JP2009538622A - コドン最適化法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、2007年2月14日出願の米国仮出願第60/901,687号、及び2006年5月30日出願の米国仮出願第60/809,536号の優先権を主張する。
表2はコドン頻度表を表し、各アミノ酸/コドンの組を列挙している。i)MB214中のコドンの頻度百分率、ii)解析した遺伝子中のコドンの頻度百分率、及びiii)解析した遺伝子とMB214における使用頻度の差百分率。強調表示は、MB214中のコドン使用頻度が10%未満であることを示す。遺伝子使用頻度欄の「0.00」値の強調表示は、解析した配列では使用されていないレアコドンを示す。
1)GCG(Accelrys Software, Inc., San Diego, CAから入手可能)CODONFREQUENCYは、合成バージョンのコドン使用頻度を決定するために実施することができる。出力ファイルを解析し、各遺伝子についてデータベースに保存されているカットオフ百分率値によって定義される任意のレアコドンの存在を検出することができる;
2)GCG MAPSORTは、将来のサブクローニングに干渉し得る任意の望ましくない制限酵素の存在を決定するために実施することができる。評価した制限酵素のリストを、酵素、発現ベクター、及び遺伝子間の関係により、データベースから抽出することができる。出力ファイルを解析して、酵素のリストから任意の制限部位の存在を検出することができる;
3)GCG FINDPATTERNSは、合成バージョンにおいて回避されるべき任意の配列モチーフの存在を検出するために実施することができる。各パターンを、データベース中でその特定パターンについての許容ミスマッチ数とともに定義することができる。出力ファイルを解析して、定義された有害な配列モチーフのいずれかの存在を検出することができる;
4)プログラム(例えば、Perlプログラム)は、存在する任意のステムループ構造の強度を検出するために実施することができる。このプログラムは、配列中の推定ステムループの位置を見つけるためにGCG STEMLOOPを連続して実施し、それらのループのコーディネートを抽出した後、それらのループコーディネートを、ループ構造の自由エネルギーを決定するためにGCG MFOLDにかけることができる。出力結果は、自由エネルギーによってソートすることができ、5つの最強ループのデータを抽出することができる。加えて、比較目的で最強ループの自由エネルギーを報告することができる;さらに
5)GCG BESTFITは、エラーによって突然変異が導入されていないことを確実にするために、天然及び合成DNA配列のペプチド翻訳を比較するために実施することができる。翻訳配列は、GCG TRANSLATEによって作成することができる。出力結果を解析し、報告することができる。
P.フルオレセンスからの合成遺伝子の設計
最適なシャイン・ダルガーノ配列と特異SpeI制限酵素部位を含有するDNA領域をコード配列の上流に付加した。3つの停止コドンと特異XhoI制限酵素部位を含有するDNA領域をコード配列の下流に付加した。Pfenex ORFome中5%未満のコドン使用頻度で出現する全てのレアコドンを、リボソームの失速を回避するように変更した。2又はそれ以下のミスマッチを有するパターンaggaggtn5−10dtgにマッチした全ての遺伝子内リボソーム結合部位を、末端切断型タンパク質産物を回避するように変更した。5又はそれ以上のC、あるいは5又はそれ以上のGヌクレオチドの伸展を排除して、RNAポリメラーゼスリッページを回避した。強い遺伝子内ステムループ構造、特にリボソーム結合部位を包含するものを変更した。この合成遺伝子はDNA2.0,Inc.(Menlo Park, CA)によって合成された。
P.フルオレセンスからの合成遺伝子の設計
最終発現タンパク質産物にはメチオニン21〜グルタミン520のアミノ酸が含まれた。Pfenex ORFome中5%未満のコドン使用頻度で出現する全てのレアコドンを、リボソームの失速を回避するように変更した。2又はそれ以下のミスマッチを有するパターンaggaggtn5−10dtgにマッチした全ての遺伝子内リボソーム結合部位を、末端切断型タンパク質産物を回避するように変更した。5又はそれ以上のC、あるいは5又はそれ以上のGヌクレオチドの伸展を排除して、RNAポリメラーゼスリッページを回避した。強い遺伝子内ステムループ構造、特にリボソーム結合部位を包含するものを変更した。24アミノ酸pbp周辺質分泌リーダーをコードするDNA配列を最適化配列の5’末端に融合した。最適シャイン・ダルガーノ配列と特異SpeI制限酵素部位を含有するDNA領域をコード配列の上流に付加した。3つの停止コドンと特異XhoI制限酵素部位を含有するDNA領域をコード配列の下流に付加した。この合成遺伝子はDNA2.0,Inc.によって合成された。
Claims (20)
- 組換えタンパク質を生産する方法であって、
宿主シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)菌における異種発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチドの配列を最適化する段階と;
前記最適化された合成ポリヌクレオチド配列を発現ベクターに連結する段階と;
前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌を前記発現ベクターで形質転換する段階と;
前記形質転換された宿主シュードモナス・フルオレセンス菌を前記タンパク質の発現に適した好適な培地において培養する段階と;
前記タンパク質を単離する段階と
を含む、方法。 - 前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌における異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌においてほとんど使用されない、前記合成ポリヌクレオチド配列由来のレアコドンを同定及び変更する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌における異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、前記合成ポリヌクレオチド配列由来の推定内部リボソーム結合部位配列を同定及び変更する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌における異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、前記合成ポリヌクレオチド配列由来のG又はCヌクレオチドの伸長リピートを同定及び変更する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌における異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、前記合成ポリヌクレオチド配列のRBS及び遺伝子コード領域におけるmRNA二次構造を同定及び最小化する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主シュードモナス・フルオレセンス菌における異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、前記合成ポリヌクレオチド配列由来の望ましくない酵素制限部位を同定及び変更する段階をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- レアコドンを同定及び変更する段階が、前記シュードモナス・フルオレセンス菌のゲノム中における出現が10%未満であるコドンを同定及び変更する段階を含む、請求項2に記載の方法。
- レアコドンを同定及び変更する段階が、前記シュードモナス・フルオレセンス菌のゲノム中における出現が5%未満であるコドンを同定及び変更する段階を含む、請求項2に記載の方法。
- 異種発現のために前記合成ポリヌクレオチド配列を最適化する段階が、発現を増加させるために前記合成ポリヌクレオチド配列由来のコドンを同定及び変更する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記レアコドンを変更する段階が、前記レアコドンを高頻度で出現するコドンに置き換える段階を含む、請求項2に記載の方法。
- 組換えタンパク質を生産する方法であって、
前記宿主シュードモナス属(Pseudomonas)細菌においてほとんど使用されない、前記合成ポリヌクレオチド配列由来のレアコドンを同定及び変更する段階と;
前記合成ポリヌクレオチド配列由来の推定内部リボソーム結合部位配列を同定及び変更する段階と;
前記合成ポリヌクレオチド配列由来のG又はCヌクレオチドの伸長リピートを同定及び変更する段階と;
前記合成ポリヌクレオチド配列のRBS及び遺伝子コード領域におけるmRNA二次構造を同定及び最小化する段階と;
最適化された合成ポリヌクレオチド配列を形成するために前記合成ポリヌクレオチド配列由来の望ましくない酵素制限部位を同定及び変更する段階と;
前記最適化された合成ポリヌクレオチド配列を発現ベクターに連結する段階と;
前記宿主シュードモナス属細菌を前記発現ベクターで形質転換する段階と;
前記形質転換された宿主シュードモナス属細菌を前記タンパク質の発現に適した好適な培地において培養する段階と;
前記タンパク質を単離する段階と
を含む、方法。 - 前記宿主シュードモナス属細菌がシュードモナス・フルオレセンスである、請求項11に記載の方法。
- 前記宿主シュードモナス属細菌がシュードモナス・フルオレセンス株MB101である、請求項11に記載の方法。
- レアコドンを同定及び変更する段階が、前記シュードモナス・フルオレセンス菌ゲノム中における出現が10%未満であるコドンを同定及び変更する段階を含む、請求項12に記載の方法。
- レアコドンを同定及び変更する段階が、前記シュードモナス・フルオレセンス菌ゲノム中における出現が5%未満であるコドンを同定及び変更する段階を含む、請求項12に記載の方法。
- 最適化された遺伝子を解析する方法であって、
シュードモナス・フルオレセンス菌用の遺伝子最適化データベースを提供する段階と;
前記データベースに遺伝子データを入力する段階と;
発現ベクター又は宿主を同定する段階と;
候補遺伝子又は転写ユニットの合成リクエストを提示する段階と;
前記データベースに最適化された遺伝子配列を追加する段階と;
確実に合成リクエストが順守されるように合成された候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンを評価する段階と;
前記候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンを解析する段階と
を含む、方法。 - 前記候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンの解析結果のレポートを作成する段階をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンを解析する段階が、候補遺伝子を検査(inspection)により又はコンピュータ(computationally)により解析する段階を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンを解析する段階が、候補遺伝子によってもたらされる発現のレベルを解析する段階を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記候補遺伝子の1又はそれ以上の合成バージョンを解析する段階が、高もしくは低GC含量の有無、配列エレメント、又は前記候補遺伝子の構造を解析する段階を含む、請求項16に記載の方法。
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