JP2019522031A - 核酸操作のための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
マルチプレックス核酸組立のための装置および方法が提供される。具体的には、当該装置は、複数の示差的に標識された粒子またはビーズを含み、それにより使用時に当該標識粒子は、異なるオリゴヌクレオチドをバーコード化することができる。当該装置は、組立の間および/または組立後の核酸単一化のために使用されてもよい。【選択図】図1A
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第62/367,715号の優先権および利益を主張するものであり、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願第62/367,715号の優先権および利益を主張するものであり、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される装置および方法は、特にマルチプレックス核酸組立の間の核酸操作に関連する。
組み換え型核酸および合成核酸は、研究、産業、農業、および医療に多くの用途を有する。組み換え型核酸および合成核酸を使用して、酵素、抗体、成長因子、受容体、および様々な医療、産業、または農業の目的に対し使用され得る他のポリペプチドをはじめとする、大量のポリペプチドを発現および取得することができる。組み換え型核酸および合成核酸は両方とも、改変された細菌、酵母、哺乳類、植物体、およびその他の生物体を含む遺伝子改変生物体を製造するために使用され得る。研究(例えば、生物学的プロセスを理解するためのツールのような、疾患動物モデルなど)、産業(例えば、タンパク質発現用の宿主生物体として、産業用製品を生成するためのバイオリアクターとして、環境復旧用のツールとして、産業用途を有する天然化合物を単離または改変するためのツールとして、など)、農業(例えば、収率が上昇した改変作物、または疾患もしくは環境ストレスに対する抵抗性が上昇した改変作物など)において、および他の応用のために遺伝子改変生物体が使用されてもよい。組み換え型核酸および合成核酸は両方とも、治療用組成物(例えば、遺伝子発現の改変用、遺伝子治療用など)として、または診断用ツール(例えば、疾患状態に対するプローブとして、など)として、使用されてもよい。
実際に、核酸合成は、合成生物学の重要な領域である。2013年7月付の会議報告において、米国エネルギー省(DOE:U.S.Department of Energy)によると、「合成生物学」は、「新しい生物学的部品およびシステムの設計ならびに大量販売の構築、そしてテーラーメイドな目的に対する既存の天然生物学的システムの再設計を、生物学的研究を行いながら、エンジニアリングおよびコンピュータ支援された設計アプローチと統合すること」である。DNA合成およびDNA組立は、DOEレポートにおいて、合成生物学の継続的な開発に対する基盤的な課題として特定された。具体的には、「合成生物学実験に対する主な制約の一つは、巨大DNA構築体の合成および組立であり、それらはいまだ高価であり、遅く、エラーが発生し易いままである。新しいバイオ製造システムのエンジニアリングは、遺伝的設計を迅速、安価、そして正確に合成および組み立てるための新しいアプローチを必要とするであろう。」
既存の核酸(例えば、天然核酸)を改変して組み換え型核酸を生成するための多数の技術が開発されている。例えば、核酸増幅、突然変異誘発、ヌクレアーゼ消化、ライゲーション、クローニング、および他の技術の組み合わせを使用して、多くの異なる組み換え型核酸を生成してもよい。化学合成されたポリヌクレオチドは、核酸増幅、突然変異誘発、およびクローニングのためのプライマーまたはアダプターとして使用されることが多い。
固形支持体上でのde novo核酸合成のための技術も開発されている。例えば、所定の核酸配列の一本鎖オリゴヌクレオチドを一般的な支持体上でin situ合成することができ、この場合において各所定の核酸配列は当該支持体上の分かれた、または個別の機構(またはスポット)上で合成される。
また、de novo核酸組立用の技術も利用可能であり、それにより、核酸が作製され(例えば、支持体上で化学的に合成される)、そして組み立てられて、より長い対象標的核酸が生成される。例えば、より大きな合成核酸へとオリゴヌクレオチドを組み立てるための様々なマルチプレックス組立技術が開発されており、その大きな合成核酸は研究、産業、農業、および/または医療に使用することができる。しかしながら、現在利用可能な支持体を基にした合成と組立の技術の制約の一つは、一つまたは複数の対象標的を特定および選択する能力である。そこで、高精度、高選択性の核酸の単一化および組立の技術が必要とされる。
一つの態様において、マルチプレックス核酸組立用の装置が提供される。当該装置は、以下を含んでもよい:
第一、第二および第三の粒子を含み、第一、第二および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがそれぞれその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子、
第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで当該第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチド、
第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで当該第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチド、ならびに
第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで当該第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチド。
第一、第二および第三の粒子を含み、第一、第二および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがそれぞれその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子、
第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで当該第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチド、
第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで当該第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチド、ならびに
第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで当該第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチド。
別の態様は、以下を含む、マルチプレックス核酸組立のための方法に関連する:
第一の粒子、第二の粒子、および第三の粒子を含み、第一のアンカーヌクレオチド、第二のアンカーヌクレオチド、および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがそれぞれその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子を提供すること、
第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで当該第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、
第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで当該第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに
第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで当該第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチドを提供すること。
第一の粒子、第二の粒子、および第三の粒子を含み、第一のアンカーヌクレオチド、第二のアンカーヌクレオチド、および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがそれぞれその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子を提供すること、
第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで当該第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、
第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで当該第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに
第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで当該第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって当該第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチドを提供すること。
さまざまな実施形態で、当該粒子はそれぞれ、それに付加された異なる蛍光色素分子を有し得る。特定の実施形態において、当該粒子は、それに付加された異二種の蛍光色素分子の異なる混合物を有し得る。当該複数の示差的に標識された粒子は、単一の反応体積中に提供されてもよい。一部の実施形態において、当該第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドは、固有の相補配列を有するよう設計されてもよい。特定の実施形態において、各粒子は、別個の反応体積中で提供されてもよい。一部の実施形態において、各別個の反応体積は、異なるウェル中に提供されてもよい。
本明細書に開示される装置および方法は、特にマルチプレックス核酸組立中の核酸操作に関連する。一部の実施形態において、ビーズを基にした単一化を使用して、マルチプレックス核酸組立の前、間、および/または後で、例えば合成オリゴヌクレオチドから一個以上の標的を選択的に拾い上げることができ、当該合成オリゴヌクレオチドは、ビーズまたは他の個別化された固形支持体上で合成および/または固定されていてもよい。
定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項に用いられる特定の用語を、ここにまとめる。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項に用いられる特定の用語を、ここにまとめる。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書において、「a」および「an」という用語は、品目の文法的客体のうちの一つまたは複数(つまり、少なくとも一つ)を指す。一例として、「構成要素」は一つの構成要素または複数の構成要素を意味する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、20%以内、より好ましくは10%以内、最も好ましくは5%以内を意味する。「実質的に」という用語は、50%を超える、好ましくは80%を超える、および最も好ましくは90%または95%を超えることを意味する。
本明細書で使用される場合、「複数の」とは、1を超える、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上、例えば、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500以上、またはそれ以上、またはそれらの間の任意の整数を意味する。
「組立」または「組み立てる」とは、短いDNA配列(構築オリゴヌクレオチド)が特定の順序で付加されて、より長いDNA配列(標的)を形成するプロセスを意味する。「部分組立」または「部分的に組み立てる」とは、構築オリゴヌクレオチドのサブセットが付加されて、最終標的の一部である部分構築体を形成する中間工程または中間製品を意味する。
「CEL」または「粘着性末端ライゲーション」とは、少なくとも部分的に相互に相補的な粘着性端を使用して、予め設計された順序でDNA断片を結合するプロセスを指す。粘着性末端は、制限酵素消化によって生成されてもよく、または例えば、固形支持体上で直接合成されてもよい。
本明細書で使用される場合、「チップ」とは、平面に付加された多数のオリゴヌクレオチドを有するDNAマイクロアレイを指す。チップ上のオリゴヌクレオチドは任意の長さとすることができる。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約10〜1,000、20〜800、50〜500、100〜300、または約200個のヌクレオチド、またはより長いもしくは短いヌクレオチド、またはその間の任意の数のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」とは、二つの核酸配列が、標準的なワトソンクリック相補性ルールに従って互いに少なくとも部分的に塩基対形成し得ることを意味する。例えば、二つの粘着末端は部分的に相補的でありうるが、この場合、一つのオーバーハングのある領域は、別のオーバーハングのある領域またはすべてと相補的であり、アニーリングする。もし存在する場合、ギャップは、ポリメラーゼと単一ヌクレオチドの存在下での鎖伸長、その後に、または同時にライゲーション反応を行うことで埋められ得る。
本明細書で使用される場合、「構築体」とは、完全な標的配列を含むDNA配列を指す。概して、構築体は、組み立てられていることが暗示されている。「部分構築体」は、完全な標的配列の一部を意味し、典型的には階層的組立の間の中間製品である。
本明細書で使用される場合、「機構」とは、例えば、チップ、マルチウェルトレイ、またはマイクロアレイなどの固形支持体上の個別の位置(またはスポット)を指す。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、当該機構上で合成されることができ、および/または当該機構に固定化されることができる。さらなる反応のためのオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、送付(routing)、増幅、放出、およびその他の方法で操作するための個別の機構の配置を固形支持体上に提示させることができる。一部の実施形態では、各機構はアドレス指定可能である。つまり各機構は、支持体上のあらかじめ決定され、事前に記録された特定の位置(すなわち、「アドレス」)に配置される。したがって、各オリゴヌクレオチドは、支持体上の公知の所定位置に配置される。各オリゴヌクレオチドの配列は、支持体上のその位置から決定されることができる。機構のサイズは、当該機構上で微量(例えば、1〜1000マイクロリットル、1〜1000ナノリットル、1〜1000ピコリットル)の液滴が形成されるように選択することができ、各液滴は互いに別個に保持される。本明細書で使用される場合、機構は、必ずではないが典型的には機構間の空間により分けられており、それにより二つの隣接する機構間の液滴が確実に融合されないようになっている。典型的には機構間にはその表面上にオリゴヌクレオチドがいずれも担持されておらず、不活性空間に相当するであろう。一部の実施形態では、機構および機構間は、その親水性または疎水性の特性が異なる場合がある。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」またはその他の文法的均等物は、共有結合された、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか少なくとも二個のヌクレオチドまたはその類似体を意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、10、20、50、100、200、300、500、1000などを含む、任意の長さのポリマーである。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも二個の共有結合ヌクレオチド残基を含む核酸分子であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、10〜1,000ヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、10〜500ヌクレオチドの長さ、または500〜1,000ヌクレオチドの長さであってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約20〜約800ヌクレオチドの長さ(例えば、約20〜400、約400〜800ヌクレオチドの長さ)であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約50〜約500ヌクレオチドの長さ(例えば、約50〜250、約250〜500ヌクレオチドの長さ)であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約100〜約300ヌクレオチドの長さ(例えば、約100〜150、約150〜300ヌクレオチドの長さ)であってもよい。しかし、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の核酸であってもよい。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、ヌクレオチドの天然型、または非天然型の合成高分子形態を指す。概して「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の両方を含み、ここで「ポリヌクレオチド」はより長い核酸(例えば、1,000個を超えるヌクレオチド、5,000個を超えるヌクレオチド、10,000個を超えるヌクレオチド)を指す場合があり、「オリゴヌクレオチド」は、より短い核酸(例えば、10〜500個のヌクレオチド、20〜400個のヌクレオチド、40〜200個のヌクレオチド、50〜100個のヌクレオチド)を指す場合がある。
本開示の核酸分子は、例えばデオキシリボ核酸(DNA)分子又はリボ核酸(RNA)分子を形成する天然型のヌクレオチドから形成されてもよい。あるいは、天然型核酸は、たとえばペプチド核酸(PNA)またはロック核酸(LNA)などのように、その特性を変化させる構造修飾を含みうる。天然型塩基または人工塩基を用いた核酸分子の固相合成法は、当該技術分野で公知である。当該用語は、均等物、ヌクレオチド類似体から作製されるRNAまたはDNAいずれかの類似体、および記載される実施形態に適用可能である場合には一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されたい。本開示に有用なヌクレオチドとしては、例えば、天然型ヌクレオチド(例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)、またはヌクレオチドの天然修飾型もしくは合成修飾型、または人工塩基が挙げられる。一部の実施形態では、核酸の配列は、自然界に存在しない(例えば、cDNAもしくは相補的DNAの配列、または人為的に設計された配列)。
通常、核酸においてヌクレオシドは、ホスホジエステル結合によって連結される。核酸が連続した文字で表されたときはいつでも、ヌクレオシドは左から右へ、5’から3’の順序であることが理解されるであろう。IUPAC表記によると、「A」はデオキシアデノシンを意味し、「C」はデオキシシチジンを意味し、「G」はデオキシグアノシンを意味し、「T」はデオキシチミジンを意味し、「U」はリボヌクレオシドであるウリジンを意味する。さらに、二種以上のヌクレオチドがその位置に存在し得るときに使用される文字も存在する。「W」(すなわち、弱い結合)はAまたはTを表し、「S」(強い結合)はGまたはCを表し、「M」(アミノの場合)はAまたはCを表し、「K」(ケトの場合)はGまたはTを表し、「R」(プリンの場合)はAまたはGを表し、「Y」(ピリミジンの場合)はCまたはTを表し、「B」はC、GまたはTを表し、「D」はA、GまたはTを表し、「H」はA、CまたはTを表し、「V」はA、CまたはGを表し、「N」はA、C、GまたはT(U)の任意の塩基を表す。核酸配列は、四種の天然デオキシヌクレオチドに限定されず、さらにリボヌクレオシドおよび非天然ヌクレオチドも含み得ることを理解されたい。括弧中で与えられたヌクレオチド配列またはヌクレオチド中の「/」は代替的なヌクレオチドを指し、たとえばDNA配列のTの代わりに、RNA配列では代替のUとなる、など。したがって、U/TまたはU(T)は、UまたはTのいずれかであり得る一つのヌクレオチド位を示す。同様に、A/Tは、ヌクレオチドのAまたはTを指す。G/Cは、ヌクレオチドのGまたはCを指す。UとTの間には機能的同一性があることから、本明細書において、UまたはTに関するいずれの言及も、当該TまたはUの他方としての開示であるともみなされるべきである。例えば、配列UUCG(RNA上)に関する言及はまた、配列TTCG(対応するDNA上)の開示としても理解されるべきである。単に簡略化を目的として、これら選択肢のうちの一つのみが本明細書に記載される。相補的なヌクレオチドまたは塩基は、例えばAおよびT(またはU)、GおよびC、GおよびUなどの塩基対を形成する能力がある。
本明細書で使用される場合、「固形支持体」、「支持体」および「基材」という用語は互換的に使用され、核酸などのポリマーが合成または固定される多孔性または非多孔性の固形状(例えば、不溶性溶媒)物質を指す。本明細書で使用される場合、「多孔性」とは、当該物質が実質的に均一な直径を有する細孔(例えば、nm範囲内)を含むことを意味する。多孔性物質は、紙、合成フィルター、およびこれに類するものを含み得るがこれに限定されない。このような多孔性物質において、反応は当該細孔内で発生し得る。支持体は、例えばピン、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、ベンド、円筒形構造、そしてビーズ、ナノ粒子などをはじめとする粒子など、多数の形状のいずれか一つを有し得る。一部の実施形態では、支持体は平面的(例えば、チップ)である。支持体は可変性の幅を有し得る。固形支持体は、例えばマイクロアレイなどの系統化されたマトリクス、またはウェルのネットワークであってもよい。一部の実施形態では、支持体は、複数のビーズまたは粒子を含んでもよく、それらは任意で一つまたは複数のマルチウェルプレートに配置される。
支持体は、親水性であってもよく、または親水性にされる能力を有してもよい。支持体としては、無機粉末、例えばシリカ、硫酸マグネシウム、及びアルミナなど、天然高分子物質、特にセルロース系物質およびセルロースから誘導された物質、例えば、フィルター紙、クロマトグラフィー紙などの紙を含む繊維など、合成ポリマーまたは改変天然型ポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ(塩化ビニル)、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタラート)、ナイロン、ポリ(酪酸ブチル)、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜、ガラス、制御細孔ガラス、磁気制御細孔ガラス、セラミック、金属などが挙げられ、それらはそれ自体で、または他の物質と併せて使用される。
本明細書で使用される場合、「粒子」または「ビーズ」とは、核酸配列が付加され得る任意の固形状または半固形状の粒子を指し、それらはマルチプレックスアッセイに適しており、ならびにハイブリダイゼーション、検出、および/またはゲーティング条件下で安定的であり、そして不溶性である。粒子またはビーズは、例えば円筒形、球状などの任意の形状、サイズ、組成、または化学的特性のものであってもよい。粒子サイズまたは組成は、例えば特定の細孔サイズでのろ過により、または何らかの他の物理的特性、例えば蛍光により当該粒子が流体から分離され得るように選択され得る。
例えばマイクロビーズなどの粒子は、1ミリメートル未満の直径を有し得る。例えば、マイクロビーズの直径は、約2〜20ミクロンの直径、約5〜10ミクロンの直径などを含む、約0.1〜約1,000マイクロメートルの直径範囲であり得る。例えばナノビーズなどの粒子は、境界も含め約1ナノメートル(nm)〜約100,000nmの直径を有し得、例えば、約1〜100nm、または約10〜1,000nm、または約200〜500nmの範囲のサイズを有し得る。特定の実施形態では、使用される粒子は、ビーズ、特にマイクロビーズおよびナノビーズである。米国特許第7,932,037号に記載されるような、特定の核酸粒子結合方法が援用され、当該特許の開示内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、さらなる反応のためのオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、送付、増幅、および放出するための個別の機構の配置を指す。アレイは平面的であってもよい。ある実施形態において、支持体またはアレイは、アドレス指定可能であってもよい。アドレス指定可能な支持体またはアレイにより、例えば液滴などの個別の単離された体積の直接的な制御が可能となる。
本明細書で使用される場合、「固定化された」という用語は、固形支持体に結合したオリゴヌクレオチドを指し、それらはその5’末端または3’末端を通して付加され得る。支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列(例えば、縮重結合配列)またはリンカー(例えば、光活性化可能なリンカーまたは化学リンカー)を介してチップまたはビーズ上に固定化されてもよい。3’末端とは、5’末端に対し下流の配列を意味し、5’末端とは、3’末端に対して上流の配列を意味することを認識されたい。例えば、オリゴヌクレオチドは、その後の反応に関与しないヌクレオチド配列またはリンカーを介してチップまたはビーズ上に固定されてもよい。特定の固定化方法は、Nimseら、Sensors 2014,14,22208−22229により概説されており、当該開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「アンカーオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用されるような「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」または他の文法的均等物を指し、共有結合され、そして固形支持体に結合されるデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれか少なくとも三個のヌクレオチドを意味し、それらはその5’末端または3’末端を介して付加され得る。アンカーオリゴヌクレオチドは、固形支持体(例えば、ビーズ、チップ、粒子、マルチウェルディッシュ、または他の基材)上にヌクレオチド配列(例えば、縮重結合配列)またはリンカー(例えば、光活性化可能なリンカーまたは化学リンカー)を介して固定化されてもよい。3’末端とは、5’末端に対し下流の配列を意味し、5’末端とは、3’末端に対して上流の配列を意味することを認識されたい。
本明細書で使用される場合、「化学的切断」という用語は、化学的切断または分解に影響を受けやすい不安定な結合を切断または分解することによって、固定化されたオリゴヌクレオチドを放出し、それに従い当該固定化オリゴヌクレオチドを剥離させることを指す。例えば、結合領域は、局所環境のpH変化に反応して、加水分解または分解するように化学修飾された領域を含んでもよい。特定の化学的に切断可能なリンカーは、Lericheら、Bioorganic and Medicinal Chemistry 20(2012)571−582により概説されており、当該開示内容は本明細書にその全体で参照により組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「酵素的切断」という用語は、酵素的分解に影響を受けやすい領域を含有する不安定な結合を切断または分解することによって、固定化されたオリゴヌクレオチドを放出し、それに従い当該固定化オリゴヌクレオチドを剥離させることを指す。例示的な切断可能な群としては、例えばTEVプロテアーゼ、トリプシン、トロンビン、カテプシンB、カテプシンD、カテプシンK、カスパーゼ1、およびマトリクスメタロプロテイナーゼなどのプロテアーゼにより切断可能なペプチド性配列、ならびに例えばホスホジエステル、リン脂質、エステル、及びβ−ガラクトースなどの群が挙げられるが、これらに限定されない。特定の酵素的に切断可能なリンカーは、Lericheら、Bioorganic and Medicinal Chemistry 20(2012)571−582により概説されており、当該開示内容は本明細書にその全体で参照により組み込まれる。さらに、結合は、制限酵素による切断に影響を受けやすい核酸配列を含有してもよい。制限酵素切断部位の例としては、例えば、AatI、AatIIAccI、AflII、AluI、Alw44I、ApaI、AseI、AvaI、BamHI、BanI、BanII、BanIII、BbrPI、BclI、BfrI、BglI、BglII、BsiWI、BsmI、BssHII、BstEII、BstXI、Cfr9I、Cfr10I、Cfrl3I、CspI、Csp45I、DdeI、DraI、Eco47I、Eco47III、Eco52I、Eco8lI、Eco105I、EcoRI、EcoRII、EcoRV、EcoT22I、EheI、FspI、HaeII、HaeIII、HhaI、Hin1I、HincII、HindIII、HinfI、HpaI、HpaII、KpnI、MboII、MluI、MroI、MscI、MspI、MvaI、NaeI、NarI、NciI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NspV、PacI、PpuMI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、SacI、SacII、SalI、Sau3AI、Sau96I、ScaI、ScrFI、SfiI、SmaI、SpeI、SphI、SrfI、SspI、TaqI、TspEI、XbaIおよびXhoIなどの一般的な制限酵素により認識可能な部位が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「光活性化可能なリンカーの切断」という用語は、例えばレーザーなどの光および/または光からの熱に影響を受けやすい不安定な結合を切断または分解することによって、固定化されたオリゴヌクレオチドを放出し、それに従い当該固定化オリゴヌクレオチドを剥離させることを指す。例えば、結合領域は、当該結合にレーザーを照射した結果としての熱によって分解されてもよい。その他の光切断可能な群またはフォト切断可能な群としては、2−ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、8−キノリニルベンゼンスルホン酸塩、クマリン、ホスホトリエステル、ビス−アリールヒドラゾン、およびビマン2−チオプロピオン酸誘導体が挙げられる。特定の光活性化可能なリンカーは、Lericheら、Bioorganic and Medicinal Chemistry 20(2012)571−582により概説されており、当該開示内容は本明細書にその全体で参照により組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「標的」とは、本明細書に開示される一つまたは複数の方法を使用して特定される、合成される、または組み立てられる公知のヌクレオチド配列(例えば、顧客によって注文されたもの)の核酸を意味する。
本明細書で使用される場合、「構築オリゴヌクレオチド」とは、マルチプレックス核酸組立で利用されて標的核酸を生成することができるオリゴヌクレオチドを指す。構築オリゴヌクレオチドは、特定の核酸配列を特定し、所望の標的核酸へと組み立てられ得る(例えば、ライゲーションされ得る)二個以上の断片へと当該配列を解析することによって生成され得る。
本明細書において使用される場合、「所定順序」とは、本明細書に開示される一つまたは複数の方法を使用して特定、合成または組み立てるための公知のヌクレオチド配列(例えば、顧客によって注文された、またはオリゴヌクレオチド合成前に別手段で設計されたものなど)の核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「蛍光色素分子」または「蛍光標識」とは、特定の波長の放射エネルギーを吸収でき、別の特定の波長で放射エネルギーを発することができる官能基を含有する分子を指す。蛍光色素分子は、例えばオリゴヌクレオチドなどの分子に光を当てる、標識する、または特定するために物理的に付加され得る。フルオレセイン、ローダミン、またはシアニン系染料などをはじめとする、幅広い多様な蛍光色素分子が本明細書に記載の方法および装置に利用可能で、適用可能である。例えば、さまざまな染料が市販されており、Jackson Immuno Research(米国ペンシルバニア州ウェストグローブ)から市販されるCy染料、例えばCy2、Cy3、Cy5などが挙げられ、またはInvitrogen/Molecular Probes社(カリフォルニア州カールスバッド)から市販されるAlexa(登録商標)ファミリー、例えばAlexa:488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、および750などが挙げられる。フローサイトメトリーと適合する例えばMoFlo XDPなどの代替的蛍光色素分子は、Beckman Cutler社(米国マサチューセッツ州ダンバー)から市販されている。
あるいは、標識戦略は、たとえばQuantum Dotsなどの蛍光ナノ粒子などの標識部分を利用するものであり、当該ナノ粒子は、半導体構造とナノスケールのサイズにより、内在的な蛍光能力を保有する。かかるナノ結晶物質は、例えば、Invitrogen、Inc.(米国カリフォルニア州カールスバッド)から市販されている。こうした化合物は、個々の標識群として、または例えば他の無機ナノ結晶物または有機蛍光色素分子との双方向性の群またはペアとして存在しうる。一部の実施形態では、蛍光色素分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,133,702号に記載されるように組み込まれる。
「示差的に標識された」または「示差的ラベル」という用語は、当該標識、例えば蛍光標識が個々の標的(例えば、粒子)ごとに異なることを意味する。
本明細書で使用される場合、「含む(including)」、「備える(comprising)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「関与する(involving)」およびその変形は、その後に列挙された項目およびそのそれらの均等物および追加的項目を包含することを意味する。「からなる(consisting of)」は、構成要素または特徴の限定された範囲に関連するクローズエンドとして理解されるものとする。「本質的にからなる(consisting essentially of)」は、特定の構成要素または工程に対する範囲を制限するが、請求される本発明の基本的および新規の特徴に実質的な影響を与えないものは除外しない。
本明細書で使用される組み換え型核酸技術、合成生物学、および分子生物学の分野で使用されるその他の用語は、適用可能な分野の当業者によって一般的に理解されるであろう。
合成オリゴヌクレオチド
合成オリゴヌクレオチドは、構築オリゴヌクレオチドとしてマルチプレックス核酸組立で使用され得る。標的核酸を組み立てるための一つの戦略は、標的核酸の配列を分析し、標的核酸に組み立てられ得る(例えば、ライゲーションされ得る)二つ以上の構築オリゴヌクレオチドに分析することである。
合成オリゴヌクレオチドは、構築オリゴヌクレオチドとしてマルチプレックス核酸組立で使用され得る。標的核酸を組み立てるための一つの戦略は、標的核酸の配列を分析し、標的核酸に組み立てられ得る(例えば、ライゲーションされ得る)二つ以上の構築オリゴヌクレオチドに分析することである。
一部の実施形態では、一つ以上の構築オリゴヌクレオチドを組立前に増幅することができる。増幅を促進するために、一つ以上の構築オリゴヌクレオチドおよび/または部分構築体は、一つまたは複数のプライマー結束部位を備えるよう設計されてもよく、プライマーはポリメラーゼ連鎖反応においてそれらの部位に結合またはアニールすることができる。プライマー結束部位は、全ての構築オリゴヌクレオチドまたはそのサブセット、または二つ以上の部分構築体に対してユニバーサルである(すなわち、同じである)ように設計され得る。ユニバーサルプライマー結束部位(および対応するユニバーサルプライマー)を使用して、かかるユニバーサルプライマー結束部位を有するすべての構築オリゴヌクレオチドまたは部分構築体をポリメラーゼ連鎖反応で増幅させることができる。一つ以上の選択構築オリゴヌクレオチドおよび/または部分構築体に対して特異的なプライマー結合部位を設計してもよく、それにより当該選択構築オリゴヌクレオチドおよび/または部分構築体の標的とされた特異的増幅が可能となる。一部の実施形態では、一つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドおよび/または部分構築体は、一端または両端で入れ子型または直列型プライマー結合部位を含有してもよく、そこで一つまたは複数の外側プライマーと内側プライマーが結合し得る。一つの実施例では、構築オリゴヌクレオチドおよび/または部分構築体はそれぞれ、一対の外側プライマーおよび一対の内側プライマーのための結合部位を有する。外側プライマー対のうちの一つまたは両方が、ユニバーサルプライマーであってもよい。あるいは外側プライマー対のうちの一つまたは両方が、固有プライマーであってもよい。一部の実施形態では、組立前に、構築オリゴヌクレオチドの各々が個々に増幅される。構築オリゴヌクレオチドはまた、増幅用の一つまたは複数のプールへとプールされ得る。一つの実施例では、すべての構築オリゴヌクレオチドが単一のプールで増幅される。特定の実施形態では、増幅された構築オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼを基にした組み立てまたはライゲーションを介して組み立てられる。増幅された構築オリゴヌクレオチドは、階層的に、または連続的に、または一工程の反応で、標的核酸へと組み立てられてもよい。
プライマー結合部位のうちの一つ以上が、構築オリゴヌクレオチドの一部となるように設計されてもよく、そして当該部分は最終標的核酸へと組み込まれる。一部の実施形態では、各プライマー結合部位のすべてまたは一部が、構築オリゴヌクレオチドの中央部分の外側の隣接領域の形態であってもよく、この場合において当該中央部分が最終標的核酸に組み込まれ、当該隣接領域は組立前に除去される必要がある。その目的のために、一つまたは複数の制限酵素(RE)部位を設計し、当該隣接領域の除去を行ってもよい。
一部の実施形態では、RE部位は、例えばIIP型またはIIS型などのII型のRE部位、および修飾部位またはハイブリッド部位であってもよい。IIP型酵素は、4〜8塩基対の長さの対称的な(またはパリンドローム構造の)DNA配列を認識し、一般的にその配列内で切断する。例:EcoRI、HindIII、BamHI、NotI、PacI、MspI、HinP1I、BstNI、NciI、SfiI、NgoMIV、EcoRI、HinfI、Cac8I、AlwNI、PshAI、BglI、XcmI、HindIII、NdeI、SacI、PvuI、EcoRV、NciI、TseI、PspGI、BglII、ApoI、AccI、BstNI、およびNciI。IIS型制限酵素は、認識部位から0〜20塩基離れた一か所で二本鎖切断を行う。例としては、BstF5I、BtsCI、BsrDI、BtsI、AlwI、BccI、BsmAI、EarI、MlyI(平滑)、PleI、BmrI、BsaI、BsmBI、FauI、MnlI、SapI、BbsI、BciVI、HphI、MboII、BfuAI、BspCNI、BspMI、SfaNI、HgaI、BseRI、BbvI、EciI、FokI、BceAI、BsmFI、BtgZI、BpuEI、BsgI、MmeI、BseGI、Bse3DI、BseMI、AcIWI、Alw26I、Bst6I、BstMAI、Eam1104I、Ksp632I、PpsI、SchI(平滑)、BfiI、Bso31I、BspTNI、Eco31I、Esp3I、SmuI、BfuI、BpiI、BpuAI、BstV2I、AsuHPI、Acc36I、LweI、AarI、BseMII、TspDTI、TspGWI、BseXI、BstV1I、Eco57I、Eco57MI、GsuI、およびBcgIが挙げられるが、これらに限定されない。かかる酵素、およびそれらの認識部位と切断部位に関する情報は、例えばNew England Biolabs,Inc.(米国マサチューセッツ州イプスウィッチ)などの卸売業者から入手可能である。
RE部位は、たとえばMspJI、SgeIおよびFspEIなどのメチル化感受性ヌクレアーゼで消化され得るように、メチル化されてもよい。こうしたヌクレアーゼはIIM型とIIS型の特性の両方を共有する。したがって、かかるヌクレアーゼは、メチル化特異的4bp部位であるmCNNR(N=AまたはTまたはCまたはG、R=AまたはG)のみを認識し、この認識配列の外側のDNAを切断する。
標的核酸に基づき構築オリゴヌクレオチドを設計した後、販売会社または当分野に公知の任意の方法により構築オリゴヌクレオチドは合成されることができ、または別手段により供給されることができる。典型的には、オリゴヌクレオチド合成は多くの化学的工程を含み、それら工程は当該合成全体を通じてサイクル反復方式で実施され、各サイクルは増殖するオリゴヌクレオチド鎖に一ヌクレオチドを付加する。サイクルに含まれる化学的工程は、さらなる鎖伸長のために官能基を遊離させる脱保護工程、合成されるオリゴヌクレオチドにヌクレオチドを組み込むカップリング工程、そして例えばホスホラミダイト化学で必要とされる酸化工程など、オリゴヌクレオチド合成で使用される特定の化学に要求されるその他の工程である。任意でカップリング工程で伸長されなかった官能基をブロックするキャッピング工程をこのサイクルに入れてもよい。末端ヌクレオチドの5’ヒドロキシル基にヌクレオチドが付加されてもよく、その場合、オリゴヌクレオチド合成は3’→5’の方向に行われる。または末端ヌクレオチドの3’ヒドロキシル基にヌクレオチドが付加されてもよく、その場合、オリゴヌクレオチド合成は5’→3’の方向で行われる。
明確性を目的として、二本鎖核酸の二つの相補的な鎖は本明細書において、正(P)の鎖、および負(N)の鎖と呼称される。この指定は、当該鎖がコード配列のセンス鎖とアンチセンス鎖であることを暗示することは意図していない。それらは核酸の配列または機能に関わらず、単に核酸(例えば、標的核酸、中間核酸断片など)の二つの相補的な鎖を指しているに過ぎない。したがって、一部の実施形態では、P鎖はコード配列のセンス鎖であってもよく、一方で他の実施形態では、P鎖はコード配列のアンチセンス鎖であってもよい。本明細書において相補的核酸または相補的核酸領域への参照は、互いに逆相補である配列を有する核酸またはその領域を指し、それらは天然型DNAの典型的な逆平行の様式でハイブリダイズすることができる。
本開示の一部の態様では、本明細書に記載の方法に従って合成されたか、またはその他の方法で調製されたオリゴヌクレオチドは、対象の標的ポリヌクレオチドの組立のための構成要素として使用され得る。
オリゴヌクレオチドは、当分野に公知の方法を使用して固形支持体上で合成されてもよい。一部の実施形態では、多くの別個の一本鎖オリゴヌクレオチドは、固形支持体の別個の機構に固定化される。一部の実施形態では、支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、その5’末端または3’末端を介して付加されてもよい。一部の実施形態では、支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列(例えば、縮重結合配列)、リンカー(例えば、光活性化リンカーまたは化学リンカー)を介して支持体上に固定化されてもよい。3’末端とは、5’末端に対し下流の配列を意味し、5’末端とは、3’末端に対して上流の配列を意味することを認識されたい。例えば、オリゴヌクレオチドは、その後の反応に関与しないヌクレオチド配列またはリンカーを介して支持体上に固定化されてもよい。
本開示の特定の実施形態は、不活性基材および多孔性反応層から構成される固形支持体を使用してもよい。多孔性反応層は、事前に合成されたオリゴヌクレオチドの固定化に関する化学的機能を提供することができ、またはオリゴヌクレオチド合成に関する化学的機能を提供することができる。一部の実施形態では、アレイ表面は、核酸の固定化または共有結合に適した反応基を備えた物質で処理または被覆されてもよい。オリゴヌクレオチドの固定化またはin situ合成に適した反応基を有する当分野に公知の任意の物質を使用することができる。
一部の実施形態では、多孔性反応層は、ヒドロキシル反応基を含むように処理されてもよい。例えば、多孔性反応層はスクロースを含んでもよい。
本開示の一部の態様によると、3’ホスホリル基オリゴヌクレオチドで終わるオリゴヌクレオチドは、固形支持体に結合した化学リン酸化試薬を有する固形支持体上で、3’→5’方向に合成されることができる。一部の実施形態では、リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの合成の前に、多孔性層に結合されてもよい。例示的な実施形態では、リン酸化試薬はスクロースに結合され得る。例えば、リン酸化試薬は、2−[2−(4,4’−ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル−(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)−ホスホラミダイトであってもよい。一部の実施形態では、3’リン酸化オリゴヌクレオチドは本明細書に記載される方法に従い固形支持体から放出され、その後に修飾を受けてもよい。一部の実施形態では、3’リン酸化オリゴヌクレオチドは、水酸化アンモニウムを使用して固形支持体から放出されてもよい。
一部の実施形態では、組立用合成オリゴヌクレオチドが設計されてもよい(たとえば、配列、サイズおよび数)。合成オリゴヌクレオチドは、標準的なDNA合成化学(例えば、ホスホラミダイト法)を使用して生成されてもよい。合成オリゴヌクレオチドは、本明細書でより詳細に解説されるように、任意の適切な技術を使用して、例えばマイクロアレイなどの固形支持体上で合成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイから溶出され、その後に増幅されてもよく、またはマイクロアレイ上で増幅されてもよい。当然のことながら、異なるオリゴヌクレオチドは、異なる長さを持つように設計され得ることを認識されたい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、米国特許第7,563,600号、米国特許出願第13/592,827号およびWO2014/004393として公開されたPCT/US2013/047370に記載されるように(例えばアレイ形式上で)合成される。それら文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一般的な支持体上でin situで合成され、当該支持体で、各オリゴヌクレオチドは基材上の離れたまたは別個の機構(またはスポット)上で合成される。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドが、支持体または機構の表面に結合される。本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、さらなる反応のためのオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、送付、増幅、および放出するための個別の機構の配置を指す。アレイは平面的であってもよい。ある実施形態では、支持体またはアレイは、アドレス指定可能である。支持体は、当該支持体上の特定の所定の位置(すなわち、「アドレス」)で二個以上の別個のアドレス指定可能な機構を含む。したがって、アレイの各オリゴヌクレオチド分子は、支持体上の既知および規定の位置に配置される。各オリゴヌクレオチドの配列は、支持体上のその位置から決定されることができる。さらにアドレス指定可能な支持体またはアレイにより、例えば液滴などの個別の単離された体積の直接的な制御が可能となる。規定の機構のサイズは、当該機構上で微量の液滴が形成されるように選択することができ、各液滴は互いに別個に保持される。本明細書に記載される場合、機構は、必ずではないが典型的には機構間の空間により分けられており、それにより二つの隣接する機構間の液滴が確実に融合されないようになっている。典型的には機構間にはその表面上にオリゴヌクレオチドがいずれも担持されておらず、不活性空間に相当するであろう。一部の実施形態では、機構および機構間は、その親水性または疎水性の特性が異なる場合がある。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖の核酸であってもよい。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドを本明細書に記載されるように使用してもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように化学的に合成されてもよい。一部の実施形態では、合成オリゴヌクレオチドは、使用前に増幅されてもよい。得られた製品は、二本鎖であってもよい。
一つまたは複数の修飾塩基(例えば、ヌクレオチド類似体)を組み込むことができる。修飾の例としては、以下のうちの一つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない:例えばシトシンおよびグアニンなどのメチル化塩基;例えばニトロインドール、dPおよびdK、イノシン、ウラシルなどのユニバーサル塩基;例えばBrdUなどのハロゲン化塩基;蛍光標識塩基;例えばビオチン(dTの誘導体として)およびジゴキシゲニン(DIG)などの非放射性標識;2,4−ジニトロフェニル(DNP);放射性ヌクレオチド;例えばdR−NH2(デオキシリボースNEb)などの結合後修飾;アクリジン(6−クロロ−2−メトキシアクリジン);および例えばC3、C8(オクタンジオール)、C9、C12、HEG(ヘキサエトレングリコール)およびC18などの配列内にスペーサー「アーム」を加えるために合成中に使用されるスペーサーホスホラミド。
さまざまな実施形態で、合成一本鎖または合成二本鎖のオリゴヌクレオチドは非天然型であってもよく、例えば、それらがヘミメチル化される(一つの鎖のみがメチル化される)、またはセミメチル化される(一つの鎖または両方の鎖の正常なメチル化部位の一部のみがメチル化される)、または低メチル化される(正常なメチル化部位よりも多くが一つの鎖または両方の鎖でメチル化される)ような方法で非メチル化または修飾され(例えば化学的または生化学的にin vitro修飾される)、または非天然型メチル化パターンを有してもよい(正常なメチル化部位の一部が一つの鎖または両方の鎖でメチル化され、および/または正常な非メチル化部位がメチル化される)。対照的に、天然型DNAは、典型的には、例えばDNAのシトシン環のC−5位置での、in vivoでのDNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)によるメチル化などのエピジェネティックな修飾を含有している。DNAメチル化は、Jinら、Genes&Cancer 2011 Jun;2(6):607−617により概説され、当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
マルチプレックス核酸組立
マルチプレックス核酸組立を使用して、一つ以上の標的核酸を調製することができ、この場合において各標的に対し、複数の構築オリゴヌクレオチドを予め設計された順序に従って互いに接触させてもよい。構築オリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよく、この場合において、設計によって正と負の鎖を交互に並ばせ、一つの鎖を次の鎖と部分的にアニーリングさせて、それらが共に二本鎖製品を形成してもよい。構築オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよく、および互換性のある粘着性末端を有するよう設計されてもよく、当該粘着性末端は互いに少なくとも部分的にアニーリングし、予め設計された順序で構築オリゴヌクレオチドを整列させて二本鎖製品を形成させる。二本鎖製品はギャップが無くてもよく、およびライゲーションで標的核酸を生成してもよい。二本鎖製品は、ポリメラーゼによって埋められ得るギャップを含んでもよい。
マルチプレックス核酸組立を使用して、一つ以上の標的核酸を調製することができ、この場合において各標的に対し、複数の構築オリゴヌクレオチドを予め設計された順序に従って互いに接触させてもよい。構築オリゴヌクレオチドは一本鎖であってもよく、この場合において、設計によって正と負の鎖を交互に並ばせ、一つの鎖を次の鎖と部分的にアニーリングさせて、それらが共に二本鎖製品を形成してもよい。構築オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよく、および互換性のある粘着性末端を有するよう設計されてもよく、当該粘着性末端は互いに少なくとも部分的にアニーリングし、予め設計された順序で構築オリゴヌクレオチドを整列させて二本鎖製品を形成させる。二本鎖製品はギャップが無くてもよく、およびライゲーションで標的核酸を生成してもよい。二本鎖製品は、ポリメラーゼによって埋められ得るギャップを含んでもよい。
一部の実施形態では、組み立ては、複数の標的核酸が同時に調製される並行様式で行われてもよい。例えば、2〜100,000、5〜10,000、10〜1000、または100〜500、またはその他の任意の数の標的を並行に製造してもよい。
組み立ては、階層的、連続的および/または一工程の組み立てを使用して実行することができる。例示の目的で、オリゴヌクレオチドA、B、CおよびD(それぞれ構築オリゴヌクレオチド)のA+B+C+D標的への階層的な組み立ては、最初にA+BおよびC+Dの組み立て(それぞれ部分構築体または部分組み立て)、その後にA+B+C+Dの組み立てを含んでもよい。連続的な組み立ては、A+B(一次部分構築体または部分組み立て)の組み立て、その後にA+B+C(二次部分構築体または部分組み立て)の組み立て、そして最終的にA+B+C+D(標的)の組み立てを含んでもよい。一工程組み立ては、A、B、CおよびDを一つの反応で組み合わせて、A+B+C+Dを生成する。異なる戦略を組み合わせてもよいことに留意されたい。その場合、構築オリゴヌクレオチドの一部は一つの戦略で組み立てられ、一方で別の部分は別の戦略で組み立てられる。
構築オリゴヌクレオチドは、例えば、上述のような固形支持体上で、化学合成されてもよい。一部の実施形態では、構築オリゴヌクレオチドは充分な量で合成されてもよく、それにより構築オリゴヌクレオチドのうちの一つ以上を増幅させる必要無く、直接、部分組み立てまたは総組み立てが可能となる。特定の実施形態において、構築オリゴヌクレオチドは、化学合成後、最初は部分構築体への部分組み立てに供されてもよい。そしてその部分構築体を(例えばポリメラーゼ連鎖反応において)増幅し、その後、二次副構築体または最終標的へのさらなる組み立てに供されてもよい。一部の実施形態では、組立前に一つ以上の構築オリゴヌクレオチドが増幅されてもよい。その目的のために、構築オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されるように一つ以上のユニバーサルプライマーまたは特異的プライマーの結合部位を有するように設計されてもよい。
組み立ては、固形支持体上で行われてもよく、任意で例えばPCT公開WO2011/066185およびWO2011/056872に開示される装置などのマイクロ流体装置により補助されてもよい。各文献の開示内容は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
ビーズを基にした組み立ておよび単離
マルチプレックス核酸組立の一つの戦略は、ビーズまたは他の個別化された固形支持体に末端構築オリゴヌクレオチドを付加させながら、その他の遊離した付加していない構築オリゴヌクレオチドを、ビーズに付加した当該末端構築オリゴヌクレオチドとともに連続的にまたはワンポット反応で組み立て、それにより一つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを生成することである。あるいは、標的ポリヌクレオチドの一部ではないアンカーオリゴヌクレオチドをビーズに付加させてもよく、これは構築オリゴヌクレオチドとビーズとの間のリンカーとして機能することができる。例えば図1Aに関し、ビーズA、B、Cは、それに付加されたアンカーまたは末端構築オリゴヌクレオチドのA1、B1、C1を有するように設計される。A1、B1、C1は、二本鎖として図示されているが、一本鎖でも同様にあり得ることを理解されたい。
マルチプレックス核酸組立の一つの戦略は、ビーズまたは他の個別化された固形支持体に末端構築オリゴヌクレオチドを付加させながら、その他の遊離した付加していない構築オリゴヌクレオチドを、ビーズに付加した当該末端構築オリゴヌクレオチドとともに連続的にまたはワンポット反応で組み立て、それにより一つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを生成することである。あるいは、標的ポリヌクレオチドの一部ではないアンカーオリゴヌクレオチドをビーズに付加させてもよく、これは構築オリゴヌクレオチドとビーズとの間のリンカーとして機能することができる。例えば図1Aに関し、ビーズA、B、Cは、それに付加されたアンカーまたは末端構築オリゴヌクレオチドのA1、B1、C1を有するように設計される。A1、B1、C1は、二本鎖として図示されているが、一本鎖でも同様にあり得ることを理解されたい。
図1Aと1Bに関し、ビーズA、B、C....はそれぞれ、それに付加された(末端)構築オリゴヌクレオチドのA1、B1、C1....を有し得る。さらに構築オリゴヌクレオチドの第二の組み合わせのA2、B2、C2...がそれぞれ、A1、B1、C1と組み立てられてもよい。最終的な組み合わせであるAn、Bn、Cn…(nは、2以上の整数であり、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30など)が組み立てられて、標的核酸のXA(配列A1A2...Anを有する)、XB(配列B1B2...Bnを有する)、XC(配列C1C2...Cnを有する)などが形成されるまで、構築オリゴヌクレオチドの追加の組み合わせが加えられてもよい。あるいは構築オリゴヌクレオチドのn個すべての組み合わせ(A1、B1、C1...)、(A1、B1、C1...)...(An、Bn、Cn...)が共に単一ポット組立反応で混合され、標的核酸のXA、XB、XC...を形成してもよい。
一部の実施形態では、組み立て前、組み立て中、および/または組み立て後に、ビーズA、B、C...を互いに分離させて、構築オリゴヌクレオチド、部分構築体、および/または最終組立製品を単離することが望ましい場合がある。一つの方法は、ビーズ混合物が充分に希釈されている限界希釈であり、それによって分注物がウェル内に置かれたとき、当該分注物は2個以上のビーズを含まなくなる。そこから、その唯一のビーズに付加された核酸が単離され、(たとえば配列解析により)特定される。しかし、開始混合物が複数のビーズA、複数のビーズB、複数のビーズC...を含んだ場合、限界希釈は、同じビーズを有する多数の重複分注物を生成する。すべての重複分注物を分析してビーズに付加された核酸を特定しなければならないため、この方法は時間の消費が激しく、コストがかかり得る。
時間とコストを節約するために、別の方法では、ビーズA、B、C…は互いに分離され得るように示差的に標識される。示差的標識の例は蛍光色素分子である。多種多様な蛍光色素分子が市販されており、これを使用して異なるビーズを標識し、フローサイトメトリー(例えば、ベックマン・コールター社のMoFlo(商標)XDP)を使用したソーティングを行うことができる。特定の実施形態では、2−フルオロコアシステムは、ビーズを標識するように設計されてもよい。具体的には、二種の蛍光色素分子を選択して異なる比率で別々のビーズに付加し、それによりレーザーで励起されたときに、別々のビーズは、付加された蛍光色素分子によって別々の発光スペクトラムを有するようになる。一例として、蛍光色素分子のF1およびF2は、相対量でそれぞれ10%と90%でビーズA上に存在してもよく、それぞれ15%と85%でビーズB上に存在してもよく、それぞれ20%と80%でビーズC上に存在してもよい。フローサイトメトリーで別個のビーズをゲーティングするのに充分なほどの発光スペクトルの差異をあらかじめ設計しておくこともできる。ゲーティングされたビーズをマルチウェルプレート上に配置して、たとえばビーズ上の核酸の配列解析などのさらなる分析を行うこともできる。
例えば図2は、組み立てられたオリゴヌクレオチドの単一化およびソーティングの方法の例を図示する。ビーズA、B、Cは、本明細書に開示されるように示差的な標識を含有してもよい。反応容器10での組立後、完全に組み立てられ、示差的に標識された標的オリゴヌクレオチドは、その後、フローサイトメトリー20によって、自身固有の発光スペクトルに従ってゲーティングされてもよい。ゲーティングされたビーズをマルチウェルプレート30において、個々のウェル30A、30B、30C...内に配置してもよい。
選択的な単一化は、完全な組み立ての後に行われてもよく、および/または組み立ての間に行われてもよく、その場合、一個以上の部分構築体が例えば増幅、配列解析および/またはさらなる組立などのさらなる操作のために単一化され得ることに留意されたい。加えて、組み立て前の構築オリゴヌクレオチドも、増幅、配列解析および/または組立のために選択的に単一化され得る。
本開示の様々な態様は、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよく、または上述の実施形態で具体的には検討されなかった様々な設定において使用されてもよく、ゆえにその応用において、前述の説明において解説された、または図面において図示された構成要素の詳細および設定に限定されない。例えば、一つの実施形態で記載された態様は、その他の実施形態で記載された態様と、任意の様式で組み合わせられてもよい。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的のためであり、限定と見なされるべきではない。
請求の範囲において、請求項の構成要素を修飾するための例えば、「第一」、「第二」、「第三」等の序数用語の使用は、それ自身で一つの請求項の構成要素が他を超えるという任意の優先度、優位性又は順序を暗示するものではなく、さもなければ方法の行為が行われる時間的順序を暗示するものでもない。それらは、請求項の構成要素を識別するために、特定の名称を有する一つの請求項の構成要素を、(序数用語の使用に関し)同一の名称を有する他の構成要素から識別するための標識として単に使用されているものである。
参照による組み込み
本明細書に言及されるすべての公表文献、特許および配列データベースエントリーは、それぞれ個々の公表文献または特許が具体的および個々に参照により組み込まれるように示されたとして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に言及されるすべての公表文献、特許および配列データベースエントリーは、それぞれ個々の公表文献または特許が具体的および個々に参照により組み込まれるように示されたとして、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (14)
- マルチプレックス核酸組立のための装置であって、
a)第一の粒子、第二の粒子、および第三の粒子を含み、それぞれ第一のアンカーヌクレオチド、第二のアンカーヌクレオチド、および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子、
b)第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで前記第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチド、
c)第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで前記第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチド、ならびに
d)第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで前記第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチドを、含む、装置。 - 前記第一、第二および第三の粒子が、それに付加されたそれぞれ異なる蛍光色素分子を有する、請求項1に記載の装置。
- 前記第一、第二および第三の粒子が、それに付加されたそれぞれ二種の蛍光色素分子の異なる混合物を有する、請求項1に記載の装置。
- 前記複数の示差的に標識された粒子は、単一の反応体積中に提供される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第一、第二および第三の構築オリゴヌクレオチドは、互いに固有の相補配列を有するよう設計される、請求項4に記載の装置。
- 各粒子が別個の反応体積中に提供される、請求項1に記載の装置。
- 各別個の反応体積が、異なるウェル中に提供される、請求項6に記載の装置。
- マルチプレックス核酸組立のための方法であって、
a)第一の粒子、第二の粒子、および第三の粒子を含み、それぞれ第一のアンカーヌクレオチド、第二のアンカーヌクレオチド、および第三のアンカーオリゴヌクレオチドがその上に固定された、複数の示差的に標識された粒子を提供すること、
b)第一の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第一の末端オリゴヌクレオチドで前記第一のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第一の粒子上に第一の核酸を形成するよう設計された複数の第一の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、
c)第二の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第二の末端オリゴヌクレオチドで前記第二のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第二の粒子上に第二の核酸を形成するよう設計された複数の第二の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、ならびに
d)第三の所定順序で互いに少なくとも部分的にアニーリングし、および第三の末端オリゴヌクレオチドで前記第三のアンカーオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にアニーリングして、それによって前記第三の粒子上に第三の核酸を形成するよう設計された複数の第三の構築オリゴヌクレオチドを提供すること、を含む、方法。 - 前記第一、第二および第三の粒子が、それに付加されたそれぞれ異なる蛍光色素分子を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記第一、第二および第三の粒子が、それに付加されたそれぞれ二種の蛍光色素分子の異なる混合物を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記複数の示差的に標識された粒子は、単一の反応体積中に提供される、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一、第二および第三の構築オリゴヌクレオチドは、互いに固有の相補配列を有するよう設計される、請求項11に記載の方法。
- 各粒子が別個の反応体積中に提供される、請求項8に記載の方法。
- 各別個の反応体積が、異なるウェル中に提供される、請求項13に記載の方法。
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