CN105624209A - 一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，包括：（1）对木质纤维素原料进行预处理，获得预处理原料；（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为5wt%-15wt%；（3）酶解后的料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。本发明在酶解体系中加入木糖醇，提高了纤维素酶的耐受高温的能力，在高温条件下酶解纤维素酶的活性高，降低了纤维素酶的使用量，提高了木质纤维素的酶解效率，提高了经济性。

Description

一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法
技术领域
本发明属于生物质能源领域，具体涉及一种木质纤维素高温酶解与发酵产丁醇的方法。
背景技术
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且由于比乙醇多两个亚甲基，丁醇具有更高的疏水性，较低的挥发性，可与汽油以任意比例混合，并具有与汽油相当的热值。作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。
随着石油资源的日益枯竭，降低矿物能源的使用比重，加强可再生能源开发已成为人类今后能源利用的重要趋势。而且采用以石油为原料的丙烯羰基合成法生产丁醇由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。
由于我国人口众多，用传统的原料（玉米和甘蔗）发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素和半纤维素，例如玉米秸秆干物质中纤维素占34-42%，半纤维素占22-28%（岳国君，纤维素丁醇工程概论[M].北京：化学工业出版社，2014）。纤维素的水解产物为葡萄糖，而半纤维素的水解产物主要为木糖，还有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木质纤维素原料水解产生的混合糖中，半纤维素糖（主要为木糖）占30%-40%，因此半纤维素糖的发酵显得至关重要。我国政府十分重视能源多元化和环境污染问题，采取财政补贴和税收减免等鼓励措施，大力推进多元化替代石油能源的技术和产业开发。《可再生能源法》和《国家中长期科学和技术发展规划纲要》的出台，极大地推进了生物柴油和燃料丁醇等生物液体燃料的开发进程。我国规划到2020年，生物燃料消费量占到全部交通燃料的15%左右，建立起具有国际竞争力的生物燃料产业，这给我国燃料丁醇产业带来了良好的发展机遇。
纤维素水解过程中纤维素酶的成本和丁醇分离能耗等一直是纤维丁醇工业化的制约因素。中国专利CN200910098877.8公开了一种纤维素酶产生菌及其制备和应用，该菌株具有耐高温的能力，其分泌的纤维素酶具有耐高温的特点。中国专利CN201110025776.5公开了一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因和应用，该发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH3.5～5.0，最适温度70℃，比活为60.3U/mg；良好的稳定性，在极端酸性范围内依然保持较高酶活。
传统的纤维素酶工艺采用的纤维素酶较优化的酶解温度为45-50℃，研究表明更高的温度酶解可以提高酶解效率，减少纤维素酶的使用量，现有耐高温纤维素酶可以用于高温酶解制糖，然后发酵产丁醇，但耐温纤维素酶产业还不成熟，远未到工业化的程度。开发一种能够使常规市售纤维素酶提高酶解温度的方法对纤维素丁醇工业的发展具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法。本发明方法可以提高酶的活性和利用率，增加发酵产物得率，可降低了酶解和发酵成本。
本发明木质纤维素高温酶解与发酵产丁醇方法，包括如下步骤：
（1）对木质纤维素原料进行预处理，获得预处理原料；
（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为5wt%-15wt%；控制酶解时间为8-48h；预酶解的pH为4.5-5.5；预酶解的温度为54-62℃；
（3）预酶解后料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；
（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。
步骤（1）中，木质纤维素原料优选为玉米秸秆；所述预处理方式优选采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
步骤（2）中，木糖醇加入量为0.05-0.30g/L。
步骤（2）中，控制酶解时间优选为12-24h；预酶解的pH优选为4.8-5.2；预酶解的温度优选为56-60℃。
步骤（2）中，所述的纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5-25IU/g纤维素。
步骤（3）中，同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程。
步骤（3）中，所述的丁醇发酵菌种包括：丙酮丁醇羧菌ATCC824和拜氏羧菌NCIMB8052，培养温度优选36-42℃；丁醇发酵菌种子液的接种量为1v%-5v%，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为6-8，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在4.5-5.0，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为36-42℃，发酵时间为48-96h。
步骤（3）中，同步糖化发酵体系中加入氮源，氮源可选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、酸解豆粕或尿素等中的一种或几种，加入量为体系总质量的0.02wt%-0.2wt%。
步骤（3）中，氮源优选酸解豆粕。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、在酶解体系中加入木糖醇，提高纤维素酶的耐受高温的能力，提高酶解的温度，有利于提高纤维素酶的活性，降低纤维素酶的使用量，提高木质纤维素的酶解效率，提高经济性。
2、利用丁醇发酵菌株的耐温性和生长过程中pH变化特性，对预酶解后残余的纤维素进行同步糖化发酵，可以降低葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制，进一步提高纤维素的酶解效率，降低酶成本。
3、玉米秸秆预处理过程中可能产生一些对丁醇发酵菌种具有毒性的化合物，例如甲酸、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛和酚类物质，利用氢氧化钙调节pH还可起到水解液脱毒的作用。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图；
其中，1-酶解罐，2同步糖化发酵罐，3-产品分离单元。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法作进一步说明。本发明中，wt%为质量分数，v%为体积分数。
实施例1
本发明实施例使用的木质纤维素原料为玉米干秸秆，其中纤维素38.2wt%，半纤维素22.1wt%，木质素20.2wt%，灰分3.9wt%，用粉碎机粉碎至颗粒大小为1-5mm。采用稀酸蒸汽爆破进行预处理，反应温度为190℃，反应时间5min，固液比为1:2，稀硫酸浓度为2.0wt%。从蒸汽爆破装置出来后用NaOH调节pH为5.0，其中干物质浓度为32wt%，干物质中纤维素含量为40wt%，干物质中木糖含量20.8%，预处理干物质回收率为96wt%。
种子液培养基为丁醇发酵菌种的常规培养基，如P2和RCM等，115℃灭菌30min备用。种子液的制备共分3级培养：第一级利用接种针从固体培养基中接入到置于10mL厌氧管中的3mL种子培养基中，37℃厌氧培养24h；第二级培养从第一级培养液接种到1L发酵罐中的500mL种子培养基中，37℃，100r/m，通入N2厌氧培养24h；第三级培养把第二级培养液全部接种到50L发酵罐中的25L种子培养基中，37℃，100r/min，通入N2厌氧培养24h。
按图1所示的流程，采用立式酶解罐的有效容积为240L，同步糖化发酵罐的有效容积为240L。将预处理好的玉米秸秆、纤维素酶（购自诺维信生物技术有限公司，型号为Ctec2，滤纸酶活135IU/g）和水按比例连续加入到酶解罐中进行预酶解，其中预处理玉米秸秆的加入量为75kg，纤维素酶加入量0.432kg加入后相当于6.075IU/g纤维素），木糖醇加入量0.048kg，自来水加入量164.52kg，酶解体系中干物质浓度为10wt%，酶解罐中温度为58℃，pH5.0，搅拌速率50r/min，预酶解时间为24h。然后从酶解罐泵入到同步糖化发酵罐中，利用氢氧化钙调节pH为7.5，之后连续通入N2除去培养基质中的氧气，再接入ATCC824种子液24L。氮源采用酸解豆粕，加入量0.24kg，豆粕酸解方法为：0.24kg豆粕加入到1L2%的硫酸中，95℃酸解24h。发酵罐中温度为37℃，搅拌速率为100r/min，N2在整个发酵过程中一直保持通入，通气量为0.05vvm。ATCC824生长过程中pH从7.5下降，最后控制在4.5，同步糖化发酵时间为96h。
通过液相色谱检测，最终发酵液中产生的溶剂浓度为22.1g/L，其中丁醇浓度为12.8g/L，丙酮浓度7.1g/L，乙醇浓度2.2g/L。经过计算葡萄糖得率为89%，溶剂得率为33%。
比较例1
处理流程和工艺条件与实施例1相同，不同之处在于：酶解罐中不加入木糖醇，预酶解温度为50℃。
通过液相色谱检测，最终发酵液中产生的溶剂浓度为20.2g/L，其中丁醇浓度为11.3g/L，丙酮浓度6.5g/L，乙醇浓度2.4g/L。经过计算葡萄糖得率为81%，溶剂得率为32%。
比较例2
处理流程和工艺条件与实施例1相同，不同之处在于：酶解罐中不加入木糖醇，预酶解温度为58℃。
通过液相色谱检测，最终发酵液中产生的溶剂浓度为16.7g/L，其中丁醇浓度为9.4g/L，丙酮浓度5.3g/L，乙醇浓度2.0g/L。经过计算葡萄糖得率为66%，溶剂得率为30%。
实施例2
本发明木质纤维素高温酶解与发酵产丁醇方法，包括如下步骤：
（1）对木质纤维素原料玉米秸秆玉米秸秆进行稀酸蒸汽爆破组合预处理，获得预处理原料；
（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为5wt%；控制酶解时间为8h；预酶解的pH为4.5；预酶解的温度为62℃；木糖醇加入量为0.05g/L；所述的纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5IU/g纤维素；
（3）预酶解后料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程；所述的丁醇发酵菌种为丙酮丁醇羧菌ATCC824，培养温度优选36℃；丁醇发酵菌种子液的接种量为1v%，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为6，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在4.5，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为36℃，发酵时间为96h；同步糖化发酵体系中加入氮源，氮源选自酵母膏，氮源加入量为体系总质量的0.02wt%。
（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。
实施例3
本发明木质纤维素高温酶解与发酵产丁醇方法，包括如下步骤：
（1）对木质纤维素原料玉米秸秆玉米秸秆进行稀酸蒸汽爆破组合预处理，获得预处理原料；
（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为15wt%；控制酶解时间为48h；预酶解的pH为5.5；预酶解的温度为62℃；木糖醇加入量为0.30g/L；所述的纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为25IU/g纤维素；
（3）预酶解后料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程；所述的丁醇发酵菌种为拜氏羧菌NCIMB8052，培养温度优选42℃；丁醇发酵菌种子液的接种量为5v%，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为8，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在5.0，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为42℃，发酵时间为48h；同步糖化发酵体系中加入氮源，氮源选自蛋白胨，氮源加入量为体系总质量的0.2wt%。
（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。
实施例4
本发明木质纤维素高温酶解与发酵产丁醇方法，包括如下步骤：
（1）对木质纤维素原料玉米秸秆玉米秸秆进行稀酸蒸汽爆破组合预处理，获得预处理原料；
（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为10wt%；控制酶解时间为28h；预酶解的pH为5.0；预酶解的温度为58℃；木糖醇加入量为0.16g/L；所述的纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为15IU/g纤维素；
（3）预酶解后料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程；所述的丁醇发酵菌种为丙酮丁醇羧菌ATCC824，培养温度优选39℃；丁醇发酵菌种子液的接种量为3v%，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为7，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在4.8，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为39℃，发酵时间为72h；同步糖化发酵体系中加入氮源，氮源选自酸解豆粕，氮源加入量为体系总质量的0.1wt%。
（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。
实施例5
步骤（2）中，控制酶解时间为12h；预酶解的pH为4.8；预酶解的温度为56℃。其它步骤同实施例1。
实施例6
步骤（2）中，控制酶解时间为24h；预酶解的pH为5.2；预酶解的温度为60℃。其它步骤同实施例1。
本发明步骤（1）中的木质纤维素原料包括一切含纤维素的生物质原料，如秸秆、木屑、能源植物（如柳枝稷）和废纸等，优选为玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或上述方法的组合预处理等，优选采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
步骤（2）中加入的木糖醇可以提高纤维素酶耐受高温的能力，加入量为0.05-0.30g/L。
步骤（2）中，控制酶解时间为8-48h，优选12-24h。酶解体系的干物质浓度（可溶性固体和不可溶性固体质量之和与体系总质量的百分比，下同）为5wt%-15wt%。所述的纤维素酶采用一切可水解木质纤维素组分的酶蛋白或酶蛋白混合物，可在工厂在线生成纤维素酶，也可采用市售商品纤维素酶，如诺维信酶或者泽生酶。控制纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5-25IU/g纤维素。预酶解的pH为4.5-5.5，优选为4.8-5.2；温度为54-62℃，优选为56-60℃。
步骤（3）中的同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程。所述的丁醇发酵菌种采用目前已知的可利用木质纤维素原料发酵产丁醇的菌株，包括：丙酮丁醇羧菌ATCC824和拜氏羧菌NCIMB8052等，培养温度优选36-42℃。采用本领域常规的培养方式制备发酵菌种子液，种子液的接种量为1v%-5v%。本发明中，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为6-8，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在4.5-5.0，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为36-42℃，发酵时间为48-96h。同步糖化发酵体系中加入的氮源可选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵或尿素等中的一种或几种，优选酸解豆粕，加入量为体系总质量的0.02wt%-0.2wt%。豆粕酸解采用本领域常规方法。
步骤（4）采用本领域常规方法对发酵液中的丁醇、丙酮和乙醇进行分离。

Claims (9)

1.一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）对木质纤维素原料进行预处理，获得预处理原料；
（2）将预处理原料、纤维素酶、水和木糖醇加入到酶解罐中进行预酶解，控制酶解体系的干物质浓度为5wt%-15wt%；控制酶解时间为8-48h；预酶解的pH为4.5-5.5；预酶解的温度为54-62℃；
（3）预酶解后料液打入到发酵罐中，加入丁醇发酵菌株进行同步糖化发酵；
（4）发酵液打入到精馏装置分离丁醇，及丙酮和乙醇副产物。
2.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（1）中，木质纤维素原料优选为玉米秸秆；所述预处理方式优选采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
3.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（2）中，木糖醇加入量为0.05-0.30g/L。
4.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（2）中，控制酶解时间优选为12-24h；预酶解的pH优选为4.8-5.2；预酶解的温度优选为56-60℃。
5.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（2）中，所述的纤维素酶的加入量使得纤维素酶与预处理原料中纤维素的比例为5-25IU/g纤维素。
6.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（3）中，同步糖化发酵是指预酶解后残余纤维素在发酵葡萄糖产丁醇的同时继续被水解的过程。
7.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（3）中，所述的丁醇发酵菌种包括：丙酮丁醇羧菌ATCC824和拜氏羧菌NCIMB8052，培养温度优选36-42℃；丁醇发酵菌种子液的接种量为1v%-5v%，预酶解后加入氢氧化钙调节pH为6-8，丁醇发酵菌种利用预处理和预酶解阶段产生的自由糖生长，同时pH开始下降，最后稳定在4.5-5.0，进入到同步糖化发酵，控制发酵温度为36-42℃，发酵时间为48-96h。
8.根据权利要求1所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（3）中，同步糖化发酵体系中加入氮源，氮源可选自酵母膏、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵、酸解豆粕或尿素等中的一种或几种，加入量为体系总质量的0.02wt%-0.2wt%。
9.根据权利要求8所述的一种木质纤维素高温酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于步骤（3）中，氮源优选酸解豆粕。
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