CN102676400A - 一种具有生物转化特性的哈茨木霉及其应用 - Google Patents
一种具有生物转化特性的哈茨木霉及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于天然产物的生物技术与医药领域，涉及一种具有生物转化特性的哈茨木霉及其应用。生物转化过程将哈茨木霉接种于含有栀子、杜仲等中药粉末的培养基中发酵培养，培养基中无需额外补充碳源和氮源，培养温度为20~40°C，pH 3.0~10.0，发酵时间为12~72小时。本发明充分综合利用药材中淀粉纤维素等有效成分满足自身生长需要的同时，将药材中京尼平苷高效转化为目的产物京尼平，整个过程无需要京尼平苷的提取和相关酶的制备，方法简便易行，发酵时间短、转化率高。哈茨木霉能够产生一种特异性水解京尼平苷的糖苷酶，转化过程中不产生栀子蓝色素，提高了京尼平的质量，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的生物技术与医药领域，特别涉及到一种具有新生物转化特性微生物及其在制备京尼平中的应用。
背景技术
京尼平，即栀子苷元，属环烯醚单萜化合物，具有广泛的用途，首先，具有良好的抗炎、治疗肝脏疾病、抗脂质过氧化、治疗Ⅱ型糖尿病、抗NO生成、降压、通便等功效。京尼平作为一种新兴的药物中间体，在注射剂开发中表现出较为广泛的应用前景。其次，京尼平还是一种优良的天然生物交联剂，具有细胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力强等特点，被广泛应用于生物材料中。同时，京尼平作为生物染料蚕丝的直接染色时，具有低毒、稳定、环境友好的的特点，可以替代化学合成染料。京尼平与氨基酸反应可以制备栀子蓝色素，栀子蓝色素是一种天然水溶性色素，它耐热、耐光、耐酸碱，pH适应范围广，广泛应用于食品、药品及化妆品等的着色。
京尼平苷为京尼平苷元在C1位连接1分子β-葡萄糖的糖苷，该化合物在中药中含量较高，如在栀子可以达到3%-8%左右，而京尼平苷的含量却只有0.005%～0.01%左右。在杜仲中京尼平苷含量为0.1%-0.3%左右，几乎不含京尼平。直接从中药中提取出京尼平非常困难，存在着成本高、不经济的问题。常用的酸碱水解糖苷键生成苷元的方法也不适用于京尼平，主要是因为环烯醚萜结构在酸碱作用下会遭到破坏。所以目前常采用去除京尼平苷中1分子β-葡萄糖的的方法获得京尼平。中国专利CN101029066和公开了一种将从栀子中提取浓缩后的京尼平苷用葡萄糖苷酶酶解后、对酶解液进行柱层析、冷冻干燥制备京尼平的方法；中国专利CN101396455公开了了一种采用酶解京尼平苷，并对酶解产物进行提取、结晶制备京尼平的方法。中国专利CN101899484A公开了一种京尼平的制备方法，将产β-葡萄糖苷酶的菌种发酵，待达到产酶高峰后，将发酵液收集，用包埋-交联结合的方法共固定化酶和细胞、或酶和菌丝，制备固定化酶，采用填充床或搅拌式反应器对栀子苷进行催化水解反应，经纯化后得到京尼平，但上述方法需要对京尼平苷或葡萄糖苷酶进行提取。同时目前已使用的β-葡萄糖苷酶与京尼平发生反应生成栀子蓝色素，导致酶活降低的同时有副产物生成，影响转化率和京尼平的质量。为解决栀子蓝色素的问题，中国专利CN102146423公开了一种将β-葡萄糖苷酶固定化，在乙酸钠/乙酸和乙酸乙酯双相体系中催化京尼平苷制备京尼平的方法，反应过程中，反应产物被提取到乙酸乙酯层，减弱了京尼平与β-葡萄糖苷酶的反应，提高了京尼平的产率。但该方法操作复杂，成本高。与已知β-葡萄糖苷酶特性不同，和京尼平反应不生成栀子蓝色素的β-葡萄糖苷酶，对提高转化率和京尼平质量具有十分重要的意义。
中药材微生物直接转化法是将含有转化底物的中药材作为培养基的微生物发酵方法，该方法利用微生物发酵过程中的产生的酶转化底物，过程中无需对中药材中转化底物进行分离，操作简单、成本低廉、环境友好，在得到收率较高的目标产物的同时综合利用植物粉末中的其他有效成分，大大节省原料，降低产品成本，做到了植物药材有效成分的综合利用。中国发明专利CN102382771A公开了一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法，即利用实验室筛选得到的保藏菌发酵中药栀子，但京尼平苷转化率低，只有14%。Xu等利用高产β-葡萄糖苷酶菌株对栀子进行发酵制备京尼平，并进一步进行了固定化细胞转化栀子苷的研究，栀子苷转化率达95%以上，但是发酵时间过长，需要108h（Xu M, et al, Enzyme Microb Tech, 2008,42, 440），
目前，生产京尼平的企业迫切需要获得高效转化京尼平苷制备京尼平的新微生物，以及提高生产效率，缩短生产周期，降低成本的新方法。
发明内容
本发明的目的解决目前京尼平生产中效率低、周期长、产品质量差、易产生副产物的问题，提供一种高效、实用的微生物。
本发明的技术解决方案是提供一种哈茨木霉，该微生物于2009年3月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.2979，分类命名为Trichoderma harzianum。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市海淀区中关村北一条13号，邮编：100080。
在生物转化过程中，将本发明的哈茨木霉接种于含有栀子或杜仲粉末的培养基中发酵培养，培养基中无需额外补充碳源和氮源，培养温度为20~40°C，pH 3.0~10.0发酵时间为12~72小时。
本发明的哈茨木霉分泌的一种特异性水解京尼平苷的糖苷酶，其分子量为74.4 kDa，该糖苷酶转化京尼平苷制备京尼平不产生栀子蓝色素。
哈茨木霉分离自中国辽宁省的土壤样品中，将该菌株的孢子悬浮液接种于PDA平板上，25℃培养，隔段时间观察。菌落在PDA上生长迅速，广铺，呈棉絮状。最初为白色平坦菌丝，3天时已将整个培养皿铺满。中部为大量棉絮状气生菌丝，形成致密产孢从束区，并排成同心轮纹。中央部颜色呈绿色，边缘呈白色。一周后，整个菌落全部变为深绿色，菌落背面呈棕褐色。形态学鉴定显示该菌属于木霉属。利用液氮研磨破碎菌体细胞，结合使用BiosPin真菌基因组DNA提取试剂盒，提取该菌的基因组DNA。选择ITS1和ITS4作为引物扩增木霉DL3012的ITS区。将通过聚合链式反应得到的产物，利用TaKaRa凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。回收PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带清晰明亮，无杂带，无拖尾。纯化的DNA电泳图谱由Bandscan处理，确定回收纯化的DNA浓度大于30 ng/μL，可满足测序要求。将PCR产物直接测序获得ITS序列。样品纯化后委托北京天根生物有限公司测序，采用正反双向测序，得到的序列利用Chromas软件进行拼接。将拼接序列在NCBI中进行BLAST同源性比较，显示其与哈茨木霉（Trichoderma harzianum）同源。
本发明提出的具有新生物转化特性的哈茨木霉在制备京尼平中具有较好的效果，1）哈茨木霉能够直接转化中药药材，在充分综合利用药材中淀粉纤维素等有效成分满足自身生长需要的同时，将药材中京尼平苷高效转化为目的产物京尼平，与酶解法相比，整个过程无需要京尼平苷的提取和相关酶的制备，方法简便易行，在12~72小时的发酵时间内，可以将大于90%的京尼平苷转化率为京尼平，发酵时间短、转化率高。2）具有新生物转化特性的哈茨木霉能够分泌一种特异性水解京尼平苷的糖苷酶，转化过程中没有栀子蓝色素副反应发生，降低了β-葡萄糖苷水解酶活损失，提高了转化率，减少了副反应的发生，提高了京尼平的质量。
附图说明
图1：栀子中京尼平苷和京尼平的HPLC色谱图。
图2：哈茨木霉转化栀子后京尼平苷和京尼平的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细说明本发明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例 1. 哈茨木霉转化栀子中京尼平苷制备京尼平
将哈茨木霉菌液接种于PDA斜面培养基上，置28-30℃恒温培养箱培养3-5天，用无菌水溶解斜面上的孢子获得孢子液，将孢子液接入含有4%栀子粉末的种子培养基，种子培养基为自来水配置，pH自然，栀子粉末中京尼平苷的含量为6.4% (HPLC测定），种子培养24h后，接入发酵培养基，发酵培养基为含有8%栀子粉末的1/15 mol/L的磷酸缓冲液，pH6.1，接种量4%。培养温度30℃，转速150 rpm, 发酵时间48小时，发酵结束后，采用HPLC法测定京尼平的含量，转化率计算方法为：转化率（%）=（转化后京尼平摩尔数-转化前京尼平摩尔数）/药材中京尼平苷摩尔数×100%。京尼平得率（%）=（转化后京尼平总质量数/培养基中栀子的质量数）×100%。
京尼平和京尼平苷采用HPLC方法分析，HPLC色谱仪为waters公司 600E泵，2487检测器，7725i进样器，检测波长为238nm，洗脱条件为85%乙腈-水等度洗脱，色谱柱为sunfire C18色谱柱（waters公司），在该条件下京尼平苷和京尼平的保留时间分别为6.0和12.0min。
按照上述的方法，栀子中京尼平苷经过哈茨木霉转化48h后，转化率为98.0%，京尼平得率为3.6%。
实施例 2. 哈茨木霉中京尼平苷-β-葡萄糖苷酶的分离纯化
取1L栀子发酵液，12000rpm，4℃，离心30min，得上清，75%硫酸铵沉淀，静置过夜，12000rpm，4℃，离心20min，得蛋白沉淀，用40 mLpH5.0，66.7 mmol/L磷酸缓冲液溶解，超滤浓缩，过DEAE阴离子柱层析，DEAE用于脱色，酶活部分直接流穿，收集流穿液，得到粗酶液，超滤浓缩，过Superdex200凝胶柱层析，得到纯酶液，SDS-PAGE电泳显示单一条带。MALDI/TOF 质谱质量分析仪测定该酶的分子量为74.4 kDa。
实施例3. 京尼平苷-β-葡萄糖苷酶转化京尼平苷制备京尼平
将京尼平苷溶于pH5.0，66.7 mmol/L磷酸缓冲液配制成1mg/mL京尼平苷标准品溶液，取200 μL该溶液，50℃预热5min后，分别加入由实施例2制备的纯酶液200μL，分别反应1h，1.5h，2h，2.5h，3h，沸水浴5min，停止反应。HPLC分析京尼平苷转化率，每个反应重复三次。结果表明，反应1h，京尼平苷转化率已在90%以上，反应2h，京尼平苷转化率超过98%，反应进行3h，反应液未变色，未有栀子蓝色素的生成。
实施例4. 京尼平苷-β-葡萄糖苷酶的特异性实验
将盾叶新苷（Zingibernsis newsaponin）、三角叶皂苷（deltonin）、薯蓣皂苷元葡萄糖三糖苷（diosgenin-triglucoside）、prosaponin、薯蓣皂苷元-葡萄糖二糖苷（diosgenin-diglucoside）（以上5种皂苷均由本实验室制备，HPLC检测纯度大于95%），延玲草次苷（trillin，购自芜湖delta公司，纯度大于98%）分别溶于pH 5.0、66.7 mmol/L磷酸缓冲液配制成1mg/mL各种皂苷溶液，分别取各种皂苷溶液200 μL，50℃预热5min后，分别加入由实施例2制备的纯酶液200μL，50 ℃预热5min后，分别反应24 h，向反应液加入200μL水饱和正丁醇，震荡放置一段时间后取正丁醇层，旋转浓缩至干，加入200μL无水甲醇重新溶解，过膜。HPLC分析各种皂苷的转化率，每个反应重复三次。结果表明，反应24 h时，HPLC分析表明，上述6种皂苷含量和初试浓度相同，未见转化产物产生，表明京尼平苷-β-葡萄糖苷酶不具有水解上述6种皂苷的活性，是一种特异性水解京尼平苷的糖苷酶。
Claims (4)
1.一种具有新生物转化特性的哈茨木霉，其特征在于，哈茨木霉于2009年3月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.2979，分类命名为 Trichoderma harzianum。
2.权利要求1所述的具有新生物转化特性的哈茨木霉在制备京尼平苷中的应用，其特征在于，生物转化过程将哈茨木霉接种于含有中药粉末的培养基中发酵培养，培养基中无需额外补充碳源和氮源，培养温度为20~40°C，pH 3.0~10.0，发酵时间为12~72小时。
3.根据权利要求2所述的具有新生物转化特性的哈茨木霉在制备京尼平苷中的应用，其特征在于，所述中药为栀子、杜仲。
4.权利要求2或3所述的具有新生物转化特性的哈茨木霉在制备京尼平苷中的应用，其特征在于哈茨木霉能够分泌一种分子量为74.4 kDa的特异性水解京尼平苷的糖苷酶，该糖苷酶转化京尼平苷制备京尼平不产生栀子蓝色素。
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