CN114540436A - 一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法，所述方法包括：当前批次发酵结束后，将发酵液进行浓缩，浓缩后的发酵液接种至下一批次发酵培养基中继续进行发酵，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液。本发明提供的方法可以将发酵液中的菌体回收，再次用于葡萄糖酸钠的发酵，本发明提供的方法减少了菌种培养工序，并且极大程度的降低了废弃菌种排放量，缩短了发酵周期，减少了能源消耗。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
背景技术
葡萄糖酸钠是一种多羟基羧酸钠，又名：五羟基已酸钠，分子式为C6H11O7Na，分子量为218.14，是一种白色或淡黄色结晶粉末，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。葡萄糖酸钠是一种应用极为广泛的多羟基有机酸盐，在食品、医药、轻工、化工等行业具有广泛的应用：在食品行业可用作营养增补剂、食品保鲜剂、品质改良剂、缓冲剂和低盐(无盐)食品；在医药行业可用作酸碱平衡剂；葡萄糖酸钠具有良好的螯合性和缓蚀阻垢作用，被广泛应用于表面清洗剂和水质稳定剂；葡萄糖酸钠能增加混凝土的可塑性、强度和耐久性，作为减水剂、缓凝剂广泛应用于建筑行业；另外葡萄糖酸钠也是制备葡萄糖酸内酯、葡萄糖酸盐(锌、铜、亚铁盐)等的基础原料。
葡萄糖酸钠的生产方法主要有催化氧化法和微生物发酵法。催化氧化法是以葡萄糖为原料，以贵金属作为催化剂(如：Pd-C、Pt-C、Pd-AL2O3等)，催化氧化葡萄糖产生葡萄糖酸，加入NaOH中和生成葡萄糖酸钠，存在生产成本高、反应条件苛刻、具有副反应、环境污染等缺点；微生物发酵法生产葡萄糖酸钠是以糖质为原料，经微生物转化生成葡萄糖酸，发酵过程中流加NaOH溶液中和得到葡萄糖酸钠，该方法具有条件温和、工艺路线简洁环保、产品成本低等优势，是目前葡萄糖酸钠的主要生产方法。
发酵法生产葡萄糖酸钠的原理是在微生物体内葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的催化作用下，葡萄糖经一步反应转化生成葡萄糖酸，发酵速度快、周期较短，一般为28-32小时。在工业化生产过程中发酵法生产葡萄糖酸钠普遍采用的是三级批次发酵技术：首先是在一级种子罐内将生产菌种黑曲霉孢子培养成为成熟的菌丝体(培养18-22小时)，作为一级种子液，再将成熟的一级种子液转入二级种子罐进行二次扩大培养(8-12小时)，成熟后的二级种子液接入发酵罐进行三级发酵，每级接种量均为10-20％，发酵结束后发酵液经板框过滤除菌浓缩、结晶获得葡萄糖酸钠产品。因此在实际生产过程中，种子液的扩大培养占据了大量生产时间和工作量，每生产一批需要进行一批两级菌种扩培(需要培养种子液约0.6m3/吨产品)，同时发酵结束后产生一批菌丝体固体废弃物(约100kg/吨产品)，存在着菌种培养工作量大、灭菌蒸汽消耗量大、生产效率低、固体废渣排量大等不足，另外，废弃菌丝体含水量50-60％、粗蛋白含量10-20％，易腐败变质、污染环境，给生产带来染菌隐患，其存放和有效处理是一个难点。
随着葡萄糖酸钠发酵生产的发展，如何解决以上问题已成为生产企业节能减排、降低生产成本、提高市场竞争力的瓶颈问题。近年来有关发酵法生产葡萄糖酸钠的研究主要集中于高产菌株选育、发酵条件优化和废弃菌体资源化利用方面，针对葡萄糖酸钠发酵生产工艺改进的研究较少，目前有报道利用利用种子培养液或者发酵前期的发酵液作为种子液介入发酵罐中实现半连续发酵，可以降低种子罐灭菌次数，但是此种方法并不能消减种子液培养环节和减少菌体生长所需能源消耗、菌体废弃物的排放量。
因此，希望提供一种既可以缩短发酵周期，又可以降低能源消耗，减少废弃菌体排放量的制备葡萄糖酸钠的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法，本发明提供的方法可以将发酵液中的菌体回收，再次用于葡萄糖酸钠的发酵，本发明提供的方法减少了菌种培养工序，并且极大程度的降低了废弃菌种排放量，缩短了发酵周期，减少了能源消耗。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法，所述方法包括：
当前批次发酵结束后，将发酵液进行浓缩，浓缩后的发酵液接种至下一批次发酵培养基中继续进行发酵，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液。
本发明将发酵结束后仍具有较高发酵活力的菌体接种至其他发酵罐中继续进行发酵，可以减少菌体培养的环节，同时可以减少废弃菌体的排放量，并且此种方法还可以缩短发酵周期，显著降低种子液制备和菌体生长所需要的能源消耗。
作为本发明的一种优选技术方案，所述方法包括：将种子培养液接入发酵培养基进行发酵培养，当前批次发酵完成后，将发酵液进行浓缩，浓缩后的发酵液接种至后续的发酵装置中继续进行发酵，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液。
为了使接种后的发酵罐能够具有较高的活性继续进行发酵，本发明以浓缩后的发酵液体积为100％计，所述接种的接种量为40-60％，例如42％、44％、45％、48％、50％、52％、53％、55％、58％等。若接种量过低，则菌种的活性不够，影响发酵时间，导致发酵时间稍长，若接种量较高，则菌体生长过快，影响产量及转化率。
作为本发明的一种优选技术方案，所述浓缩采用过滤浓缩法，具体是将发酵液通过含有细微孔的过滤装置以实现浓缩的目的，过滤得到的清液进入后续提取工序。
作为本发明的一种优选技术方案，所述过滤采用的过滤装置的孔径为100-200nm，例如120nm、150nm、160nm、180nm等。本发明对过滤装置的孔径进行了优选，若孔径过低，则会导致过滤过程菌体产热过大、菌体死亡较多；若孔径过大，则可能会导致过滤不完全。
作为本发明的一种优选技术方案，所述过滤装置为板框、陶瓷膜或离心机，优选陶瓷膜。本发明优选利用陶瓷膜代替目前常规的板框过滤，可以降低板框过滤的负荷，降低能源消耗。
作为本发明的一种优选技术方案，所述浓缩为浓缩发酵液至原体积的10-20％，例如12％、15％、18％等。
本发明通过先将完成的发酵液进行浓缩，然后再把浓缩后的发酵液按特定的接种量接种至新的发酵罐，通过浓缩量以及接种量的配合，可以增加发酵产量、提高转化率、缩短发酵周期。在浓缩过程中，若过滤浓缩后的体积较多，则可能导致对发酵液稀释过大，导致发酵液培养基各含量较低，不利于发酵产酸；若过滤浓缩后的体积较小，则可能导致浓缩液温度过高，菌体死亡较多。
本发明所述发酵使用的菌种为黑曲霉菌。
本发明所述过滤浓缩(即菌体回收)在密闭、无菌条件下完成。
本发明所述方法还包括活化菌种，以及，制备种子培养液。
作为本发明的一种优选技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)活化菌种；
(2)制备种子培养液；以及
(3)将种子培养液接入发酵培养基进行连续发酵培养，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液；
在连续发酵培养中，当前批次发酵完成后，利用孔径为100-200nm的陶瓷膜进行过滤浓缩，剩余发酵液体积为总发酵液体积10-20％时停止，将剩余发酵液按接种量为40-60％接种至后续的发酵装置中继续进行发酵。
本发明进行一次连续发酵仅需制备一次种子培养液即可，可以得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液，减少了菌种培养工序，且大大降低了废弃菌体排放量，缩短了发酵周期。
本发明在所述发酵过程中，控制发酵液的溶氧量为20-30％，例如25％等。所述发酵的温度为37.0-37.5℃，例如37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃等。
本发明在发酵培养过程中使用的发酵培养基为本领域常规的发酵培养基，示例性的进行如下列举：
所述发酵使用的发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖270-300g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将发酵结束后仍具有较高发酵活力的菌体接种至其他发酵罐中继续进行发酵，可以减少菌体培养的环节，同时可以减少废弃菌体的排放量，并且此种方法还可以缩短发酵周期，显著降低种子液制备和菌体生长所需要的能源消耗；
(2)利用本发明提供的方法可以缩短发酵周期3-8h，每吨产品的种子液培养量从0.6m3下降至0.15m3，每吨产品的废弃菌种排放量由100kg下降至50kg。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖280g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将2g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有2L种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取10％上述培养液转入装有20L种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将20％种子培养液接种至装有110L发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.2℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期28h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液160L；
(3)采用孔径为200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为16L时，停止过滤，将6.4L浓缩后的发酵液泵送至另一装有125L发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的9.6L发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计7批次，发酵周期分别为22.5h、22h、23h、25h、26.5h、27h、28.5h。
实施例2-3
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
与实施例1的区别在于，在本实施例中，步骤(3)中接种量为5.6L(35％，实施例2)、10.4L(65％，实施例3)。
实施例4
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
与实施例1的区别在于，在本实施例中，步骤(3)采用的过滤装置为离心机。
实施例5
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将2g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有2L种子培养基的一级种子罐中，36.6℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取20％上述培养液转入装有10L种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将10％种子培养液接种至装有120L发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.3℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期27h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液160L；
(3)采用孔径为100nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为32L时，停止过滤，将19.2L浓缩后的发酵液泵送至另一装有110L发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的12.8L发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计8批次，发酵周期分别为22.5h、21.5h、24h、24.5h、24h、25.5h、26h、27h。
实施例6
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将3g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有3L种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度10-15％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取15％上述培养液转入装有20L种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有150L发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.3℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-25％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期27h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液188L；
(3)采用孔径为150nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为28L时，停止过滤，将14L浓缩后的发酵液泵送至另一装有160L发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的14L发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过15％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计7批次，发酵周期分别为24h、23h、24h、25h、25.5h、27h、30h。
实施例7
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.1g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖270g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.1g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将2.5g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有3L种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度15-20％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.05MPa进行培养10h，取20％上述培养液转入装有15L种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有120L发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.5℃，发酵罐压力为0.05MPa，控制溶解氧浓度为20-25％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期28.5h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液168L；
(3)采用孔径为100nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为33L时，停止过滤，将19.8L浓缩后的发酵液泵送至另一装有120L发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的13.2L发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计8批次，发酵周期分别为21h、23h、21h、22h、23h、21.5h、24h、26h。
实施例8
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖180g/L，硫酸铵0.6g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸铵0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.6g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硝酸铵0.1g/L，硫酸镁0.3g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将3g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有3L种子培养基的一级种子罐中，36.6℃，控制溶解氧浓度20％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.15MPa进行培养10h，取20％上述培养液转入装有15L种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有120L发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.0℃，发酵罐压力为0.15MPa，控制溶解氧浓度为30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期26h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液168L；
(3)采用孔径为100nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为33L时，停止过滤，将19.8L浓缩后的发酵液泵送至另一装有120L发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的13.2L发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计8批次，发酵周期分别为20h、22h、23h、21h、24h、25.5h、25h、27h。
实施例9
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖165g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖285g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硝酸铵0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将55g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有0.6m3种子培养基的一级种子罐中，36.8℃，控制溶解氧浓度10-15％，pH为6.5，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取20％上述培养液转入装有3m3种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有20m3发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.5℃，发酵罐压力为0.08MPa，控制溶解氧浓度为20-25％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.7，发酵周期27h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液30m3；
(3)采用孔径为100nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为6m3时，停止过滤，将3.6m3浓缩后的发酵液泵送至另一装有20m3发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的2.4m3发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计6批次，发酵周期分别为20h、21.5h、24h、24.5h、24h、26h。
实施例10
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖150g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖270g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将50g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有0.4m3种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.0-6.5，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取10％上述培养液转入装有4.0m3种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将20％种子培养液接种至装有20m3发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.3℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.5-6.0，发酵周期26.5h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液30m3；
(3)采用孔径为200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为3m3时，停止过滤，将1.5m3浓缩后的发酵液泵送至另一装有23m3发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的1.5m3发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计7批次，发酵周期分别为21h、22.5h、23h、22h、24h、25h、27h。
实施例11
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖180g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖300g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将580g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有4m3种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.3，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取13％上述培养液转入装有30m3种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有220m3发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.3℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.7，发酵周期28h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液315m3；
(3)采用孔径为100nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为31.5m3时，停止过滤，将14.5m3浓缩后的发酵液泵送至另一装有240m3发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的17m3发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计7批次，发酵周期分别为23h、22h、23h、25h、26.5h、26h、28h。
实施例12
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖165g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖285g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将570g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有3.0m3种子培养基的一级种子罐中，36.8℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.3，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取10％上述培养液转入装有30m3种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有220m3发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.2℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.7，发酵周期27h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液315m3；
(3)采用孔径为200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为31.5m3时，停止过滤，将12.5m3浓缩后的发酵液泵送至另一装有240m3发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的19m3发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计7批次，发酵周期分别为22.5h、22h、23h、26.5h、25h、27h、28.5h。
实施例13
本实施例提供了一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
本实施例使用的培养基组成如下：
种子培养基：葡萄糖155g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
发酵培养基：葡萄糖275g/L，硫酸铵0.4g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，硝酸铵0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，灭菌。
制备方法如下：
(1)制备种子培养液：将650g黑曲霉麸曲孢子菌种接入装有5.0m3种子培养基的一级种子罐中，36.5℃，控制溶解氧浓度10-20％，pH为6.2，种子罐压力为0.1MPa进行培养10h，取17％上述培养液转入装有30m3种子培养基的二级种子罐进行二级扩大培养，培养条件不变，得到种子培养液；
(2)将15％种子培养液接种至装有220m3发酵培养基的发酵罐内进行发酵，37.2℃，发酵罐压力为0.1MPa，控制溶解氧浓度为20-30％，在发酵过程中流加30％氢氧化钠溶液控制pH值为5.7，发酵周期23h，得到含有葡萄糖酸钠的发酵液312m3；
(3)采用孔径为200nm的陶瓷膜对发酵液进行过滤浓缩，过滤得到的清液进入提取工艺，当发酵液体积为40m3时，停止过滤，将20m3浓缩后的发酵液泵送至另一装有230m3发酵培养基的发酵罐中继续进行发酵，同时加入L-半胱氨酸和硫酸锌，使发酵培养基中L-半胱氨酸和硫酸锌的浓度分别为0.02g/L和0.2g/L，发酵条件不变，菌体回收利用过程在密闭、无菌条件下进行，剩余的2.4m3发酵液经板框过滤除菌后进入提取工序；
(4)利用步骤(3)的方法重复发酵至发酵速率明显下降(超过10％)结束发酵，最后一批次的菌体浓缩液全部经过板框过滤除菌后进入提取工序，共计9批次，发酵周期分别为18h、20h、19h、21h、22h、21h、20.5h、22h、23.5h。
对比例1
本对比例提供了一种发酵制备葡萄糖酸钠的方法。
与实施例1的区别在于，本对比例不进行连续发酵，进行单批次发酵，即发酵完成后利用板框过滤除菌后，清液进入提取工序。
统计实施例1-13和对比例1的产物以及菌丝体固体废弃物，计算每吨产物需要的种子培养液的量、废弃菌体排放量，以及计算平均发酵周期，结果见表1：
表1
由表1可知，本发明提供的连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法可以减少菌体培养环节，缩短发酵周期3-8h，并且可以减少菌种培养量以及废弃菌种排放量，每吨产品的种子液培养量从0.6m3下降至0.15m3，每吨产品的废弃菌种排放量由100kg下降至50kg，有效的减少了灭菌蒸汽消耗、菌体生长原料消耗和废弃菌体排放量，显著提高了设备利用率和生产效率，降低了生产成本。
并且，本发明采用陶瓷膜过滤代替了传统工艺的板框过滤除菌，可以减少板框过滤除菌负荷70-80％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种连续发酵制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，所述方法包括：
当前批次发酵结束后，将发酵液进行浓缩，浓缩后的发酵液接种至下一批次发酵培养基中继续进行发酵，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将种子培养液接入发酵培养基进行发酵培养，当前批次发酵完成后，将发酵液进行浓缩，浓缩后的发酵液接种至后续的发酵装置中继续进行发酵，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以浓缩后的发酵液体积为100％计，所述接种的接种量为40-60％。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其特征在于，所述浓缩采用过滤浓缩法，优选采用孔径为100-200nm的过滤装置进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过滤装置为板框、陶瓷膜或离心机，优选陶瓷膜。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其特征在于，所述浓缩为浓缩发酵液至原体积的10-20％。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的菌种为黑曲霉菌。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括活化菌种，以及制备种子培养液；
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)活化菌种；
(2)制备种子培养液；以及
(3)将种子培养液接入发酵培养基进行连续发酵培养，得到多批次含有葡萄糖酸钠的发酵液；
在连续发酵培养中，当前批次发酵完成后，利用孔径为100-200nm的陶瓷膜进行过滤浓缩，剩余发酵液体积为总发酵液体积10-20％时停止，将剩余发酵液按接种量为40-60％接种至后续的发酵装置中继续进行发酵。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述方法，其特征在于，在所述发酵过程中，控制发酵液的溶氧量为20-30％；
和/或，所述发酵的温度为37.0-37.5℃。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖270-300g/L，硫酸铵0.2-0.6g/L，磷酸氢二钾0.1-0.5g/L，硝酸铵0.1-0.3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L。
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