CN108315331B - 一种应用于棒杆菌的启动子 - Google Patents

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    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)

Abstract

本发明公开了一种应用于棒杆菌的启动子，属于基因工程技术领域。本发明提供的启动子PodhI，为谷氨酸棒杆菌代谢工程改造提供了新的启动子可用于构建大肠杆菌‑棒杆菌穿梭载体，应用于基因的表达及代谢产物的生产，效率比Psod更高。

Description

一种应用于棒杆菌的启动子
技术领域
本发明涉及一种应用于棒杆菌的启动子，尤其是一种棒杆菌中的与中心代谢相关的启动子PodhI及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
启动子位于转录起始点上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，由此启动转录。
棒杆菌是安全生产菌，无内毒素及胞外水解酶活性，广泛应用于多种氨基酸及有机酸的生产，如谷氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，尼龙-4等，其产品可作为饲料添加剂，食品添加剂，医药中间体，可降解塑料的前体，在化妆品行业也有着重要应用。
近年来棒杆菌启动子工程取得了很大的进展，棒杆菌基因组上的启动子如Psod，Ptuf，PcspB等近年来被应用于增强相关基因的表达，并取得了一定的成效。虽然组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子等都有所报道，但是真正应用于棒杆菌的还比较少，与中心代谢相关的启动子研究的也比较少，且迫切需求更多的启动子来增强基因的表达，平衡代谢流，以实现高产目的代谢产物的目标。
发明内容
本发明提供了一种棒杆菌的启动子，将其连接到表达载体上，或者将其插入棒杆菌染色体上待表达基因的前面，构建重组菌，可用于表达相关的基因，催化相关代谢产物的合成。
所述启动子，包括SEQ ID NO.1所示的PodhI。
所述启动子PodhI是谷氨酸棒杆菌中编码包含FHA结构域的蛋白的odhI基因上游的序列，odhI基因是与中心代谢相关的基因，其编码产物OdhI是α-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC)的OdhA亚基的抑制蛋白。
所述启动子PodhI可用于构建各种表达载体，例如用于表达载体pJYW-4，pJYW-5，pDXW-8，pDXW-10等。所得表达载体可以用于在各种棒杆菌属中表达基因或合成特定代谢产物，例如谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌等。
所述启动子PodhI可以应用于在谷氨酸棒杆菌中表达谷氨酸脱羧酶基因(gadB2)。例如，以谷氨酸高产的谷氨酸棒杆菌为宿主，以PodhI作为gadB2的启动子表达谷氨酸脱羧酶。可以pJYW-5为载体，将其已有PtacM启动子切掉替换为启动子PodhI，构建重组表达载体。
本发明有益效果：所述启动子PodhI在发酵的前期，转录水平很高，而后期转录水平会降低，适合于前期高表达，后期弱表达的基因及前期大量积累代谢产物，后期微弱积累代谢产物的发酵，而常用的启动子如Psod，Ptuf等均属于组成型表达，而诱导启动子需添加诱导剂，增加生产成本且不安全。
具体实施方式
下面通过实例来证明PodhI启动子的应用，但并非局限于只能用作谷氨酸脱羧酶基因的启动子，还可应用于棒杆菌中任何基因及其相关代谢产物的合成。
菌株：本发明所用到的菌株：高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌JM 109购自天根生物公司。
试剂：限制性内切酶XbaI，T4DNA连接酶，PCR试剂均购自Thermo公司，基因组提取试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，卡那霉素均购自上海生工，其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。
种子培养基(100ml)：葡萄糖2.5％，玉米浆3％，尿素0.8％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO4 0.02％，NaOH调pH 7.2。
发酵培养基(100ml)：葡萄糖10％，K2HPO4·3H2O 0.2％，玉米浆0.2％，MgSO40.04％，MnSO4·H2O 2mg/L，FeSO4·7H2O 2mg/L，NaOH调pH 7.2。
启动子对gadB2的表达效果测定：(1)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR主要用于检测gadB2的转录水平，取20h和40h发酵液，提取RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的测定；(2)谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活检测：GAD酶活测定时，取40h发酵液，测定OD值，离心去上清，用pH7.2的磷酸缓冲液洗两次，去除发酵液及胞外粘附的杂质，再将细胞悬浮在含0.1％Triton的0.02M pH4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，获得全细胞液；GAD酶促反应体系为1ml，包括0.2M pH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，30mM的谷氨酸钠，0.03mM的磷酸吡哆醛及400μl全细胞液，底物和全细胞提前于37℃预热10min，然后全细胞液加到反应体系中，于37℃反应1h，再煮沸10min结束反应，离心20min，上清用于检测合成的γ-氨基丁酸(GABA)含量；(3)高效液相色谱OPA柱前衍生法测定GABA产量：发酵液上清用终浓5％的TCA(三氯乙酸)稀释50倍，沉淀4h以上，12000rpm离心30min去除沉淀，取上清用于检测γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。
实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PodhI强度检测
1、以
上游引物PodhI-F：
5'-CATTTCTAGACGATCACGAGGGGGCACATT-3'
下游引物PodhI-R：
5'-CCCGGCTCTAGATCTTAACGATTTTCATCATA-3'扩增启动子片段PodhI(SEQ IDNO.1)，将启动子与测试质粒pJYW-5-gadB2(pJYW-5构建方法见公开号CN103834679A、发明名称“一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统”的专利，pJYW-5在酶切位点XbaI及PstI之间连gadB2，gadB2见公开号CN102154345A、发明名称“谷氨酸脱羧酶基因及其应用”的专利)用XbaI酶切，载体需要去磷酸化，然后将启动子片段和载体用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞JM109，挑选出正确的转化子，构建pJYW-5-PodhI-gadB2。
2、将质粒pJYW-5-PodhI-gadB2电转进谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，挑选出正确转化子，SH/pJYW-5-PodhI-gadB2
3、将活化好的重组谷氨酸棒杆菌SH/pJYW-5-PodhI-gadB2接种到30ml种子培养基，30℃、200rpm，培养8h，转接到发酵培养基中，初始OD5621.9接到发酵培养基，10h-24h，通过补加尿素的方法维持发酵液pH在6.5-7.5，从24h开始，每12h取样测定OD、残糖、pH、GABA产量等各参数，直至72h发酵结束。
发酵各参数测定结果表明，含PodhI菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的20.04倍、2.69倍，是含Ptuf菌株的13.48倍、3.68倍；含PodhI菌株的谷氨酸脱羧酶活性是含Psod、Ptuf菌株的6.64倍、1.10倍；从72h GABA积累情况来看，含PodhI菌株比含Psod菌株提高了1.79倍，比含Ptuf的菌株略低，综合三方面均证明启动子PodhI比对照启动子Psod强，与Ptuf强度相近。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种应用于棒杆菌的启动子
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 250
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 1
cgatcacgag ggggcacatt tggatgatga gggcttggcg cgtccatcgg caacgtggac 60
ctacatggtc tctgacaacc cactcgcggg tagtggcaac tcagtgatca gtggcatagg 120
aaatatcttt agataactcg aaaactgtga aattccagtt cacggcgttt tttcaggaaa 180
ttctaggatc ttacggaggg taactccgca ctcaacatct acacaaaggc tatgatgaaa 240
atcgttaaga 250
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catttctaga cgatcacgag ggggcacatt 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccggctcta gatcttaacg attttcatca ta 32

Claims (2)

1.一种生产谷氨酸脱羧酶的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示序列为启动子，替换pJYW-5-PtacM原有启动子PtacM，用于表达谷氨酸脱羧酶基因。
2.权利要求1所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
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OdhI dephosphorylation kinetics during different glutamate;Boulahya等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20100307;1-8页 *
Requirement of de novo synthesis of the OdhI protein in penicillin-induced glutamate production by Corynebacterium glutamicum;Kim，J.等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20091203;引言第2段倒数第5行-倒数第1行、材料与方法第2段1-6和材料与方法第2段倒数第2-3行 *
Ribosomal binding site sequences and promoters for expressing glutamate decarboxylase and producing γ-aminobutyrate in Corynebacterium glutamicum;Shi,F.等;《AMB Express》;20180418;1-17页 *
Zhang,H等.Select seq CP022614.1 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, complete genome.《NCBI Genbank》.2017, *
谷氨酸棒状杆菌基因敲除和表达系统的构建及其应用;胡瑾瑜;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20150315;摘要第2段3-5行 *

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