CN107557396B - 一种两阶段全细胞催化木质纤维水解液联产多种糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两阶段全细胞催化木质纤维水解液联产多种糖酸的方法，主要特征：从山梨醇‑琼脂保藏斜面直接接入一定量氧化葡萄糖酸杆菌细胞于含有50g/L～200g/L葡萄糖糖液或木质纤维素酶水解液中，培养细胞并全细胞催化产葡萄糖酸，控制反应体系的溶氧浓度等于或不低于1mg/L，pH值等于或不低于3.0，直至葡萄糖消耗完全回收全部氧化葡萄糖酸杆菌并接入含有50～200g/L木糖糖液或木质纤维水解液中，利用回收的细胞作为催化菌种，全细胞高效催化产木糖酸。此方法在培养细胞的同时全细胞催化得到高浓度的葡萄糖酸，回收的细胞能够克服抑制物的致死毒性得到高浓度的木糖酸，最终，葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)的得率分别为91.77％，87.07％，浓度分别可达到103.965g/L，88.66g/L。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物催化糖合成糖酸的技术领域，特别涉及一种两阶段全细胞催化木质纤维水解液联产多种糖酸的方法。
二、背景技术
葡萄糖酸和木糖酸作为多羟基有机酸类生物基化学品广泛应用于食品、医药、饲料养殖、化工和环保等多种行业。糖酸的制备生产方法主要包括化学法及生物法，其中化学法一般需要采用无机催化剂、反应条件较苛刻、存在副产物和环境污染较大，相比而言生物法工艺条件温和，生产过程绿色环保，具有更加广阔的应用前景。
包括氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans在内的多种微生物细胞都具有高效、快速催化糖类生成糖酸的能力。其中，该菌株催化葡萄糖产葡萄糖酸的浓度可达到132.46g/L(Zhang Hongsen et al.，Bioresource Technology，2016)。采用通氧加压全细胞催化工艺，可以生成600g/L木糖酸(CN201310167758.X；Zhou Xin et al.，BiochemicalEngineering Journal，2015)。葡萄糖酸杆菌成为细胞催化制取糖酸的最适菌株。
包括农林废弃物在内的木质纤维原料，经过稀酸水解和纤维素酶水解可以得到富含葡萄糖、木糖等多种糖组分的水解液，可替代粮食淀粉原料用于糖酸生物制备。但是，在多种糖组分共存的反应体系中，氧化葡萄糖酸杆菌优先催化葡萄糖生成葡萄糖酸，包括木糖在内的其它糖类催化均会受到葡萄糖不同程度抑制而产生延滞效应，同时所生成的葡萄糖酸会迅速转化成成酮基葡萄糖酸等副产物(Zhou Xin，et al，Bioresources，2015；ZhouXL，et al，Bioresource Technology，2017)。与此同时，在木质纤维原料稀酸预处理过程中所生成的复杂降解产物对微生物的生长及糖酸催化会产生严重的抑制效应甚至致死毒性，上述障碍最终造成葡萄糖酸产品得率的严重损失和其它糖酸的生产效益下降。
三、发明内容
发明目的：利用富含葡萄糖组分的反应体系培养得到一定质量浓度的氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NL71细胞，同时，在菌种培养过程中全细胞催化产葡萄糖酸，经离心收集接种于富含木糖的反应体系中全细胞催化产木糖酸，从而实现低成本全细胞高效催化木质纤维水解液产多种糖酸(盐)的目的。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种两阶段全细胞催化木质纤维水解液联产多种糖酸的方法，包括以下步骤：
(1)从山梨醇-琼脂保藏斜面直接接入一定量氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans NL71)细胞于含有50g/L～200g/L葡萄糖糖液或者木质纤维素酶水解液中，培养细胞并全细胞催化产葡萄糖酸，控制反应体系的溶氧浓度等于或不低于1mg/L，pH值等于或不低于3.0；
(2)在步骤(1)的基础上，回收全部氧化葡萄糖酸杆菌并接入含有50～200g/L木糖糖液或者木质纤维水解液中，利用回收的细胞作为催化菌种，全细胞高效催化产木糖酸；
(3)采用步骤(1)得到一定质量浓度的细胞的同时全细胞催化得到高浓度的葡萄糖酸，采用步骤(2)能够得到高浓度的木糖酸，其中，葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)的得率分别为91.77％，87.07％，产品葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)浓度可达到103.965g/L，88.66g/L。
所述的反应体系中的底物为所有含有葡萄糖及木糖或任意组合型的反应底物。
所述的两阶段全细胞催化为生物催化剂的两个生长阶段，包括对数生长期及稳定期。
所述的生物催化剂为所述微生物菌株为氧化葡萄酸杆菌Gluconobacter Oxydans及任何以它为宿主菌的基因重组菌株或者遗传改良菌株。
有益效果：本发明利用富含葡萄糖的反应体系培养氧化葡萄糖酸杆菌细胞的同时全细胞催化产葡萄糖酸，经离心收集细胞后接入富含木糖的反应体系中全细胞催化产木糖酸。培养细胞的同时高效全细胞催化产葡萄糖酸，不仅降低了细胞培养成本并且经过培养得到的细胞克服了水解液中降解产物的抑制作用与致死毒性，缩短了全细胞催化的周期，提高了全细胞催化的效率，分别实现了木质纤维组分的高值化利用。为木质纤维原料高值化利用及氧化葡萄糖酸杆菌的工业应用开拓了一种新方法，有效提高了整体生产效益。
四、附图说明
图1是以玉米秸秆为原料，经过稀酸预处理，酶解过程，采用两阶段全细胞催化方法联产葡萄糖酸及木糖酸的技术路线图。
五、具体实施方式
实施案例1
在250ml三角摇瓶体系中，加入50ml含有100g/L葡萄糖。直接从山梨醇-琼脂保藏斜面中接入一定量氧化葡萄糖酸杆菌，添加20g/L碳酸钙维持催化体系的pH值在4.0左右。置于恒温反应器，220rpm，30℃，全细胞催化直至葡萄糖转化完全，收集全部细胞于含有木糖100g/L的反应体系中，反应直至木糖消耗完全时停止反应获得木糖酸(盐)产品液。产品中葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)的浓度分别达到103.66g/L，102.22g/L，葡萄糖及木糖的利用率达到100％，葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)的得率分别达到超过95.16％，92.36％。
实施案例2
在3.0L机械通风式反应罐中，加入1.0L含有浓度为103.995g/L葡萄糖的木质纤维酶水解液，通入氧气并密封罐体维护气压在0.01～0.10MPa，直接从山梨醇-琼脂斜面培养基中接入一定量氧化葡萄糖酸杆菌进行全细胞催化反应。反应直至葡萄糖消耗完全，收集全部细胞于含有92.005g/L的木质纤维水解液中全细胞催化产木糖酸。反应直至木糖消耗完全时停止反应获得葡萄糖酸钠和木糖酸钠产品液。采用pH电极监测并以30％(w/w)氢氧化钠溶液在线自动流加调节反应体系的pH值4.0～6.0。采用溶氧电极监测并控制反应液中的溶氧浓度不低于1mg/L。其中，葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)的得率分别为91.77％，87.07％，产品葡萄糖酸(盐)及木糖酸(盐)浓度可达到103.965g/L，88.66g/L。单位体积生产率分别达到8.66g/L/h，3.69g/L/h。
Claims (1)
1.一种两阶段全细胞催化木质纤维水解液联产多种糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从山梨醇-琼脂保藏斜面直接接入一定量氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NL71细胞于含有50g/L~200g/L葡萄糖糖液或者木质纤维素酶水解液中，培养细胞并全细胞催化产葡萄糖酸，控制反应体系的溶氧浓度不低于1mg/L，pH值不低于3.0；
（2）在步骤（1）的基础上，回收全部氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans NL71并接入含有50~200g/L木糖糖液或者木质纤维水解液中，利用回收的细胞作为催化菌种，全细胞高效催化产木糖酸；
（3）采用步骤（1）得到一定质量浓度的细胞的同时全细胞催化得到高浓度的葡萄糖酸，采用步骤（2）能够得到高浓度的木糖酸，其中，葡萄糖酸和/或葡萄糖酸盐及木糖酸和/或葡萄糖酸盐的得率分别为91.77%，87.07%，产品葡萄糖酸和/或葡萄糖酸盐及木糖酸和/或葡萄糖酸盐浓度可达到103.965g/L，88.66g/L。
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