CN113088460A

CN113088460A - 一株拟无枝酸菌突变体及其应用

Info

Publication number: CN113088460A
Application number: CN201911338230.8A
Authority: CN
Inventors: 薛凯; 杜喜林; 张丽莎; 张鹏; 何汉平
Original assignee: Boton Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Boton Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN113088460B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一株拟无枝酸菌突变体及其应用。本发明所述拟无枝酸菌突变体保藏编号为CCTCC NO：M2019756。本发明提供了一株通过等离子诱变筛选获得的拟无枝酸菌突变体CFFSH012，其在具备较高的阿魏酸转化率时，也同时具备提高香兰素产量的能力，可同时满足生产效率与成本水平的需求，可为发酵香兰素产业提供重要的经济价值。

Description

一株拟无枝酸菌突变体及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株拟无枝酸菌突变体及其应用。

背景技术

香兰素(化学名称:3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，FEMA Number 3107)是一种使用量巨大的重要香料。香兰素的分子量为152.1，具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，起增香和定香作用。香兰素的天然来源是源于多年生的草本植物的香荚兰的提取。然而，香荚兰种植3年后方能采摘收取其香豆荚，并且其香豆荚内的香兰素含量大约只有1.5％到3％(干重含量)。另外，受到热带植物香荚兰气候、土壤的地域性限制，全球约90％的香荚兰产于热带岛屿马达加斯加的大溪地地区。香荚兰豆等天然香草植物的种植、采收、提取和制备过程需要大量的劳工、土地与时间，使得其成本是化学合成产品的100多倍，因此天然香兰素产品价格也是合成产品的50～200倍。因此从天然植物中提取的香兰素产品在全球产量中的占比不到1％，多数的香兰素依赖于不可再生的石油化工产品邻甲氧基苯酚和4-甲基愈创木酚通过人工化学合成获得的人造香料。

随着社会对于天然和有机的生活方式的关注程度不断增加，天然香料越来越受到消费者的喜欢。在日化领域，天然有机护肤产品不仅其添加的植物提取物必须要获得有机认证的，同时产品中不能添加人工香料，因此只能采用天然香料的成份。另外，在食品领域，有机食品的认证规则中也规定了有机食品类不得使用人工香料。欧盟法规(EU Directive88/388/CEE)及美国FDA法规(CFR-21CFR101.22)将以天然来源的原料通过酶处理或者是微生物发酵方式及其他传统食品加工方式获取的香料也纳入了天然香料的法律定义中。

美国专利Process for the preparation of vanillin and microorganismssuitable therefor(US Patent NO.6,133,003)公开了利用拟无知酸菌DSM9992(Amycolatopsis sp.DSM 9992)或拟无知酸菌DSM9991转化阿魏酸生产香兰素的方法。阿魏酸是一种来自于天然谷物谷壳提取的天然可再生物质可再生原料，因此以该方法获取的香兰素符合天然香料的法律定义。在该专利的公开的最优结果(实施实例3)中，累积224.92g阿魏酸被投入发酵罐发酵转化，生物转化结束时共获取香兰素129.835g(浓度11.5g/L)，摩尔转化率为73.66％。如果考虑反应结束时，反应液中尚残留1g/L阿魏酸未参与转化反应，扣除未参与反应的阿魏酸，实际上的摩尔转化率应为77.5％(专利中记载值为77.8％)。

美国专利Microbiological process for producing vanillin(US PatentNO.6,235,507)公开了一种利用西塘链霉菌ATCC 39116(保藏名称Streptomyces setoniiATCC 39116)转化阿魏酸生产香兰素的方法。在该专利所公开的方案中，5至40g/L(终浓度)的阿魏酸被加入到培养基中，并利用菌体的发酵转化为香兰素，在其公开的若干个方案中阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为51-75％之间。在专利中公开的最优方案(实施实例4)中香兰素产量达到13.9g/L(阿魏酸的摩尔转化率为75％)。另外，西塘链霉菌ATCC 39116根据其16s rRNA的全长序列比对后，重新鉴定为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)，因此西塘链霉菌ATCC 39116实质上就是拟无枝酸菌ATCC 39116的曾用名，菌株信息变更情况记载于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)网站，在有关菌株Amycolatopsis sp.(

39116^TM)的有关介绍条目中以及该菌株的产品手册(Productsheet)中。

中国专利一株链霉菌及利用其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法(公开号CN101165168A)公开了一种利用链霉菌CCTCC M 206065(Streptomyces sp.CCTCC M 206065转化阿魏酸生产香兰素的方法，在其公开最优技术方案(实施实例10)中阿魏酸溶液在发酵的不同阶段以优化的流加方式及速度流加至发酵体系中(阿魏酸累积终浓度达45g/L)，同时在加入DM11大孔吸附树脂以减少香兰素和阿魏酸对细胞的毒害及抑制作用，最终实现香兰素的产量达到19.2g/L(阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为54.5％)。

美国专利Amycolatopsis sp.strain and methods of using the same forvanillin production(US Patent NO.9,758,759)公开了一种利用拟无枝酸菌CCTCC NO:M2011265(Amycolatopsis sp.CCTCC NO:M 2011265)转化阿魏酸生产香兰素的技术方案，在其公开的最优技术方案中Amycolatopsis sp.zhp06菌株细胞(即Amycolatopsis sp.CCTCCNO:M 2011265)其可将初始浓度30g/L的阿魏酸转化为产量达10.03g/L的香兰素(摩尔转化率为43.8％)或将初始浓度40g/L的阿魏酸转化为10.08g/L的香兰素(摩尔转化率为34.46％)。

美国专利Microorganisms and methods for producing vanillin(US PatentNO.10,280,407)公开了一种进一步提高拟无枝酸菌香兰素产量及转化率的技术方案，在其技术方案中作为生产菌株的拟无枝酸菌重组菌株的香草醛还原酶或者香醛脱氢酶是无功能的，通过插入失活或者敲除所述的香草醛还原酶或者所述的香醛脱氢酶使得香兰素进一步被还原为香草醇或进一步被氧化为香草酸的支路代谢途径被截断，减少副产物的产生，从而提高香兰素的产量。在其优选的实施方案中作为拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的vr1-vr5基因被失活后拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的香兰素产量得以提高(原文中并未记载香兰素的产量与转化率，仅以“+”数量表示产量多数)。

在已经公开的现有技术中，拟无枝酸菌属，特别是拟无枝酸菌菌株ATCC39116被公认为是现有已知现有微生物中利用阿魏酸转化为香兰素能力最强的菌株，具有非常好的产业化应用价值。由于要满足欧盟法规(EU Directive88/388/CEE)及美国FDA法规(CFR-21CFR101.22)的天然香料要求，作为原料的阿魏酸本身首先必须是天然的，源于谷壳提取的阿魏酸的成本依旧较高，占到了所有发酵原料成本的70％以上，对香兰素的成本影响比重较大。因此更高的阿魏酸转化率则意味则更好的阿魏酸利用率及更低的生产成本。同时，更高的香兰素产量意味着拥有更高的生产效率，二者均非常重要。因此，有大量的尝试被投入到对拟无枝酸菌株或者改进发酵工艺以提高香兰素的产量，同时维持一个较高水平的阿魏酸转化率。

公开技术文献《Effect of bioconversion conditions on vanillinproductionby Amycolatopsis sp.ATCC 39116through an analysis of competing by-product formation》(Bioprocess Biosyst Eng(2014)37:891–899，DOI10.1007/s00449-013-1060-x)公开了对于培养pH、初始糖浓和碳源、副产物香草酸浓度及阿魏酸底物浓度的抑制作用在菌株发酵生产香兰素过程中的影响，并优化了培养方式，Amycolatopsissp.ATCC 39116在其优化后的香兰素产量达到9.18g/L(摩尔转化率达96.1％)。

公开技术文献《Transformation of Ferulic Acid to Vanillin Using a Fed-Batch Solid–Liquid Two-Phase Partitioning Bioreactor》(American Institute ofChemical Engineers Biotechnol.Prog.,30:207–214,2014，DOI 10.1002/btpr.1830)公开了一种利用原位分离技术提高香兰素产量的技术方案，在其优选的技术方案中，采取固液两相分离反应器(solid-liquid two-phase partitioning bioreactor，TPPB)作为发酵容器，并利用优选的分离相材料Hytrel G4078W在发酵过程中及时吸附产生的香兰素以降低香兰素的对于Amycolatopsis sp.ATCC 39116菌体的抑制毒性，从而使得产量从9.4g/L提高至19.5g/L。

公开技术文献《Metabolic Engineering of the Actinomycete Amycolatopsissp.Strain ATCC 39116towards Enhanced Production of Natural Vanillin》(ApplEnviron Microbiol.2016Jun 1；82(11):3410–3419.doi:10.1128/AEM.00802-16)公开了一种拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的基因工程改造菌株。在该技术文献中公开的技术方案中，拟无枝酸菌菌株ATCC 39116的香兰素脱氢酶(Vdh)被敲除以减少香兰素进一步氧化为香草酸及进一步被降解，同时阿魏酰辅酶A合成酶(fcs)和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶(ech).在拟无枝酸菌菌株ATCC39116菌株内完成三项基因的代谢工程改造后的工程菌F84，在2L的发酵体系中并同时采取分批流加阿魏酸的发酵策略，投入的49.5g阿魏酸酸中共转化生成36.8g香兰素，新的重组菌株的香兰素产量达到了19.3g/L(摩尔转化率为94.9％)。同时，加大阿魏酸的补料速率和补料量时(5.5g/h，累积99g/L)，香兰素的的产量可以进一步提高至22.3g/L，但是此条件阿魏酸在未被利用，至发酵结束时培养基中会残留大量的阿魏酸(5-7g/L,该公开技术文献的Fig4)，阿魏酸的摩尔转化率(通过计算为28.7％)和利用率会大幅下降。

对发酵天然香兰素生产来说，高产量和高阿魏酸转化率是两个共同追求的目标，其之间影响天然香兰素的的生产效率与成本水平。因此，寻求开发更高产量及更高阿魏酸转化率水平的生产菌株对于发酵香兰素产业具有重要的经济价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株拟无枝酸菌突变体，使其同时具备阿魏酸高转化率和香兰素高产量两个能力；

本发明的另一个目的在于提供上述拟无枝酸菌突变体在生产香兰素或制备生产香兰素的微生物产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一株拟无枝酸菌突变体，保藏编号为CCTCC NO：M2019756，已于2019年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心；本发明菌株为Amycolatopsis sp.ATCC39116的突变菌株，其由菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116原始菌株通过等离子诱变筛选获得，编号为CFFSH012。

本发明所提供的突变菌株拟无枝酸菌CFFSH012(该菌株的保存号为CCTCC NO：M2019756)相比于原始菌株其对香兰素及阿魏酸的耐受能力更强，同时具有在高产香兰素的同时保持较高的阿魏酸转化与利用能力的特点。

在具体的发酵生产试验中，以原始菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116和突变菌株CFFSH012分别作为发酵菌株，按照相同的发酵培养条件进行生产，结果显示，原始菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116发酵结束时，香兰素产量浓度达到23.3g/L，残留底物阿魏酸2.1g/L，阿魏酸至香兰素的实际摩尔得率为67.1％(如不计入未被参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为70.8％)；突变菌株CFFSH012发酵结束时，发酵液中含有香兰素浓度可达到29.9g/L，残留底物阿魏酸0.60g/L，阿魏酸至香兰素的实际摩尔得率为88.3％(如不计入未被参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为89％)。发酵试验结果表明，本发明提供突变菌株CFFSH012不仅能够提高香兰素产量至30g/L左右的高水平，而且还保持了阿魏酸仅85-90％的高转化率。

基于上述优异的技术效果，本发明提出了所述突变菌株拟无枝酸菌CFFSH012(该菌株的保存号为CCTCC NO：M2019756)在发酵生产香兰素中的应用，以及在制备用于发酵生产香兰素的微生物产品中的应用。

依据上述应用，本发明对应提供了一种发酵生产香兰素的方法，以阿魏酸为发酵底物，采用保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体进行发酵。

作为优选，所述方法为保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体活化后，用种子培养基制备种子液，然后接种至发酵培养基中发酵，发酵过程中补加碳源、氮源和阿魏酸。其中，种子液中的OD₆₁₀值为6～7；接种量可视发酵需求进行调整，在本发明中种子液接种量为6％。

作为优选，所述活化用琼脂平板培养基进行；在本发明具体实施方式，所述琼脂平板培养基组成为葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2。

作为优选，所述种子培养基为每300mL中，含葡萄糖1.5g，酵母浸粉3g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.3g，七水硫酸镁0.06g，余量水，pH7.2。

作为优选，所述发酵培养基为葡萄糖32g/L，酵母膏15g/L，硫酸镁0.8g/L，pH值7.2。

作为优选，所述发酵的初始条件为：

温度：45℃；通气比：1vvm；流加氢氧化钠控制pH值：7.2；菌体生长阶段溶氧35％～50％，罐压：0.05Mpa；搅拌转速：溶氧联动调节，同时设定转速上下限为200～800rpm。

作为优选，所述发酵过程中补加碳源、氮源和阿魏酸具体为：

当发酵液浊度的OD₆₁₀达到20±3时(接种后约15h)，开始补加碳源、氮源；发酵液浊度OD₆₁₀的测试方式是以水作为参照，以水稀释发酵液至适当浓度(分光光度读数在其0.6-1.6范围内为适当)，利用分光光度计在610nm下测试稀释发酵液的吸光率值。

作为优选，所述发酵过程中补加碳源或氮源的补加速率以初始发酵液的装液量计，每1L发酵液每分钟补料的碳源或氮源的量为0.2-0.4g；过程中若产大量泡沫则手动补入消泡剂(GP330 30％)以防止大量泡沫堆积，补加少量消泡剂，若过程中无大量泡沫则不加；

作为优选，所述发酵过程中补加阿魏酸的具体时机为发酵罐内的发酵液浊度OD₆₁₀达到40±5时时被投入罐内。当发酵罐内的发酵液的OD₆₁₀达到40±5时，调节发酵罐溶氧上下限为40％～70％，调节罐内pH至8.2，温度37℃；之后投入阿魏酸水溶液开始进行阿魏酸的转化，阿魏酸水溶液是以阿魏酸及溶解于添加有NaOH的水溶液中，配置为125g/L，以NaOH调节溶液pH为pH8.2。

作为更进一步的选择，投入阿魏酸水溶液分为两步进行，其有助于提升香兰素的产量，第一次投料时机为发酵液浊度达到40±5时，第二次投料时机为阿魏酸消耗至低于2.5g/L；

作为进一步的优选方案，阿魏酸第一次与第二次的投料比例为3:1至2:1，更优选的是2.5:1。阿魏酸的总投料量以初始发酵液装液量计，每1L发酵液投入阿魏酸为60-80g，作为优选的投入为70g。

由以上技术方案可知，本发明提供了一株由Amycolatopsis sp.ATCC39116通过等离子诱变筛选获得的拟无枝酸菌突变体CFFSH012，其在具备较高的阿魏酸转化率时，也同时具备提高香兰素产量的能力，可同时满足生产效率与成本水平的需求，可为发酵香兰素产业提供重要的经济价值。

生物材料保藏信息说明

拟无枝酸菌CFFSH012，分类命名为拟无枝酸菌CFFSH012 Amycolatopsissp.CFFSH012，已于2019年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，CCTCC NO：M2019756。

附图说明

图1所示为以10-2000mg/L香兰素溶液荧光衍生化检测结果；其中第1列A-H行的对应孔依次为10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L香兰素溶液；

图2所示为96孔培养板培养液荧光衍生化检测结果；其中，A-H字母表示96孔板A-H行，1-12数字表示96孔板1至12列；

图3所示为原始菌株10L发酵罐发酵过程曲线；

图4所示为本发明突变菌株10L发酵罐发酵过程曲线。

具体实施方式

本发明公开了一株拟无枝酸菌突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述拟无枝酸菌突变体及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的拟无枝酸菌突变体及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施例中，对比试验中除应有的技术区别外，其余所用原料、试剂、方法等试验条件保持一致；

此外，本发明中所涉及的摩尔得率和摩尔转化率参照如下计算公式：

摩尔得率(moL/moL)＝发酵终点时香兰素物质的量÷添加的阿魏酸物质的量总量

摩尔转化率(moL/moL)＝发酵终点时香兰素物质的量÷(添加的阿魏酸物质的量总量-发酵结束时培养基内残余的阿魏酸的物质的量)

以下就本发明所提供的一株拟无枝酸菌突变体及其应用做进一步说明。

实施例1菌株的诱变与筛选

菌株的诱变以Amycolatopsis sp.ATCC39116的为出发菌株，经由等离子诱变筛选获得。其诱变筛选过程简如下：

1.将出发菌株涂布于试管内的琼脂斜面(葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2；)上于37℃培养箱内培养36h至斜面表面布满淡黄色孢子；

2.加入5mL无菌生理盐水反复吹洗斜面表面孢子制备成菌株孢子悬液，以生理盐水稀释调整孢子浓度至3×10⁵至3×10⁶个/mL。取30μL调整后的孢子悬液涂布于ARTP等离子诱变仪的不锈钢载片上，以离子体轰击诱变30秒(采用ARTP诱变育种仪，无锡源清天木生物科技有限公司，ARTP-M型)；

3.将等离子体处理后的载片，投入装有500μL去生理盐水的EP离心管，以漩涡振荡器震荡混匀以重悬孢子；100μL重悬后的孢子悬液涂布于具有一定底物浓度(5-15g/L，阿魏酸浓度随着诱变轮次的增加渐次提高)的耐受琼脂平板上(葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉20g/L，5-15g/L阿魏酸，pH8.2；)于37℃培养36h；

4.选取琼脂平板上形成的单菌落挑取至96或48孔深孔板中培养24h(每孔装有1mL培养液)，之后加入阿魏酸溶液100μL(pH8.5 100g/L)继续培养24h；取深孔板内发酵液100uL至无荧光96微孔板，分别加入芳香醛的荧光衍生化试剂50μL衍生反应；将衍生化后的将96微孔板置于荧光酶标仪(SpectraMax i3x，Molecular Devices)检测其孔荧光强度。(图1为以浓度为10-2000mg/L香兰素溶液与50μl芳香醛的荧光衍生化试剂衍生化反应后的荧光强度检测图。图2为其中一组96深孔板中取得发酵液荧光衍生化后的的荧光强度检测结果。由图1可知荧光强度较高的孔意味着产生了更多的芳香醛(香兰素)，因此通过该方法可以快速识别和筛选到高产香兰素的突变菌株；

5.每次均挑取荧光强度最高的3个微孔板孔(图2，黑色箭头标出)所对应的深孔板孔内的菌做进一步摇瓶水平及发酵罐复筛，以其中最高产的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复1-5步骤往复多轮诱变筛选直只到找到高产的菌株。

实施例2：10L发酵罐体系发酵生产香兰素的培养过程

1、本实施例中所采用的培养基的组成如下：

(1)琼脂平板培养基

葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉20g/L，pH7.2；

(2)摇瓶种子培养基

体积：300mL，葡萄糖1.5g，酵母浸粉3g，磷酸氢二钠1.2g，磷酸二氢钾0.3g，七水硫酸镁0.06g，水300mL，pH7.2；

(3)发酵培养基

装液体积5L，葡萄糖32g/L，酵母膏15g/L，硫酸镁0.8g/L，pH值7.2；

(4)补料培养基：

葡萄糖100g，加水500mL作为碳源补料；酵母膏100g，加水500mL作为氮源补料培养基；氢氧化钠60g溶于500mL水用于调节控制过程pH。

2、种子液的准备流程及接种

取出-80℃冰箱保藏的菌种甘油管，取适量涂布在琼脂平板上，37℃恒温培养箱培养24h左右。

挑取琼脂平板长出的菌落2～3环接种于摇瓶种子培养基，220rpm、37℃摇床培养16～18h左右，OD610值为6～7。

将摇瓶种子培养基以6％的接种量，在火焰接种的条件下，倒入发酵罐，开始发酵。

3、发酵的过程控制：

(1)发酵罐初始参数设置温度：45℃；通气比：1vvm；流加氢氧化钠(浓度35％w/v)控制pH值：7.2；菌体生长阶段溶氧35％～50％，罐压：0.05MPa，搅拌转速：溶氧联动调节，同时设定转速上下限为200～800rpm；

(2)发酵罐内的发酵液的OD₆₁₀达到20(接种后约15h)时，开始补加碳源、氮源，补加速率均为1mL/min(即0.2g每分钟每升发酵液)，1h后补料速度改为1.5mL/min(即0.3g每分钟每升发酵液)，过程中若产大量泡沫则手动补入消泡剂(GP330 30％)以防止大量泡沫堆积，补加少量消泡剂，若过程中无大量泡沫则不加；

(3)发酵罐内的发酵液的OD₆₁₀达到40时(接种后约20h)时，调节溶氧上下限为40％～70％，调节罐内pH至8.2。之后投入阿魏酸水溶液2.0L(125g/L，以NaOH调节pH至8.2)，开始进行阿魏酸的转化。第一次投料后至监测到阿魏酸浓度低于2.5g/L时，投入第二批次阿魏酸水溶液0.8L(125g/L，以NaOH调节pH至8.2)，第一次与第二次投料比例为2.5:1。

(4)发酵至37h时，结束发酵，放罐做后续分离、分析处理。

(5)发酵过程中香兰素、香草酸、阿魏酸等各组分的含量，取样后由高效液相色谱分析处理测定。

实施例3：原始菌株与突变株的发酵对比

以原始菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116和突变菌株CFFSH012分别作为发酵菌株，按照实施例1所述的发酵培养条件，在10L发酵体系内的发酵情况。发酵过程中pH、温度的调整控制如图3和图4所示，溶氧转速监控由发酵罐所连接电极与计算机自动监测，葡萄糖含量及香兰素、香草酸、阿魏酸等各代谢产物的含量有取样后，利用高效液相色谱离线测定。

图3为原始菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116的典型发酵过程曲线，由该图可知。发酵结束时，香兰素产量浓度达到23.3g/L(发酵过程中因水蒸发逃逸、取样罐内料液会有所减少，放料时罐内料液体积(以下简称为放罐体积)测得为7.9L)，同时还含有副产物香草醇3.5g/L和香草酸1.07g/L及残留底物阿魏酸2.1g/L，阿魏酸至香兰素的实际摩尔得率为67.1％(如不计入未被参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为70.8％)。

图4为突变菌株CFFSH012的典型发酵过程曲线。发酵结束时，发酵液中含有香兰素浓度可达到29.9g/L(放罐体积测得为8.1L)，同时还含有香草醇2.4g/L、香草酸1.1g/L及残留底物阿魏酸0.60g/L，阿魏酸至香兰素的实际摩尔得率为88.3％(如不计入未被参与转化的残留阿魏酸，则摩尔转化率为89％)。

为何和现有相关的菌株做直观比对，本发明将各种菌株的转化率和产量汇总如下表1；

表1

由本实施例可知，突变菌株CFFSH012在产量水平及阿魏酸的有效转化水平上均显著高于原始菌株，同时也是目前能够同时将转化率和产量保持较高水准的菌株，在产量方面也是目前所知报道中最高的自然突变菌株。

实施例4：重复性验证及显著性差异分析

按照实施例3所述的步骤及条件，多次重复突变菌株CFFSH012和原始菌株Amycolatopsis sp.ATCC39116的10L水平的发酵测试，发酵结果如表2所示。

对原始菌株ATCC39116和突变菌株CFFSH012的香兰素产量，及实际摩尔得率进行显著性分析。显著性分析采用T-test方式，设置显著性水平α＝0.01，结果如表2中所列。结果表明突变菌株其在产量及转化得率上优于原始菌株的结果差异具有统计上的显著性意义。

表2

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株拟无枝酸菌突变体，保藏编号为CCTCC NO：M2019756。

2.保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体在发酵生产香兰素中的应用。

3.保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体在制备用于发酵生产香兰素中的微生物产品中的应用。

4.一种发酵生产香兰素的方法，其特征在于，以阿魏酸为发酵底物，采用保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体进行发酵。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M2019756的拟无枝酸菌突变体活化后，用种子培养基制备种子液，然后接种至发酵培养基中发酵，发酵过程中补加碳源、氮源和阿魏酸。

6.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述发酵的初始条件为：

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述发酵过程中补加碳源和氮源的时机为当发酵液菌浓度浊度OD₆₁₀达到20±3时。

8.根据权利要求5或7所述方法，其特征在于，所述发酵过程中补加碳源或氮源的流加速率以初始发酵液装液量计，每升发酵液每分钟分别流加0.2至0.4g。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述发酵过程中补加阿魏酸的具体时机为当发酵罐内发酵液浊度OD610达到40±5时。

10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述阿魏酸分两次投入，第一次的投料时机为发酵罐内发酵液浊度OD₆₁₀达到40±5时，第二次投料的时机为发酵罐内阿魏酸浓度消耗至低于2.5g/L时，第一次及第二次阿魏酸投料比例为3:1至2:1。