CN117701611A - 一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用 - Google Patents
一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用。所述构建方法包括：敲除受体菌的D‑乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因；导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因；所述受体菌为含有所述D‑乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、L‑丙氨酸、β‑丙氨酸、3‑羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用。
背景技术
丙氨酸作为氨基酸的一种，是构成生命基础物质蛋白质的基本单元，参与糖代谢和氨基酸循环等生命过程。丙氨酸具备α-丙氨酸和β-丙氨酸两种同分异构体。α-丙氨酸存在L-丙氨酸和D-丙氨酸两种立体镜像。DL-丙氨酸为α-丙氨酸的外消旋体。L-丙氨酸常用于食品、制药和材料应用。它不仅是一种重要的甜味剂和调味料，也是新型绿色螯合剂的原料甲基甘氨酸二乙酸。在医学领域，L-丙氨酸是重要的胰高血糖素刺激剂。因此它在糖尿病的研究和治疗中发挥着重要作用。丙烯酸是一种用途广泛的化工产品。它是最简单的不饱和羧酸，由直接连接到羧酸末端的乙烯基组成。丙烯酸作为一种商用的化工中间体，可以用于高分子材料的生产加工。作为原材料生产的SAP材料市场广阔，比如聚丙烯酸，是超吸收尿布的重要组成成分。传统的丙烯酸的工业制备通常由丙烯的氧化来实现。但化石来源的化学品通常会受到原料价格波动、不稳定的供应链等因素影响，亟需寻找到更优的、能源和资本所需较少的可替代的方案。生物基丙烯酸是传统石化丙烯酸的生物基替代品。它由可再生原料(例如葡萄糖或其他糖)和淀粉基材料(主要来自玉米)生产。生物基丙烯酸可以减少对化石燃料和不可再生资源的依赖，减轻碳足迹，满足长期的可持续发展，逐渐成为前景广阔的方向。
全球市场中亚太地区生物基丙烯酸市场表现最有活力。19年LG化学与ADM(阿彻丹尼尔斯米德兰)公司合作联合开发生产生物基丙烯酸。化工巨头阿科玛(Arkema，法国)2022年推出系列丙烯酸单体和特种添加剂(已通过国际可持续发展和碳认证)，目标着眼于欧洲市场。巴斯夫23年9月在德国达到以工业规模的生产设施实现使用来自于蓖麻油的生物醇来制备丙烯酸酯单体，丙烯酸2-辛酯(2-OA)，在胶黏剂和涂料中有更好表现。陶氏化学也推出来自于玉米/木薯等生物原料的FORMASHIELD生物基丙烯酸乳液，可以用于装修涂料。其它在生物基丙烯酸市场活跃的公司有中石化、立邦涂料(印度)，德国赢创(Evonik)等。
国内丙氨酸市场以华恒生物为龙头，2012年华恒生物实现了全球首次厌氧发酵L-丙氨酸万吨级商业化生产。目前发酵法年产能2万吨，酶法年产能0.2万吨。厌氧发酵L-丙氨酸技术已经为企业新增28.8亿，其L-丙氨酸实现全球占有率60％以上。发酵法和酶法分别售价1.6万/吨和2万/吨，分别实现毛利率46％和10％～25％。其它国内主要生产企业有丰原石化和烟台恒源，国外生产企业主要有武藏野。
传统L-丙氨酸工业生产以石油基产物为原料经L-天冬氨酸酶法获得。生产成本居高不下(因天冬氨酸价格昂贵)，环保压力大等因素限制了L-丙氨酸的下游应用。而若考虑生物法合成，目前自然菌生产丙氨酸或者其它目标产物产量较低。以原料丰富的葡萄糖或者甘油为底物的生物发酵法因路径丰富近年来收到越来越多的学者青睐。可以用基因工程调控目的产物的表达来提高生物发酵的产量。
因此，亟需提供一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法，实现天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用，通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种工程菌群的构建方法，所述构建方法包括：
敲除受体菌的D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因；导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因。
本发明中通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
优选地，所述导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因之后还包括：导入天冬氨酸β脱羧酶基因。
优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸β脱羧酶基因之后还包括导入天冬氨酸α脱羧酶基因。
优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸α脱羧酶基因之后还包括导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因。
优选地，所述构建方法在导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因之后还包括导入3-羟基酸脱氢酶基因。
优选地，所述受体菌包括含有所述D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。
优选地，所述受体菌包括大肠杆菌。
优选地，所述敲除受体菌的D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的上下游同源臂的DNA片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括FRT+抗性基因氨苄+FRT。
优选地，所述含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因上下游同源臂的DNA片段的核酸序列包括如SEQ ID No.1-SEQ ID No.12所示的序列。
D-乳酸脱氢酶基因IdhA上、下游同源臂基因序列SEQ ID No.1-SEQ ID No.4：
SEQ ID No.1：
UF:5’-ATCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGA-3’。
SEQ ID No.2：
DF:5’-TCAGTAGCGCTGTCTGGCAACATAAACGGCCCCTTCTGGGCAATGCCGAT-3’。
SEQ ID No.3：
UR:5’-AATGCTCTCCTGATAATGTTAAACTTTTTTAGTAAATCATCTGCTCGAAT-3’。
SEQ ID No.4：
DR:5’-ATTCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATT-3’。
醛醇脱氢酶基因AdhE上、下游同源臂SEQ ID No.5-8：
SEQ ID No.5：
UF:5’-ATCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGA-3’。
SEQ ID No.6：
DF:5’-TCAGTAGCGCTGTCTGGCAACATAAACGGCCCCTTCTGGGCAATGCCGAT-3’。
SEQ ID No.7：
UR:5’-AATGCTCTCCTGATAATGTTAAACTTTTTTAGTAAATCATCTGCTCGAAT-3’。
SEQ ID No.8：
DR:5’-ATTCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATT-3’。
乙酸激酶ackA上、下游同源臂SEQ ID No.9-12：
SEQ ID No.9：
UF:5’-CTATGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCC-3’。
SEQ ID No.10：
DF:5’-GGAAGTACCTATAATTGATACGTGGCTAAAAAAACGTCAGGGAGCCATAG-3’。
SEQ ID No.11：
UR:5’-TTTCACACCGCCAGCTCAGCTGGCGGTGCTGTTTTGTAACCCGCCAAATC-3’。
SEQ ID No.12：
DR:5’-GATTTGGCGGGTTACAAAACAGCACCGCCAGCTGAGCTGGCGGTGTGAAA-3’。
优选地，所述丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因的来源包括：谷氨酸棒杆菌。
优选地，所述天冬氨酸β脱羧酶基因的来源包括：抗辐射不动杆菌。
优选地，所述天冬氨酸α脱羧酶基因的来源包括：枯草芽孢杆菌。
优选地，所述β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因来源包括：铜绿假单胞菌。
优选地，所述3-羟基酸脱氢酶基因的来源包括：达旦提狄克氏菌和/或大肠杆菌K12。
优选地，所述丙酮酸羧化酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.13所示的序列。
SEQ ID No.13：
ctagccggagttgcgcagtgcagtggaaagaccgttcattgtcagctgaatattgcgggaaacttgctcgctttggtcgccttttcggtagcgtcgcatcatctctacctggatcacattgagtggaagcaggtaggggtaacgacgctggacagagcgtgccagaagtgggttgtcatcgaggagatcatcggagccggtgatcacgcagaacatctttttagtcaggaaatattcctcgtggatgacggaatagacgcgctcggcgacttccctatctgggatgaggtctgcatagagctttgccaaacgcagctctgccttggacatcacctgagccatgttgtccaacactgaggtgaaaaatggccaggactcgttgagtgtttgcagctctgcgatgcgctgggtagcttgctccccttctccaatccactgttcaagtgccgttccgacaccaaaccatcctggcagcatcacacgagactgtgaccagctaagaacccatgggatggctcgcaaatcttccacagaggaagtttgcttgcgtgaggaaggcctggatccgatgttgagggatccgatctcctgcagtggtgtggattgggtgaagtaatcgatgaagccttgatcctcgtgcaccaaggaggtgtacttcttcaggctgagctcagagatctcactcatgatgtcatacgcgcgttggtgatcggtgagttcagagacgtcgagaagcgatgcctcaagcgtggctgagaccagtgcctcgaggtttcggcgcgcagtttcagggttgccgtacttagctgagatgatttcgccctgctcggtgatgcgcacggaaccttggacagcccccttgggctgggcaagaatcgcatcgtaggaaggtccgccaccacgtccaacggtgccaccgcggccgtggaacaggcgaagcttgaccccggctgatcggcatagttcgacaagctgcagttccgcgtcgtaaagcgcccagtttgcggagaaatacccgccatccttgttggaatcggagtagccgagcatgacttcctggacgttgtcgcgctgcaggaggtagttgcggtagagatcaattttccacagttcgccgagaataccggcgccggctcgaaggtcttcgatggtttcgaacagtgggatgacatcgacggtgccgcgtggattgtcgccgttggccgcgatgaggccgaattctttgagcaacaccatcggctcgagcacatcggtgaccgatgatgccatggaaatgatgcagtgaggcaccatgcgtgggccgaatttcttgacagcttccgacgcggtgcggaagataccgagctcgcggtcggtgacctcgctgtattcatctgaaccgtgcgggatcaacggacgagggctgcgcagttccttcagcagcacctcaagcttctcctcttcagacagctcgcggtagtttgtggtgacttgggcacgctcgaaaagctctgtgagtacgtcttcgtagctctcagagttctggcgcagatccagtgagtagaggttgaatccgaagctctcgatggcagaaatcagcacagacaaacgatcatcggcaatgagaacgtcattggattcacgcagagaatgatcaatggtcaacgcatcgtttaagaattcttccggggatgcgtatggagtaaagaccttgaaccacacgccctcaacggcgtcctcgccgatcagctcagccgtcgtcgcgaggatacggccacgaacgccatggacggcgcgtcgataaggctcatccacgcgacttggcacgtcgttgtgcccggcatctgcaagctcaagcagctgcggggtgacctcattcatgcgatccgacaggctcagctcatgctcaagggaatgcagttggcgcgcgtagtacttgagcacagtttctgcagcgcggcgagtggagtactcgacagtgccagcggtgacataaggattaccgtcgtggtcgccaccaatccaggaacctggcttgaccacgggcttcaaaggaacatcctcgccgaaacgctcacgaagctcaacggcaacatcgcggttgatacgtggaatctcttccaaaaggctcagcttgtagtagcgcagccctacttcgatctcgtcctcgatacgtgggcgggccacacgaatcaacgcggtctgccacaaaatggtgatgcgacggcggatgttcttttcgatctcatccaacttgctttgcgtacgagcggttggctccgcagactgcaaagcgtggcgttcacgcatgtgggtggtgatccacttttgcgcatcaaaaacagtgcggcgacgagtctcagttgggtgcgcagtcagaactggcgccacctcagcattacgcaacacatccgccacagcttctgcgccaacattgccctcattgagtttcagccaggtggcatcaagagtgctgtccggaggggtgtcgcctgcatcgagagcctgttcacgaagctcttcatcgtggaggtcttccgccaggttagccagcagagcgaagtgggaaaatgcgcgagcaatcggtgttgccttggctggagtaatgccgtcgaaaacctgaaccaggctatccatttcggcgttgcccttggcgatatcaaaagaagtcaggcgcgcttgttcgaccagttcataaacctcctggccttcttgttccgcaattacctcaccgaggattcgaccgaggaacctgatgtcatcgcgtagaaaatcagtcat。
优选地，所述天冬氨酸转氨酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.14所示的序列。
SEQ ID No.14：
atgcggaggtacgcagttatgagttcagtttcgctgcaggattttgatgcagagcgaattggtctgttccacgaggacattaaacgcaagtttgatgagctcaagtcaaaaaatctgaagctggatcttactcgcggtaagccttcgtcggagcagttggatttcgctgatgagttgttggcgttgcctggtaagggtgatttcaaggctgcggatggtactgatgtccgtaactatggcgggctggatggcattgttgatattcgtcagatttgggcggatttgctgggtgttcctgtggagcaggtcttggcgggggatgcttcgagcttgaacatcatgtttgatgtgatcagctggtcgtacattttcggtaacaatgattcggttcagccttggtcgaaggaagagaccgttaagtggatttgtcctgttccgggatatgatcgccatttctccatcacggagcgtttcggctttgagatgatttctgtgccaatgaatgaagacggccctgatatggatgctgttgaggaattggtgaaggatccgcaggttaagggcatgtgggttgtgccggtattttctaacccgactggtttcacggtgtcggaggacgtcgcaaagcgtctgagcgcgatggagaccgcggcgccggacttccgcgtggtgtgggacaatgcctacgccgttcatactctgaccgatgagttccctgaggtcatcgacatcgttgggcttggtgaggcggcgggtaacccgaaccgtttctgggcgttcacttctacttcgaagatcactctcgcgggtgcgggcgtgtccttcttcatgacttctgcggagaaccgtaagtggtactccggtcatgcgggtatccgtggcattggccctaacaaggtcaatcagttggctcatgcgcgttactttggcgatgctgagggagtgcgcgcggtgatgcgtaagcatgctgcgtcgttggctccgaagttcaacaaggttctggagatcctggactcccgccttgctgagtacggtatcgcgcagtggactgtccctgcgggcggttacttcatttcccttgatgtggttcctggtacggcatctcgtgtggctgagttggctaaggaagccggcatcgcgttgacgggtgcgggttcttcttacccgctgcgtcaggatccggagaacaagaacctccgtttggcgccttctctgcctcctgttgaggaacttgaggttgccatggatggcgtggctacgtgtgttttgctggcagctgcggagcactacgctagctag。
优选地，所述天冬氨酸β脱羧酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.15所示的序列。
SEQ ID No.15：
tcaggactcatcttttttagttcccagatattcctgataggcatcttcggcaaagcgtcgtagagaatcaccgattgcagcatattggtaagcattcagattggctaatgaagcacgtgccgatggatgggataccccaaagccagaacctggcaacagaacgacaccggtttcatctgctacccgaaataataattctgtcgggtttttattgaccatgacccagttggcaaaatcgtcaccatataatatgcgggctgttctttccagatctaccaaggtgtaatagtcaacagcgttaagatcttcagggacttcaacaccaagctgtctataaagtgcagcatcgcgttcccggactacagacttgacagcttttttataagcctgacgagaatccatcatattaaacagggcaaaaagaaccatctgtacctgctgcggtgttgacagacctgcggtgtgattcagtgcaacattacggctatctgctaccaaacggtcaataaacttgattttttctggttcagtagttaatgatgaataacgttcttcaagttcctgcttttcctgatctgaaagcgatgcaatcttctgatcaatgatattgttattggacagcgcaataatgccaagtctccagcctgtagccccaaagtactttgagaatgaataaactaaaatagtattatttgggcaaattgcaaaaagtgacttaaagtcatctgcaaaagttccatatacatcatctgtcaaaataatcaggtcaggacgttttcttacaatatctgccagtattagcaatccttcatcacttattttgacagaaggcgggttgctcggattgactaaaaagaatgccttgattgaagggtcttctaactttcttaattcagactcaggatattgccagcccagattgggatcagcttcaataaaaatttcttcaagctgatagtcattcagtttgggaatttccagatacggcgtaaaaatcggtctgccgattgcaattcggtcgccagtattaataatcttgttttcttttaaggagttaaatatataagccatggctgcggttccgccttcaaccgcaaacaggtccaagccttccttgggcatactttttacgcccatttcctgtaacagatactctttaataattgtttcactgacacggagcatgcgatcaggtacagggtagttacatcctagaatcccttcgaccatttcaagcagaaacatatctggatctaaacccaattggtctctcacataagacactgcttttcccagaaataaaactccaggtttatcccggttctgcatgagaaaattatcaaaacgtgattgcaaaccgacaggacgggggaacccacctaagccttctggcatgtaagaaaatgaaaattctgattctgtggcagaaaataaacctaattgaaaaaaagccctacgtggcagggtagccagaaaattagggtttcctcgtccagcattgagcattaagcggtcccgcttactctgtgccaaagcaatcaggctatcttttaactcgaatgggctaagttttgaatatttagaataatctacattccccat。
优选地，所述天冬氨酸α脱羧酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.16所示的序列。
SEQ ID No.16：
ctacaaaattgtacgggctggttcgttccccagcatttgttcaattttgttttgatcattcagaacagccactttcggctcatggcttgccgcttcttgatcagacatcattttgtaggaaataataatgaccttatctccttcctgcacaaggcgtgcggctgcaccgtttaagcatatgacgccgcttccccgtttaccaggaataatatacgtttcaagacgtgctccattattattattcacaatttgtactttttcattaggaagcattcccacagcatcaatgagatcttcatcaattgtaatgcttcccacatagttcaggtttgcttccgtaacagttgccctgtgaagtttgccgctcatcattgttcgatacat。
优选地，所述β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.17所示的序列。
SEQ ID No.17：
tcaggcgatgccgttgagcgcttcgccgaccgcgtcgaacaggcggtccagctcttccggcctggcgttgaaggtcgggccgaattgcagggtatcgccgccgaagcgcacgtagaaaccctgttgccagagcttcatgccggcctcgaacggacgcacggtcggatcgccgtcgcgcggggcgatctggatcgcgccggccaggccgcagttgcggatgtcgatgacgttcttcgcgccttgcaggccgtgcaggcccttctcgaagtgcggcgccagctcggcggactgctgcaccaggttgtccctggccaggatgtccagcgcggcgaggccggcggcgcaggcgaccgggtgcgcggagtaggtgtagccgtggctgaactccaccgcgtgctcgggcagcgcctggttcatgaaggtgtcgtagatctcgctgctggcgatcaccgcgcccatcggcacggcgccgttggtgacctgcttggcgacgttcatcaggtccggggtgacgccgaagtactcggcgccgctgtaggtgcccaggcggccgaaggcggtgatcacctcgtcgaagatcagcaggatgttgtgctggtcgcagatctcgcgcaggcgctgcaggtagccgaccggcggtaccagtacgccggcggagccggacatcggctcgacgatcaccgcggcgatgttcgaggcgtcgtgcagttcgatcagcttgagcagctcgttggccagctcgacgccgccggtctgggccatcccgcgggtgaacgccatgcccggttgaagggtgtgcggcagatggtcgacgtccatcagctggccgaacatcttgcggttgccaccgatcccgccgaggctggtgccggcgacgttgaccccgtggtagccgcgggcgcggccgatcagcttggtcttctgcggctggcctttcaggcgccagtaggcgcgggccatcttgatcgaggtgtcggcgcactcggagccggaaccggtgaagaacacgtggttcagttcgcctggcagcaacccggcgatcttctcggccaactggaaggacagcggatggccgtactggaagcccggcgagtagtcgagggtgccgagctggcgagccaccgcctcctggatttccttgcgcgagtggccggcgccgcaggtccacaggccggacaggctgtcgtagaccttgcggcccttgtcgtcggtcagccagctgccttcggcggcgacgatgatccgcgggtccttctggaagttgcggttggcggagaagggcatccagtgggcgcgcaggttgagttcgctggaaaccggcggggccacgttgagcggctggttcat。
优选地，所述3-羟基酸脱氢酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.18所示的序列。
SEQ ID No.18：
ttactcgtcgcgattaaccttcaggccgccgtaggtttggctcaccggcatcatttccagcgtgttgatgttgacgtgagccggcagcgtcgccacccagaataccgcttccgtcacgtcttccggcgtcaatgggttggatttgtcataagtctggctgaccttggcatcatcccctttgaaacgtacggcagagaactcggttccccccaccagacccggctcgatattggttacccgcacccgagtaccagacaggtcggcgcgcagccccagactgaactggcgcacaaacgccttactggcaccgtagacattcccacccagataaggccagttgccggcagtggagccgatattaatgatatgaccgacattgcgcttcaccatttccggcagcagcgcatgggtcatgaacaccagccctttattgttggtatcgatcatggtttcccagtcgctgacgctggctttgtgcgccggctccagccctaacgccaaaccggcgttgttgaccagcacgtcaatattgcgccactcggcagacagggagccgatggcctgctcgatagcctgtcgatcgcgcacatcgagacgcagcgtgagaagcgccgcgccaaactcagctttcagagcgtcaagacgttcctggcggcggcctgtggcgataacctgatgaccttcctgaataaaccgccgggtaatcgcttcaccaaatcccgccgttgcgccggtaacaaaaataatcat。
第二方面，本发明提供了一种基因工程菌群，所述基因工程菌由第一方面所述的构建方法构建得到。
第三方面，本发明提供了第二方面所述的基因工程菌群在生产有机酸或制备有机酸产品中的应用；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了一种生产有机酸的方法，所述方法包括以葡萄糖为碳源，利用第二方面所述的基因工程菌群进行生物转化，制备有机酸；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产；
(2)本发明方法构建的工程菌群具有高转化率，且还原力供给平衡，避免了其它途径因为产生过量的NADH和伴随碳损失而转化率较低，本发明方法是由草酰乙酸直接生成天冬氨酸，避免了复杂的代谢调控。
附图说明
图1为本发明技术路线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
菌株和质粒：抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)货号TS342880，购于泰斯拓生物；大肠杆菌菌株(Escherichia coli DH5a)货号TX302购于雅吉生物；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)货号CICC 20182；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)货号CICC 10732；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)货号CICC 10204购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)，保藏编号为CCTCC NO:M2016354购于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
载体质粒：pCDFDuet-1；pET 30a(+)；pET 28a(+)；pETDuet-1；PKD3；PKD46。
种子培养基：葡萄糖20g/L，KH2PO41.3 g/L，K2HPO4·7H2O 4.4454g/L，(NH4)SO42.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，CaCO32.0 g/L，1mLFe2+/L溶液，1mLCa2+/L溶液，酵母粉1g/L，2.0mL/L微量元素A溶液。
发酵培养基：20g/L葡萄糖，9g/L KH2PO4，4g/L(NH4)2HPO4，0.6g/L MgSO4·7H2O，CaCl20.2g、1.7g/L柠檬酸，2g/L酵母提取物CaCO32g，10mL/L痕量金属溶液。
微量元素A溶液：饱和盐酸0.9mL/L,CuCl2·2H2O 20mg/L,ZnCl270mg/L,MnCl2·4H2O100mg/L,H3BO360mg/L,CaCl2·6H2O 200mg/L,NiCl2·6H2O 25mg/L,NaMoO4·2H2O35mg/L。
痕量金属溶液：ZnCl20.68g/L,MnCl2·4H2O 0.17g/L,H3BO360mg/L，CuCl2·2H200.47g/L，NaMoO4·2H2O 5mg/L，FeCl2·4H2O 3.97g/L，CoCl2·6H2O 0.47g/L，HCl10mL/L。
实施例1
利用同源重组基因敲除构建使D-乳酸脱氢酶基因ldhA失活的大肠杆菌菌株E.Coli DH5α-ΔldhA。
(1)扩增D-乳酸脱氢酶基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以SEQ ID No.1-SEQ ID No.4为特异性引物。
以E.coliDH5α基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到D-乳酸脱氢酶基因ldhA前后的DNA序列。
含氨苄青霉素抗性基因片段制备：以P1:5’-ATATGAATATCCTCCTTAG-3’P2:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。
(2)获得含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株。使用热激发法将基因敲除载体pKD46转化至待敲除的大肠杆菌中。
(3)含有基因敲除载体质粒的待敲除的菌株感受态的制备。
(4)电转上游同源臂+FRT+抗性基因表达元件+FRT+下游同源臂将敲除片段和pKD46质粒混匀，诱导表达，完成基因敲除和抗性基因重组。
(5)基因敲除菌株的鉴定，消除敲除菌株的抗性基因。选择在同源交换位点上下游100bp处设计引物，以未敲除的菌株作为对照，比较敲除菌株PCR产物的大小后，将敲除菌株PCR产物送公司测序。消除菌株的抗性基因，把pCP20转化至完成敲除的菌株，30℃培养过夜后转为42℃培养，消除pCP20。
实施例2
利用同源重组方法构建醛/醇脱氢酶adhE失活的大肠杆菌菌株E.Coli DH5α-ΔldhA-ΔadhE。
扩增醛/醇脱氢酶adhE上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以SEQID No.5-SEQ ID No.8为特异性引物。
以E.coliDH5α基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到醛/醇脱氢酶adhE前后的DNA序列。
含氨苄青霉素抗性基因片段制备：以P1：5’-ATATGAATATCCTCCTTAG-3’P2:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。
后续参照实施例1。
实施例3
利用基因同源重组方法构建乙酸激酶ackA失活的大肠杆菌菌株E.Coli DH5α-ΔldhA-ΔadhE-ΔackA。
扩增乙酸激酶ackA基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因。以SEQID No.9-SEQ IDNo.12为特异性引物。
以E.coliDH5α基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到乙酸激酶ackA失活前后的DNA序列。
含氨苄青霉素抗性基因片段制备：以P1：5’-ATATGAATATCCTCCTTAG-3’P2:5’-TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’为特异性引物，以pKD3质粒为模板，进行PCR扩增，得到两端含有FRT位点中间带抗性的基因片段。
后续参照实施例1。
实施例4
构建双酶偶联工程菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1。
(1)PEP羧化酶基因ppc的克隆：以ppc-F5’-GGGCGCTAAGAAGGAGATATACATATGCTAGCCGGAGTTGCGCAGT-3’为上游引物(已包含酶切位点和保护碱基)并以ppc-R5’-TTTACCAGACTCGAGGGTACCCGATGACTGATTTTCTACGCGATGACATCAGG-3’为下游引物，以谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)基因组为模板，进行PCR扩增，得到用于转化草酰乙酸的基因序列。
(2)线性化载体：在质粒pCDFDuet-1上MCS克隆位点处用NdeI和KpnI酶切位点切开，将环状的质粒线性化。
(3)构建重组质粒：根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的重组连接操作步骤，获得带有限制性酶切位点的目的基因CgPPC后与已线性化的载体pCDFDuet-1连接成环，得到重组质粒pCDFDuet—CgPPC。
(4)使用步骤(3)的重组质粒，在载体上另一MCS克隆位点处导入GOT1扩增后的基因序列以获得有PPC和GOT1两处基因表达的重组质粒。
以GOT1-F 5’TCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCATGCGGAGGTA CGCAGTTATGAGT-3’为上游引物(已包含酶切位点和保护碱基等)并以ppc-R 5’-GCGCTTACTTTCTGTTCGACTTAAGCTAGCTAGCGTAGTGCT-3’为下游引物，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，得到用于转化L-天冬氨酸的基因序列。
(5)线性化载体：在上述重组质粒pCDFDuet-1-CgPPC上用AscI和AflII酶切位点切开，将环状的质粒线性化。
(6)构建重组质粒：根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的重组连接操作步骤，获得带有限制性酶切位点的目的基因CgGOT1后与已线性化的载体pCDFDuet-1-CgPPC连接成环，得到含有连个目的基因的重组质粒pCDFDuet-1-CgPPC-CgGOT1。
(7)目的基因在E.coli DH5α的表达与筛选：将重组产物化转入大肠杆菌EcoliDH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pCDFDuet-1-CgPPC-CgGOT1。转化成功质粒序列如SEQ IDNo.19所示。
SEQ ID NO.19：
ggggaattgtgagcggataacaattcccctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgaattcgagctcggcgcgccatgcggaggtacgcagttatgagttcagtttcgctgcaggattttgatgcagagcgaattggtctgttccacgaggacattaaacgcaagtttgatgagctcaagtcaaaaaatctgaagctggatcttactcgcggtaagccttcgtcggagcagttggatttcgctgatgagttgttggcgttgcctggtaagggtgatttcaaggctgcggatggtactgatgtccgtaactatggcgggctggatggcattgttgatattcgtcagatttgggcggatttgctgggtgttcctgtggagcaggtcttggcgggggatgcttcgagcttgaacatcatgtttgatgtgatcagctggtcgtacattttcggtaacaatgattcggttcagccttggtcgaaggaagagaccgttaagtggatttgtcctgttccgggatatgatcgccatttctccatcacggagcgtttcggctttgagatgatttctgtgccaatgaatgaagacggccctgatatggatgctgttgaggaattggtgaaggatccgcaggttaagggcatgtgggttgtgccggtattttctaacccgactggtttcacggtgtcggaggacgtcgcaaagcgtctgagcgcgatggagaccgcggcgccggacttccgcgtggtgtgggacaatgcctacgccgttcatactctgaccgatgagttccctgaggtcatcgacatcgttgggcttggtgaggcggcgggtaacccgaaccgtttctgggcgttcacttctacttcgaagatcactctcgcgggtgcgggcgtgtccttcttcatgacttctgcggagaaccgtaagtggtactccggtcatgcgggtatccgtggcattggccctaacaaggtcaatcagttggctcatgcgcgttactttggcgatgctgagggagtgcgcgcggtgatgcgtaagcatgctgcgtcgttggctccgaagttcaacaaggttctggagatcctggactcccgccttgctgagtacggtatcgcgcagtggactgtccctgcgggcggttacttcatttcccttgatgtggttcctggtacggcatctcgtgtggctgagttggctaaggaagccggcatcgcgttgacgggtgcgggttcttcttacccgctgcgtcaggatccggagaacaagaacctccgtttggcgccttctctgcctcctgttgaggaacttgaggttgccatggatggcgtggctacgtgtgttttgctggcagctgcggagcactacgctagctagcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacatatgctagccggagttgcgcagtgcagtggaaagaccgttcattgtcagctgaatattgcgggaaacttgctcgctttggtcgccttttcggtagcgtcgcatcatctctacctggatcacattgagtggaagcaggtaggggtaacgacgctggacagagcgtgccagaagtgggttgtcatcgaggagatcatcggagccggtgatcacgcagaacatctttttagtcaggaaatattcctcgtggatgacggaatagacgcgctcggcgacttccctatctgggatgaggtctgcatagagctttgccaaacgcagctctgccttggacatcacctgagccatgttgtccaacactgaggtgaaaaatggccaggactcgttgagtgtttgcagctctgcgatgcgctgggtagcttgctccccttctccaatccactgttcaagtgccgttccgacaccaaaccatcctggcagcatcacacgagactgtgaccagctaagaacccatgggatggctcgcaaatcttccacagaggaagtttgcttgcgtgaggaaggcctggatccgatgttgagggatccgatctcctgcagtggtgtggattgggtgaagtaatcgatgaagccttgatcctcgtgcaccaaggaggtgtacttcttcaggctgagctcagagatctcactcatgatgtcatacgcgcgttggtgatcggtgagttcagagacgtcgagaagcgatgcctcaagcgtggctgagaccagtgcctcgaggtttcggcgcgcagtttcagggttgccgtacttagctgagatgatttcgccctgctcggtgatgcgcacggaaccttggacagcccccttgggctgggcaagaatcgcatcgtaggaaggtccgccaccacgtccaacggtgccaccgcggccgtggaacaggcgaagcttgaccccggctgatcggcatagttcgacaagctgcagttccgcgtcgtaaagcgcccagtttgcggagaaatacccgccatccttgttggaatcggagtagccgagcatgacttcctggacgttgtcgcgctgcaggaggtagttgcggtagagatcaattttccacagttcgccgagaataccggcgccggctcgaaggtcttcgatggtttcgaacagtgggatgacatcgacggtgccgcgtggattgtcgccgttggccgcgatgaggccgaattctttgagcaacaccatcggctcgagcacatcggtgaccgatgatgccatggaaatgatgcagtgaggcaccatgcgtgggccgaatttcttgacagcttccgacgcggtgcggaagataccgagctcgcggtcggtgacctcgctgtattcatctgaaccgtgcgggatcaacggacgagggctgcgcagttccttcagcagcacctcaagcttctcctcttcagacagctcgcggtagtttgtggtgacttgggcacgctcgaaaagctctgtgagtacgtcttcgtagctctcagagttctggcgcagatccagtgagtagaggttgaatccgaagctctcgatggcagaaatcagcacagacaaacgatcatcggcaatgagaacgtcattggattcacgcagagaatgatcaatggtcaacgcatcgtttaagaattcttccggggatgcgtatggagtaaagaccttgaaccacacgccctcaacggcgtcctcgccgatcagctcagccgtcgtcgcgaggatacggccacgaacgccatggacggcgcgtcgataaggctcatccacgcgacttggcacgtcgttgtgcccggcatctgcaagctcaagcagctgcggggtgacctcattcatgcgatccgacaggctcagctcatgctcaagggaatgcagttggcgcgcgtagtacttgagcacagtttctgcagcgcggcgagtggagtactcgacagtgccagcggtgacataaggattaccgtcgtggtcgccaccaatccaggaacctggcttgaccacgggcttcaaaggaacatcctcgccgaaacgctcacgaagctcaacggcaacatcgcggttgatacgtggaatctcttccaaaaggctcagcttgtagtagcgcagccctacttcgatctcgtcctcgatacgtgggcgggccacacgaatcaacgcggtctgccacaaaatggtgatgcgacggcggatgttcttttcgatctcatccaacttgctttgcgtacgagcggttggctccgcagactgcaaagcgtggcgttcacgcatgtgggtggtgatccacttttgcgcatcaaaaacagtgcggcgacgagtctcagttgggtgcgcagtcagaactggcgccacctcagcattacgcaacacatccgccacagcttctgcgccaacattgccctcattgagtttcagccaggtggcatcaagagtgctgtccggaggggtgtcgcctgcatcgagagcctgttcacgaagctcttcatcgtggaggtcttccgccaggttagccagcagagcgaagtgggaaaatgcgcgagcaatcggtgttgccttggctggagtaatgccgtcgaaaacctgaaccaggctatccatttcggcgttgcccttggcgatatcaaaagaagtcaggcgcgcttgttcgaccagttcataaacctcctggccttcttgttccgcaattacctcaccgaggattcgaccgaggaacctgatgtcatcgcgtagaaaatcagtcatcgggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaacctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaaccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcatcgtggccggatcttgcggcccctcggcttgaacgaattgttagacattatttgccgactaccttggtgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttccaactgatctgcgcgcgaggccaagcgatcttcttcttgtccaagataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactgggccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggttactgcgctgtaccaaatgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagtcgggcggcgagttccatagcgttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcaggaaccggatcaaagag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实施例5
构建工程菌EcoliDH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET28a(+)-ArAsd。
(1)L-天冬氨酸β-脱羧酶基因的克隆：以Asd-F5’GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGACTCATCTTTTTTAGTTCCCAG-3’为上游引物(已包含酶切位点和保护碱基等)并以Asd-R5’-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCCGCGCGCGATGGGGAATGTAGATTATTCTAAATATTC-3’为下游引物，以不动杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，得到用于生产L-丙氨酸的L-天冬氨酸β脱羧酶的基因序列。
(2)线性化载体：在质粒pET28a(+)上用XhoI和EcoRI酶切位点切开，将环状的质粒线性化。
(3)构建重组质粒：根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的重组连接操作步骤，获得带有限制性酶切位点的目的基因ArAsd后与已线性化的载体pET28a(+)连接成环，得到重组质粒pET28a(+)-ArAsd。
(4)将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pET28a(+)-ArAsd。转化的质粒序列如SEQ ID No.20所示。
SEQ ID NO.20：
atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtcaggactcatcttttttagttcccagatattcctgataggcatcttcggcaaagcgtcgtagagaatcaccgattgcagcatattggtaagcattcagattggctaatgaagcacgtgccgatggatgggataccccaaagccagaacctggcaacagaacgacaccggtttcatctgctacccgaaataataattctgtcgggtttttattgaccatgacccagttggcaaaatcgtcaccatataatatgcgggctgttctttccagatctaccaaggtgtaatagtcaacagcgttaagatcttcagggacttcaacaccaagctgtctataaagtgcagcatcgcgttcccggactacagacttgacagcttttttataagcctgacgagaatccatcatattaaacagggcaaaaagaaccatctgtacctgctgcggtgttgacagacctgcggtgtgattcagtgcaacattacggctatctgctaccaaacggtcaataaacttgattttttctggttcagtagttaatgatgaataacgttcttcaagttcctgcttttcctgatctgaaagcgatgcaatcttctgatcaatgatattgttattggacagcgcaataatgccaagtctccagcctgtagccccaaagtactttgagaatgaataaactaaaatagtattatttgggcaaattgcaaaaagtgacttaaagtcatctgcaaaagttccatatacatcatctgtcaaaataatcaggtcaggacgttttcttacaatatctgccagtattagcaatccttcatcacttattttgacagaaggcgggttgctcggattgactaaaaagaatgccttgattgaagggtcttctaactttcttaattcagactcaggatattgccagcccagattgggatcagcttcaataaaaatttcttcaagctgatagtcattcagtttgggaatttccagatacggcgtaaaaatcggtctgccgattgcaattcggtcgccagtattaataatcttgttttcttttaaggagttaaatatataagccatggctgcggttccgccttcaaccgcaaacaggtccaagccttccttgggcatactttttacgcccatttcctgtaacagatactctttaataattgtttcactgacacggagcatgcgatcaggtacagggtagttacatcctagaatcccttcgaccatttcaagcagaaacatatctggatctaaacccaattggtctctcacataagacactgcttttcccagaaataaaactccaggtttatcccggttctgcatgagaaaattatcaaaacgtgattgcaaaccgacaggacgggggaacccacctaagccttctggcatgtaagaaaatgaaaattctgattctgtggcagaaaataaacctaattgaaaaaaagccctacgtggcagggtagccagaaaattagggtttcctcgtccagcattgagcattaagcggtcccgcttactctgtgccaaagcaatcaggctatcttttaactcgaatgggctaagttttgaatatttagaataatctacattccccatcgcgcgcggaattcggatccgcgacccatttgctgtccaccagtcatgctagccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccga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实施例6
构建工程菌EcoliDH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET30a(+)-BsPanD。
(1)L-天冬氨酸β-脱羧酶基因的克隆：以PanD-F 5’GTGGTGCTCGAGTGCCGGCCGCTACAAAATTGTACGG GCTGGT-3’为上游引物(已包含酶切位点和保护碱基等)并以PanD-R 5’-GCCATGGCTGATATCGCGGATCCATGTATCGAACAATGATGAGCGGC-3’为下游引物，以不动杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，得到用于生产β-丙氨酸的天冬氨酸α脱羧酶的基因序列。
(2)线性化载体：在质粒pET30a(+)上用EagI和BamHI酶切位点切开，将环状的质粒线性化。
(3)构建重组质粒：根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的重组连接操作步骤，获得带有限制性酶切位点的目的基因PanD后与已线性化的载体pET30a(+)连接成环，得到重组质粒pET30a(+)-PanD。
(4)将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pET30a(+)-PanD。转化的质粒序列如SEQ ID No.21所示。
SEQ ID No.21：
atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgctacaaaattgtacgggctggttcgttccccagcatttgttcaattttgttttgatcattcagaacagccactttcggctcatggcttgccgcttcttgatcagacatcattttgtaggaaataataatgaccttatctccttcctgcacaaggcgtgcggctgcaccgtttaagcatatgacgccgcttccccgtttaccaggaataatatacgtttcaagacgtgctccattattattattcacaatttgtactttttcattaggaagcattcccacagcatcaatgagatcttcatcaattgtaatgcttcccacatagttcaggtttgcttccgtaacagttgccctgtgaagtttgccgctcatcattgttcgatacatggatccgatatcagccatggccttgtcgtcgtcgtcggtacccagatctgggctgtccatgtgctggcgttcgaatttagcagcagcggtttctttcataccagaaccgcgtggcaccagaccagaagaatgatgatgatgatggtgcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatcgatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggacatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatt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实施例7
构建双酶偶联工程菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET30a(+)-BsPanD-pETDuet-1-PabauA-DdydFG。
(1)扩增过表达目的基因：β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶bauA的克隆，以bauA-F5’-GCGCTAAGAAGGAGATATACCATGGTCAGGCGATGCCGTTGA-3’为上游引物并以bauA-R 5’-GCCGAGCTCGAATTCGGATCCATGAACCAGCCGC TCAACGT-3’为下游引物(已包含酶切位点和保护碱基等)，以铜绿假单胞菌P.aeruginosa基因组作为模板，进行PCR扩增，得到用于获得丙二酸半醛的β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶的基因序列bauA。
(2)NADP+依赖性3-羟基酸脱氢酶基因ydFG的克隆：
以ydFG-F 5’-CGCGCGTAAGAAGGAGATATACATATGTTACTCGTCG CGATTAACCTTCAGGC-3’和ydFG-R’-AGGGTACCGACGTCAGCGATCGCATGATTATTTTTGTTACCGGCGCAACGGCGGG-3’为上游引物和下游引物(已包含酶切位点和保护碱基等)，以Dickeya dadantii 3937基因组序列为模板，进行PCR扩增，得到用于生产3-HP羟基丙酸的3-羟基酸脱氢酶的基因序列。
(2)线性化载体：在质粒pETDuet-1上用NcoI和BamHI酶切位点切开(用于连接bauA)，另一MCS位点用NdeI和AsiSI酶切位点切开(用于连接YdFG基因)，将环状的质粒线性化。
(3)构建重组质粒：根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的重组连接操作步骤，获得带有限制性酶切位点的目的基因bauA和ydFG后与已线性化的载体pETDuet-1连接成环，得到重组质粒pETDuet-1-bauA-ydFG。
(4)将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过卡那霉素抗性的平板进行筛选阳性克隆。阳性克隆中提取的质粒即为pETDuet-1-bauA-ydFG。转化的质粒序列如SEQ IDNo.22所示。
SEQ ID NO.22：
ggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatggtcaggcgatgccgttgagcgcttcgccgaccgcgtcgaacaggcggtccagctcttccggcctggcgttgaaggtcgggccgaattgcagggtatcgccgccgaagcgcacgtagaaaccctgttgccagagcttcatgccggcctcgaacggacgcacggtcggatcgccgtcgcgcggggcgatctggatcgcgccggccaggccgcagttgcggatgtcgatgacgttcttcgcgccttgcaggccgtgcaggcccttctcgaagtgcggcgccagctcggcggactgctgcaccaggttgtccctggccaggatgtccagcgcggcgaggccggcggcgcaggcgaccgggtgcgcggagtaggtgtagccgtggctgaactccaccgcgtgctcgggcagcgcctggttcatgaaggtgtcgtagatctcgctgctggcgatcaccgcgcccatcggcacggcgccgttggtgacctgcttggcgacgttcatcaggtccggggtgacgccgaagtactcggcgccgctgtaggtgcccaggcggccgaaggcggtgatcacctcgtcgaagatcagcaggatgttgtgctggtcgcagatctcgcgcaggcgctgcaggtagccgaccggcggtaccagtacgccggcggagccggacatcggctcgacgatcaccgcggcgatgttcgaggcgtcgtgcagttcgatcagcttgagcagctcgttggccagctcgacgccgccggtctgggccatcccgcgggtgaacgccatgcccggttgaagggtgtgcggcagatggtcgacgtccatcagctggccgaacatcttgcggttgccaccgatcccgccgaggctggtgccggcgacgttgaccccgtggtagccgcgggcgcggccgatcagcttggtcttctgcggctggcctttcaggcgccagtaggcgcgggccatcttgatcgaggtgtcggcgcactcggagccggaaccggtgaagaacacgtggttcagttcgcctggcagcaacccggcgatcttctcggccaactggaaggacagcggatggccgtactggaagcccggcgagtagtcgagggtgccgagctggcgagccaccgcctcctggatttccttgcgcgagtggccggcgccgcaggtccacaggccggacaggctgtcgtagaccttgcggcccttgtcgtcggtcagccagctgccttcggcggcgacgatgatccgcgggtccttctggaagttgcggttggcggagaagggcatccagtgggcgcgcaggttgagttcgctggaaaccggcggggccacgttgagcggctggttcatggatccgaattcgagctcggcgcgcctgcaggtcgacaagcttgcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacatatgttactcgtcgcgattaaccttcaggccgccgtaggtttggctcaccggcatcatttccagcgtgttgatgttgacgtgagccggcagcgtcgccacccagaataccgcttccgtcacgtcttccggcgtcaatgggttggatttgtcataagtctggctgaccttggcatcatcccctttgaaacgtacggcagagaactcggttccccccaccagacccggctcgatattggttacccgcacccgagtaccagacaggtcggcgcgcagccccagactgaactggcgcacaaacgccttactggcaccgtagacattcccacccagataaggccagttgccggcagtggagccgatattaatgatatgaccgacattgcgcttcaccatttccggcagcagcgcatgggtcatgaacaccagccctttattgttggtatcgatcatggtttcccagtcgctgacgctggctttgtgcgccggctccagccctaacgccaaaccggcgttgttgaccagcacgtcaatattgcgccactcggcagacagggagccgatggcctgctcgatagcctgtcgatcgcgcacatcgagacgcagcgtgagaagcgccgcgccaaactcagctttcagagcgtcaagacgttcctggcggcggcctgtggcgataacctgatgaccttcctgaataaaccgccgggtaatcgcttcaccaaatcccgccgttgcgccggtaacaaaaataatcatgcgatcgctgacgtcggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttctggcggcacgatggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatcatgattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactata。
(5)质粒的转化1：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，加入质粒pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养经过卡那霉素抗性筛选，挑选阳性转化子，进行4组平行实验命名为E1-E4。
(6)质粒的转化2：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，同时加入质粒pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1,和pET28a(+)-ArAsd进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E5-E8。
(7)质粒的转化3：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞，同时加入质粒pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1,和pET30a(+)-PanD进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E9-E12。
(8)质粒的转化4：取50μL新鲜制作的电转大肠杆菌感受态细胞同时加入质粒pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1,pET30a(+)-PanD和pETDuet-1-bauA-ydFG进行电击转化。快速向电击后的混合液进行复苏。复苏完的菌液经适当稀释后涂布在含卡那霉素抗性的平板上，37℃下过夜培养。进行4组平行实验命名为E13-E16。
实施例8
制备丙烯酸。
(1)反应釜中加入稳定性和3-羟基丙酸转化效率高的硅胶催化剂，在加入原料3-羟基丙酸前，氮气(20mL/min)以10℃/min加热到300℃预热保持30min。
(2)将发酵后离心过滤提纯后的3-羟基丙酸制备为15％浓度的3-HP溶液以1g/g/h空间流速(WHSV)通入反应釜中。
(3)产物通过冷却抽集器收集，并进一步检测。
实施例9
发酵培养。
针对不同目的产物的工程菌群发酵培养均按照分批补料方式进行发酵培养，具体如下：
(1)诱导重组大肠杆菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1表达PEP羧化酶和天冬氨酸转氨酶，获得天冬氨酸。
菌株在25mL试管中的5mL LB培养基(Amp:100μg/mL)中活化。37℃摇床内过夜培养，种子罐高压蒸汽灭菌后投入培养基再灭菌。将菌株接种到100mL LB培养基(Amp:100μg/mL)中，接种过程确保无菌操作。当分光光度计测试OD600达到2时，转移到含有2L发酵培养基的5L发酵罐A中。通过自动添加氨将pH控制在7.0。气流速度为2L/min，搅拌速度通过与溶解氧(DO)浓度耦合来控制，以确保在生长和诱导阶段DO值低于30％。初始搅拌速度为400rpm，在发酵转化期间小于1000rpm。
葡萄糖按照1.5g/L/h不断补料。在37℃下进行细胞生长，直到OD600达到20，然后加入2g/L L-阿拉伯糖诱导蛋白质在30℃下放置20小时(最终细胞密度约为OD600＝40)。发酵培养每隔2h取样一次，取样量1mL，至发酵结束。
(2)重组大肠杆菌菌群中-天冬氨酸β-脱羧酶的诱导表达，制备L-丙氨酸。
将筛选成功、保存的重组菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET28a(+)-ArAsd于氨苄抗性的LB(Amp:100μg/mL)平板上活化，37℃摇床内过夜培养；挑取单菌落接种于含氨苄霉素(Amp:100μg/mL)的100mL LB培养基中，使用氨水控制pH在5。生长期30℃、200r·min-1摇床培养至菌体OD600为1.2，转接至5L发酵罐B，并加入100μg/mL氨苄霉素。当细胞浓度达到OD600约为25(～9.6g DCW/l)时，将温度调至Asd酶活性较高的42℃，1h后开始限氧阶段。按0.2vvm通氮气添加终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导，温度设定在40℃诱导培养40h。葡萄糖(1.5g/L/h)需不断补料。发酵培养每隔4h取样一次，取样量1mL，至发酵结束。
(3)重组大肠杆菌菌群中-天冬氨酸α脱羧酶的诱导表达，制备β-丙氨酸。
将筛选成功、保存的重组菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET30a(+)-BsPanD于氨苄抗性的LB(Amp:100μg/mL)平板上活化，37℃摇床内过夜培养；挑取单菌落接种于含氨苄霉素(Amp:100μg/mL)的100mL LB培养基中，37℃、200r·min-1培养8h，摇床培养至菌体OD600为1.2，转接至5L发酵罐C，并加入100μg/mL氨苄霉素通过自动添加氨将pH控制在7.0。气流速度为2L/min。添加终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导，温度调至37℃诱导培养48h。发酵培养每隔4h取样一次，取样量1mL，至发酵结束。
(4)重组大肠杆菌菌群中β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶和β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶的诱导表达，制备3-HP(3-羟基丙酸)。
将筛选成功、保存的重组菌Ecoli DH5αΔldhA-ΔadhE-ΔackA/pCDFDuet-1-CgPpc-CgGOT1-pET30a(+)-BsPanD-pETDuet-1-PabauA-DdydFG于氨苄抗性的LB(Amp:100μg/mL)平板上活化，37℃摇床内过夜培养；挑取单菌落接种于含氨苄霉素(Amp:100μg/mL)的100mL LB培养基中，37℃、200r·min-1下摇床培养至菌体OD600为1.2，转接至5L发酵罐D，并加入100μg/mL氨苄霉素，添加终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导，温度调至30℃共诱导培养72h。发酵培养每隔3h取样一次，取样量1mL，至发酵结束。
测试例1
发酵液中有机酸含量的测定。
样品处理及检测。将不同时间段取样和最终发酵完成的发酵液分别在12000rpm离心，上清液沸水浴10分钟12000rpm离心半小时，上清液经用0.22μM的膜过滤后用高效液相色谱分析，具体操作如下。
氨基酸(L-天冬氨酸、β-丙氨酸，L-丙氨酸)的浓度通过HPLC(Agilent 1260系列，Hewlett-Packard)使用Agilent Extend-C183.5μm色谱柱(4.6×250mm)进行测量。分析在40℃下进行，流动相A为10mM KH2PO4水溶液(pH 7.0)，流动相B为乙腈、甲醇和水(45:45:10，v/v/v)，流速为1毫升/分钟。60℃、1h后用二硝基氟苯(DNFB)衍生化并通过0.22μM PES膜过滤来检测分析物。使用二极管阵列检测器(DAD)在360nm处测定浓度。该测试使用浓度梯度。天冬氨酸或L-丙氨酸或β-丙氨酸或3-羟基丙酸的含量，结果如表1所示。
表1
由表1HPLC高效液相色谱的分析结果可知：经由代谢工程改造的重组大肠杆菌工程菌发酵产生的L-天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸和3-羟基丙酸分别实现平均产量为43g/L,38.4g/L,42.9g/L,40.9g/L。同时过表达关键酶的基因和敲除控制支路碳流的基因可以实现优于现有文献的较高转化。
测试例2
发酵液中葡萄糖含量的测定。
测定葡萄糖含量需使用生物传感分析仪YSI 2700生物化学分析仪(YSI LifeSciences，OH)，在测定前准备好样品与葡萄糖标准液。葡萄糖标准液配置可以取适量葡萄糖标准品于称量瓶中，在104℃烘干4h,然后在干燥器内冷却。随后称取0.100mg葡萄糖标准品，用蒸馏水在100ml烧杯中溶解，并全部转移到1000ml容量瓶，定容备用。具体测定方法如下：首先进行仪器的清洗，完成后仪器显示进入标定状态。清洗进样针，每次吸取超过25mL，吸取后快速排空，清洗三次；标定。吸取25ML葡萄糖标准液，待仪器清洗完将进样针插入进样口，迅速打入标准液后拔出，仪器测定后，屏幕上的数字会稳定为—个数值，按此方法清洗三次，直到通过标定；按照标定的方法进行样品的测定，待数值稳定后记下此时的葡萄糖浓度，现实数值若大于1000，则需对样品进行稀释。葡萄糖含量结果如表2所示。
表2
由表2结果可知：本发明由于间歇补料，底物葡萄糖浓度充足，并随发酵时间增加残留葡萄糖浓度也相应增加。根据补料浓度和初始浓度推算，补料后四个目的产物对应的培养基可以分别达到葡萄糖浓度约为50g/L，80g/l，92g/L，128g/L。由此消耗的葡萄糖可以计算转化率。以葡萄糖为底物，质量转化率可以计算得到分别为96％，56％，79％和55％。该实验四个产物的摩尔转换率高于(或持平)目前已有文献的最高摩尔转化：1.01，0.98，1.52和0.84。
综上所述，本发明通过对大肠杆菌感受态细胞进行改造，敲除D-乳酸脱氢酶、醛/醇脱氢酶、乙酸激酶基因抑制碳流向乳酸、乙醇、乙酸的转化；同时构建可过表达PEP羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶，天冬氨酸β脱羧酶，天冬氨酸α脱羧酶，β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶和3-羟基酸脱氢酶的工程菌群，改造后的大肠杆菌从而可利用葡萄糖为碳源实现天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸和3-羟基丙酸的多种有机酸的可控生产。
Claims (10)
1.一种工程菌群的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
敲除受体菌的D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因；导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法在导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因之后还包括：导入天冬氨酸β脱羧酶基因；
优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸β脱羧酶基因之后还包括导入天冬氨酸α脱羧酶基因；
优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸α脱羧酶基因之后还包括导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因；
优选地，所述构建方法在导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因之后还包括导入3-羟基酸脱氢酶基因。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述受体菌包括含有所述D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述敲除受体菌的D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的上下游同源臂的DNA片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括FRT+抗性基因氨苄+FRT。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因上下游同源臂的DNA片段的核酸序列包括如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.12所示的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因的来源包括：谷氨酸棒杆菌；
优选地，所述天冬氨酸β脱羧酶基因的来源包括：抗辐射不动杆菌；
优选地，所述天冬氨酸α脱羧酶基因的来源包括：枯草芽孢杆菌；
优选地，所述β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因来源包括：铜绿假单胞菌；
优选地，所述3-羟基酸脱氢酶基因的来源包括：达旦提狄克氏菌和/或大肠杆菌K12。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.13所示的序列；
优选地，所述天冬氨酸转氨酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.14所示的序列；
优选地，所述天冬氨酸β脱羧酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.15所示的序列；
优选地，所述天冬氨酸α脱羧酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.16所示的序列；
优选地，所述β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.17所示的序列；
优选地，所述3-羟基酸脱氢酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.18所示的序列。
8.一种基因工程菌群，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到。
9.权利要求8所述的基因工程菌群在生产有机酸或制备有机酸产品中的应用；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种生产有机酸的方法，其特征在于，所述方法包括以葡萄糖为碳源，利用权利要求8所述的基因工程菌群进行生物转化，制备有机酸；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
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