CN101709268B - 丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于生物工程、生物技术领域以实现对菌种高通量筛选的菌株培养方法，尤其是一种丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法。该方法包括丝状菌选取、获得菌落、设置多孔板培养环境及悬浮培养等步骤，通过使菌落悬浮在液体培养基表面进行静止培养的简单方式，解决微型化培养的供氧难题，实现了丝状菌的高通量培养，配合相应的高通量检测技术，实现了高通量筛选，并且还使菌株的培养过程和孢子形成过程合二为一，进一步缩短菌种选育的流程，达到了高产菌株高通量筛选的目的。其操作简单，效率较高。

Description

丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法

技术领域

本发明涉及一种用于生物工程、生物技术领域以实现对菌种高通量筛选的菌株培养方法，尤其是一种丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法。

背景技术

目前，自然界中除病毒外的微生物主要由丝状菌和非丝状菌组成，非丝状菌包括细菌和酵母菌，丝状菌包括：放线菌和霉菌，丝状菌的主要特点菌体为丝状(例如，常见的发霉现象均是霉菌引起的)，放线菌的菌丝很细，是原核生物，霉菌的菌丝较粗，直径约为放线菌的10倍，是真核生物。生物工程很多重要产品是由丝状微生物(包括霉菌和放线菌)产生的，主要包括抗生素类、酶制剂类、有机酸类及生物活性调节剂类等。这些产品在市场竞争中受到很多的因素影响，其中产生菌株的性能优劣是至关重要的因素之一，因此，选育更好、更优的产生菌株一直是各国科技工作者追求的目标，所以，建立有效的高通量筛选平台是目前菌种选育的关键技术。

高通量筛选平台由两部分组成：(1)高通量筛选平台的菌株培养技术，(2)高通量筛选平台的产物检测技术，两者密切相联，形成一个完整的高产菌株的筛选平台。

目前，高通量筛选平台的产物检测技术发展较快，将产物的信号转化为间接的颜色信号、荧光信号、紫外信号、pH信号、抗体信号、光谱信号等进行快速检测，实现了产物检测的微量、快速、准确。但高通量筛选平台的菌株培养技术，发展相对缓慢，主要原因是高通量培养意味着微型化培养，而微型化培养模式受到现有培养设备的限制，特别是当前有用的丝状菌都是好氧菌，氧气的供给方式成为微型化培养的瓶颈，国外一些公司已经研制出含有多个微型传感器探头的微型反应器设备，可以满足液体微培养过程中氧气的供给以及培养过程中的相关检测控制(温度、pH、光密度等)其培养主体模式依然是液体均匀培养，即微型发酵罐，有些产品已经应用，但造价昂贵。

国内，丝状菌的菌种筛选的评价体系，都是以液体摇瓶培养作为常规的菌株培养技术，操作过程复杂，设备效率低，培养规模小，同时没有良好的高通量筛选的检测技术，因此，大大限制了筛选效率。目前一台大型液体摇瓶培养设备每天最多能够培养100株菌，设备造价3-4万元，而优良菌株的获得机率，大约在10^-4-10^-6之间，也就是说连续工作100-10000天，才有可能获得一株优良菌株，工作量大，筛选效率低。且液体摇瓶培养，为获得氧气补给，需将摇瓶不停的摇动，在摇动过程中，会将丝状菌菌丝打断，无法在培养过程中产生无性孢子(第二代繁殖体)，进一步延长了菌种选育的流程。

现有技术中，丝状菌也可以在固体培养基生长，同时也可以产生代谢产物，可以用于菌种初步的定性筛选，但产物检测不方便，营养物质的吸收速率受影响，会影响筛选结果，所以真正筛选检测还得转换为液体摇瓶培养。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种丝状菌高通量筛选的悬浮培养方法，该方法在提高菌种培养工作效率的同时，增加了获得优良菌株的几率。

为实现上述目的，本发明的丝状菌高通量悬浮培养方法，包括如下步骤：

a、丝状菌选取：选取可能有遗传性差异的待培养的丝状菌的菌丝或孢子；

b、获得菌落：所述的丝状菌的菌丝或孢子经稀释后，在固体培养基上，获得菌丝或孢子萌发后的菌落；此处，在固体培养基的选择上，要确保固体培养基的营养成分主要满足菌体生长的营养要求，长的多、长的快，获得高生长活力的菌落。

c、设置多孔板培养环境：向多孔板中的每一个孔分别加入与所述的菌落相适应的液体培养基；该相适应液体培养基为不同菌株在培养时所选取的最佳培养基，该培养基的配方组成随菌株及其菌株的产物不同，成分有较大差异，因此，在液体培养基的选择上，要满足液体培养基的营养成分一方面满足菌株的生长，另一方面要满足产物的积累。如产生卡那霉素的放线菌，其培养基可采用：黄豆粉30g，麦芽糖25g，淀粉25g NaNO₃8g，ZnSO₄0.1g，水1000ml，pH 7.2，而产植酸酶的霉菌所采用的培养基成分可以是：Sucrose(蔗糖)30g，植酸钠5g，蛋白胨5g，NaNO₃3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g KCl0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，维生素1ml，水1000ml，pH 6.2-6.5。

d、悬浮培养：将各可能有遗传性差异的已培养的丝状菌的单菌落分别移入多孔板的各孔中，使菌落漂浮在液体培养基表面，进行静止培养。

上述的步骤c中，液体培养基的加入量为微孔板孔体积的1/3-5/6。

步骤b中，所述的菌落为可于液体培养基水面上自然悬浮的毛絮状。

进一步的，步骤d中，在多孔板各个孔中设有带有支架的丝网，所述的菌落置于丝网上，并通过支架的支撑相对在液体培养基液面上悬浮。

更进一步来说，步骤c中还包括向液体培养基中添加凝固剂，使液体培养基生成软凝胶。

此外，步骤d中，静止培养过程中，根据菌株的需要，可以向微孔板各孔中补加营养、前体或调节pH值。

上述步骤中静止培养的温度为25-35℃，培养时间为1-8天。

采用上述技术方案，其效果如下：

1、由于是将丝状菌的菌丝或孢子萌发后的单个菌落分别放入孔板中进行液体静止培养，使菌种的遗传背景不相交叉；

2、由于对单个菌落在多孔板中进行静止培养，即微培养，因此，每次可培养菌种的数量可大大增加，在提高培养效率的同时，可增加获得优良菌株的几率，如采用本培养方法，相对于现有的培养技术来说，每天可以培养20000株菌，效率提高200倍，设备均采用现有的菌株培养设备，仅为5000元，获得优良菌株的机率也相应提高200倍。同时采用本培养方法，为高通量筛选奠定了基础。

3、采用在多孔板的板孔中进行静止培养，在对培养液进行高通量快速检测时，由于培养液非常稀薄，无菌取样方便。

4、采用静止培养，无需对带有菌落的多孔板进行晃动，即可获得氧气补给，使得菌落内部组织不受破坏，培养后期可形成孢子，便于挑选拣出和保藏，使培养过程和孢子形成过程合二为一，缩短了选育流程。

5、液体培养基的加入量一般为微孔板板孔体积的1/3-5/6，该参数确定的依据一是确保液体中的营养物质能够支撑菌体的生长及代谢产物的产生，二是留有的空间用于确保菌体的需氧生长，如一般丝状真菌(霉菌)的个体比较大，需氧多，液体上方的空间余地要大些，放线菌个体小，需氧少，空间余地或大或小均可。

6、将丝状菌菌落生长到一定直径大小程度，呈毛絮状，或在微孔板的板孔中设有带有支架的丝网以及采用液体培养基中添加少量凝固剂三种所列举的方式，其目的是使菌落能够悬浮在液体培养基表面，实现静止培养。如使丝状菌菌落生长到一定直径大小呈毛絮状，是使该菌落比重下降，因此在液体培养基中悬浮；采用带有支架的丝网，使菌落得到固定支撑，进而悬浮在培养基表面尤其是对生长较小的菌落(由于还有少量的固体培养基)，比重较大，不能在液体培养基上悬浮，用带有支架的丝网确保了菌种的支撑；在液体培养基中添加少量凝固剂制成软凝胶，其凝固剂的加入量在确保营养交换的前提下，使液体培养基密度增大，浮力增加，进而实现对菌落的浮力支撑，使菌落悬浮。

综上所述，本发明通过使菌落悬浮在液体培养基表面进行静止培养的简单方式，解决微型化培养的供氧难题，实现了丝状菌的高通量培养，配合相应的高通量检测技术，实现了高通量筛选，并且还使菌株的培养过程和孢子形成过程合二为一，进一步缩短菌种选育的流程，达到了高产菌株高通量筛选的目的。其操作简单，效率较高。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作更进一步详细说明：

实施例一

以青霉素的高产菌株筛选为例：

菌株：产黄青霉p09

固体培养基的主要成分：蔗糖、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂，pH6.5-7.2

液体培养基的主要成分：乳糖、玉米浆、硫酸钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、苯乙酸

培养温度：25-30℃

多孔板：24孔板

(1)菌丝或孢子：获得产黄青霉可能有遗传差异的大量菌丝或孢子。

(2)菌落形成：菌丝或孢子适度稀释后，涂布在固体培养基上，25-30℃，孢子萌发，形成菌落，培养时间3-5天。

(3)24孔板中加入培养液(液体培养基)，培养液约为孔体积的1/3-2/3，此时，青霉素的液体培养基中原料的选取上，需要加入苯乙酸(青霉素分子的侧链结构)，同时青霉素分子中含有硫元素，因此要加入硫酸钠，乳糖的作用就是要控制菌体的生长速度，以使代谢转向青霉素的合成。此时，如果也用葡萄糖则生长太快，影响青霉素的产生，工业生产上到了最后一级发酵阶段用的还是葡萄糖，但是采用少量缓慢流加的方式供给的，目的也是控制生长速率，产生更多的青霉素。

(4)菌落转移并漂浮：将菌落转移到孔板中，菌落因为长成毛絮状，比重下降，可以在每个孔中自然漂浮，25-30℃静止培养，培养过程中，定期补加入苯乙酸。7天后，每个孔中各取液体样品200μl，放入对应的24孔板中，进行青霉素的高通量快速检测，通过颜色变化可以迅速定性判别青霉素的高产菌株，每一个24孔板的检测时间仅用3分钟，一次性加入固定体积的检测试剂，该试剂用量可以自我设定，例如，加入的试剂量正好可以与8000u/ml青霉素完全反应，低于8000u/ml的样品呈现稳定的蓝色结果，高于8000u/ml的样品蓝色很快退去，呈现黄色结果，这样可以快速挑选出产量高于8000u/ml的青霉素产生菌株。同时如果需要，可以另外取一份平行样品进行定量检测，检测时间大约需要5分钟检测时间，与上述方法所不同的是，检测试剂分多次加入，每次加入量是固定值(如30μl、50μl或100μl)，以蓝色稳定不退为终点，效价低的样品在加入到对应体积量的试剂后就不再退色(次数较少)，而效价高的样品需要更多次加入检测试剂，直到蓝色不再消退才达到终点，这样的结果数据虽然不是严格连续，但每个孔的检测数值都是青霉素的最高限，例如，下表中7754u/ml结果表示该孔青霉素产量最高不超过7754u/ml(实际值可能是7746、7748或7750等)。

下面是一个24孔板的定量检测结果：

以上结果可以看出：此24孔板的最高青霉素效价为10554u/ml，则对应的菌落就是相对优胜菌株，采集该菌落产生的无性孢子(每个菌落约产10⁷个无性孢子)，一部分孢子用于菌种保藏，另一部分孢子可以进一步重复验证。

实施例二

高产蛋白酶菌株的筛选

菌株：米曲霉3042

平板固体培养基：马铃薯200g煮沸30min取汁，蔗糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂18g，水1000ml，pH 6.2

液体培养基：麸皮浸出汁100g、黄豆粉10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5水900ml，pH 6.2

培养温度：28-32℃

多孔板：24孔板

(1)菌丝或孢子：获得米曲霉可能有遗传差异的大量菌丝或孢子。

(3)菌落形成：在平板固体培养基上，28-30℃，孢子萌发，形成菌落，培养时间1-2天。(该菌产酶时间早，因此固体培养基上培养时间不宜过长)

(3)24孔板中加入培养液(即液体培养基)，培养液约为孔体积的1/3-2/3

(4)菌落转移并采用丝网支架悬浮：将菌落转移到孔板中，每个孔中放有一个丝网支架，以便支撑悬浮菌落，28-32℃静止培养，3天后进行蛋白酶的高通量检测，每个孔中各取液体样品30μl，放入96孔板中，加入检测试剂，50℃保温30mi n，产生的颜色反应与蛋白酶的酶活力呈正相关，采用酶标仪同时对96孔板读数，根据结果可以获得产蛋白酶活力较高的菌株。

以上结果可以看出，最高酶活为4622u/ml，则对应的菌落就为优胜菌株。从该菌落上采集孢子进行菌种保藏和进一步验证。

实施例三

本实施例仍以高产蛋白酶菌株筛选为例，与实施例二不同的是在(4)中，向液体培养基中加入0.5％的琼脂，使菌落在液体培养基中悬浮。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (9)

1.一种丝状菌高通量悬浮培养方法，包括如下步骤：

a、丝状菌选取：选取可能有遗传性差异的产黄青霉的丝状菌的菌丝或孢子；

b、获得菌落：所述的丝状菌的菌丝或孢子经稀释后，在固体培养基上，获得菌丝或孢子萌发后的菌落；

其特征在于该方法在步骤b后包括如下步骤：

c、设置多孔板培养环境：向多孔板中每一个孔分别加入与所述的菌落相适应的液体培养基，其中，液体培养基的主要成分为乳糖、玉米浆、硫酸钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、苯乙酸；

d、悬浮培养：将各可能有遗传性差异的已培养的丝状菌的单菌落分别移入多孔板的各孔中，使菌落漂浮在液体培养基表面，进行静止培养。

2.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：所述的步骤c中，液体培养基的加入量为微孔板孔体积的1/3-2/3。

3.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：步骤b中，所述的菌落为可于液体培养基水面上悬浮的毛絮状。

4.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：步骤d中，在多孔板各个孔中设有带有支架的丝网，所述的菌落置于丝网上，并通过支架的支撑相对在液体培养基液面上悬浮。

5.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：所述的步骤c中还包括向液体培养基中添加凝固剂，使液体培养基生成半固体软凝胶。

6.根据权利要求5所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：所述的凝固剂为琼脂、明胶、卡拉胶、海藻酸钠、变性淀粉中的一种。

7.根据权利要求6所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：所述的凝固剂为琼脂，其加入量为0.4～0.8％。

8.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：步骤d中，静止培养过程中，向微孔板各孔中补加营养、前体或调节pH值。

9.根据权利要求1所述的丝状菌高通量悬浮培养方法，其特征在于：静止培养的温度为25-30℃，培养时间为3-5天。