FI104836B - Menetelmä aminohappojen valmistamiseksi fermentoimalla - Google Patents

Description

104836

Menetelmä aminohappojen valmistamiseksi fermentoimalla

Keksintö koskee parannettua menetelmää aminohappojen, kuten esimerkiksi L-lysiinin tai L-treoniinin valmis-i 5 tamiseksi fermentoimalla. L-lysiini on välttämätön amino happo, ja sitä käytetään paljon eläinten rehujen täydentäjänä.

Monia aminohappoja valmistetaan yleensä biosynteet-tisesti, ja tämä valmistustapa on ollut pitkään tunnettu. 10 Tuottajina käytettäville bakteerikannoille on ominaista kyky erittää näitä aminohappoja kasvualustaan lyhyessä ajassa suuriksi pitoisuuksiksi. Suuren substraattialkupi-toisuuden välttämiseksi käytetään yleensä panoksenlisäys-prosesseja. Käytettävien tuotantokantojen sangen suuren 15 aineenvaihduntakapasiteetin vuoksi on erittäin tärkeätä ohjata fermentointiprosessia sillä tavalla, että hapenkulutuksen ja lämmönkehityksen maksimiarvot ovat taloudellisesti kannattavaa suuruusluokkaa. Siksi käytetään erilaisia strategioita organismien metabolisen aktiivisuuden 20 säätelemiseksi sillä tavalla, että toisaalta taataan ha-pensyöttö ja lämmönpoisto ja toisaalta biomassan ja tuotteen muodostuminen jakautuvat tasapainoisesti.

CSFR-patenttijulkaisussa 212 558 kuvataan menetelmä, jossa syötetään lisäravintoa epäjatkuvasta ja jossa 25 metabolista aktiivisuutta säädellään kasvuvaiheessa pH-muutoksilla ja biomassan kokonaismäärää α-aminotypen kautta. SU-patenttijulkaisussa 1 157 059 kuvataan menetelmää lisäravinnon syöttämiseksi epäjatkuvasti, jossa treoniini-pitoisuus toimii kriteerinä lisäravinnon syöttämiselle ja 30 tämän pelkistävän yhdisteen pitoisuus pidetään alueella . 3 - 5 %. FR-patenttijulkaisussa 8 303 487 kuvataan erästä sangen tarkasti säädettyä menetelmää. Tässä menetelmässä » on kaksi jatkuvasti lisättävää syöteliuosta, joista toinen on leusiinifosfaattiliuos, jota annostellaan siten, että 35 täydennyslisäys rajoittaa sekä aineenvaihdunnan intensi- 104836 2 teettiä että biomassan muodostusta. Toista syöteliuosta, sokeriliuosta, lisätään sillä tavalla, että todellinen sokeripitoisuus pysyy alueella 5-15 g/1. Siitä on nähtävissä, että leusiini-/fosfaattitäydennysten aikaansaaman 5 rajoituksen vuoksi viljelmä kuluttaa lisäravinnon syöttö-vaiheen aikana joka hetkellä vähemmän sokeria, kuin kasvualustassa on käytettävissä. Tämä menettelytapa on yhdenmukainen sen useaan kertaan esitetyn näkemyksen kanssa, että tulisi välttää sekä hiilen rajoittamista että suurta hii-10 liylimäärää (esimerkiksi DD-patenttijulkaisu 269 167). Hajd Sassi et ai. [Biotechn. Letters 10 (1988, nro 8) 583 - 586] ehdottavat tässä yhteydessä jopa glukoosipitoi-suutta 90 - 140 g/1. Metabolista aktiivisuutta säätelee siten aina jokin muu tekijä kuin hiililähde.

15 Tämän keksinnön päämääränä on menetelmä aminohappo jen valmistamiseksi fermentoimalla, jonka yhteydessä käytettävän hiililähteen (sokerin) muuttumisaste on korkeampi ja saadaan aikaan korkeampi aminohappopitoisuus biomassat-tomassa kuivamassassa.

20 Tämä keksintö koskee menetelmää aminohappojen val mistamiseksi fermentoimalla, jossa kasvatetaan yhtä tai useampaa aminohappoa tuottavaa Brevibacteritän- tai Coryne-bacterium-suvun kantaa ravintoalustassa ja eristetään fer-mentoinnin lopussa aminohappo tai aminohapot viljelmänes-25 teestä ja jolle on tunnusmerkillistä, että välittömästi voimakkaan kasvun vaiheen jälkeen (tuotantovaiheessa) bak-teeriviljelmän käytettävissä on vähemmän hyödynnettävissä olevaa hiililähdettä, kuin mitä se pystyisi metaboloimaan kannan rakenteen ja ravintoalustaan lisättyjen muiden 30 välttämättömien täydennysravintoaineiden määrän perusteel-.. la. Fermentointi(kasvu-Jalusta on muuten koostumukseltaan yleisesti tunnetun kaltainen. Se sisältää hiililähteiden, kuten assimiloitavissa olevien sokereiden, sakkaroosin, glukoosin, melassin tai tärkkelyshydrolysaattien, ja ammo-35 niumionien ohella auksotrofisten tuottajien ollessa ky- 3 104836 seessä monimutkaisia aineosia yhden tai useamman auksotro-fian vuoksi välttämättömien orgaanisten täydennysravinto-• aineiden lähteenä, esimerkiksi proteiinihydrolysaatteja a-aminotyppilähteenä, vitamiineja samoin kuin epäorgaani-. 5 siä suoloja. Fermentoinnin alussa esiintyvän voimakkaan kasvun yhteydessä on yleensä kyse logaritmisen kasvun vaiheesta. Sitä voidaan lyhentää tarpeen mukaan rajoittamalla täydennysravintoaineita ja/tai hiililähdettä. Myös välittömästi sen jälkeen tapahtuu vielä solujen kasvua. Sen 10 määrä on kuitenkin vain pieni murto-osa kasvusta, joka tapahtuu vaiheessa, jolle on tunnusmerkillistä voimakas kasvu. On edullista käyttää kantoja, jotka tuottavat L-ly-siiniä ja/tai L-treoniinia. Käymisympäristö valitaan siten, että lämpötila on alueella 25 - 40 °C, edullisesti 15 30 - 36 eC, pH alueella 6-8, edullisesti 7-7,5, ja ammoniumionipitoisuus 0,5-8 g/1. Lientä sekoitetaan ja siihen syötetään riittävästi happea. Erityisesti aminohap-poauksotrofisten lysiiniä erittävien kantojen ollessa kyseessä voidaan sokerimetaboliaa säädellä lisättävän amino-20 hapon määrän kautta. Sen ja muiden välttämättömien täyden-nysravintoaineiden pitoisuus on kasvuvaiheen mukaan edullisesti kulloinkin 0-0,1 g/1, erityisesti 0 - 0,05 g/1. Niinpä esimerkiksi leusiiniauksotrofisen lysiiniä erittävän kannan yhteydessä valitaan jatkuvasti lisättävässä . 25 lisäravintoalustassa vallitseva sokeri-leusiinisuhde si ten, että biomassan muodostusta rajoitetaan leusiinin syötöllä, mutta samalla pidetään tarjolla vain murto-osa siitä sokerimäärästä, joka olisi muutettavissa kyseisen leu-siinipitoisuuden vallitessa.

30 Hyödynnettävissä olevien sokereiden pitoisuus on - .. välittömästi voimakkaan kasvun vaiheen jälkeen edullisesti 0 - <3 g/1, erityisesti kuitenkin 0-1 g/1. Pitoisuus 0 g/1 iermentointiliemessä ei kuitenkaan merkitse mahdollisten välttämättömien täydennysravintoaineiden eikä myös-35 kään hiililähteen suhteen sitä, että näitä aineita ei syö- 104836 4 tettäisi jatkuvasti. Ennemminkin se tarkoittaa, että näitä yhdisteitä syötetään määrä, jonka bakteeriviljelmät ottavat välittömästi vastaan. Keksinnön mukaisella menetelmällä toteutetulla fermentoinnilla on joukko hyvin huomatta-5 via etuja edellä esitettyihin perinteisiin menetelmiin nähden.

1. Viljelmän metaboliseen aktiivisuuteen ja siten hapentarpeeseen ja lämmönkehitykseen voidaan vaikuttaa suoraan ja viivyksettä lisäravinnon annostelunopeudella ja 10 tehdä siitä sopiva fermentorin kapasiteetille.

2. Fermentointiliemille on ominaista suurempi tuo-tepitoisuus kokonaiskuivamassassa ja siten parempi puhtaus. Koska bakteeriviljelmälle tarjotaan koko lisäravinnon syötön ajan vähemmän substraattia, kuin mitä se pys- 15 tyisi muuttamaan, ja hiililähde on siten primaarinen rajoittava tekijä, estetään siirtyminen sivutuotteiden suuntaan.

3. Fermentoinneilla saadaan suurempi saanto kuin fermentointiprosesseilla, joissa lisäravintoaineet ovat 20 primaarinen rajoittava tekijä.

4. Tuoteseurannan yhteydessä voidaan fermentointi keskeyttää suoraan ja ilman jälkikäymisaikaa optimivai-heessa eli tasanteen kohdalla ja bruttosaanto vastaa joka hetkellä nettosaantoa.

. 25 5. Jälkikäsittelymallissa, jossa fermentointiliemi konsentroidaan suoraan haihduttamalla, voidaan fermentorin sisältö teknisten häiriöiden sattuessa johtaa heti jälkikäsittelyyn tuotteen laadun heikkenemättä sokerin suuren j äännöspitoisuuden vuoksi.

30 Seuraavat esimerkit valaisevat keksinnön mukaisen .. menetelmän toteutusmahdollisuuksia.

104836 5

Esimerkki 1 (vertailuesimerkki)

Sekoittimella ja ilmastusjärjestelmällä varustettuun fermentointisäiliöön panostettiin 5,1 kg steriiliä liuosta, joka sisälsi seuraavat komponentit: . 5 Vettä 4540 g

Melassia 26 g

Glukoosia 125 g

Maissigluteenihydrolysaattia (rikkihappoista) 35 g

Tuottajabiomassahydrolysaattia (rikkihappoista) 320 g 10 Ammoniumsulfaattia 45 g

Fosforihappoa (85-%:ista) 7 g

Magnesiumsulfaattia 3 g muita mineraalisuoloja, hivenaineita, biotiinia ja tiamiinia, 15 ja säädettiin pH arvoon 7,3 ammoniakkiliuoksella. Tähän liuokseen lisättiin lämpötilassa 33 - 36 °C 0,6 1 Coryne-bacterium glutamicum DM 346-1 -inokulaattiviljelmää, jossa geneettisinä markkereina ovat leu*, oksalysiiniresistenssi 20 ja aminoetyyliresistenssi. Inokulaattiviljelmä valmistettiin inkuboimalla 15 tuntia lämpötilassa 33 °C pH:n 7 vallitessa sekoittaen ja ilmastaen kasvualustassa, joka sisälsi 4,4 paino-% melassia ja lisäksi 2 % sakkaroosia, 14 % soijajauhohydrolysaattia (rikkihappoista), 3 % ammo-. 25 niumsulfaattia, 0,05 % fosforihappoa ja 0,02 % magnesium- sulfaattia sekä vitamiineina biotiinia ja tiamiinia. Se-koitettaen ja ilmastaen riittävästi ja pitäen pH suunnilleen arvossa 7,3 ammoniakin vesiliuoksella annosteltiin logaritmisen kasvun vaiheen päätyttyä pääfermentorissa 32 30 tunnin kuluessa tavanomaisella tavalla seuraava ammoniakin . .. vesiliuoksella neutraloitu alusta siten, että fermentoin- tiliemestä mitattavissa oleva sokeripitoisuus oli alueella 5-35 g/1 (entsymaattiset sakkaroosi- ja glukoosimääri-tykset): 35 104836 6

Vettä 1250 g

Melassia 94 g

Glukoosia 1465 g

Maissigluteenihydrolysaattia (rikkihappoista) 39 g 5 Tuottajabiomassahydrolysaattia (rikkihappoista) 265 g

Ammoniumsulfaattia 31 g

Fosforihappoa (85-%:ista) 4 g

Magnesiumsulfaattia 2 g muita mineraalisuoloja, hivenaineita, biotiinia ja tiamii-10 nia.

Fermentoinnin päätepisteessä, kun kaikki fermen-tointialustassa oleva assimiloituva sokeri oli käytetty, oli sokerin muuttumisaste lysiiniksi 35 % laskettuna 15 Lys*HCl:na ja biomassattoman haihdutetun fermentointiliu-oksen lysiiniemäspitoisuus 45 %.

Esimerkki 2

Inokulaatin valmistus, pääfermentoriin aluksi laitettu alusta ja viljelyolosuhteet ovat esimerkin 1 mukai-20 set. Myös alusta 2 koostuu samoista aineosista seuraavasti muunnettuna:

Vettä 1560 g

Melassia 75 g . 25 Glukoosia 1170 g Tässä kokeessa lisättiin lisäravintoalustaa samalla annostelunopeudella kuin esimerkissä 1. Fermentoinnin edetessä tehdyt assimiloituvan sokerin analyysit osoittivat, 30 että keksinnön mukaista menetelmää vastaavalla tavalla .. mitattavissa oleva assimiloituvan sokerin pitoisuus pysyi koko lisäravinnon syötön ajan pienempänä kuin 3 g/1 ja lähes koko ajan pienempänä kuin 1 g/1. Fermentointiliemes-sä olevan leusiinin analysointi aminohappoanalysaattorilla 35 osoitti, että lisäravinnon syötön aikana alustan 1 mukana 104836 7 alussa panostetun leusiinimäärän tultua käytetyksi leusii-nipitoisuus el missään valheessa ollut suurempi kuin 0,05 g/1.

Fermentoinnin loputtua oli sokerin muuttumisaste 5 lysiiniksi 40 % (laskettuna Lys*HCl:na) Ja biomassattoman haihdutetun fermentointiliuoksen lysiiniemäspitoisuus 54 %.

Esimerkki 3

Reaktoriin (tilavuus 10 m3) laitetaan 3980 kg ste- 10 rilliä alustaa, jolla on seuraava koostumus:

Sakkaroosia 320 kg

Melassia 20 kg

Maissigluteenihydrolysaattia 230 kg 15 Ammoniumsulfaattiliuosta (25 % vedessä) 150 kg

Sitruunahappomonohydraattia 2,3 kg

Fosforihappoa (89-%:ista) 6,6 kg

MgS04«7H20:a 2,8 kg

CaCl2*2H20:a 75 g 20 FeS04 · H20: a 113 g

MnS04 · H20: a 113 g

ZnS04*7H20:a 5,6 g

CuS04 · 5H20: a 0,6 g

Biotiinia 1,1 g 25 Tiamiinihydrokloridia 0,8 g NH40H: a (2--3-%:ista) 1010 kg

Vettä 2258 kg pH 7,0 30 Säiliön sisältöä sekoitetaan lämpötilassa 33 °C ja _ ilmastetaan riittävästi. Kun 10 m3:n reaktoriin on siirret- ty 250 1 kantaa DM 282-2 sisältävää inokulaattia, jossa on geneettisenä markkerina leusiiniauksotrofia ja aminoetyy-likysteiiniresistenssi (inkuboitu 16 tuntia alustassa, 35 joka sisältää 6 % melassia, 14 % soijajauhohydrolysaattia, 104836 8 1 % ammoniumsulfaattia ja 0,1 % fosforihappoa, pH:n 7 vallitessa ja lämpötilassa 30 °C), pidetään pH arvossa 7,0 ammoniakin vesiliuoksen avulla ja säädetään ilmastus siten, että liuenneen hapen pitoisuus on aina yli 15 % kyl-5 lästyspitoisuudesta. Kun viljelmä on kasvanut optiseen tiheyteen (535 nm) noin 30, annostellaan nopeudella 30 1/h tuotantoalusta, jolla on seuraava koostumus:

Sakkaroosia 940 kg 10 Melassia 50 kg

Maissigluteenihydrolysaattia 180 kg

Ammoniumsulfaattiliuosta (25 % vedessä) 80 kg

Sitruunahappomonohydraattia 1 kg

Fosforihappoa (89-%:ista) 2,8 kg 15 MgS04*7H20:a 1,2 kg

FeS04*H20:a 48 g

MnS04*H20:a 48 g

ZnS04*7H20:a 2,4 g

CuS04*5H20:a 0,3 g 20 Biotiinia 0,6 g

Tiamiinihydrokloridia 0,4 g NH40H:a (25-%:ista) 80 kg

Vettä 740 kg PH 7,5 25

Tuotantovaiheen aikana pH pidetään arvossa 7,3. Kasvualustassa aluksi lisätyn sokerin tultua käytetyksi ei assimiloituvan sokerin pitoisuus ylittänyt keksinnön mukaista menetelmää vastaavalla tavalla lisäravinnon syöttö-30 vaiheen aikana arvoa 1 g/1, ja mitattavissa oleva leusii-.. nipitoisuus oli alle 0,05 g/1. Fermentoinnin lopussa oli sokerin muuttumisaste lysiiniksi 32,3 % (laskettuna Lys*HCl:na) ja biomassattoman haihdutetun fermentointilie-men lysiiniemäspitoisuus 54,7 %.

9 104836

Esimerkki 4 (vertailuesimerkki)

Inokulaatin valmistus, menettelyparametrit ja kasvuvaiheessa ja tuotantovaiheessa käytetyt alustat ovat esimerkin 3 mukaiset. Lisäravinto syötettiin kuitenkin nyt 5 annostelunopeudella noin 100 1/h. Tällöin kasvualustassa aluksi lisätyn sokerin tultua käytetyksi mitattavissa oleva assimiloituvan sokerin pitoisuus pysyi koko lisäravinnon syötön ajan selvästi suurempana kuin 5 g/1; mitattavissa oleva leusiinipitoisuus pysyi kuitenkin kuten edel-10 läkin pienempänä kuin 0,05 g/1. Sokerin muuttumisaste ly-siiniksi oli fermentoinnin lopussa 30,9 % (laskettuna Lys1HCl:na) ja biomassattoman haihdutetun fermentointilie-men lysiiniemäspitoisuus 43,5 %.

Esimerkki 5 (vertailuesimerkki) 15 Inokulaatttiviljelmä-, kasvatus- ja tuotantoalustat vastaavat koostumukseltaan esimerkin 1 alustoja sillä erotuksella, että kasvatusalustassa glukoosi korvataan sakkaroosilla (25 g/1) ja tuotantoalustassa sakkaroosilla (564 g/1); inkubointiparametrit mukaan luettuna inokulaa-20 tin valmistus ovat samoin identtiset. Sekoittimella ja ilmastuksella varustetuun pieneen fermentoriin laitettiin aluksi 0,82 kg (0,8 1) steriiliä kasvatusalustaa. Tähän liuokseen lisättiin lämpötilassa 33 - 35 °C 0,1 1 Coryne-bacterium glutamicum DSM 5715 -inokulaattiviljelmää. Kun . 25 oli saavutettu optinen tiheys noin 30 (535 nm) syötettiin 533 g (430 ml) tuotantoalustaa 24 tunnin aikana jatkuvasti. Lisäravinnon syötön aikana mitattavissa oleva sokeri-pitoisuus fermentointialustassa oli aina yli 5 g/1 ja leusiinipitoisuus kasvatusalustassa aluksi lisätyn määrän 30 kuluttua loppuun aina alle 0,05 g/1. Fermentoinnin loput-. .. tua havaittiin alustassa 74 g lysiiniä (Lys 1HCl:na), joka vastaa kokonaissakkaroosimäärän ollessa 275 g muuttumisas-tetta 27 %. Kokonaiskuivamassan lysiinipitoisuus oli 30,5 %.

104836 10

Esimerkki 6

Kokeessa, joka tehtiin samoin kannalla DSM 5715 ja jossa kaikki alusta- ja inkubointiparametrit olivat kokeen 5 mukaiset, annosteltiin tuotetoalusta jatkuvasti 39 tun-5 nin aikana. Keksinnön mukaista menetelmää vastaavalla tavalla oli lisäravinnon syötön aikana kasvatusalustassa aluksi lisätyn hiili- ja leusiinilähteen tultua käytetyksi sakkaroosipitoisuus kullakin mittaushetkellä alle 1 g/1 ja leusiinipitoisuus alle 0,05 g/1. Fermentoinnin lopussa 10 havaittiin alustassa 89 g lysiiniä (Lys»HCl:na) ja muuttu-misaste oli 32 %. Kokonaiskuivamassan lysiinipitoisuus oli 36,3 %. 1 ·

Claims (5)

1. Menetelmä aminohappojen valmistamiseksi fermen-toimalla, jossa kasvatetaan ravintoalustassa Brevibacte-5 rium- tai Corynebacterium-suvun kantaa, joka tuottaa yhtä tai useampaa aminohappoa, ja eristetään fermentoinnin lopussa aminohappo tai aminohapot viljelmänesteestä, tunnettu siitä, että välittömästi logaritmisen kasvuvaiheen jälkeen bakteeriviljelmän käytettävissä on 10 vähemmän hyödynnettävissä olevaa hiililähdettä, kuin mitä se pystyisi metaboloimaan kannan rakenteen ja ravintoalustaan lisättyjen muiden välttämättömien täydennysravintoai-neiden määrän perusteella, ja hiililähdepitoisuus on 0 - <3 g/1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään auksotrofisia bakteerikantoja ja vähintään yhden, kannan yksinkertaisen tai moninkertaisen auksotrofian perusteella annosteltavan orgaanisen yhdisteen pitoisuus rajoitetaan logaritmisen kas-20 vuvaiheen jälkeen alueelle 0-0,1 g/1.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään L-lysiiniä ja/tai L-treoniinia tuottavia kantoja.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, . 25 tunnettu siitä, että käytetään leusiiniauksotrofi- sia Corynebacterium glutamicum -kantoja.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biomassan muodostusta rajoitetaan leusiinitarjonnalla. m * · ♦ 12 104836