 일정농도의 균체가 생육을 계속할 수 있도록 배양조건을 최적화시키면서 최대의 균체를 얻는 방법이다.

이에 본 발명에서는 고농도 배양기술을 응용한 연가식 배양방법을 이용함에 있어 탄소원을 제한인자로 하고 발효몰당 일정농도 이상에서도 세포의 생리적 활성도가 저해받지 않도록 온도, pH, 교반속도 등을 일정하게 유지 해주고 용존산소량이 제한받지 않도록 하면서 배양조건을 적절하게 조절하였으며, 특히, 영양배지의 첨가량을 단세포단백질의 성장속도에 따라 인위적으로 조절해주므로써, 세포농도가 높으면서도 핵산의 함량이 낮아서 간단한 후처리공정으로 단세포단백질의 생산성을 극대화시킬 수 있는 단백질의 개선된 제조방법을 제공하는데 그 목적이있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 단세포를 생산하는 효모를 이용하여 연가식 발효방법으로 단세포단백질을 제조함에있어서, 균체의 성장속도에 따라 배지의 첨가속도를 조절하므로서 단세포단백질의 세포농도가 발효물 1ℓ당 140 내지 200g까지 생산되도록 하는 것을 특징으로 하는 단세포단백질의 제조방법인 것이다.

본 발명에서, 균체의 성장속도는 발효조내의 조단백함량이 50% 이상이면서 핵산함량은 6% 이하로 되도록 조절한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

연가식 배양방법에 있어서, 영양배지의 첨가방식은 여러 가지가 있지만 본 발명에서는 단세포단백질의 성장속도에 따라 영양배지의 첨가량을 조절하였다.

단세포단백질의 생산은 그 성장속도에 의해 균체의 생리적 활성도가 크게 영향을 받아 높은데, 대체로 높은 성장속도에서는 낮은 수득율(발효물에 공급되는 탄소원, 즉 기질의 주어진 공급중량에 대하여 생성되는 세포의 량을 g수로 나타낸 것), 낮은 조단백함량 및 높은 핵산의 함량을 보이는 반면에, 낮은 성장속도에서는 높은 조단백함량 및 낮은 핵산함량의 단세포단백질이 얻어진다.

여기에서 10% 이상의 높은 핵산함량은 단세포단백질의 질을 저하시키므로 후처리공정에서 핵산파괴공정을 요구하게 되는바, 그러므로 단세포단백질이 배양후, 생산물의 핵산함량이 낮을수록 바람직한 것이다.

또한, 세포농도, 즉 발효액의 용적당 분리된 미생물의 건조 상태의 중량(g/l)은 높을수록 유리하지만 한계가 있어서, 이론적으로는 약 240 내지 280g/l의 세포농도가 가능하고, 실제로 종래의 배양방법으로는 약 70 내지 80g/l까지의 세포농도로 단세포단백질을 생산할 수 있었으나, 본 발명은 세포농도가 140 내지 200g까지의 단세포단백질을 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 근본적으로 연가식 배양방법을 이용해서 고농도배양에 의한 단세포단백질을 제조할 때 배양초기에서 배양후기로 가명서 균체의 성장속도를 점차 더 낮은 속도로 달리하여 주는 것을 특징으로 하는 것인바, 그 성장속도를 28시간 기준으로 할 때 배양초기(0-14hr)에는 약0.35-0.20hr^-1로, 배양중기(14-20hr)에는 약 0.20-0.07hr^-1로, 그리고 배양말기(20-28hr)에는 약 0.07-0.03hr^-1의 성장속도로 연가식 배양을 행하면 가장 바람직하다. 여기서는 성장속도는 다소 변경될 수도 있다.

이러한, 본 발명의 연가식 배양을 하나의 예로서 나타내보면, 0-4hr 에는 0.30hr^-1, 14-16hr에는 0.15hr^-1, 16-18hr에는 0.10hr^-1, 18-20hr에는 0.07hr^-1, 20-28hr에는 0.05hr^-1로 성장 속도를 조절해 나가면 되며, 이러한 성장속도는 실시예의 표 1에 기재된 바와 같이 영양배지의 첨가속도를 조절하면서 성장속도가 조절되도록한다. 이때 영양배지 첨가속도는 배양조건, 배양 시간 등에 따라 달라질 수가 있다.

또한, 위와 같은 성장속도를 조절하기 위해 첨가속도의 프로그래밍은 첨부도면 제2도에서와 같이 컴퓨터를 이용하여 펌프의 속도를 조절할 수 있는바, 일반적으로 알려진 바와같이 단계적으로 속도를 변화시키는 방법이 있기는 하지만 보다 더욱 정밀한 속도조절을 위해서는 연속적으로 첨가하는 것이 바람직하므로 본 발명에서는 컴퓨터를 이용하였으며, 후술하는 실시예에서는 계단식 및 연속식을 병행하였다.

첨부한 도면 제1도는 칸디다유틸리스에 있어서 균체성장 속도가 세포농도 및 조단백함량등에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, 균체성장속도에 대한 효과를 알아보기 위해 성장속도를 달리함으로써 조단백함량 및 핵산의 함량을 측정한 것이다.

상기 제1도에 따르면 성장속도가 0.1hr^-1이하에서는 조단백함량이 55% 이상, 핵산의 함량이 8% 이하의 값을 나타낸다.

따라서, 본 발명에서는 연가식 배양방법에 있어서 균체의 성장속도에 따라 영양배지의 첨가량을 조절하되 배양초기에는 높은 성장속도를 유지하여 배양시간을 단축시키고 배양후기로 갈수록 성장속도를 점차 낮추므로서, 조단백함량이 급속히 저하되는 것을 방지함과 동시에 핵산의 함량이 감소될 수 있도록 한 것이다.

본 발명에 따르면 발효물 1ℓ당 140g 이상의 고형분과 함께 50% 이상의 조단백함량, 6% 이하의 핵산을 함유하는 단세포단백질을 안정되게 얻을 수 있다.

단세포단백질 생산에 있어서 최종 생산물의 조단백함량이 50% 부근에서 불안정한 양상을 나타내며 핵산의 함량이 높아지면 제품의 질이 낮아져서 또다른 후처리공정이 필요하게 된다.

그러므로, 세포성장속도에 따른 미생물의 생리적 조성변화 성질을 이용하여 세포성장 속도를 인위적으로 조절함으로써, 조단백함량을 50% 이상, 핵산함량을 6%이하로 조절하여 특별한 후처리 공정 없이도 단세포단백질의 품질을 높일 수 있게 되는 것이다.

또한, 본 발명에 의해 얻어지는 고도의 세포농도는 단세포단백질이 농축된 상태로 생산되기 때문에 원심분리와 같은 공정을 거의 사용할 필요가 없다.

일반적인 원심분리등의 장치를 사용하면 20% 정도의 고형분을 얻을 수 있는데 비해 고농도 배양에 의해 고도의 세포농도를 유지하면 이 공정을 생략할 수 있어서 바로 분무건조기 등의 건조장치로 보낼 수 있고, 필요하다면 배양액 전체를 건조하여 폐수를 거의 없앨 수 있다.

한편, 본 발명에 사용할 수 있는 효모종으로서는 칸디다(Candida), 한세눌 라 (Hansenula), 토루롭시스(Torulopsis), 사카로미세스(Saccharomyces) 피치아 (Pic hia)등이 있고, 기질로서는 수용성 화합물인 탄소-산소-수소로 된 화합물을 할 수 있다.

이때 탄소원의 기질로서 대체로 수용성 탄수화물, 알코올, 케톤, 에스테르, 산, 알데히드 및 이들의 혼합물을 사용하되 이중에서 1분자당 1-20개의 탄소원자를 가진 것으로서 수용성이 큰 것들이 좋다.

이러한 수용성탄수화물의 예로는 글룩토오스, 프룩토오스, 슈크로스등이 있고, 알코올로는 메탄올, 에탄올 등이 있다.

상술한 바와 같이 본 발명은 균체의 배양시 첨가배지의 량을 세포생육상태에 맞게 조절하여 성장속도를 일정비율로 유지시켜줌으로써, 원하는 단백질의 량을 증대시키고 부산물의 생성을 억제하는 한편, 배양시간을 단축하여 생산성을 증대시킨다.

이하 본 발명에 대한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

칸디다유틸리스 효모를 이용하여 연가식 발효공정 조건하에서 단세포단백질을 생산하되 5ℓ의 용량을 갖는 발효조에 총 3ℓ의 액체용적을 가지도록 하고, pH, 온도 및 기포수준을 자동적으로 조절할 수 있도록 된 발효조를 사용한다.

교반조건은 회전속도가 300-1500rpm의 범위로 하여 세 개의 임펠러가 달린 교반기를 사용한다.

그리고 통기속도는 1분당 발효조내에 있는 액체용적당 공기의 0.5-3용적으로 조절하는 것이 좋다.

pH를 4정도로 유지하기 위하여 암모니아수와 염산을 자동적으로 첨가, 조절될 수 있도록 한다. 이때의 암모니아수는 효모성장을 위한 질소원으로도 사용된다.

연가식 배양에 있어서 초기에는 총 발효액의 반인 1.5ℓ를 우선 3 내지 6시간 동안 회분식 배양시키는데 용액 1ℓ에대하여 50%의 글루코스를 함유한 포도당액 120g, 옥수수침지물 40g, 요소 8g, 소금 0.1g, 황산철 15mg, 황산망간 2mg, 황산동 2mg 및 소포제 0.2g을 첨가하고 증류수를 가한다. 멸균후 초기 pH는 4.0으로 한다.

그리고 첨가되는 영양배지의 양은 총 1.5ℓ로써 글루코스 870g에 해당하는 포도당액과 함께 옥수수침지액 350g, 요소 60g, 소금 0.8, 황산철 0.15g, 황산망간 12mg, 황산구리 3mg, 소포제 0.2g을 첨가하고 증류수를 가하여 제조, 공급한다.

첨가되는 영양배지의 공급방법은 성장속도가 0.25hr^-1에서 0.05hr^-1까지 점차로 감소될 수있도록 일곱단계로 단계별로 나누어서 정량펌프에 의해 첨가한다.

첨가속도는 다음 표 1과 같다.

[표 1]

발효조건은 온도 30℃와 pH를 3.5-4.0으로 자동조절하며 대기압정도의 압력에서 실시한다.

원심분리에 의해 발효액으로부터 효모세포를 분리하고 수중에 현탁한 후 다시 원심분리시키는 방법으로 2-3회 세척한 후 60℃의 진공건조기에서 48시간 건조시켜 중량을 단다.

제조된 효모세포의 수득율은 글루코스 공급물 100g당 45.8g이었고, 세포농도는 발효액 1ℓ당 146.6g, 그리고 조단백함량은 53.3%(W/W)를 가진 것이었다.

[실시예 2]

실시예 1에서와 같이 발효조내에서 연가식 발효공정을 실시하는데 이 경우에 있어서는 발효액내 용존산소의 함량을 20%로 유지할 수 있도록 산소가 섞인 충분한 공기를 공급하여 준다.

이때 회전속도의 범위는 600-1500rpm이고, 통기속도의 범위는 1분당 발효조내에 있는 액체용적당 공기의 0.5-3 용적으로 조절하였다.

효모세포를 분리한 후 효모세포의 수득율은 글루코스 공급물 100g당 48.6g이었고, 세포농도는 발효액 1ℓ당 155.7g, 그리고 조단백함량은 52.0%(W/W)를 나타내었다.

[실시예 3]

실시예 2에서와 같이 칸디다유틸리스 효모를 연가식 발효공정 조건하에서 배양을 실시하는데 배지조성 등은 실시예 1과 같으나 첨가기질의 공급방법에 있어서 공급속도를 다르게 한다.

균체의 성장속도를 보다 정확하게 인위적으로 조절하기 위하여 균체의 성장속도가 점차 감소할 수있도록 첨가배지의 공급속도를 결정하는데 계단식이 아닌 연속식으로 제2도와 같이 첨가한다.

연속적인 방법은 1-5분마다 정량펌프의 속도를 정해진 수치로 조절하거나 프로그램이 가능한 정량펌프에 의하여 첨가기질을 공급한다.

배양후 분리된 효모의 세포농도는 발효물 1ℓ당 194.3g이며, 수득율은 탄소원기질 100g당 60.7g을 나타낸다. 또한 최종 조단백함량은 50.2%이며 핵산함량은 5.0%이다.

[실시예 4]

칸디다 유틸리스 SH 8636 효모를 450ℓ 발효조내에서 총 300ℓ의 액체용적을 가지도록 하고 교반속도는 500rpm, 통기속도의 범위는 1분당 발효조내에 있는 액체용적당 공기의 0.5-1용적으로 조절하고 pH 는 4를 유지하도록 자동조절한다.

배지의 조성은 실시예 1과 동일하게 하고 첨가기질의 공급속도는 실시예 4와 연속적인 방법으로 한다. 분리된 세포농도는 발효물 1ℓ당 160.8g이며, 수득율은 탄소원기질 100g당 50.2g이었으며 조단백함량은 52.7%이었다.

Claims (1)

1. 단세포단백질을 생산하는 효모를 이용하여 연가식 발효방법으로 고농도배양에 의해 단세포단백질을 제조함에 있어서, 연가식 발효배양시 배양초기에서 배양후기로 가면서 균체의 성장속도를 점차 낮게 되도록 유지하되 그 성장속도를 배양초기(0-14hr)에는 0.35-0.20hr^-1로, 배양중기(14-20hr)에는 0.20-0.07hr^-1로, 배양후기 (20-28hr)에는 0.07-0.03hr^-1로 점차 감소시키는 것을 특징으로 하는 고농도 배양에 의한 단세포단백질의 제조방법.

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