JP6821598B2 - Corynebacterium glutamicum由来のプロモーター - Google Patents
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Description
本出願は、2015年12月7日に出願された米国特許仮出願番号第62/264,232号、及び2016年12月7日に出願された米国特許仮出願番号第62/431,409号の利益を主張し、それぞれの出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表は、2016年11月30日に作成され、4,575バイトのサイズを有する、テキストファイル「ZMG−001−PCT_SL.txt」として本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
(項目2)
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号1、5、及び7からなる群から選択される、項目1に記載の組換え核酸分子。
(項目3)
リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、項目1または2に記載の組換え核酸分子。
(項目4)
前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、項目1に記載の組換え核酸分子。
(項目5)
前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、
京都遺伝子ゲノム百科事典及びゲノム(KEGG)のエントリーM00016の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00525の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00526の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00527の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM0030の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00433の遺伝子を含むリジン生合成経路;及び
KEGGエントリーM0031の遺伝子を含むリジン生合成経路
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、項目4に記載の組換え核酸分子。
(項目6)
配列番号1〜8からなる群から選択される1つ以上の追加のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、各プロモーターが、少なくとも1つの追加の異種遺伝子に機能的に連結している、項目1に記載の組換え核酸分子。
(項目7)
前記組換え核酸分子が単離されている、項目1に記載の組換え核酸分子。
(項目8)
少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。
(項目9)
前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号1、5、及び7からなる群から選択される、項目8に記載の組換えベクター。
(項目10)
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、項目8または9に記載の組換えベクター。
(項目11)
前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、項目8または9に記載の組換えベクター。
(項目12)
項目1〜7のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、または項目8〜11のいずれか1項に記載の組換えベクターで形質転換された組換え核酸分子を含む、宿主細胞。
(項目13)
項目1〜7のいずれか1項に記載の1つ以上の追加の組換え核酸分子、または項目8〜11のいずれか1項に記載の1つ以上の追加の組換えベクターで形質転換された1つ以上の追加の組換え核酸分子をさらに含む、項目12に記載の宿主細胞。
(項目14)
項目1〜7のいずれか1項に記載の1つ以上の追加の組換え核酸分子、または項目8〜11のいずれか1項に記載の1つ以上の追加の組換えベクターが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、項目13に記載の宿主細胞。
(項目15)
プロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、項目12に記載の宿主細胞。
(項目16)
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部である、項目15に記載の宿主細胞。
(項目17)
前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部ではない、項目15に記載の宿主細胞。
(項目18)
Corynebacterium属に属する、項目12〜17のいずれか1項に記載の宿主細胞。
(項目19)
Corynebacterium glutamicumである、項目18に記載の宿主細胞。
天然のC.glutamicumプロモーターは、以下の基準:1)構成的プロモーターのラダー、すなわち、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを表すこと;及び2)短いDNA配列、理想的には、100未満の塩基対によってコードされることの両方を満たすと同定された。C.glutamicum ATCC13032においてグローバル遺伝子発現レベルを記述している公開されたデ−タセット(Lee et al.,Biotechnol Lett(2013)35:709−717)は、異なる成長条件にわたって恒常的に発現される遺伝子を同定するために検査した。発現レベルが、2つの成長条件にわたって一定(0.33〜3の間の発現比として定義される)のままであった、すなわち、過酸化水素の添加の有り無し両方の最少培地におけるケモスタット成長であった遺伝子は、第1の基準を満たした。C.glutamicum ATCC13032トランスクリプトームを記述している公開されたデ−タセット(Pfeifer−Sancar et al.,BMC Genomics 2013,14:888)は、コンパクトプロモーターを有する遺伝子、すなわち、60塩基対コアプロモーター領域と、26〜40の長さの塩基対の間の5’非翻訳領域とからなる遺伝子を見つけるために検査した。2つのデ−タセットを相互参照して、両方の基準を満たしたプロモーターを同定した。図1を参照されたい。以下の5つの野生型プロモーターが同定された(表1)。
本発明の一実施形態は、配列番号1、配列番号5、及び配列番号7から選択される配列を含む第1のプロモーターポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドの適当な保管手段を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、第1のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号5、及び配列番号7から選択される配列からなる。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも2つの本明細書に記載の第1のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも1つの第1のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、及び配列番号8から選択される配列を含む少なくとも1つの第2のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の少なくとも1つの第1のプロモーターポリヌクレオチド、及び配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、及び配列番号8から選択される配列からなる少なくとも1つの第2のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組み合わせを含む。
本発明の一実施形態は、本明細書に記載のプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含む、標的遺伝子を発現する方法に関する。標的遺伝子は、本明細書に記載のプロモーターによって発現が制御されるポリヌクレオチドである。標的遺伝子は、1つ以上のポリペプチド(複数可)をコードするコードポリヌクレオチド、または非コードRNAなどの非コードポリヌクレオチドであり得る。タンパク質/ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ATG、GTG、及びTTG、好ましくは、ATGまたはGTG、特に好ましくは、ATGからなる群から選択される開始コドン、タンパク質コ−ド配列、並びにTAA、TAG、及びTGAからなる群から選択される1つ以上の停止コドン(複数可)から本質的になる。
両方のポリヌクレオチドが、直接、またはリンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドによってのいずれかで互いに機能的に連結されるように、標的遺伝子は、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの下流、すなわち、3’末端に位置する。リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドによって互いに機能的に連結したプロモーター及び標的遺伝子が好ましい。前記リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなる。
6−600、6−500、6−400、6−300、6−200、6−180、6−160、6−140、6−120、6−100、6−80、6−60、6−50、6−40、6−30、6−28、6−27、6−26、6−25;または
8−600、8−500、8−400、8−300、8−200、8−180、8−160、8−140、8−120、8−100、8−80、8−60、8−50、8−40、8−30、8−28、8−27、8−26、8−25;または
10−600、10−500、10−400、10−300、10−200、10−180、10−160、10−140、10−120、10−100、10−80、10−60、10−50、10−40、10−30、10−28、10−27、10−26、10−25;または
12−600、12−500、12−400、12−300、12−200、12−180、12−160、12−140、12−120、12−100、12−80、12−60、12−50、12−40、12−30、12−28、12−27、12−26、12−25;または
14−600、14−500、14−400、14−300、14−200、14−180、14−160、14−140、14−120、14−100、14−80、14−60、14−50、14−40、14−30、14−28、14−27、14−26、14−20;または
16−600、16−500、16−400、16−300、16−200、16−180、16−160、16−140、16−120、16−100、16−80、16−60、16−50、16−40、16−30、16−28、16−27、16−26、16−25;または
18−600、18−500、18−400、18−300、18−200、18−180、18−160、18−140、18−120、18−100、18−80、18−60、18−50、18−40、18−30、18−28、18−27、18−26、18−25;または
20−600、20−500、20−400、20−300、20−200、20−180、20−160、20−140、20−120、20−100、20−80、20−60、20−50、20−40、20−30、20−28、20−27、20−26、20−25のヌクレオチド長である。
さらに、本発明は、微生物中で標的遺伝子またはポリヌクレオチドを発現するために、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位を使用することに関する。本発明によるプロモーターまたは本発明による発現単位は、合成RNA、好ましくは、mRNAをポリペプチドに転写及び翻訳することを確実にする。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、微生物の形質転換細胞を指す。
本発明はさらに、
a)本発明による上述の微生物を適当な培地内において培養して発酵液を得る工程;及び
b)工程a)で得られた発酵液または微生物の細胞内においてファインケミカルを濃縮する工程
を含む、ファインケミカルの発酵調製物のための処理を提供する。
a)微生物の細胞の繁殖によって得られた微生物のバイオマス(細胞集団);
b)発酵中に形成された所望のファインケミカル;
c)発酵中に任意に形成された有機副生成物;及び
d)発酵で消費されない、例えば、ビオチンなどのビタミンまたは硫酸マグネシウムなどの塩の、使用された発酵培地または出発材料の成分。
a)水の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)またはほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、または≧99%)な除去;
b)除去前に必要に応じて非活性化されているバイオマスの部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)、またはほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、または≧99%)な除去;
c)発酵中に形成された有機副生成物の部分的(>0%〜<80%)、完全(100%)、またはほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%、または≧99.7%)な除去;及び
d)発酵で消費されなかった、使用された発酵培地または出発材料の成分の、発酵液からの部分的(>0%)、完全(100%)、またはほぼ完全(≧80%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%、≧99.3%または≧99.7%)な除去。これにより、所望の化合物含有量を有する生成物が単離される。
1.少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
2.前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号1、5、及び7からなる群から選択される、請求項1に記載の組換え核酸分子。
3.リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態1または2に記載の組換え核酸分子。
4.前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、実施形態1に記載の組換え核酸分子。
5.前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、
エントリーM00020の遺伝子を含むセリン生合成経路;
KEGGエントリーM00018の遺伝子を含むスレオニン生合成経路;
KEGGエントリーM00021の遺伝子を含むシステイン生合成経路;
KEGGエントリーM00338の遺伝子を含むシステイン生合成経路;
KEGGエントリーM00609の遺伝子を含むシステイン生合成経路;
KEGGエントリーM00017の遺伝子を含むメチオニン生合成経路;
KEGGエントリーM00019の遺伝子を含むバリン/イソロイシン生合成経路;
KEGGエントリーM00535の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路;
KEGGエントリーM00570の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路;
KEGGエントリーM00432の遺伝子を含むロイシン生合成経路;
KEGGエントリーM00016の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00525の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00526の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00527の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM0030の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00433の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM0031の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00015の遺伝子を含むプロリン生合成経路;
KEGGエントリーM00028の遺伝子を含むオルニチン生合成経路;
KEGGエントリーM00763の遺伝子を含むオルニチン生合成経路;
KEGGエントリーM00026の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路;
KEGGエントリーM00022の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路;
エントリーM00023の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路;
KEGGエントリーM00024の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路;
KEGGエントリーM00025の遺伝子を含むチロシン生合成経路;
KEGGエントリーM00040の遺伝子を含むチロシン生合成経路;及び
それらの生合成経路のいずれかの遺伝子の組み合わせ
からなる群から選択される生合成経路のアミノ酸の成分である遺伝子である、実施形態4に記載の組換え核酸分子。
6.配列番号1〜8からなる群から選択される1つ以上の追加のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、各プロモーターが、少なくとも1つの追加の異種遺伝子に機能的に連結している、実施形態1に記載の組換え核酸分子。
7.前記組換え核酸分子が単離されている、実施形態1に記載の組換え核酸分子。
8.配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列、及びそれらの組み合わせを含む、各プロモーターが、少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結している、組換えベクター。
9.前記プロモーターポリヌクレオチド配列が、配列番号1、5、及び7からなる群から選択される、実施形態8に記載の組換え核酸分子。
10.配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列、及びそれらの組み合わせを含む2つ以上の組換え核酸分子の組み合わせを含み、各プロモーターが、少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態8または9に記載の組換えベクター。
11.前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態10に記載の組換えベクター。
12.前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態11に記載の組換えベクター。
13.前記標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態11に記載の組換えベクター。
14.実施形態1〜6のいずれか1項に記載の組換え核酸分子、または実施形態10に記載のそれらの組み合わせ、または実施形態8〜13のいずれか1項に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
15.プロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記プロモーターポリヌクレオチド配列の各々が、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態14に記載の宿主細胞。
16.前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部である、実施形態15に記載の宿主細胞。
17.前記異なる異種標的遺伝子の各々が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態15に記載の宿主細胞。
18.Corynebacterium属に属する、実施形態14〜17のいずれか1項に記載の宿主細胞。
19.Corynebacterium glutamicumである、実施形態18に記載の宿主細胞。
20.実施形態12〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含み、前記1つ以上の標的遺伝子の各々が、配列番号1〜8からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に機能的に連結した異なる異種標的遺伝子であり、各異種標的遺伝子の発現の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択される、1つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
21.実施形態12〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含み、前記1つ以上の標的遺伝子の各々が、配列番号1〜8からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に機能的に連結した異なる異種標的遺伝子であり、各異種標的遺伝子の発現の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択される、1つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
22.生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態12〜19のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
23.前記生体分子が、L−アミノ酸である、実施形態20に記載の方法。
24.前記L−アミノ酸が、L−リジンである、実施形態22に記載の方法。
25.前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC:1.2.1.11);4−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(EC:4.3.3.7);ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.8);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);N−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.17);スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ(EC:3.5.1.18);ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(EC:5.1.1.7);ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.20);ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.4.1.16);アスパルトキナーゼLyscアルファ及びベ−タサブユニット(EC:2.7.2.4);アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.1);ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS);PTSのグルコース−特異的酵素II BC成分(EC:2.7.1.69);グルコース−6−リン酸1−デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.49 1.1.1.363);グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(EC:5.3.1.9);トランスケトラーゼ(EC:2.2.1.1);6−ホスホフルクトキナーゼ1(EC:2.7.1.11);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:4.1.1.31);ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:6.4.1.1);イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.42);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(GTP)(EC:4.1.1.32);オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.3);ホモセリンキナーゼ(EC:2.7.1.39);ホモセリンデヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.3);スレオニンシンターゼ(EC:4.2.3.1)、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコ−ドする遺伝子である、実施形態20に記載の方法。
26.異種標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8からなる群から選択される配列を含む、宿主細胞。
27.異種標的遺伝子に機能的に連結した2つ以上のプロモーターポリヌクレオチド配列の組み合わせを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態25に記載の宿主細胞。
28.前記組み合わせが、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC:1.2.1.11);4−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(EC:4.3.3.7);ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.8);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);N−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.17);スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ(EC:3.5.1.18);ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(EC:5.1.1.7);ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.20);ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.4.1.16);アスパルトキナーゼLyscアルファ及びベ−タサブユニット(EC:2.7.2.4);アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.1);ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS);PTSのグルコース−特異的酵素II BC成分(EC:2.7.1.69);グルコース−6−リン酸1−デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.49 1.1.1.363);グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(EC:5.3.1.9);トランスケトラーゼ(EC:2.2.1.1);6−ホスホフルクトキナーゼ1(EC:2.7.1.11);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:4.1.1.31);ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:6.4.1.1);イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.42);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(GTP)(EC:4.1.1.32);オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.3);ホモセリンキナーゼ(EC:2.7.1.39);ホモセリンデヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.3);及びスレオニンシンターゼ(EC:4.2.3.1)からなる群から選択された2つの異種標的遺伝子を含み、各々が、配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターに機能的に連結している、実施形態26に記載の宿主細胞。
29.前記組み合わせが、前記異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1、5、及び7からなる群から選択されるプロモーターを含む、実施形態27に記載の宿主細胞。
30.前記組み合わせが、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC:1.2.1.11);4−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(EC:4.3.3.7);ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.8);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);N−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.17);スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ(EC:3.5.1.18);ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(EC:5.1.1.7);ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.20);ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.4.1.16);アスパルトキナーゼLyscアルファ及びベ−タサブユニット(EC:2.7.2.4);アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.1);ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS);PTSのグルコース−特異的酵素II BC成分(EC:2.7.1.69);グルコース−6−リン酸1−デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.49 1.1.1.363);グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(EC:5.3.1.9);トランスケトラーゼ(EC:2.2.1.1);6−ホスホフルクトキナーゼ1(EC:2.7.1.11);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:4.1.1.31);ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:6.4.1.1);イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.42);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(GTP)(EC:4.1.1.32);オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.3);ホモセリンキナーゼ(EC:2.7.1.39);ホモセリンデヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.3);及びスレオニンシンターゼ(EC:4.2.3.1)からなる群から選択される3つの異種標的遺伝子を含み、各々が、配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターに機能的に連結している、実施形態26に記載の宿主細胞。
31.前記組み合わせが、前記異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1、5、及び7からなる群から選択されるプロモーターを含む、実施形態29に記載の宿主細胞。
32.前記異種標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態26に記載の宿主細胞。
33.前記異種標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態26に記載の宿主細胞。
34.Corynebacterium属に属する、実施形態25〜32のいずれか1項に記載の宿主細胞。
35.Corynebacterium glutamicumである、実施形態25〜33のいずれか1項に記載の宿主細胞。
36.実施形態25〜34のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含み、各異種標的遺伝子の改変が、上方調節または下方調節から独立して選択され、前記上方調節または下方調節が、内因性プロモーターの制御下で前記標的遺伝子の発現のレベルに相対的である、1つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
37.生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態25〜35のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
38.前記生体分子が、L−アミノ酸である、実施形態36に記載の方法。
39.前記L−アミノ酸が、L−リジンである、実施形態37に記載の方法。
40.前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(EC:1.2.1.11);4−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ(EC:4.3.3.7);ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(EC:1.17.1.8);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);2,3,4,5−テトラヒドロピリジン−2−カルボン酸N−スクシニルトランスフェラーゼ(EC:2.3.1.117);N−スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.17);スクシニル−ジアミノピメリン酸デサクシニラーゼ(EC:3.5.1.18);ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(EC:5.1.1.7);ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.20);ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.4.1.16);アスパルトキナーゼLyscアルファ及びベ−タサブユニット(EC:2.7.2.4);アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(EC:2.6.1.1);ホスホトランスフェラーゼシステム(PTS);PTSのグルコース−特異的酵素II BC成分(EC:2.7.1.69);グルコース−6−リン酸1−デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.49 1.1.1.363);グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(EC:5.3.1.9);トランスケトラーゼ(EC:2.2.1.1);6−ホスホフルクトキナーゼ1(EC:2.7.1.11);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:4.1.1.31);ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC:6.4.1.1);イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.42);ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシキナーゼ(GTP)(EC:4.1.1.32);オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ(EC:4.1.1.3);ホモセリンキナーゼ(EC:2.7.1.39);ホモセリンデヒドロゲナーゼ(EC:1.1.1.3);スレオニンシンターゼ(EC:4.2.3.1)、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態38に記載の方法。
41.異種標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチドを含み;プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、及び配列番号8から選択される配列を含み;プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号6、または配列番号8から選択される配列を含み、標的遺伝子が、プロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、組換えベクター。
42.少なくとも2つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる標的遺伝子に機能的に連結している、実施形態40に記載の組換えベクター。
43.標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部である、実施形態41に記載の組換えベクター。
44.標的遺伝子が、同じ代謝経路の一部ではない、実施形態42に記載の組換えベクター。
45.実施形態40〜43のいずれか1項に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
46.Corynebacterium属に属する、実施形態44に記載の宿主細胞。
47.Corynebacterium glutamicumである、実施形態46に記載の宿主細胞。
48.実施形態44〜46のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含み、各標的遺伝子の改変が、上方調節、及び下方調節から独立して選択される、1つ以上の標的遺伝子の発現を改変する方法。
49.生体分子を生成するのに適した条件下で、実施形態44〜47のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養することを含む、生体分子を生成する方法。
50.前記生体分子が、L−アミノ酸である、実施形態48に記載の方法。
以下の手順を使用して、天然のC.glutamicumプロモーターは、以下の基準:1)構成的プロモーターのラダーを表すこと;及び2)短いDNA配列、理想的には、100未満の塩基対によってコードされ得ることの両方を満たした天然のC.glutamicumプロモーターを同定した。C.glutamicum ATCC13032においてグローバル遺伝子発現レベルを記述している公開されたデ−タセット(Lee et al.,Biotechnology Letters,2013)を検査して、異なる成長条件にわたって恒常的に発現された遺伝子を同定した。発現レベルが、2つの成長条件にわたって一定(0.33〜3の間の発現比として定義される)のままであった、すなわち、過酸化水素の添加の有り無し両方の最少培地におけるケモスタット成長であった遺伝子は、第1の基準を満たした。C.glutamicum ATCC13032トランスクリプトームを記述している公開されたデ−タセット(Pfeifer−Sancar et al.,BMC Genomics 2013,14:888)は、コンパクトプロモーターを有する遺伝子、すなわち、60塩基対コアプロモーター領域と、26〜40の長さの塩基対の間の5プライム非翻訳領域とからなる遺伝子を見つけるために検査した。2つのデ−タセットを相互参照して、両方の基準を満たしたプロモーターを同定した。図1を参照されたい。5つ候補プロモーター(配列番号2、3、4、6、及び8)を選択して、さらに評価した。
候補プロモーター活性を評価するため、蛍光レポーター構築物に基づく一連のプラスミドを設計した。簡単に言えば、各プロモーターを、eyfp、シャトルベクターpK18rep中の黄色の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の前にクローニングした。これらのプラスミドを、C.glutamicum NRRL B−11474に形質転換し、分光分析法によるYFPタンパク質の蓄積を測定することによって、プロモーター活性を評価した。
本開示のプロモーターは、宿主細胞中の生体分子の生成のための処理を改善するのに有用である。本開示のプロモーターの適用及び使用の例は、アミノ酸L−リジンの生成に関する。図3は、L−リジンの生成のための生合成経路を提示し、中間体を経路から分岐させて、全体のL−リジン収率を減少させる遺伝子pck、odx、icd、及びhom(例えば、ホモセリン/スレオニンシンターゼ経路)を含む。C.glutamicum株ATCC13032の記号、遺伝子名、酵素委員会番号(EC番号)、及びマップ位置を以下の表3に提供する。
L−リジンの収率は、表8に提供されるように、標的遺伝子に対するプロモーターの対をスワッピングすることで修正される。実施例3の構築物を使用して、表8に提供されるように、組換え有機体を調製する。示すように、Pcg0007−lysAとPcg3121−pgiの組み合わせは、最も高い収率のL−リジンをもたらす。
Claims (16)
- 配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を少なくとも3つ含む、プロモーターのラダーであって、
前記プロモーターのラダーが、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを含む、前記プロモーターのラダー。 - 前記プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも1つが、配列番号1、5、及び7からなる群から選択される、請求項1に記載のプロモーターのラダー。
- 前記プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも1つが、配列番号1〜2からなる群から選択される、請求項1に記載のプロモーターのラダー。
- 前記プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも1つが、配列番号3、4、及び5からなる群から選択される、請求項1に記載のプロモーターのラダー。
- 前記プロモーターポリヌクレオチド配列の少なくとも1つが、配列番号6〜8からなる群から選択される、請求項1に記載のプロモーターのラダー。
- 前記プロモーターのラダーの各プロモーターが、少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結している、請求項1〜5のいずれか1項に記載のプロモーターのラダー。
- 前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、タンパク質、及びポリマーからなる群から選択される生体分子を生成する生合成経路の成分である遺伝子である、請求項6に記載のプロモーターのラダー。
- 前記少なくとも1つの異種標的遺伝子が、
京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)のエントリーM00016の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00525の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00526の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00527の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM0030の遺伝子を含むリジン生合成経路;
KEGGエントリーM00433の遺伝子を含むリジン生合成経路;及び
KEGGエントリーM0031の遺伝子を含むリジン生合成経路
からなる群から選択されるアミノ酸生合成経路の成分である遺伝子である、請求項6または請求項7に記載のプロモーターのラダー。 - 請求項1に記載のプロモーターのラダーを含む複数の組換えポリヌクレオチドであって、各組換えポリヌクレオチドが、異種標的遺伝子に機能的に連結している前記プロモーターのラダーからの1つのプロモーターを含む、前記複数の組換えポリヌクレオチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロモーターのラダー、または、請求項9に記載の複数の組換えポリヌクレオチドを含む、複数の組換えベクターであって、各ベクターが、前記プロモーターのラダーまたは少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドからの少なくとも1つのプロモーターを含む、前記複数の組換えベクター。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロモーターのラダー、請求項9に記載の複数の組換えポリヌクレオチド、または請求項10に記載の複数の組換えベクターを含む、複数の宿主細胞であって、各宿主細胞が、前記プロモーターのラダー、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドまたは少なくとも1つのベクターからの少なくとも1つのプロモーターを含む、前記複数の宿主細胞。
- コリネバクテリウム属に属する、請求項11に記載の複数の宿主細胞。
- 各々が少なくとも1つの異種標的遺伝子に機能的に連結した配列番号1〜8からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列少なくとも3つの組み合わせを含む、形質転換された宿主細胞であって、
前記プロモーターポリヌクレオチドの組み合わせが、徐々に増加するレベルのプロモーター活性を有する複数のプロモーターを含む、前記形質転換された宿主細胞。 - 前記標的遺伝子が、アミノ酸、有機酸、香味料、及び香料、バイオ燃料、タンパク質、及び酵素、ポリマー/モノマー、及び他の生体材料、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質治療薬、ファインケミカル、及び栄養補助食品から選択される生体分子を生成する生合成経路と関連する、請求項13に記載の形質転換された宿主細胞。
- 前記標的遺伝子が、抗生物質、アルカロイド、テルペノイド、及びポリケチドから選択される二次代謝産物を生成する生合成経路と関連する、請求項14に記載の形質転換された宿主細胞。
- 各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる異種標的遺伝子に機能的に連結している、請求項13〜15のいずれか1項に記載の形質転換された宿主細胞。
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