CN116694657A - 一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 - Google Patents
一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116694657A CN116694657A CN202310663758.2A CN202310663758A CN116694657A CN 116694657 A CN116694657 A CN 116694657A CN 202310663758 A CN202310663758 A CN 202310663758A CN 116694657 A CN116694657 A CN 116694657A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- escherichia coli
- sigma
- regulation
- expression
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 39
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 title abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 36
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 21
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 4
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000006861 primary carbon metabolism Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 101150114996 sdhd gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 1
- 101100306508 Bacillus subtilis (strain 168) sigB gene Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100134884 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) aceF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090997 DLAT gene Proteins 0.000 description 1
- 101100378193 Dictyostelium discoideum aco2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710109733 ECF RNA polymerase sigma-E factor Proteins 0.000 description 1
- 101150099894 GDHA gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010023021 Glutamyl-tRNA reductase Proteins 0.000 description 1
- 101100277701 Halobacterium salinarum gdhX gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 101100322911 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) aksF gene Proteins 0.000 description 1
- 101100453819 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) kgd gene Proteins 0.000 description 1
- 101100392454 Picrophilus torridus (strain ATCC 700027 / DSM 9790 / JCM 10055 / NBRC 100828) gdh2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000951 RNA polymerase sigma 70 Proteins 0.000 description 1
- 108050006002 RNA polymerase sigma factor FliA Proteins 0.000 description 1
- 101710097492 RNA polymerase sigma factor RpoS Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101150053469 SDHC gene Proteins 0.000 description 1
- 101100116769 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) gdhA-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100023132 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) sdhE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150053555 acnB gene Proteins 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- -1 and once bound Proteins 0.000 description 1
- 230000007940 bacterial gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 101150058351 fecI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017109 fliA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 101150106096 gltA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042350 gltA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010010779 glutamine-pyruvate aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150112623 hemA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 101150118781 icd gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150078036 odhB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150084116 rpo4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102864 rpoD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150040886 rpoE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150106872 rpoH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150011750 rpoN gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076849 rpoS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 101150047761 sdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108347 sdhB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 101150111745 sucA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150055132 sucB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031436 sucD gene Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法,属于生物技术领域。本发明通过过表达sigma因子实现对大肠杆菌全基因组基因的表达调控,以提高大肠杆菌的生长强度,进而强化其代谢物的生产。与其他调控方法相比,本发明无需额外表达异源元件,也不需要对目的基因进行改造,即可实现全基因组水平的表达调控。且经验证,利用本发明提升细胞生长和代谢产物合成的方法,可以显著提高5‑氨基乙酰丙酸的产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法,属于生物技术领域。
背景技术
σ因子(sigma因子)是一种参与调节细菌基因表达的蛋白质,是大肠杆菌(Escherichia coli)中转录调控的重要组成部分,具有重要的生物学功能。作为RNA聚合酶(RNA polymerase)的一个亚基,σ因子能够协助RNA聚合酶识别并结合到启动子DNA序列上,从而启动转录并促进RNA合成。不同的σ因子可以识别并结合不同的启动子序列,从而实现对不同基因的特异性表达调控,使细菌能够根据环境的变化选择性地转录不同基因以更好地适应环境生长。σ因子通过它与核心酶的相互作用来实现对DNA的识别及结合。在转录开始阶段,σ因子与游离的核心酶结合形成全酶来发挥其作用,全酶识别并结合到基因启动子区域中的特定DNA序列,一旦结合,RNA聚合酶就会催化与DNA模板链互补的RNA链的合成。通过选择性地结合不同的启动子序列,σ因子可以调节不同基因的转录,切换不同的生理生长状态帮助细菌适应环境。在过去的几十年里,σ因子研究取得了显著的进展。科研人员对这些关键转录调控因子的结构、功能和互作机制有了更深入的了解。然而,尽管取得了一定的成果,但仍有许多关于σ因子的疑问尚待解决。随着高通量测序、结构生物学和基因编辑等新技术的不断发展,更多有关σ因子调控的细节有望被揭示。
大肠杆菌常见的单基因调控工具已有广泛研究,比如使用启动子、RBS等顺式原件,可通过更换靶基因所属表达框的启动子及RBS来实现对目的蛋白的不同强度表达,也可以使用诱导型启动子并通过诱导物来改变基因的表达强度;使用核糖开关可以对单基因实现动态调控,核糖开关由适配体(Aptamer)和表达平台(Expression platform)两部分组成。当适配体结合的配体是代谢中含量动态变化的的中间产物时,适配体与之结合后会引起靶基因mRNA结构变化,从而影响靶基因的转录或翻译,但是以上策略的缺点在于需要对基因组上靶基因附近的序列进行改造。另外,基因调控的反式元件如CRISPR-dCas9和小RNA策略也得到了广泛应用,通过sgRNA介导的dCas蛋白定位到靶序列区域附近即可阻碍基因的转录,但由于需要额外表达具有一定毒性的dCas9蛋白,可能潜在对细胞的生长带来负担。使用小RNA策略可以通过表达小RNA与靶基因mRNA起始密码子及其后21nt进行配对,阻遏翻译过程的进行。但以上研究策略仅是在单基因水平影响靶基因的表达,若需要对多基因进行表达调控则需要对新增靶基因的周围序列进行改造,或引入新的小RNA或者构建sgRNA阵列,操作较为复杂,且调控靶标数量有限。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法,提出了一种新的基因表达调控策略,能够实现基因组水平多基因调控的功能,从而在全局实现对细胞代谢模式的转换。
本发明的第一个目的是提供一种基于sigma因子的大肠杆菌表达系统,所述表达系统包括含有sigma因子σ70的质粒。
本发明通过对Escherichia coli MG1655来源的sigma因子σ70、σ54、σ38、σ32、σ28、σ24和σ19进行筛选,发现σ70不仅能够通过对基因组中成百上千的基因进行表达调控,促进大肠杆菌在发酵生产过程中的生长并强化代谢途径中相关基因的表达,而且无需对目的基因进行改造,可以同时对多个中心碳代谢途径基因的表达进行调控,实现在基因组表达水平的全局调控,操作简便、高效。
进一步地,所述sigma因子σ70可组成表达或诱导表达。优选地,由诱导型启动子调控表达。
进一步地,所述诱导型启动子包括但不限于IPTG诱导启动子,如plam启动子等。
进一步地,所述质粒上连接有RBS序列,用于调控sigma因子σ70的表达。
进一步地,编码所述sigma因子σ70的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地,所述plam启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地,所述RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第二个目的是提供所述表达系统在代谢调控或生物合成中的应用。
进一步地,调控中心碳代谢途径基因的表达。
本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌,含有所述表达系统,该重组大肠杆菌可实现基因组水平多基因调控。
本发明的第四个目的是提供一种促进大肠杆菌生长的方法,包括向大肠杆菌中导入含有sigma因子σ70的质粒的步骤。
本发明的第五个目的是提供一种强化大肠杆菌代谢产物合成的方法,包括向大肠杆菌中导入含有sigma因子σ70的第一质粒的步骤。
进一步地,还包括向大肠杆菌中导入含有产物合成相关基因的第二质粒的步骤。
进一步地,所述第一质粒上含有第一诱导启动子,所述第二质粒上含有第二诱导启动子,且第一诱导启动子不同于第二诱导启动子。
进一步地,所述第一诱导启动子和第二诱导启动子选自T7启动子或plam启动子。为快速改变大肠杆菌的生长及代谢状态,使用pET-28a(+)载体连接各sigma因子编码基因并使用plam启动子进行表达,转化到大肠杆菌中通过诱导表达对目的基因进行表达调控。
进一步地,所述代谢产物包括直接或间接经中心碳代谢途径合成的产物。
进一步地,所述代谢产物包括但不限于5-氨基乙酰丙酸等。利用本发明方法可以快速实现对中心碳代谢途径中的gltA、acnB、icd、sucA、sucB、sucC、sucD、sdhA、sdhB、sdhC、sdhD、mqo和gdhA等的调控,可有效提升5-Ala的产量。
本发明的有益效果:
(1)本发明旨在通过全局改变细胞转录代谢水平,强化细胞生长并使其生长状态模式符合特定代谢产物合成。通过构建大肠杆菌不同sigma因子的过表达质粒,转化到大肠杆菌后进行诱导表达,以改变细胞的生长状态和代谢模式,从而提高代谢产物的产量。
(2)本发明无需额外引入异源调控元件发挥功能,也无需额外对靶基因进行改造,只需要额外表达sigma因子即可实现对多基因的表达调控。
(3)本发明无需额外表达其他蛋白辅助调控元件发挥功能,也无需额外对靶基因进行改造,只需转入质粒即可实现的对基因组上多个基因快速方便的调控。本发明可以在基因组水平对若干基因进行表达调控,只需转入质粒既可改变细胞生长并提高对应代谢产物的合成。
附图说明
图1为sigma因子过表达载体示意图。
图2为不同sigma因子过表达菌株生长曲线图。
图3为sigma因子过表达策略提高5-Ala生产菌株的生长及产量。
图4为5-Ala的C5合成途径及上调基因。
图5为部分中心碳代谢基因表达量上调图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例涉及的核苷酸序列信息:
SEQ ID NO.1表达σ70的rpoD基因序列
SEQ ID NO.2表达σ54的rpoN基因序列
SEQ ID NO.3表达σ38的rpoS基因序列
SEQ ID NO.4表达σ32的rpoH基因序列
SEQ ID NO.5表达σ28的rpoF基因序列
SEQ ID NO.6表达σ24的rpoE基因序列
SEQ ID NO.7表达σ19的fecI基因序列
SEQ ID NO.8plam启动子序列(诱导型启动子)
SEQ ID NO.9uRBS核糖体结合位点序列
SEQ ID NO.10hemA基因序列
SEQ ID NO.11hemL基因序列
(一)菌株
使用Escherichia coli MG1655作为基因获取的模板及生长功能验证的菌株;使用E.coli BL21(DE3)作为5-Ala生产菌株的宿主;使用E.coli JM109作为质粒构建的宿主。
(二)培养基
Luria-Bertani(LB)培养基:10g·L-1Tryptone,5g·L-1Yeast extract,10g·L- 1NaCl;固体培养基需额外添加1.5%(w·v-1)的琼脂粉。
发酵培养基:10g·L-1葡萄糖,20g·L-1酵母粉,16g·L-1(NH4)2SO4,3g·L-1KH2PO4,16g·L-1Na2HPO4·12H2O,1g·L-1MgSO4·7H2O,0.01g·L-1MnSO4·H2O。
抗生素使用终浓度:Kanamycin 50μg·mL1、Chloramphenicol 15μg·mL-1;诱导剂使用终浓度:0.1mM IPTG(异丙基-β-D-半硫代乳糖苷)
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。
表1实施例中所涉及的引物序列
实施例1不同sigma因子过表达载体及重组表达菌株的构建
分别使用引物plam-uRBS-fecI-F/R、plam-uRBS-rpoE-F/R、plam-uRBS-rpoF-F/R、plam-uRBS-rpoH-F/R、plam-uRBS-rpoS-F/R、plam-uRBS-rpoD-F/R、plam-uRBS-rpoN-F/R从E.coli MG1655基因组上获取各σ因子编码基因DNA片段。再通过Plam-uRBS-1/2-F/R对pET28a(+)质粒载体进行扩增获得线性化的载体片段;将以上PCR片段回收后使用太极连接体系试剂盒按照说明书进行同源重组连接,通过化学转化法导入Escherichia coli JM109感受态,构建pET-28a(+)-plam-uRBS-fecI-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoE-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoF-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoH-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoN-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoD-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoS-T7ter。使用pET-28a(+)空载作为对照组。以上质粒通过Sanger测序确认序列准确性后转化到E.coli MG1655菌株中分别构建MGI、MGE、MGF、MGH、MGS、MGN、MGD、MGT。
实施例2不同σ因子过表达重组菌株的生长曲线的测定
分别挑取各固体LB平板上的各重组菌株三个独立单菌落,接种到含对应抗生素的5mL新鲜LB培养基中于37℃,220rpm培养12h作为种子液进行生长曲线的测定。对种子培养液的OD600进行测定后,按起始OD600=0.1转接至装有25mL新鲜LB培养基的250mL锥形摇瓶中,并加入相应量的抗生素以及终浓度0.1mM的IPTG于37℃、220rpm培养,每隔2h取样进行生长曲线的测定,结果如图2所示。其中过表达pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoD-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoS-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoN-T7ter的重组菌株生长状况良好。
实施例3使用大肠杆菌sigma因子提高5-Ala生产菌株的生长及产量
选取使细胞生长状态良好的σ因子过表达质粒pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoD-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoS-T7ter、pET-28a(+)-plam-uRBS-rpoN-T7ter和pET-28a(+)转化到含有5-Ala合成途径质粒(pCOLA-T7-hemA-hemL,T7启动子控制表达,hemA编码谷氨酰tRNA还原酶;hemL编码谷氨醛氨基转移酶)的E.coli BL21(DE3)生产菌株中构建BLD、BLS、BLN、BLT。按实施例2中的方法进行种子液培养,按起始OD600=0.1转接至装有25mL新鲜的发酵培养基的250mL平底摇瓶中,并加入相应量的抗生素,37℃培养两小时后,加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导,转入30℃摇床培养,培养36h结束,进行后续产量测定。
取1mL发酵液于12000rpm离心5min收集上清,加入到表2所述的反应体系中,在38℃下反应100min,反应结束后再于12000rpm离心5min后取上清过膜后注入液相小瓶中,完成液相样品前处理。其中,缓冲体系由0.17M NaHCO3和0.1M NaOH构成。
表2样品处理体系
使用C18柱(250×4.6mm,5μm),通过Waters ACQUITY Arc HPLC system测量5-Ala产量,UV检测器,柱温:30℃,流速:0.7mL·min-1,流动相:25%乙腈,75%0.13M乙酸铵(乙酸调pH为6.82,超声两小时以上除尽气泡用作液相流动相)。配置不同浓度的5-Ala标品进行标准曲线的绘制,从而可以根据样品的积分峰面积进行产量定量。测得产量如附图3所示,相比产量为444.6mg/L的对照菌株BLT,过表达σ38的重组菌株BLS的5-Ala产量可达515.4mg/L,提升至出发菌株的116%;过表达σ54的重组菌株BLN的5-Ala产量可达524.569mg/L,提升至出发菌株的118%。过表达σ70的重组菌株BLD的5-Ala产量可达625.9mg/L,提升至出发菌株的140%。
实施例4使用σ70上调5-Ala的C5合成途径及上调基因
由于向5-Ala合成菌株中转入σ70过表达质粒后产量提升最高,继续分别挑取固体LB抗性平板的BLT(作为对照组)和BLD单菌落,接种到含对应抗生素的5mL新鲜LB培养基中,于37℃培养12h后以OD600=0.1转接到含有相应抗性的25mL LB培养基中,培养至对数生长期末期后将摇瓶中的菌液分装到50mL离心管中,于4℃、12000rpm离心2min保留菌体,用约15mL DEPC水洗掉培养基,4℃12000rpm离心2min,重复一次,弃上清得到的菌体置于液氮中速冻10min,然后转到干冰中保存送金唯智生物进行转录组测序,其中心碳代谢途径的基因上调如图4所示,相较对照组菌株BLT,过表达σ70的重组菌株中心碳代谢上调幅度如图5所示,其中横坐标为部分中心碳代谢上调基因,柱状图数值为上调差异变化值对2取log对数。该实例明确定量验证了过表达σ70可显著上调中心碳代谢的部分基因。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种基于sigma因子的大肠杆菌表达系统,其特征在于:所述表达系统包括含有sigma因子σ70的质粒。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达系统,其特征在于:所述质粒上连接有RBS序列。
3.权利要求1或2所述的大肠杆菌表达系统在代谢调控或生物合成中的应用。
4.一种重组大肠杆菌,其特征在于:含有权利要求1或2所述的表达系统。
5.一种促进大肠杆菌生长的方法,其特征在于:包括向大肠杆菌中导入含有sigma因子σ70的质粒的步骤。
6.一种强化大肠杆菌代谢产物合成的方法,其特征在于:包括向大肠杆菌中导入含有sigma因子σ70的第一质粒的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:还包括向大肠杆菌中导入含有产物合成相关基因的第二质粒的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述第一质粒上含有第一诱导启动子,所述第二质粒上含有第二诱导启动子,且第一诱导启动子不同于第二诱导启动子。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于:所述第一诱导启动子和第二诱导启动子选自T7启动子或plam启动子。
10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述代谢产物包括直接或间接经中心碳代谢途径合成的产物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310663758.2A CN116694657A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310663758.2A CN116694657A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116694657A true CN116694657A (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87835193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310663758.2A Pending CN116694657A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116694657A (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101356273A (zh) * | 2005-09-28 | 2009-01-28 | 麻省理工学院 | 全局转录机器的改造 |
CN108060174A (zh) * | 2018-01-10 | 2018-05-22 | 信阳师范学院 | 一种提高大肠杆菌生长性能的方法 |
WO2019166093A1 (en) * | 2018-03-01 | 2019-09-06 | Bundesrepublik Deutschland, Vertreten Durch Die Bundesministerin Für Wirtschaft Und Energie, Diese Vertreten Durch Den Präsidenten Der Bundesanstalt Für Materialforschung Und -Prüfung (Bam) | Method for enhancing continuous production of a natural compound during exponential growth phase and stationary phase of a microorganism |
-
2023
- 2023-06-06 CN CN202310663758.2A patent/CN116694657A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101356273A (zh) * | 2005-09-28 | 2009-01-28 | 麻省理工学院 | 全局转录机器的改造 |
CN108060174A (zh) * | 2018-01-10 | 2018-05-22 | 信阳师范学院 | 一种提高大肠杆菌生长性能的方法 |
WO2019166093A1 (en) * | 2018-03-01 | 2019-09-06 | Bundesrepublik Deutschland, Vertreten Durch Die Bundesministerin Für Wirtschaft Und Energie, Diese Vertreten Durch Den Präsidenten Der Bundesanstalt Für Materialforschung Und -Prüfung (Bam) | Method for enhancing continuous production of a natural compound during exponential growth phase and stationary phase of a microorganism |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JAMES D. WINKLER等: "Complementation of a temperature sensitive Escherichia coli rpoD mutation using Lactobacillus sigma factors", BIORXIV, 1 March 2014 (2014-03-01), pages 4 * |
朱玉贤等: "现代分子生物学", 31 July 2002, 第196页, pages: 196 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3162889B1 (en) | Engineered escherichia coli for producing 1,5-pentanediamine by whole-cell catalysis and application thereof | |
CN109055289B (zh) | 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
Negrete et al. | Glucose uptake regulation in E. coli by the small RNA SgrS: comparative analysis of E. coli K-12 (JM109 and MG1655) and E. coli B (BL21) | |
CN111019878B (zh) | L-苏氨酸产量提高的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
CN113186143B (zh) | 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 | |
Lee et al. | Improved production of 3-hydroxypropionic acid in engineered Escherichia coli by rebalancing heterologous and endogenous synthetic pathways | |
CN106995794B (zh) | 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途 | |
CN114874964A (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
Pablos et al. | Enhanced production of plasmid DNA by engineered Escherichia coli strains | |
CN107099497B (zh) | 一种促进生物素合成的质粒、细胞及其促进方法 | |
CN108998401B (zh) | 一种生产3-氨基异丁酸的方法 | |
CN114395571B (zh) | 三角褐指藻zep1基因、蛋白及应用 | |
CN116694657A (zh) | 一种基于调控sigma因子改变大肠杆菌细胞生长与代谢合成的方法 | |
US20210403893A1 (en) | Highly active s-cyanohydrin lyase and application thereof | |
CN110872595B (zh) | 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 | |
CN107287196B (zh) | ilv衰减子的突变体、相关工程菌及其在生产缬氨酸中的应用 | |
CN115651882B (zh) | 基于动态调控硫回收利用的l-半胱氨酸工程菌的构建方法与应用 | |
CN117106819B (zh) | 三角褐指藻CHLC基因以及编码的蛋白在叶绿素c合成中的应用 | |
CN110982770B (zh) | 一种动态调控脂肪酸代谢途径强化柚皮素合成的方法 | |
EP3406724A1 (en) | Recombinant mutant microorganisms having acrylic acid productivity and method for producing acrylic acid using same | |
CN115838712B (zh) | 具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 | |
CN114410659B (zh) | 三角褐指藻crtiso5基因、蛋白及在岩藻黄素合成中的应用 | |
CN113249281B (zh) | 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用 | |
KR102031886B1 (ko) | 신규한 프로모터 및 이의 용도 | |
CN118147034A (zh) | 一种高产l-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |