CN108359669B - 一种棒杆菌启动子及其应用 - Google Patents

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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)

Abstract

本发明公开了一种棒杆菌启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(‑1)，解决了在谷氨酸棒杆菌中启动子强度不够强的问题。将启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(‑1)直接导入棒杆菌的待表达基因前，应用于基因的表达及相关代谢产物的生产，提供了比Psod和Ptuf更强的启动子。本发明还可应用于协调棒杆菌中其它基因的表达及相关代谢产物的合成。

Description

一种棒杆菌启动子及其应用
技术领域
本发明涉及一种棒杆菌启动子及其应用，尤其是一种棒杆菌中的胁迫感应启动子PdnaK及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
启动子位于转录起始点上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，由此启动转录。
棒杆菌是安全生产菌，无内毒素及胞外水解酶活性，广泛应用于多种氨基酸及有机酸的生产，如谷氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，尼龙-4等，其产品可作为饲料添加剂，食品添加剂，医药中间体，可降解塑料的前体，在化妆品行业也有着重要应用。近年来棒杆菌启动子工程取得了很大的进展，棒杆菌基因组上的启动子如Psod，Ptuf，PcspB等近年来被应用于增强相关基因的表达，并取得了一定的成效。虽然组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子等都有所报道，但是真正应用于棒杆菌的还比较少，且迫切需求更多的启动子来增强基因的表达，平衡代谢流，以实现高产目的代谢产物的目标。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了几种适用于棒杆菌的启动子，将其连接到表达载体上，或者将其插入棒杆菌染色体上待表达基因的前面，构建重组菌，可用于表达相关的基因，催化相关代谢产物的合成。
所述启动子，包括SEQ ID NO.1所示的PdnaK、SEQ ID NO.2所示的PdnaK(+1)、SEQ IDNO.3所示的PdnaK(-1)。
所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)是谷氨酸棒杆菌中编码热激蛋白的dnaK基因上游的序列，dnaK基因是胁迫感应基因。
所述启动子PdnaK(+1)是在PdnaK的基础上向下游延伸60bp。
所述启动子PdnaK(-1)是在PdnaK的基础上向上游延伸60bp。
所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)可用于构建各种表达载体，例如用于表达载体pJYW-4，pJYW-5，pDXW-8，pDXW-10等。所得表达载体可以用于在各种棒杆菌属中表达基因或合成特定代谢产物，例如谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌等。
所述启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)可以应用于在谷氨酸棒杆菌中表达谷氨酸脱羧酶基因(gadB2)。例如，以谷氨酸高产的谷氨酸棒杆菌为宿主，以PdnaK或PdnaK(+1)或PdnaK(-1)作为gadB2的启动子表达谷氨酸脱羧酶。可以pJYW-5为载体，将其已有PtacM启动子切掉替换为启动子PdnaK，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)，构建重组表达载体。
本发明有益效果：本发明提供的启动子PdnaK、PdnaK(+1)、PdnaK(-1)在发酵的中后期转录水平明显上调，适用于前期微弱表达，后期增强表达的状况，例如前期积累底物，后期转化合成产物的相关发酵，而常用的启动子如Psod，Ptuf等均属于组成型表达，而诱导启动子需添加诱导剂，增加生产成本且不安全。
具体实施方式
下面通过实例来证明Pdnak，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)启动子的应用，但并非局限于只能用作谷氨酸脱羧酶基因的启动子，还可应用于棒杆菌中任何基因及相关代谢产物的合成。
菌株：本发明所用到的菌株：高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌本实验室储藏，大肠杆菌JM 109购自天根生物公司。
试剂：限制性内切酶XbaI，PstI，T4DNA连接酶，PCR试剂均购自Thermo公司，基因组提取试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，卡那霉素均购自上海生工，其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。
种子培养基(100ml)：葡萄糖2.5％，玉米浆3％，尿素0.8％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO40.02％，NaOH调pH 7.2。
发酵培养基(100ml)：葡萄糖10％，K2HPO4·3H2O 0.2％，玉米浆0.2％，MgSO40.04％，MnSO4·H2O 2mg/L，FeSO4·7H2O 2mg/L，NaOH调pH 7.2。
启动子对gadB2的表达效果测定：(1)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR主要用于检测gadB2的转录水平，取20h和40h发酵液，提取RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的测定；(2)谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活检测：GAD酶活测定时，取40h发酵液，测定OD值，离心去上清，用pH7.2的磷酸缓冲液洗两次，去除发酵液及胞外粘附的杂质，再将细胞悬浮在含0.1％Triton的0.02M pH4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，获得全细胞液；GAD酶促反应体系为1ml，包括0.2M pH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，30mM的谷氨酸钠，0.03mM的磷酸吡哆醛及400μl全细胞液，底物和全细胞提前于37℃预热10min，然后全细胞液加到反应体系中，于37℃反应1h，再煮沸10min结束反应，离心20min，上清用于检测合成的γ-氨基丁酸(GABA)含量；(3)高效液相色谱OPA柱前衍生法测定GABA产量：发酵液上清用终浓5％的TCA(三氯乙酸)稀释50倍，沉淀4h以上，12000rpm离心30min去除沉淀，取上清用于检测γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。
实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK强度检测
1、以
上游引物PdnaK-F:
5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGTTGAAAATTAG-3'
下游引物PdnaK-R:
5'-CGCGTCTAGAGTGATTTTAGTACTGTCCA-3'扩增启动子片段PdnaK(SEQ ID NO.1)，将启动子PdnaK与测试质粒pJYW-5-gadB2(pJYW-5构建方法见公开号CN103834679A、发明名称“一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统”的专利，pJYW-5在酶切位点XbaI及PstI之间连gadB2，gadB2见公开号CN102154345A、发明名称“谷氨酸脱羧酶基因及其应用”的专利)用XbaI酶切，载体需要去磷酸化，然后将启动子片段和载体用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞JM109，挑选出正确的转化子，构建pJYW-5-PdnaK-gadB2。
2、将质粒pJYW-5-PdnaK-gadB2电转进谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，挑选出正确转化子，SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2。
3、将活化好的重组谷氨酸棒杆菌SH/pJYW-5-PdnaK-gadB2接种到30ml种子培养基，30℃、200rpm，培养8h，转接到发酵培养基中，初始OD5621.9接到发酵培养基，10h-24h，通过补加尿素的方法维持发酵液pH在6.5-7.5，从24h开始，每12h取样测定OD、残糖、pH、GABA产量等各参数，直至72h发酵结束。发酵各参数测定结果表明，含Pdnak菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的4.59倍、39.7倍，是含Ptuf菌株的3.09倍、54.3倍；含PdnaK菌株的谷氨酸脱羧酶活性是含Psod、Ptuf菌株的10倍、1.68倍；从72h GABA积累情况来看，含PdnaK菌株比含Psod、Ptuf菌株分别提高了2.29倍和10％，综合三方面均证明启动子PdnaK比对照启动子Psod、Ptuf更强。
实施例2：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK(+1)强度检测
1、以：
上游引物PdnaK(+1)-F:
5'-CGCGTCTAGAATTGGGTGGTTGAAAATTAG-3'
下游引物PdnaK(+1)-R:
5'-CATCAATCCTCTCCTTTCAGTTGGTGGTTCCAAGGTCA-3'
扩增出启动子片段PdnaK(+1)(SEQ ID NO.2)
2、以引物：
gadB2-F
5'-GAAAGGAGAGGATTGATGAA-3'
gadB2-R
5'-AAATCTGCAGTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3'
从质粒pJYW-5-gadB2扩增出基因片段gadB2，将启动子片段PdnaK(+1)和基因片段gadB2，通过重叠延伸的方法将两个片段重叠在一起。
3、将重叠后的片段和测试质粒pJYW-5-gadB2用XbaI和PstI酶切，产物纯化，随后用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞，挑选出正确转化子，成功构建pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2。
4、将质粒pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2电转入谷氨酸棒杆菌，挑选出正确转化子，成功构建重组菌SH/pJYW-5-PdnaK(+1)-gadB2。
5、发酵各参数测定结果表明，含PdnaK(+1)的菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的1.59倍、8.9倍，是Ptuf的1.07倍、12.17倍；含PdnaK(+1)菌株的谷氨酸脱羧酶酶活是Psod、Ptuf的5.54倍、0.92倍；72h GABA积累量来看，含PdnaK(+1)菌株比含Psod、Ptuf的菌株分别提高了2.35倍和13％，综合三方面均证明启动子PdnaK(+1)比对照启动子Psod、Ptuf更强。
实施例3：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PdnaK(-1)强度检测
1、以：
上游引物PdnaK(-1)-F:
5'-ATTACTCTAGAGCGTGAGACTTGGTGTCAAA-3'
下游引物PdnaK(-1)-R:
5'-CATCAATCCTCTCCTTTCGTGATTTTAGTACTGTCCAC-3'扩增出启动子片段PdnaK(-1)
2、以引物：
gadB2-F
5'-GAAAGGAGAGGATTGATGAA-3'
gadB2-R
5'-AAATCTGCAGTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3'
从质粒pJYW-5-gadB2扩增基因片段gadB2，将启动子片段PdnaK(-1)和基因片段gadB2，通过重叠延伸的方法将两个片段重叠在一起。
3、将重叠后的片段和测试质粒pJYW-5-gadB2用XbaI和PstI酶切，产物纯化，随后用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌JM 109感受态细胞，挑选出正确转化子，成功构建pJYW-5-PdnaK(-1)-gadB2。
4、将质粒pJYW-5-PdnaK(-1)-gadB2电转入谷氨酸棒杆菌，挑选出正确转化子，成功构建重组菌SH/pJYW-5-PdanK(-1)-gadB2。
5、发酵各参数测定结果表明，含PdnaK(-1)的菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的1.39倍、20.11倍，是含Ptuf菌株的0.93倍、27.47倍；含PdnaK(-1)菌株的谷氨酸脱羧酶酶活是Psod、Ptuf的5.18倍、86％；72h GABA积累量来看，含PdnaK(-1)菌株比含Psod、Ptuf的菌株分别提高了2.27倍和10％，综合三方面均证明启动子PdnaK(-1)比对照启动子Psod、Ptuf更强。
从72h积累的GABA产量来看，PdnaK，PdnaK(+1)，PdnaK(-1)菌株分别积累了15.8g/L、16.1g/L、15.7g/L GABA，说明在PdnaK的基础上向上下游分别延伸60bp后，启动子活性基本不受影响，即三种启动子活性差不多。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种棒杆菌启动子及其应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 224
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 1
attgggtggt tgaaaattag gggtaaaccc ggattttttc tcaagtgaag cactttgacc 60
tgtgtaaatt aagaaagttg agtctagtgg gaacaacttt gtggcattta ccgttgctat 120
atatgtaagc ttgagtcagg caggctcaat gaggagtttt tcttaccggc gaaagtcggt 180
gggaagcaag tcaaagctca agccgtggac agtactaaaa tcac 224
<210> 2
<211> 284
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 2
attgggtggt tgaaaattag gggtaaaccc ggattttttc tcaagtgaag cactttgacc 60
tgtgtaaatt aagaaagttg agtctagtgg gaacaacttt gtggcattta ccgttgctat 120
atatgtaagc ttgagtcagg caggctcaat gaggagtttt tcttaccggc gaaagtcggt 180
gggaagcaag tcaaagctca agccgtggac agtactaaaa tcacctaaaa caggaggcac 240
cattatggga cgtgcagtag gaattgacct tggaaccacc aact 284
<210> 3
<211> 284
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 3
gcgtgagact tggtgtcaaa gttgagtggg acctgttgaa aacagctctt atcttccctg 60
attgggtggt tgaaaattag gggtaaaccc ggattttttc tcaagtgaag cactttgacc 120
tgtgtaaatt aagaaagttg agtctagtgg gaacaacttt gtggcattta ccgttgctat 180
atatgtaagc ttgagtcagg caggctcaat gaggagtttt tcttaccggc gaaagtcggt 240
gggaagcaag tcaaagctca agccgtggac agtactaaaa tcac 284
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgtctaga attgggtggt tgaaaattag 30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcgtctaga gtgattttag tactgtcca 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgcgtctaga attgggtggt tgaaaattag 30
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
catcaatcct ctcctttcag ttggtggttc caaggtca 38
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaaaggagag gattgatgaa 20
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaatctgcag ttaacttcga acggtggtct tg 32
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
attactctag agcgtgagac ttggtgtcaa a 31
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
catcaatcct ctcctttcgt gattttagta ctgtccac 38
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaaaggagag gattgatgaa 20
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaatctgcag ttaacttcga acggtggtct tg 32

Claims (9)

1.一种启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.携带权利要求1所述启动子的载体。
3.携带权利要求1所述启动子或权利要求2所述载体的细胞。
4.权利要求1所述启动子在表达基因或合成特定代谢产物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为宿主。
6.权利要求2所述载体在表达基因或合成特定代谢产物中的应用。
7.权利要求3所述细胞在表达基因或合成特定代谢产物中的应用。
8.一种生产谷氨酸脱羧酶的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列为启动子，替换pJYW-5-PtacM原有启动子PtacM，用于表达谷氨酸脱羧酶基因gadB2。
9.权利要求8所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
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