CN107557397A - 一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2－酮基葡萄糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2－酮基葡萄糖酸的方法，主要特征：在100～300g/L的葡萄糖溶液体系中，以0.2～5g/L氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)全细胞为生物催化剂，在供氧条件下添加2～20g/L过氧化氢，以定向促进细胞对葡萄糖酸的催化氧化2‑酮基葡萄糖酸(2‑KGA)，而对葡萄糖的脱氢催化反应几乎没有影响，从而达到高效合成2‑酮基葡萄糖酸(盐)产品的效果。采用本方法，反应体系的溶氧和pH值控制范围分别不低于1mg/L和3.0，采用的过氧化氢浓度控制在2～20g/L，葡萄糖的利用率达到100％，2‑酮基葡萄糖酸的得率超过74％，产品质量体积浓度可超过8％。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物催化糖合成糖酸的技术领域，特别涉及一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法。
二、背景技术
2-酮基葡萄糖酸(2-KGA)是目前大规模生产的一种有机酸，被广泛应用于合成异抗坏血酸(钠)(EA/EN)；EA作为肉类、水果、饮料等食品中可代谢抗氧化剂可以有效地减少食品的氧化，防止其色、香、味褪变，抑制食品中致癌物质亚硝酸盐的生成，其防腐效果大大超过维生素C，而价格不到维生素C的二分之一，有很好的应用前景。另外，2-KGA还可以用来合成有机糖(酸)及其衍生物，如树胶醛醣、核酮糖、二羟基丙酮、醛基糖酸以及氨基糖等；可以作为显影剂、动物饲料添加剂、除草添加剂。以及建筑水泥行业增塑剂。
目前，利用经定向驯化的氧化葡萄糖酸杆菌株(Gluconobacter oxydans)NL71，在通氧加压全细胞催化反应条件下可以高效、快速催化单一的C6糖类(包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖)、C5糖类(包括木糖、阿拉伯糖)碳骨架上的C1醛基转化成羧酸根生成对应的糖酸(盐)，最高糖酸产品浓度、单位体积生产速率和底物转化率分别达到600g/L、3.72g/(L.h)和99％以上(CN201310167758.X；Zhou Xin，et al，Biochemical Engineering Journal，2015)，达到了很高的生产水平。
目前，2-KGA的合成方法主要有3种：化学合成法、酶法和发酵法，其中以荧光假单胞杆菌发酵法为实际生产中最主要的合成工艺，过程中时空产率高达6.22g/L/h，平均发酵转化率为89％。据报道，氧化葡萄糖酸杆菌具有的膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶(GA-2-DH)可氧化葡萄糖酸(GA)生成2-KGA，故以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans NL71)为催化菌株，探索全细胞催化葡萄糖合成2-KGA的工艺。经实验发现，以葡萄糖为底物时，2KGA的时空产率仅为0.65g/L/h，平均发酵转化率低于46％。因此，以Gluconobacter oxydansNL71为全细胞催化菌株，以葡萄糖为底物时，难以实现高效合成2-KGA的目的。
三、发明内容
发明目的：在含有葡萄糖组分的反应体系中，添加适量的过氧化氢水溶液，利用过氧化氢改善催化体系的供氧水平，并且影响氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖酸的代谢，促进膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶(GA-2-DH)对葡萄糖酸的转化，从而实现含有大量葡萄糖组分的木质纤维素酶水解液高效催化制取2-酮基葡萄糖酸(盐)目的。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法，包括以下步骤：
(1)在含有100g/L％～300g/L葡萄糖糖液或者木质纤维素酶水解液中，接入细胞浓度为0.1g/L～2g/L的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans NL71)细胞作为生物催化剂，控制反应体系的溶氧浓度等于或不低于1mg/L，pH值等于或不低于3.0；
(2)在步骤(1)的基础上，流加30％质量浓度的过氧化氢溶液0.1～1ml至50ml反应体系中。利用过氧化氢作为供氧剂，促进氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖酸的代谢，而对细胞催化葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸的反应影响较小；
(3)采用步骤(1)和(2)使反应体系中的葡萄糖和葡萄糖酸被完全转化，2-酮基葡萄糖酸的得率达到74％，产品葡萄糖酸(盐)浓度可达到80g/L。
所述的所述反应体系中的底物为所有含有葡萄糖的反应底物，包括淀粉水解液，木质纤维素酶水解液等。
所述的外源添加剂为所有含有过氧化氢化合物的溶液。
所述的生物催化剂为氧化葡萄糖酸杆菌或以它为宿主菌的基因重组菌株或其它遗传改良菌株。
有益效果：本发明通过添加一定浓度的过氧化氢溶液，在不影响细胞对葡萄糖催化氧化制取葡萄糖酸前提下，促进氧化葡萄糖酸杆菌细胞葡萄糖酸分解代谢，以提高葡萄糖酸的转化效率，达到细胞高效催化葡萄糖酸至2-酮基葡萄糖酸的效果。与现有的技术相比，能够显著提高细胞催化葡萄糖合成2-酮基葡萄糖酸(盐)的产品得率，为2-KGA的高效生物合成开拓了一条新的潜在生产途径，有效提高整体生产效益。
四、具体实施方式
实施案例1
在250ml三角摇瓶体系中，加入100g/L的葡萄糖。接入氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度1g/L，置于恒温反应器，220rpm，30℃，进行全细胞催化。添加15g/L碳酸钙维持催化体系的pH值在4.5左右。添加2～20g/L左右质量浓度为30％的过氧化氢溶液至反应体系中。反应直至葡萄糖及葡萄糖酸消耗完全时停止反应获得2-酮基葡萄糖酸钙产品液。产品中2-酮基葡萄糖酸的浓度达到80g/L，葡萄糖的利用率达到100％，2-酮基葡萄糖酸的得率超过74％，产品质量体积浓度超过8％。
实施案例2
在3.0L机械通风式反应罐中，加入1.0L未经脱毒的，浓度为85.67g/L的木质纤维酶水解液，通入氧气并密封罐体维护气压在0.01～0.10MPa，接入氧化葡萄糖酸杆菌至细胞浓度1.0g/L进行全细胞催化反应。采用pH电极监测并以30％(w/w)氢氧化钠溶液在线自动流加调节反应体系的pH值4.0～6.0。采用溶氧电极监测并控制反应液中的溶氧浓度不低于1mg/L。添加2～20g/L左右质量浓度为30％的过氧化氢溶液至反应体系中。反应直至葡萄糖和木糖消耗完全时停止反应获得葡萄糖酸钠和木糖酸钠产品液。产品中2-酮基葡萄糖酸的浓度达到75.97g/L，葡萄糖的利用率达到100％，2-酮基葡萄糖酸的得率超过82.3％，单位体积生产率2.53g/L/h。
Claims (4)
1.一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在含有100g/L～300g/L葡萄糖糖液或者木质纤维素酶水解液中，接入细胞浓度为0.2g/L～5g/L的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞作为生物催化剂，控制反应体系的溶氧浓度等于或不低于1mg/L，pH值等于或不低于3.0；
(2)在步骤(1)的基础上，流加30％质量浓度的过氧化氢溶液2～20g/L至50ml反应体系中。利用过氧化氢作为供氧剂，促进氧化葡萄糖酸杆菌对葡萄糖酸的代谢，而对细胞催化葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸的反应影响较小；
(3)采用步骤(1)和(2)使反应体系中的葡萄糖和葡萄糖酸被完全转化，2-酮基葡萄糖酸的得率达到74％，产品葡萄糖酸(盐)质量体积浓度可超过8％。
2.根据权利要求1所述的一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的所述反应体系中的底物为所有含有葡萄糖的反应底物，包括淀粉水解液，木质纤维素酶水解液等。
3.根据权利要求1所述的一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的生物催化剂为氧化葡萄糖酸杆菌或以它为宿主菌的基因重组菌株或其它遗传改良菌株。
4.根据权利要求1所述的一种过氧化氢调控全细胞催化葡萄糖定向合成2-酮基葡萄糖酸的方法，其特征在于：所述的外源添加剂为所有含有过氧化氢化合物的溶液。
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