CN116987606A - 碳中和产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种碳中和产3‑羟基丙酸的基因工程菌，其为含有外源的经过人工修改的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR的重组酿酒酵母菌；所述人工修改为野生型酿酒酵母基因组上的修改，其包括将外源的编码丙二酰辅酶A还原酶基因整合在XI‑2染色体位置，上调碳酸氢盐转运蛋白SUL1的表达,上调3‑羟基丙酸的转运蛋白ESBP6的表达，敲除OCA5基因等。通过上述改造构建了一株3‑羟基丙酸的高产菌，使用20g/L葡萄糖在摇瓶中产生11.63g/L的3‑HP，接近理论产量。
Description
技术领域
本发明属于代谢工程和合成生物学技术领域，涉及一种碳中和产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用。
背景技术
由于温室气体的排放，如二氧化碳和甲烷，被广泛认为是当前气候危机的主要驱动因素。为避免严重的气候变化影响，政府间气候变化专门委员会(IPCC)第六次评估报告强烈建议将全球变暖限制在工业化前水平的1.5℃以下。为实现这一目标，需在2030年前将二氧化碳排放量减少一半，并在2050年前实现净零排放。生物燃料和生物基化学品生产替代石油基燃料和石油化工产业是应对这一有害发展的潜在手段。但是，“绿色工艺”所产生的大量温室气体使它们不如最初预期的那么“绿色”。
例如，广泛使用的主要生物燃料乙醇每生成一个分子必须排放一个CO2分子。这种情况下，每升乙醇生产会产生800克CO2的排放，在工业中试规模下会导致数百万吨的CO2排放。针对这个问题，提出了多种策略，例如将原料从糖转向生物质，并从大气中捕集CO2。然而，将CO2固定到生物质中的过程需要能量投入。为了缓解这种固有的能量缺乏问题，一些研究使用甲酸、甲醇甚至丙酮酸作为能源来源。尽管做出了这些努力，但由于技术限制，如大多数生物技术相关微生物中缺乏利用这些底物的本底途径以及关键酶的氧敏感性，实施这些策略仍然具有挑战性。
因此，将底物中的碳转化为用于碳中和生产的产品是一种有前途的方法。2022年，美国能源部支持了几个实现碳中和生产的项目。已经提出了不同的策略，包括优化碳发酵菌株减少CO2废弃物排放和利用混合碳源的工程微生物以防止CO2排放。碳中和生产不仅有益于环境，还能通过增加碳收率和降低原料成本带来商业优势。现有的微生物合成法存在3-羟基丙酸产量低、碳利用和碳固定效率低等问题。
发明内容
本发明的目标之一在于为解决上述现有技术存在的问题提供一种碳中和产3-羟基丙酸的基因工程菌，该基因工程菌能够提高3-HP的产量和碳源利用效率。
本发明的目标之二在于提供一种本发明上述基因工程菌在合成3-羟基丙酸中的应用。
为此，本发明第一方面提供了一种产3-羟基丙酸的基因工程菌，其为含有外源的经过人工修改的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR的重组酿酒酵母菌；所述人工修改为野生型酿酒酵母基因组上的修改，其包括将外源的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR拆分为MCR-N与MCR-C两段，整合在XI-2染色体位置；MCR-N用启动子PGK1p表达，MCR-C经过了N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p表达。
根据本发明，所述基因工程菌为经过了底盘微生物改造的产3-羟基丙酸的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括强化3-羟基丙酸的合成途径、辅因子代谢调控基因的过表达，竞争代谢途径相关基因的调节，3-羟基丙酸转运基因的过表达以及能量代谢相关基因的敲除。
根据本发明的一些实施方式，所述强化3-羟基丙酸的合成途径包括：
在重组酿酒酵母菌的基因组中表达外源的编码5-磷酸木酮糖特异性的磷酸转酮酶的基因xPK和外源的编码磷酸转乙酰酶的基因PTA；
在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达转录因子Stb5、编码硫酸盐渗透酶的基因SUL1和编码二型磷酸酶的基因PTC7；
在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1，且编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1经过了S659A和S1157A点突变改造；
在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达编码柠檬酸合酶的基因CIT1，并且编码柠檬酸合酶的基因CIT1经过了S462A点突变改造。
在本发明的一些实施例中，过表达转录因子Stb5通过在染色体上替换其原始启动子为人工启动子ARTp实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码硫酸盐渗透酶的基因SUL1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子PGK1p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码二型磷酸酶的基因PTC7通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子TEF1p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码柠檬酸合酶的基因CIT1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CIT2p实现。
根据本发明的一些实施方式，所述强化3-羟基丙酸的合成途径还包括强化丙酰辅酶A还原酶代谢途径。
在本发明的一些实施例中，所述强化丙酰辅酶A还原酶途径包括增强了MCR-C的表达，并在MCR-N段表达了外源的编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG，且通过带有尿嘧啶筛选标记和/或组氨酸筛选标记的高拷贝质粒导入菌株中。
优选地，MCR-C经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p和/或启动子CCW12p表达。
在本发明的一些例子中，编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG用PGK1启动子表达。
根据本发明的一些实施方式，所述辅因子代谢调控基因的过表达包括过表达了编码异柠檬酸脱氢酶的基因IDP2和编码柠檬酸盐和氧戊二酸盐载体蛋白的基因YHM2。
在本发明的一些实施例中，过表达编码异柠檬酸脱氢酶的基因IDP2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CCW12p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码柠檬酸盐和氧戊二酸盐载体蛋白的基因YHM2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现。
根据本发明的一些实施方式，所述3-羟基丙酸转运基因的过表达包括ESBP6基因的过表达。
在本发明的一些实施例中，过表达ESBP6基因通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现。
本发明中，所述能量代谢相关基因的敲除包括敲除编码葡萄糖信号因子的基因GSF2和敲除编码肌醇焦磷酸酶的基因OCA5。
根据本发明的一些实施方式，竞争代谢途径相关基因的表达调节包括下调了脂肪酸合成途径相关基因的表达，过表达了编码脂肪酰辅酶A氧化酶的基因POX1、编码3-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的基因POX2，敲除编码γ-氨基丁酸(GABA)转氨酶的基因UGA1；
本发明中，所述脂肪酸合成途径相关基因包括编码脂肪酸合酶的基因FAS1。
在本发明的一些实施例中，下调编码脂肪酸合酶的基因FAS1的表达通过在染色体上替换其原始启动子为启动子HXT1p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码脂肪酰辅酶A氧化酶的基因POX1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CCW12p实现。
在本发明的一些实施例中，过表达编码3-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的基因POX2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子PGK1p实现。
本发明第二方面提供了利用本发明第一方面所述的基因工程菌合成3-羟基丙酸的方法，其包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产3-羟基丙酸。
优选地，发酵培养过程中，利用外源性甲酸氧阴离子作为能源。
在本发明的一些实施例中，摇瓶发酵培养条件为：温度30℃，摇床转速220rpm，培养基组成为7.5g/L(NH4)2SO4，14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素、维生素、20g/L葡萄糖，KOH调pH到6.5，以及任选的7.5g/L CaCO3。
在本发明的一些实施例中，发酵罐补料批次发酵培养条件为：pH维持在5，温度维持在30℃，溶氧限制值为30％，通气维持在0.5VVm，搅拌设置为400-1200rpm，补料培养基的组成为67.5g/L(NH4)2SO4、27g/L KH2PO4、4.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素、维生素、300g/L葡萄糖，以及任选的67.5g/L CaCO3。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的基因工程菌在制备丙烯酸中的应用。
根据本发明，所述应用包括：
步骤M，将所述基因工程菌进行发酵培养，制得含3-羟基丙酸的发酵液；
步骤N，向含3-羟基丙酸的发酵液中加入催化剂，进行催化脱水，制得丙烯酸(AA)。
优选地，在步骤M中，采用如本发明第二方面所述的方法进行发酵培养。
本发明提供了一种碳中和产3-羟基丙酸的基因工程菌。所述基因工程菌改造包括强化3-羟基丙酸的合成途径、辅因子代谢调控基因的过表达，竞争代谢途径相关基因的调节，3-羟基丙酸转运基因的过表达以及能量代谢相关基因的敲除，通过多策略叠加提高3-HP的产量和碳源利用效率。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出生产3-HP的相关代谢途径；
图2为XI-2染色体上整合MCR-C和MCR-N的图谱；
图3为高产3-HP的质粒图谱；
图4示出发明实施例中重组酿酒酵母菌株在摇瓶发酵培养以及发酵过程中添加7.5g/L CaCO3和6.3g/L甲酸钾的3-羟基丙酸产量；其中，C代表发酵培养基中加入CaCO37.5g/L，M代表发酵培养基中加入甲酸钾6.3g/L。
图5为实施例4中3-羟基丙酸转化成丙烯酸的结果图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图和实施例详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“碳中和基因工程菌”是指优化碳发酵菌株减少CO2废弃物排放和利用混合碳源的工程微生物以防止CO2排放。
本发明中所述用语“表达”是指代谢途径中基因的表达，指的是其本底启动子的表达。
本发明中所述用语“过表达”是指在基因前插入一个比其本底启动子要强的强启动子启动该基因的表达。
本发明中所述用语“MCR-N”和“MCR-C”分别是指将外源的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR拆分成的MCR-N段和MCR-C段；其中，用语“MCR-C”与“MCRC”可以互换使用；用语“MCR-N”与“MCRN”也可以互换使用。
本发明中所述用语“敲除”是指将基因的开放阅读框删除。
本发明中所用符号“::”基因插入，相应地，A::B表示B基因插入到A基因座。
本发明中所述用语“MSA”是指丙二酸半醛。
本发明中所述用语“URA3”是指5'-磷酸乳清苷(OMP)脱羧酶基因。
本发明中所述用语“HIS3”是指咪唑甘油磷酸脱水酶基因。
本发明中所述用语“NADPH”(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)是指还原型辅酶Ⅱ，学名为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
Ⅱ.实施方案
如前所述，现有3-羟基丙酸的微生物法合成存在3-HP的产量低、碳源利用效率和碳固定效率低等问题，为解决这些问题，本发明人从基因工程菌的角度入手，强化3-羟基丙酸的合成途径、辅因子代谢调控基因的过表达，竞争代谢途径相关基因的调节，3-羟基丙酸转运基因的过表达以及能量代谢相关基因的敲除，通过多策略叠加对于3-羟基丙酸的生产技术进行了大量的研究，最终获得高产3-羟基丙酸的工程菌。
为实现本发明，本发明提供了上述实现高效碳中和且高产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法。
本发明人研究发现，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，常用的二氧化碳(CO2)固定途径是通过丙酮酸羧化酶将2-磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)，这是糖异生的关键步骤，并且广泛用于产生四碳羧酸，如苹果酸、富马酸和琥珀酸。另一条羧化途径是由乙酰辅酶A羧化酶(Acc1)催化的乙酰辅酶A羧化反应，在原生细胞中具有更高的通量。产生的丙二酰辅酶A通常用于脂肪酸的合成，固定的CO2会在后续步骤中释放出来。然而，如果将产生的丙二酰辅酶A转化为其他化合物，例如3-羟基丙酸(3-HP)，则可以阻止后续的CO2释放步骤，实现碳固定，3-HP是第三大生物基平台化合物，预计市场规模和价值分别为360万吨/年和100亿美元/年。但将丙二酰辅酶A转化为3-羟基丙酸(3-HP)的过程中，碳固定的效率是一个重要的问题。确保高效转化丙二酰辅酶A并最大程度地固定CO2是关键挑战之一。本发明通过探索不同的工程策略和代谢路径来提高碳固定的效率，以增加产品产量和碳中和能力。
因此，根据本发明的一些实施方式，所述高产3-羟基丙酸的工程菌的构建方法包括对酿酒酵母进行基因修饰，其包括替换基因启动子、引入突变、整合外源基因等步骤，从而实现对产3-羟基丙酸的生产；其具体包括以下步骤：
利用GTR-CRISPR系统，将MCR-N和带有突变的N940V、K1106W、S1114R的MCR-C整合到酿酒酵母XI-2染色体。
利用GTR-CRISPR系统，将表达外源的编码5-磷酸木酮糖特异性的磷酸转酮酶基因xPK和外源的编码磷酸转乙酰酶的基因PTA整合到酿酒酵母XI-3染色体。
利用GTR-CRISPR系统，将酿酒酵母本底的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1引入S659A和S1157A两个突变。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母本底的编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1的启动子，将TEF1基因的TEF1p启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母STB5的启动子，将人工设计的ARTp启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母SUL1的启动子，将PGK1基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母PTC7的启动子，将CWP2基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母CIT1的启动子，将CIT2基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换对酿酒酵母CIT1的开放阅读框引入突变。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母YHM2的启动子，将CWP2基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母IDP2的启动子，将CCW12基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母FAS1，POX1和POX2的启动子，将HXT1基因启动子，CCW12基因启动子和PGK1基因的启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统替换酿酒酵母ESBP6的启动子，将CWP2基因启动子整合到该位点。
利用GTR-CRISPR系统敲除酿酒酵母的OCA5基因。
利用GTR-CRISPR系统敲除酿酒酵母的UGA1基因。
根据本发明的另一些实施方式，上述基因工程菌的构建方法还包括构建最佳的丙酰辅酶A还原酶和丙二酸半醛还原酶的组合，其具体包括将MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R，并用TEF1启动子，MCRN端换成编码大肠短链脱氢酶/还原酶基因YDFG用PGK1启动子，URA3为筛选标记，将所得的基因片段与质粒Pugg1通过golden gate进行连接，并转入E.coli DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，并转入重组酿酒酵母菌。
在一些实施例中，可以采用与上述步骤类似的方法构建丙酰辅酶A还原酶和丙二酸半醛还原酶的组合，但使用不同的启动子和筛选标记。例如，MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R，并用CCW12的启动子，MCRN端换成编码大肠短链脱氢酶/还原酶基因YDFG用PGK1启动子，HIS3为筛选标记，将所得的基因片段与质粒Pugg1通过golden gate进行连接，并转入E.coli DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，并转入重组酿酒酵母菌。
在本发明的第一方面的实施方式中，为了产生3-HP，我们以酿酒酵母菌[CEN.PK113-11C(MATa SUC2 MAL2-8c his3Δ1ura3-52)(J.P.van Dijkena,Nielsend etal.2000)]为宿主菌(BioVector质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心-NTCC典型培养物保藏中心)，选择了丙酰辅酶A还原酶途径，设计构建并提供了一种产3-羟基丙酸的基因工程菌。在丙酰辅酶A还原酶途径中，丙酰辅酶A可以通过两个步骤转化为3-HP，并消耗两个NADPH，如图1所示。我们设计使用来自橙色绿屈挠菌Chloroflexus aurantiacus编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR[(Chen Y,et al.Coupled incremental precursor and co-factor supply improves 3-hydroxypropionic acid production in Saccharomycescerevisiae[J].Metabolic Engineering,2014,22:104-109.)]，因为它可以通过MCR-C域将丙酰辅酶A转化为MSA(丙二酸半醛)，然后通过MCR-N域将其转化为3-HP。
在本发明的一些具体的实施例中，如图2所示，首先将突变N940V、K1106W、S1114R引入MCR-C(原MCR-C的序列如SEQ NO.1所示，MCR；EC 1.2.1.75；经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造的基因MCR-C的序列参见Liu,C.,et al.,Functional balance betweenenzymes in malonyl-CoA pathway for 3-hydroxypropionate biosynthesis.MetabEng,2016.34:p.104-111)中，酿酒酵母强启动子TEF1p(序列如SEQ NO.6所示)与终止子CYC1t连接至MCR-C前后用于其在酿酒酵母中的表达；另外，将酿酒酵母强启动子PGK1p与终止子FBA1t连接至MCR-N(MCR；EC 1.2.1.75，序列如SEQ NO.3所示)前后用于其在酿酒酵母中的表达。
本发明所提供的基因工程菌为经过了底盘微生物改造的产3-羟基丙酸的基因工程菌；所述底盘微生物改造包括强化3-羟基丙酸的合成途径、辅因子代谢调控基因的过表达，竞争代谢途径相关基因的调节，3-羟基丙酸转运基因的过表达以及能量代谢相关基因的敲除。
在本发明的一些具体的实施例中，为了防止乙酰辅酶A生成过程中的碳损失，我们引入了PK途径，该途径涉及磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶，可以在不损失碳的情况下将糖磷酸转化为乙酰辅酶A。将来自肠系膜乳杆菌(Leuconostoc mesenteroides)的编码5-磷酸木酮糖特异性的磷酸转酮酶的基因xPK(在NCBI中蛋白ID为YP_819405.1，序列如SEQ NO.4所示)和来自克鲁维尔氏菌(Clostridium kluyveri)的编码磷酸转乙酰酶的PTA基因(在NCBI中蛋白ID为YP_001394780.1，序列如SEQ NO.5所示)序列以酿酒酵母为表达宿主进行密码子优化。并由上海生工Sangon Biotech(中国上海)合成。将合成的序列扩增并整合在酿酒酵母XI-3染色体上，酿酒酵母强启动子TDH3p(序列如SEQ NO.9所示)与终止子ADH1t连接至xPK前后用于其在酿酒酵母中的表达；另外，将酿酒酵母强启动子TEF1p与终止子PGK1t连接至PTA前后用于其在酿酒酵母中的表达。
在本发明的一些具体的实施例中，本发明将酿酒酵母本底的ACC1基因(SGD:S000005299，序列如SEQ NO.15所示)引入S659A和S1157A两个突变来(经过S659A和S1157A点突变改造的基因ACC1的序列参见Shi,S.,et al.,Improving production of malonylcoenzyme A-derived metabolites by abolishing Snf1-dependent regulation ofAcc1.mBio,2014.5(3):p.e01130-14)。这两个突变可以阻止Snf1酶对Acc1酶的磷酸化，从而激活Acc1活性，本发明通过在染色体上替换其原始启动子为启动子TEF1p来过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1，从而强化3-羟基丙酸的合成途径，并由此得到重组菌QLW3。
转录因子能够调节多个基因的表达。某些转录因子响应特定的代谢途径或代谢状态，转录因子Stb5(SGD:S000001221，序列如SEQ NO.16所示)，是NADPH调节器，负责调节反应性氧化物种(ROS)的生成。在葡萄糖-6-磷酸节点处，Stb5抑制糖酵解关键步骤基因PGI1的表达，以减少流向糖酵解的通量，并激活氧化戊糖磷酸(oxPP)途径或与NADPH生成有关的基因，为谷胱甘肽(GSH)生成提供更多的NADPH，从而防止细胞受到ROS的损伤。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW3基础上，本发明通过在染色体上使用人工启动子ARTp(序列如SEQ NO.7所示)替换STB5的天然启动子从而实现了转录因子Stb5的过表达，使用转录因子Stb5将碳流重新定向，强化3-羟基丙酸的合成途径，并由此得到重组菌QLW5。
细胞内的无机碳存在四种形式：溶解的CO2、碳酸和碳酸氢盐和碳酸盐，碳酸盐和CO2的溶解是动态的，取决于pH和盐度。在pH为7.4、温度为20℃的条件下，与空气平衡的CO2浓度仅为0.012mmol/L，而与空气平衡的碳酸氢盐浓度为0.26mM。由于细胞质的pH大约是中性，因此无机碳主要以HCO3 -的形式存在。使用碳酸盐进行碳固定可能比使用更高的CO2分压更有效，为了增加可用碳酸盐的浓度，本发明利用碳酸酐酶和碳酸氢盐转运蛋白来增强HCO3 -的供应，对SLC4和SLC26家族的关键物种进行了系统进化分析，确定了碳酸氢盐转运蛋白Sul1，过表达酵母中的SUL1提供更多的碳酸氢盐用于细胞利用。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW5基础上，本发明通过在染色体上替换基因SUL1(SGD:S000000498，序列如SEQ NO.17所示)的原始启动子为启动子PGK1p(序列如SEQ NO.8所示)实现编码硫酸盐渗透酶的基因SUL1过表达，强化3-羟基丙酸的合成途径，并由此得到重组菌QLW8。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，常用的二氧化碳(CO2)固定途径是通过丙酮酸羧化酶将2-磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)，这是糖异生的关键步骤，并且广泛用于产生四碳羧酸，如苹果酸、富马酸和琥珀酸。另一条羧化途径是由乙酰辅酶A羧化酶(Acc1)催化的乙酰辅酶A的羧化反应，在细胞中具有更高的通量。产生的丙二酰辅酶A通常用于脂肪酸的合成，固定的CO2会在后续步骤中释放出来。为了防止碳争夺，我们尝试了各种策略来降低草酰乙酸的积累，我们专注于增强TCA循环对草酰乙酸的利用，从而产生更多用于Acc1碳酸盐羧化的ATP。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，首先，在重组菌QLW8基础上，我们通过在染色体上替换基因CIT1的原始启动子为启动子CIT2p(序列如SEQ NO.10所示)过表达了编码柠檬酸合酶的基因CIT1(SGD:S000005284，序列如SEQ NO.19所示)，并在CIT1上引入S462A突变[经过S462A点突变改造的基因CIT1序列参见Guo,X.et al.Ptc7pDephosphorylates select mitochondrial proteins to enhance metabolicfunction.Cell Rep.18,307-313(2017)]，已经被证明该突变能够推迟磷酸化从而保持活性；同时，我们还通过在染色体上替换基因PTC7的原始启动子为启动子CWP2p(序列如SEQNO.11所示)过表达了编码二型磷酸酶的基因PTC7(SGD:S000001118，序列如SEQ NO.18所示)，编码二型磷酸酶的基因PTC7可以去除Cit1在Cit1S462A处的磷酸化，可以增强酵母菌的呼吸作用；其次，对辅因子代谢调控相关基因YHM2(SGD:S000004854，序列如SEQ NO.21所示)和IDP2(SGD:S000004164，序列如SEQ NO.20所示)进行过表达，通过在染色体上替换基因YHM2的原始启动子为启动子CWP2p过表达了编码柠檬酸盐和氧戊二酸盐载体蛋白的基因YHM2，这是线粒体膜上的草酰乙酸转运蛋白；且通过在染色体上替换IDP2原始启动子为启动子CCW12p(序列如SEQ NO.12所示)过表达了IDP2，进而强化3-羟基丙酸的合成途径，并由此得到重组菌QLW19。
在天然条件下，丙二酰辅酶A是细胞中脂肪酸合成的起点。3-HP的生产将与脂肪酸合成竞争丙二酰辅酶A。为了增加3-HP的产量，有必要减少脂肪酸的生产。
为实现这一目标，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW19基础上，我们通在染色体上替换其原始启动子为使用受葡萄糖抑制的启动子HXT1来下调编码脂肪酸合酶的基因FAS1的表达。
除了抑制脂肪酸的合成外，我们通过在染色体上替换其基因POX1原始启动子为启动子CCW12p实现编码脂肪酰辅酶A氧化酶基因POX1(SGD:S000003173，序列如SEQNO.25所示)的过表达，通过在染色体上替换基因POX2原始启动子为启动子PGK1p实现编码3-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的基因POX2(SGD:S000001717，序列如SEQ NO.26所示)的过表达，由此来增强脂肪酸的β-氧化，从而最终强化3-羟基丙酸的合成途径，并由此得到重组菌QLW36。
同时，本发明进一步增强丙酰辅酶A还原酶途径，其包括MCR-C经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p表达，并在MCR-N段表达了来自编码大肠杆菌E.coli MG 1655(菌种保藏编号700926)的短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG(NCBI中基因ID为946085，序列如SEQ NO.2所示)，用PGK1启动子表达。且通过带有尿嘧啶筛选标记的高拷贝质粒表达，将质粒命名为pNLW7，并导入菌株中，得到重组菌QLW36+pNLW7。
有机酸发酵过程中酸积累是产量提升的主要瓶颈之一，因为有机酸输出通常需要能量。我们的实验结果显示，在发酵72小时后，培养基的pH值约为4，3-HP的产量为5.5-6g/L。3-HP的pKa值为4.51，在这个pH值下，它在培养基中保持未离解状态。未离解游离的3-HP可以通过轻松扩散穿过细胞膜进入细胞内，然后在细胞质中释放质子成为阴离子(细胞内的pH约为中性)。带电性的阴离子不能回扩散出细胞质，导致其在细胞质中积累，释放的质子的积累会导致细胞内酸化，对细胞具有毒性。质子和阴离子必须被泵出细胞，这个过程是通过H+-ATPase和ABC泵耗费ATP的。这个过程消耗大量的ATP，可能导致ATP耗竭，从而降低整体3-HP产量。先前的研究表明，编码葡萄糖信号因子的基因GSF2(能量代谢相关基因)的删除减缓酵母的Crabtree效应，导致与呼吸作用有关的基因表达上调，包括氧化磷酸化(OXPHOS)，其ATP产量比发酵更高，对有机酸生产至关重要。由于转运体发现的困难，目前尚未有关于特异性转运体或通透酶来转运3-HP的报道。Esbp6被认为是一种单羧酸渗透酶，并已证明ESBP6的过表达可以提高酵母的耐受性和乳酸和香豆酸的产量。本发明也发现，Esbp6可以结合3-HP并将其从细胞中输出，从而增加酵母对3-HP的耐受性并提高3-HP的产量。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW36基础上，本发明通过在染色体上替换基因ESBP6原始启动子为启动子CWP2p来过表达3-羟基丙酸转运基因ESBP6(SGD:S000005069，序列如SEQ NO.22所示)；同时，通过删除GSF2基因的开放阅读框敲除GSF2基因(SGD:S000004511，序列如SEQ NO.23所示)，得到重组菌QLW50，将质粒pNLW7，并导入QLW50菌株中，得到重组菌QLW50+pNLW7。
除了草酰乙酸的合成与丙二酰辅酶A的合成竞争碳酸氢盐外，碳酸氢盐还可以被Cpa1/2催化，与谷氨酸一起生成氨基甲酰-P。嘧啶环和精氨酸的合成会结合氨基甲酰基，精氨酸会进入鸟氨酸循环，以尿素形式再循环此氨基甲酰基。这表明从头合成嘧啶环与3-HP生产碳酸氢盐存在潜在的竞争。用于表达MCR-C域和YDFG的质粒是带有URA3标记的高拷贝数质粒。这意味着具有此质粒的菌株表达URA3的强度增强，而URA3是嘧啶环合成的关键步骤，会与ACC1竞争碳酸氢盐，从而降低3-HP的产量。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW50基础上，我们用HIS3替换了URA3标记，构建高拷贝的3-HP生产质粒，进一步增强丙酰辅酶A还原酶途径包括MCR-C经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p表达，并在MCR-N段表达了外源的编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG，用PGK1启动子表达。且通过带有组氨酸筛选标记的高拷贝质粒，将质粒命名为pNLW11，并导入菌株中，得到重组菌QLW50+pNLW11。
根据计算，我们发现，如果我们希望将葡萄糖中的所有6个碳转化为3-HP，仍需要外源ATP输入。如果考虑到有机酸跨膜运输过程中的能量需求，这使ATP需求会更加严峻。Oca5是一种肌醇焦磷酸酶，已经被鉴定为能够将5-二磷酸肌醇1,2,3,4,6-五磷酸(5-InsP7)降解为肌醇六磷酸(InsP6。这种5-InsP7分子作为“能量传感器”，用于信号ATP浓度并调节参与糖酵解和呼吸的基因表达。
因此，在本发明的一些具体的实施例中，在重组菌QLW50基础上，本发明通过删除OCA5基因(SGD:S000001021，序列如SEQ NO.24所示)的开放阅读框将编码肌醇焦磷酸酶的基因OCA5基因(能量代谢相关基因)敲除，得到重组菌QLW58，将质粒pNLW11，并导入QLW58菌株中，得到重组菌QLW58+pNLW11。
在寻找负责生产3-HP的酶的过程中，我们发现大肠杆菌的YDFG基因和酿酒酵母的Ora1基因比MCR-C结构域表现出更好的3-HP生产能力。这种底物广泛性使我们能够探索原生酶在3-HP生产领域的新功能。然而，3-HP和丝氨酸之间的结构相似性也可能使得酵母本底的酶能介导3-HP或中间体MSA的降解。因此，我推测酵母中有酶可能降解3-HP或MSA。基因UGA1编码酵母中的γ-氨基丁酸(GABA)转氨酶，参与4-氨基丁酸的降解。它与GDH2编码的谷氨酸脱氢酶和UGA2编码的琥珀酸半醛脱氢酶一起催化谷氨酸的降解并生成丙酮酸半醛，实现从谷氨酸到琥珀酸的降解。β-丙氨酸途径中的uga1酶具有底物多样性，使其能够催化从β-丙氨酸到MSA到3-HP的产生。然而，MCR-C域定向进化研究证明了Uga1具有催化从MSA到β-丙氨酸的作用，表明Uga1催化的反应是可逆的，这意味着Uga1具有催化从MSA到β-丙氨酸的能力，可以将MSA转化成丙酮酸，导致能量浪费并降低3-HP的产量。
所以，在本发明的一些具体的实施例中在重组菌QLW58基础上，通过删除UGA1基因的开放阅读框将UGA1基因(SGD:S000003251，序列如SEQ NO.27所示)敲除，得到重组菌QLW71；同时，本发明进一步增强丙酰辅酶A还原酶途径包括MCR-C经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子CCW12p表达，并用PGK1启动子在MCR-N段表达了外源的编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG，且通过带有组氨酸筛选标记的高拷贝质粒，将质粒命名为pNLW12，如图3所示，并导入菌株中，得到重组菌QLW71+pNLW12。
本发明中利用GTR-CRISPR系统对酵母染色体进行改造包括外源基因插入以及内源基因的启动子替换。为此需要构建含有Cas9蛋白和gRNA的重组质粒，对于MCR的整合用到的重组质粒包括pCas9-XI-2-G，其构建过程涉及到的载体及模板质粒包括pCas9-LacZ质粒、pST1.G.Ura3质粒通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成，其涉及到的gRNA的预测与选择由网站https://www.atum.bio/catalog/vectors/grna-design得到。对于MCR的过表达质粒，构建用到的载体质粒为pUGG1。
本发明中采用Golden Gate的方法和酿酒酵母同源重组方法进行质粒构建。首先关于Golden Gate的方法配制GoldenGate的反应体系，质粒载体按照17ng/kb加入，DNA片段按照与载体摩尔比1:1加入，另加入0.4μL T4 DNA连接酶、2μL T4连接酶缓冲液、1.6μLBsaI限制性内切酶，最后用水补齐至20μl。将反应体系按照如下程序进行反应：37℃30min；37℃ 10min；16℃ 5min；回到第2步，进行15个循环；16℃ 30min；37℃ 30min；80℃5min；4℃保持。反应结束后取4μl进行大肠转化。
关于酿酒酵母同源重组方法进行质粒构建，首先设计引物，保证同源臂在40bp以上，扩增构建质粒需要的片段，纯化克隆后的片段，以摩尔比1：1电转转入酿酒酵母中，以质粒上的筛选marker，使用对应的培养基平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆10个，接对应的筛选培养基，菌液浑浊后提取酵母质粒，然后进行大肠转化，提质粒酶切验证，送测序。
本发明中所有酵母菌株的构建采取电击转化法。电转感受态制备的具体方法如下：首先将平板上的酵母单菌落接种到5ml YPD培养基，在50mL离心管中于30℃ 200rpm下过夜培养；在250mL摇瓶中以0.3的初始OD600将预培养的细胞接种到50mL YPD培养基中，30℃培养至OD600达到1.2-1.6；4℃ 3000rpm离心3分钟，将酵母细胞收集在50mL离心管中；用20ml预冷的山梨醇洗一次；将菌体重悬于16mL 1M山梨醇中，并加入2ml 10×TE溶液和2mL10×LiOAc溶液；将摇管于30℃摇床30分钟后，向混合物中加入200μl 1M DTT，再于30℃摇床15分钟；4℃ 3000rpm离心3分钟收菌弃上清后，用20ml预冷的山梨醇溶液洗两次；再次离心后尽量吸取所有液体后将酵母细胞沉淀重悬于200μl 1M山梨醇中；将细胞悬液以每管50μl分装。
电转步骤如下：对于染色体上的基因插入或启动子替换，将500ng的pCas9质粒和约1000ng的供体DNA片段与感受态细胞轻柔混合均匀，并进行电击。电击后将细胞在2mLSC-URA3和2ml 1M山梨糖醇混合物中培养24小时。然后取100μl直接涂在SC-URA平板上，其余液体3000rpm，3min离心去上清，全部涂SC-URA平板。通过菌落PCR和测序的方法进行验证。另外，对于本发明中涉及到的质粒向酵母细胞的转化也使用电转的方法，将质粒与感受态细胞混合均匀后电击，电击后加入1ml山梨醇，3000rpm，3min离心，去上清全部涂于SC-URA平板筛选。
本发明中菌株的培养及构建筛选用到的培养基包括YPD培养基，SC-URA培养基。发酵用到的培养基为Delft培养基。上述培养基的组成如下：YPD培养基包括10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖；SC-URA培养基包括5g/L硫酸铵、1.7g/L YNB(无硫酸铵和氨基酸)、1.914g/L氨基酸混合物(无尿嘧啶)、20g/L葡萄糖，pH用NaOH调至6；Delft培养基包括7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/LMgSO4·7H2O、微量金属元素(15mg/L EDTA、4.5mg/L ZnSO4·7H2O、0.3mg/LCoCl2·6H2O、1mg/L MnCl2·4H2O、0.3mg/L CuSO4·5H2O、4.5mg/L CaCl2·2H2O、3mg/LFeSO4·7H2O、0.4mg/L NaMoO4·2H2O、1mg/L H3BO4、0.1mg/LKI)、维生素(0.05mg/L生物素、1mg/L泛酸钙、1mg/L烟酸、25mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L盐酸吡哆辛、0.2mg/L对氨基苯甲酸)、20g/L葡萄糖，pH用KOH调至6.5。
3-羟基丙酸(3-HP)可用作生产丙烯酸的前体，因此通过微生物发酵可持续生产3-HP引起了人们的广泛兴趣。尽管早期曾多次尝试对酵母进行工程改造以生产3-HP，但仍无法获得建立具有成本效益工艺所需的高葡萄糖产率。以实现环境和商业利益，回收从葡萄糖中释放的二氧化碳代表了生物生产中的共同利益。为了实现这一目标，我们采取了多种策略，通过3-HP的生产来提高碳酸氢盐固定的产量，包括将Sul1鉴定为碳酸氢盐转运蛋白、丙二酰辅酶A还原酶的途径优化、Esbp6的鉴定作为3-HP转运蛋白，可以增加3-HP耐受性，以及鉴定Uga1在潜在的3-HP降解中发挥作用。按化学计量将1摩尔葡萄糖转化为2摩尔3-HP需要额外4摩尔ATP。因此，我们删除了肌醇焦磷酸酶Oca5以增加内源ATP产量，并加入甲酸作为能量载体，为3-HP生产提供能量。此外，发现二氧化碳的气液传质低和溶解度低，我们利用碳酸钙逐渐释放碳酸氢盐，不断提供更高的细胞内碳酸氢盐浓度，组合策略使用20g/L葡萄糖在摇瓶中产生11.63g/L的3-HP，接近理论产量。
本发明还提供了利用上述基因工程菌合成3-羟基丙酸的方法，其可以理解为上述基因工程菌在合成3-羟基丙酸中的应用，其包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产3-羟基丙酸，同时利用化学催化将生成的3-羟基丙酸转化成丙烯酸。
优选地，发酵培养过程中，利用外源性甲酸作为能源。
在本发明的一些具体优选的例子中，摇瓶发酵培养条件为：温度30℃，摇床转速200rpm，培养基组成为7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素(15mg/L EDTA、4.5mg/L ZnSO4·7H2O、0.3mg/L CoCl2·6H2O、1mg/LMnCl2·4H2O、0.3mg/LCuSO4·5H2O、4.5mg/L CaCl2·2H2O、3mg/L FeSO4·7H2O、0.4mg/LNaMoO4·2H2O、1mg/LH3BO4、0.1mg/L KI)、维生素(0.05mg/L生物素、1mg/L泛酸钙、1mg/L烟酸、25mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L盐酸吡哆辛、0.2mg/L对氨基苯甲酸)、20g/L葡萄糖，pH用KOH调至6.5。适用于QLW3，QLW5，QLW8，QLW19，QLW19+pNLW7，QLW36，QLW36+pNLW7。
在本发明的另一些具体优选的例子中，摇瓶发酵培养条件为：温度30℃，摇床转速200rpm，培养基组成为7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素(15mg/L EDTA、4.5mg/L ZnSO4·7H2O、0.3mg/L CoCl2·6H2O、1mg/LMnCl2·4H2O、0.3mg/LCuSO4·5H2O、4.5mg/L CaCl2·2H2O、3mg/L FeSO4·7H2O、0.4mg/LNaMoO4·2H2O、1mg/LH3BO4、0.1mg/L KI)、维生素(0.05mg/L生物素、1mg/L泛酸钙、1mg/L烟酸、25mg/L肌醇、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L盐酸吡哆辛、0.2mg/L对氨基苯甲酸)、20g/L葡萄糖，7.5g/L的CaCO3，pH用KOH调至6.5。适用于QLW50+pNLW7，QLW50+pNLW11，QLW58+pNLW11，QLW71+pNLW12。
本发明所涉及的上述基因工程菌在制备丙烯酸中的应用可以理解为利用上述基因工程菌在制备丙烯酸的方法，其包括：
步骤M，将所述基因工程菌进行发酵培养，制得含3-羟基丙酸的发酵液；
步骤N，向含3-羟基丙酸的发酵液中加入催化剂，进行催化脱水，制得丙烯酸(AA)。
所述催化剂为20-40目的TiO2颗粒。
优选地，在步骤M中，采用前述“利用上述基因工程菌合成3-羟基丙酸的方法”进行发酵培养。
本发明中，通过高效液相色谱HPLC(Shimadzu LC-20AT)用Aminex HPX-87H(Bio-Rad)色谱柱及UV检测器在210nm下检测3-HP浓度。取1mL发酵液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤到液相小瓶中作为检测样品。流动相为0.5mM H2SO4，柱温箱温度设定为65℃，每个样品的检测时间设为20分钟。配制不同浓度梯度的3-HP标准品，同样过滤到干净的液相小瓶中，按照样品检测的程序得到峰面积与浓度相关的标准曲线。样品再经HPLC检测后，代入标准曲线计算得到每个样品中3-HP浓度。
Ⅲ.实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明均可由商业渠道或常规方法获得。
实施例1：3-HP基因工程菌构建：
3-HP生产菌构建，通过将突变N940V、K1106W、S1114R引入MCR-C中，酿酒酵母强启动子TEF1p与终止子CYC1t(序列如SEQ NO.13所示)连接至MCR-C前后整合于酿酒酵母基因组XI-2染色体中的表达，将酿酒酵母强启动子PGK1p与终止子FBA1t(序列如SEQ NO.14所示)连接至MCR-N前后整合于酿酒酵母基因组XI-2染色体中的表达，将来自肠系膜乳杆菌的xPK基因和来自克鲁维尔氏菌的基因PTA扩增并整合在酿酒酵母XI-3染色体上，酿酒酵母强启动子TDH3p与终止子ADH1t连接至xPK前后用于其在酿酒酵母中的表达；另外，将酿酒酵母强启动子TEF1p与终止子PGK1t连接至PTA前后用于其在酿酒酵母中的表达，同时将酿酒酵母本底的ACC1基因引入S659A和S1157A两个突变，并将ACC1基因的启动子换成TEF1启动子。首先关于MCRC和MCRN在XI-2位点的整合，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建在XI-2位置内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-XI-2-G构建用到的引物有：
PCAS-XI-2-g-f：
aaaggtctcagatcgttgaccagttgatcagttgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAG
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于整合的MCRC还和MCRN片段，通过以质粒PM2M为模板PCR扩增获得。需要的引物有：
XI-2-MCR-F：
AAGACTAGGCAAAAGCCAAGGAGCGTTTGCCATGAACTTCCACAACTTCGAGCGTCCCAAAACCTTCTC
XI-2-MCR-R：
AACCTACATCTAAACTTTTTAATATCTGAAAGCGCTAGTCGTGTGGGCGAAGTAGAGTGA CACGTCC
关于xPK和PTA在XI-3位点的整合，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建在XI-3位置内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-XI-3-G构建用到的引物有：
pCAS-XI-3-g-F：
aaaGGTCTCtgatcGTAGAAATCAGACGCACGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于整合的xPK还和PTA片段，通过以质粒PUC57-xPK-PTA为模板PCR扩增获得。需要的引物有：
xPK+PTA-XI-3-F：
AAGACACATCTAACTGATTAGTTTTCCGTTTTAGGATATTGACGCCAAGCCCTCATCAGTAAGACCCGTTG
xPK+PTA-XI-3-R：
ATAAAATGGCCCTTCCAAAATTAGAGACATATCGTAGAAATCAGACGCACTAAGAATATTGGCAGCGCAAAAAGG
ACC1基因引入S659A和S1157A两个突变，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建在ACC1突变位置内的gRNA的Cas9质粒,以Pcas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-ACC1-M1-M2-G构建用到的引物有：
PCAS-ACC1M1-G-F：
AAAGGTCTCAGATCATACTGCGTCAACTATCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
PCAS-ACC1M2-G-R：
AAAGGTCTCTAAACTGTTCATACCCATTTTAGATGATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG
另外用于引入ACC1基因的两个突变S659A和S1157A的供体DNA由引物通过PCR融合获得，扩增引物为：
ACC1M1-DONOR-F：
CGTTACACATTATTTATCAATGGTTCTAAATGTGATATCATCCTACGACAGCTGGCTGA
ACC1M1-DONOR-R：
GCGATTTACCGCCTATGGCAATCAAAAGACCACCATCAGCCAGCTGTCGTAGGATGATAT
ACC1基因的启动子换成TEF1启动子，用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建在ACC1启动子内的gRNA的Cas9质粒,以Pcas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-ACC1p-G构建用到的引物有：
PCAS-ACC1p-G-F：
AAAGGTCTCAGATCTCTAATTTTCTGCGCTGTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的TEF1p的供体DNA由引物通过PCR融合获得，扩增引物为：
ACC1-TEF1p-F：
GAAGAACAGCACTCCCAGTCGTATTCTGGCACAGTATAGCCTAGCACATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCC
ACC1-TEF1p-R：
CTCCATCTTCTGTGGAGAAGACTCGAATAAGCTTTCTTCGCTCATTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATTGCTATGC
制备酿酒酵母菌株CEN.PK 113-11C菌株的感受态细胞，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到3-HP生产菌株，命名为QLW3。
转录因子Stb5将碳流重新定向，STB5的人工启动子替换通过将染色体上STB5的启动子替换为人工启动子ARTp实现，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建带有STB5p内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-STB5p的构建用到的引物有：
pcas-stb5-p-g-F：
AAAGGTCTCAgatcTTCATGGCGCCATCACCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的ARTp的供体DNA由引物通过PCR融合获得，扩增引物为：
STB5-ARTp-F：
CTCGCTACGCATATATAAACGGATTCCCACACACCATAGCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAAATGGA
STB5-ARTp-R：
CGTTGTGATCTCCCGCCTTGATGTGCAAAATTGGGACCATCCATTTTGTAATTAAAACTTAGATTAGATT
制备酿酒酵母菌株QLW3菌株的感受态细胞，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到受人工启动子调控的STB5的菌株，命名为QLW5。
基因SUL1过表达通过在染色体上替换其原始启动子为启动子PGK1p实现，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建带有SUL1启动子内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-SUL1p的构建用到的引物有：
PCAS-SUL1-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCGTTCGTTATCGCTTGCTGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTALeu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的PGK1p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
PGK1P-SUL1-F：
TCTGTAAACTTTAACTAAATACATACTACTTTCATAATGGAAGTACCTTCAAAGAATGGGPGK1P-SUL1-R：
CCTGATTATGCACATATTCAGTCGAGCTCTTACGTGACATTGTTTTATGACAGATTTGTTTTATATTTG
制备酿酒酵母菌株QLW3和QLW5菌株的感受态细胞，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到sul1上调的菌株，命名为QLW8和QLW10。
基因PTC7过表达，通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建带有PTC7启动子内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-PTC7p的构建用到的引物有：
PCAS-PTC7-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCACGCACCTATACGATTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的CWP2p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
CWP2P-PTC7-F：
AAATTTCTGCAAATATCGTGCATCAGCTCATCTTGGAATTGGCGCAACCTATGCAGAAGATTGCTTTTC
CWP2P-PTC7-R：
CTCTCGAGACCCTCAAAGTTCTAAATCCAACGTTTGCAAACATTTTTTTTCTTGTTAGTGTGTAGCG
分别制备酿酒酵母菌株QLW10菌株的感受态细胞，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到PTC7上调的菌株，命名为QLW15。
基因CIT1过表达，通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CIT2p实现，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作。首先需要构建带有CIT1启动子内gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-CIT1p的构建用到的引物有：
PCAS-CIT1-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCAAGTATTTTTGGTCTAGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
PCAS-CIT1-P-G-R：
AAAGGTCTCAAAACCCGCTAGACCAAAAATACTTGATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG
另外用于替换的CIT2p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
CIT2P-CIT1-F：
CTTCGCAGGAAAGTATACCTAAACTAATTAAAGAAATCTCGACCAATGTTAATGAAAACTTGAAC
CIT2P-CIT1-R：
ATAAGAAACTTTTGCTAGTTGTTGATAATATCGCTGACATTTTTCTTGTTACTAGTATTATTAAAAC
在Cit1上引入S462A突变，利用GTR-CRISPR系统进行基因操作，首先需要构建带有CIT1突变位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-CIT1p的构建用到的引物有：
PCAS-CIT1-T-G-F：
AAAGGTCTCAGATCTTTTCGGTGGAGAATGATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
PCAS-CIT1-T-G-R：
AAAGGTCTCTAAACAAATCATTCTCCACCGAAAAGATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG
另外用于Cit1上引入S462A突变的供体DNA由引物通过PCR融合获得，扩增引物为：
CIT1M-DONOR-F：
CATCGATAGGGCTGTTGGTGCTCCAATCGAAAGGCCAAAGGCTTTTTCTACTGAG
CIT1M-DONOR-R：
TTACTTTCGATTTTCTTTACCAACTCCTTGTATTTCTCAGTAGAAAAAGCCTTTGGCC
分别制备酿酒酵母菌株QLW15，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW18。
表达YHM2是通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现，以及过表达IDP2，通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CCW12p实现，首先需要构建带有YHM2启动子和IDP2启动子位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-YHM2p-G-IDP2P-G的构建用到的引物有：
PCAS-IDP2-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCGTCGACTACAGTCGCTGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
PCAS-YHM2P-G-R：
AAAGGTCTCTAAACAAGCTGCCCACCTCAAGTCAGATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG
另外用于替换的CWP2p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
CCW12P-IDP2-F：
CACCGGGTTAGCCGGAGAGGGTGACACTTTGGTCACGTGAAAACCAGGGCAAAGCAAAATAAAAGAAAC
CCW12P-IDP2-R：
CATTTCCACAATGGGGTTAGCTACCTTAATCTTTGTCATTATTGATATAGTGTTTAAGCGAATGACAG
CWP2P-YHM2-F：
TCACTTTTCTTTCTCAAGACCTAGGTCCTGTCGGCAAATTGCAACCTATGCAGAAGATTGCTTTTC
CWP2P-YHM2-R：
CTATTACGTTTGCTGCAGCAGTATTAGTGGTAGATGGCATTTTTTTTCTTGTTAGTGTGTAGCGA
分别制备酿酒酵母菌株QLW18，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW19。
使用受葡萄糖抑制的HXT1来控制FAS1(SGD:S000001665，序列如SEQ NO.28所示)的表达,是通过在染色体上替换其原始启动子为启动子HXT1p(序列如SEQ NO.29所示)实现，首先需要构建带有FAS1启动子位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-FAS1p-G的构建用到的引物有：
PCAS-FAS1-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCAGAGATTACAGTCGGCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的HXT1p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
HXT1P-FAS1-F：
TGCCGCCCAGCCAAGCATAATTACGCAACAGCGATCTTTCCAATTGTAGGTCCTAAATTCAAGGCG
HXT1P-FAS1-R：
CGTGAGATAGGGTTAATGGTCTTGTGGAGTAAGCGTCCATGATTTTACGTATATCAACTAGTTGACGATTATG
增强脂肪酸的β-氧化，是通过表达POX1和POX2来实现。首先过表达POX1需要构建带有POX1启动子位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-POX1p-G的构建用到的引物有：
PCAS-POX1-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCTGACCGAATTCCTTTCGCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的CCW12p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
CCW12P-POX1-F：
TCCGAAGCGAAAGGAATTCGGTCATTAGCGGCTAATAGCCGAACCAGGGCAAAGCAAAATAAAAGAAAC
CCW12P-POX1-R：
AACCACCGAATCGGGATTAATAGTAGTACGTCTCGTCATTATTGATATAGTGTTTAAGCGAATGACAGAAG
过表达POX2需要构建带有POX2启动子位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-POX2p-G的构建用到的引物有：
PCAS-FOX2-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCTTGCTGATGTTGATCCCCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTALeu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的PGK1p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
PGK1P-POX2-DONOR-F：
GTAAAATTGATGACAATTTATTTAGCTGATTTTTCAATTTACGCTATGGAAGTACCTTCAAAGAATGGG
PGK1P-POX2-DONOR-R：
TTACAACAACTCTATCTTTGAAGGATAAATTTCCAGGCATTGTTTTATGACAGATTTGTTTTATATTTG
制备酿酒酵母菌株QLW19，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW36。
基因ESBP6过表达通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现，构建带有ESBP6启动子位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-ESBP6p-G的构建用到的引物有：
PCAS-ESBP6-P-G-F：
AAAGGTCTCAGATCATCTTTGCCGCGGGCTATCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTALeu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于替换的CWP2p的供体DNA由酵母基因组为模板PCR扩增获得，扩增引物为：
CWP2P-ESBP6-F：
CCTATATCTAGTTACAATAGCGCTTGCCGACGATAACCGAGGCAACCTATGCAGAAGATT GCTTTTC
CWP2P-ESBP6-R：
TTCCGGAAGAAGCAGAAAAGTAGTCGTTTGAGTGCGTTGACATTTTTTTTCTTGTTAGTG TGTAGCG
GSF2基因敲除通过删除GSF2基因的开放阅读框实现，将构建带有GSF2位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-GSF2-G的构建用到的引物有：
PCAS-GSF2-G-F：AAAGGTCTCAGATCCTTATAGAGCGGGCGCGATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：
AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于修复敲除CSF2的供体DNA由融合PCR扩增获得，扩增引物为：
GSF2-ORF-DONOR-F：
AGAGGGGCAGCAGAGATCGGTGGACTTTGTTTTGATAGAGGGCGATTGCCACTACCATCC
GSF2-ORF-DONOR-R：
GTAGTAGTTAAAGGCTATGGTTGAATAAAAAAAAAGTCTGGATGGTAGTGGCAATCGCCC
制备酿酒酵母菌株QLW36，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW50。
OCA5基因敲除通过删除OCA5基因的开放阅读框实现，将构建带OCA5位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-OCA5-G的构建用到的引物有：
PCAS-OCA5-1148-G-F：
AAAGGTCTCAGATCTCAGACCCAAGTTTTTTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
PCAS-OCA5-1148-G-R：
AAAGGTCTCTAAACCCAACCGAGCAGCAAATCCCGATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG
另外用于修复敲除OCA5的供体DNA由融合PCR扩增获得，扩增引物为：
OCA5-DONOR-F：
TCACTATTCGAAATTTCTTAGAGACGTTACAGGGTAAAGGGCTCGCTAGCCCTTTAG
OCA5-DONOR-R：
GCAAGGTGTTAAAAATTGTGTAGAAGTAGTATATAATTCTAAAGGGCTAGCGAGCCC
制备酿酒酵母菌株QLW50，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW58。
UGA1基因敲除通过删除UGA1基因的开放阅读框实现，将构建带UGA1位置内的gRNA的Cas9质粒。以pCas9-LacZ质粒为载体，以pST1.G.Ura3质粒为模板PCR出带有gRNA的片段，通过GoldenGate的质粒构建方法组装而成。pCas9-UGA1-G的构建用到的引物有：
PCAS-UGA1-G-F：
AAAGGTCTCAGATCGGTCAAGATCACGTCTGGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
Leu2.1URA3R：AAAGGTCTCAAAACCTAGACACAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAG
另外用于修复敲除UGA1的供体DNA由融合PCR扩增获得，扩增引物为：
URA1-ORF-DONOR-F：
CAGAAAGAACAGACAAGAAACCGTCAATAAGAAATATAACTAAGAACGCGAGGCCGTGTC
URA1-ORF-DONOR-R：
ACAAGATACACATATATAAAGACCAAAAAAGGGAACGTGACACGGCCTCGCGTTCTTAG
制备酿酒酵母菌株QLW58，将上述供体DNA与质粒同时电转至细胞中，筛选后得到的菌株，命名为QLW71。
实施例2：构建最佳的丙酰辅酶A还原酶和丙二酸半醛还原酶的组合：
在实施例1构建的重组菌株的基础上，构建质粒pNLW7，pNLW11和pNLW12。首先质粒pNLW7是将MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R，并用TEF1启动子与终止子CYC1t连接至MCR-C前后用于其在酿酒酵母中的表达，MCRN端换成编码大肠短链脱氢酶/还原酶基因YDFG用PGK1启动子，强启动子PGK1p与终止子FBA1t连接至MCR-N前后用于其在酿酒酵母中的表达，URA3为筛选标记，构建高拷贝的3-HP生产质粒。首先以pM2M为模板扩增出MCRC端引入突变N941V，K1107W，和S1115R的片段、TEF1启动子片段、CYC1终止子片段，PGK1启动子片段、FBA1终止子片段以及ura3片段，其中扩增的引物序列为：
pm2m-back-f1：
CTGAATGTCCACCGTCAGTAATAAGTTAATTCAAATTAATTGATATAGTTTTTTAATGAG
pm2m-back-f2：
TAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAAC
pm2m-back-r1：
TTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCTTCG
pm2m-back-r2：
CCGTTGCTCCAGTTACTAAAACGATCATTGTTTTATGACAGATTTGTTTTATATTTGTTG
其次以大肠杆菌MG1655基因组为模板扩增片段YDFG，其中扩增的引物序列为：
pdfg-f：
AACAAATATAAAACAAATCTGTCATAAAACAATGATCGTTTTAGTAACTGGAGCAACGGC
pdfg-r：
TAAAAAACTATATCAATTAATTTGAATTAACTTATTACTGACGGTGGACATTCAGTCCGG
用Golden Gate的方法将上述片段依次连接起来，得到质粒pNLW7。
制备酿酒酵母菌株QLW19、QLW36和QLW50，将上述pNLW7质粒电转至细胞中，筛选后得新的重组菌，命名为QLW19+pNLW7，QLW36+pNLW7，QLW50+pNLW7。
pNLW11是将MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R，并用TEF1启动子与终止子CYC1t连接至MCR-C前后用于其在酿酒酵母中的表达，MCRN端换成编大肠码短链脱氢酶/还原酶基因YDFG用PGK1启动子，强启动子PGK1p与终止子FBA1t连接至MCR-N前后用于其在酿酒酵母中的表达，HIS3为筛选标记，构建高拷贝的3-HP生产质粒。首先以pNLW7为模板扩增出MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R的片段、TEF1启动子片段、CYC1终止子片段，PGK1启动子片段、FBA1终止子片段以及YDFG片段其中扩增的引物序列为：
HIS-F1：AAAGGTCTCTaaaactgtattataagtaaatgcatgtatactaaactcac
golden-r2：aaaggtctcaCGATCTCTTTTTTCTTTTCCAAACCTTTAGTACGGGTAATTAACG
HIS-R1：AAAGGTCTCAtcatgatttatcttcgtttcctgcaggt
golden-F3：aaaggtctcaAtCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGG
其次以野生型酿酒酵母基因组为模板扩增片段HIS3，其中扩增的引物序列为：
HIS-F：AAGGTCTCAatgacagagcagaaagccctagt
HIS-R：AAAGGTCTCActacataagaacacctttggtggaggg
用Golden Gate的方法将上述片段依次连接起来，得到质粒pNLW11。
制备酿酒酵母菌株QLW50和QLW58，将上述pNLW11质粒电转至细胞中，筛选后得新的重组菌，命名为QLW50+pNLW11，QLW58+pNLW11。
pNLW12是将MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R，并用CCW12启动子与终止子CYC1t连接至MCR-C前后用于其在酿酒酵母中的表达，MCRN端换成编大肠码短链脱氢酶/还原酶基因YDFG用PGK1启动子，强启动子PGK1p与终止子FBA1t连接至MCR-N前后用于其在酿酒酵母中的表达，HIS3为筛选标记，构建高拷贝的3-HP生产质粒。首先以pNLW11为模板扩增出MCRC端引入突变N941V，K1107W和S1115R的片段、CYC1终止子片段，PGK1启动子片段、FBA1终止子片段以及YDFG片段其中扩增的引物序列为：
SSC-F1：gtacctcctgtgatattatcccattccatgcggg
SSC-R1：
TAAGTTTCTTTTATTTTGCTTTGCCCTGGTTGGCGAAGTAGAGTGACACGTCCATTACCC
SSC-F2：
ATCTTCTGTCATTCGCTTAAACACTATATCAATAATGTCCGCTACCACTGGTGCTAGATC
SSC-R2：aagggcctcgtgatacgcctatttttatagg
其次以野生型酿酒酵母基因组为模板扩增片段CCW12启动子片段，其中扩增的引物序列为：
CCW12P-MCRC-F：
AAGCGCTGGGTAATGGACGTGTCACTCTACTTCGCCAACCAGGGCAAAGCAAAATAAAAG
CCW12P-MCRC-R：
ATGCAGATCTAGCACCAGTGGTAGCGGACATTATTGATATAGTGTTTAAGCGAATGACAG
制备酿酒酵母菌株QLW71将上述pNLW12质粒电转至细胞中，筛选后得新的重组菌，命名为QLW71+pNLW12
实施例3：重组菌株的3-HP发酵生产
将上述实例的工程菌中，QLW3、QLW5、QLW8和QLW19在YPD平板上进行划线获得单克隆，并挑选单克隆到单克隆接种至Delft液体培养基中进行活化，获得种子液。其中每个菌株挑三个克隆作为平行样进行发酵实验。将活化后的种子液，按照初始OD600为0.1接种至Delft培养基中，在摇瓶内30℃200rpm振荡培养。工程菌QLW19+pNLW7和QLW53+pNLW7在SC-URA平板上进行划线获得单克隆，并挑选单克隆接种至Delft液体培养基中进行活化，获得种子液，其中每个菌株挑三个克隆作为平行样进行发酵实验。将活化后的种子液，按照初始OD600为0.1接种至Delft培养基中，在摇瓶内30℃200rpm振荡培养。工程菌QLW53+pNLW11和QLW65+pNLW12在SC-URA平板上进行划线获得单克隆，并挑选单克隆接种至Delft液体培养基中进行活化，获得种子液，其中每个菌株挑三个克隆作为平行样进行发酵实验。将活化后的种子液，按照初始OD600为0.1接种至Delft培养基+7.5g/L CaCO3中，在摇瓶内30℃200rpm振荡培养。
发酵结束后取1ml发酵液，离心后取上清，并经0.22μm滤膜过滤后经高效液相色谱检测3-HP浓度。以0.5mM稀硫酸溶液作为流动相，柱温箱温度设置为65℃，以0.4ml/min的流速进行检测。在紫外检测器RID检测下，3-HP标准品的出峰时间为19.5min。
如图4所示，测试后得到各个重组菌株摇瓶发酵的3-HP产量如下：
菌QLW3的3-HP产量达到0.65g/L，QLW5的3-HP产量达到0.74g/L，QLW8的3-HP产量达到0.83g/L，QLW19的3-HP产量达到1.34g/L，QLW19+pNLW7的3-HP产量达到5.3g/L，QLW36+pNLW7的3-HP产量达到5.96g/L，QLW50+pNLW7的3-HP产量达到7.1g/L，QLW50+pNLW11的3-HP产量达到8.22g/L，QLW50+pNLW11在添加7.5g/L的CaCO3的条件下的3-HP产量达到9.12g/L，QLW58+pNLW11在添加7.5g/L的CaCO3的条件下的3-HP产量达到10.15g/L，QLW71+pNLW12在添加7.5g/L的CaCO3的条件下的3-HP产量达到11.25g/L，QLW71+pNLW12在添加7.5g/L的CaCO3和6.3g/L甲酸钾的条件下的3-HP产量达到11.63g/L。
实施例4：
采用上述基因工程菌制备丙烯酸，利用化学催化将采用上述基因工程菌生产的3-羟基丙酸转化成丙烯酸，具体方法为：在一个固定床管式反应器(内径＝8毫米，外径＝12毫米，长度＝30厘米)中进行了3-羟基丙酸(3-HP)到丙烯酸(AA)的催化脱水。培养菌株发酵72小时后，发酵液通过过滤进行灭菌处理，并用超纯水稀释6倍。然后获得3-HP溶液(浓度约为2.00毫克/毫升，pH值为5.7)。将3克20-40目的TiO2作为催化剂装载到反应器管中，在炉中预热至230摄氏度。使用计量泵以100毫升/小时的速率输送3HP底物，前5分钟为快速输送，之后恒定速率为1.5毫升/小时。含有AA的洗脱液在冷水浴中冷凝。前30分钟的液体样品被丢弃，30分钟后收集丙烯酸产品；每个测量收集了4个样品。
如图5所示，HPLC峰图展示为3-羟基丙酸转化成丙烯酸的结果图，3-HP的出峰时间为20min左右，丙烯酸的出峰时间在27min左右，图表展示的为计算后的转化率和得率，转化率和得率均大于99％以上。
上述3-羟基丙酸基因工程菌经过10代传代培养，菌株性状稳定，不会出现回复突变。
应当注意的是，以上所述的实施例仅为本发明较佳实施例，用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种碳中和产3-羟基丙酸的基因工程菌，其为含有外源的经过人工修改的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR的重组酿酒酵母菌；所述人工修改为野生型酿酒酵母基因组上的修改，其包括将外源的编码丙二酰辅酶A还原酶的基因MCR拆分为MCR-N与MCR-C两段，整合在XI-2染色体位置；MCR-N用启动子PGK1p表达，MCR-C经过了N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p表达。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过了底盘微生物改造的产3-羟基丙酸的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括强化3-羟基丙酸的合成途径、辅因子代谢调控基因的过表达，竞争代谢途径相关基因的调节，3-羟基丙酸转运基因的过表达以及能量代谢相关基因的敲除。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强化3-羟基丙酸的合成途径包括：
在重组酿酒酵母菌的基因组中表达外源的编码5-磷酸木酮糖特异性的磷酸转酮酶的基因xPK和外源的编码磷酸转乙酰酶的基因PTA；
和/或，在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1，且编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1经过了S659A和S1157A点突变改造；
和/或，在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达转录因子Stb5、编码硫酸盐渗透酶的基因SUL1和编码二型磷酸酶的基因PTC7；
和/或，在重组酿酒酵母菌的基因组中过表达编码柠檬酸合酶的基因CIT1，并且编码柠檬酸合酶的基因CIT1经过了S462A点突变改造。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，
过表达编码乙酰辅酶A羧化酶的基因ACC1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子TEF1p实现；
和/或，过表达转录因子Stb5通过在染色体上替换其原始启动子为人工启动子ARTp实现；
和/或，过表达编码硫酸盐渗透酶的基因SUL1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子PGK1p实现；
和/或，过表达编码二型磷酸酶的基因PTC7通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现；
和/或，过表达编码柠檬酸合酶的基因CIT1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CIT2p实现。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述强化3-羟基丙酸的合成途径还包括强化丙酰辅酶A还原酶代谢途径；
优选地，所述强化丙酰辅酶A还原酶途径包括增强了MCR-C的表达，并在MCR-N段表达了外源的编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG，且通过带有尿嘧啶筛选标记和/或组氨酸筛选标记的高拷贝质粒导入菌株中；
进一步优选地，MCR-C经过N940V、K1106W、S1114R点突变改造，且采用启动子TEF1p和/或启动子CCW12p表达；
和/或，编码大肠短链脱氢酶/还原酶的基因YDFG用PGK1启动子表达。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述辅因子代谢调控基因的过表达包括过表达了编码异柠檬酸脱氢酶的基因IDP2和编码柠檬酸盐和氧戊二酸盐载体蛋白的基因YHM2；
优选地，过表达编码异柠檬酸脱氢酶的基因IDP2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CCW12p实现；
和/或，过表达编码柠檬酸盐和氧戊二酸盐载体蛋白的基因YHM2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，
所述3-羟基丙酸转运基因的过表达包括ESBP6基因的过表达；优选地，过表达ESBP6基因通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CWP2p实现；
和/或，所述能量代谢相关基因的敲除包括敲除编码葡萄糖信号因子的基因GSF2和敲除编码肌醇焦磷酸酶的基因OCA5。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述竞争代谢途径相关基因的表达调节包括下调了脂肪酸合成途径相关基因的表达，过表达了编码脂肪酰辅酶A氧化酶的基因POX1、编码3-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的基因POX2，敲除编码γ-氨基丁酸(GABA)转氨酶的基因UGA1；
优选地，所述脂肪酸合成途径相关基因包括编码脂肪酸合酶的基因FAS1；进一步优选地，下调编码脂肪酸合酶的基因FAS1的表达通过在染色体上替换其原始启动子为启动子HXT1p实现；
和/或，过表达编码脂肪酰辅酶A氧化酶的基因POX1通过在染色体上替换其原始启动子为启动子CCW12p实现；
和/或，过表达编码3-羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的基因POX2通过在染色体上替换其原始启动子为启动子PGK1p实现。
9.一种利用权利要求1-8中任意一项所述的基因工程菌合成3-羟基丙酸的方法，其包括将所述基因工程菌进行发酵培养，生产3-羟基丙酸；优选地，发酵培养过程中，利用外源性甲酸为能源；
进一步优选地，摇瓶发酵培养条件为：温度30℃，摇床转速220rpm，培养基组成为7.5g/L(NH4)2SO4、14.4g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素、维生素、20g/L葡萄糖，KOH调pH到6.5，以及任选的7.5g/L CaCO3；
或者，进一步优选地，发酵罐补料批次发酵培养条件为：pH维持在5，温度维持在30℃，溶氧限制值为30％，通气维持在0.5VVm，搅拌设置为400-1200rpm，补料培养基的组成为67.5g/L(NH4)2SO4、27g/L KH2PO4、4.5g/L MgSO4·7H2O、微量金属元素、维生素、300g/L葡萄糖，以及任选的67.5g/L CaCO3。
10.根据权利要求1-8中任意一项所述的基因工程菌在制备丙烯酸中的应用；优选地，所述应用包括：
步骤M，将所述基因工程菌进行发酵培养，制得含3-羟基丙酸的发酵液；
步骤N，向含3-羟基丙酸的发酵液中加入催化剂，进行催化脱水，制得丙烯酸(AA)；
优选地，在步骤M中，采用如权利要求9所述的方法进行发酵培养。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN115948264A (zh) * | 2022-01-29 | 2023-04-11 | 北京化工大学 | 产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用 |
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2023
- 2023-07-27 CN CN202310930141.2A patent/CN116987606A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115948264A (zh) * | 2022-01-29 | 2023-04-11 | 北京化工大学 | 产3-羟基丙酸的基因工程菌及其应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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