CN104651418B - 一种用改性聚氨酯纤维束固载菌株cgmcc 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法 - Google Patents

一种用改性聚氨酯纤维束固载菌株cgmcc 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明使用改性聚氨酯纤维束作为载体，固载微生物进行发酵，特别是用来固载CGMCC 1593进行丁二酸的连续发酵制备工艺，本发明还提供了在5%~20%的二氧化氯水溶液中温度加热到70℃以上浸泡不小于90h的改性聚氨酯纤维束的制备工艺。使用改性聚氨酯纤维束固载琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593进行连续发酵制备丁二酸时，会起到与棉纤维固载微生物相同的效果。而且在规模放大的发酵系统中使用时，改性的聚氨酯纤维束不会因强度问题而被解体，甚至影响使用。工业上应用时，发酵的批次可以达到8~10次。

Description

一种用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵 制备丁二酸的方法
技术领域
本发明涉及使用改性聚氨酯纤维束固载琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
丁二酸（succinic acid）又名琥珀酸，广泛存在于生物体中，是一种重要的二元有机羧酸，也是微生物三羧酸循环糖酵解途径的重要代谢产物。丁二酸在很多领域有着广泛的应用，可用于合成可降解塑料，医药领域的镇定剂，食品工业的食品添加剂，表面活性剂等。因此，丁二酸的高效、低成本的生产方法成为近年来研究的热点。
目前使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593可以实现丁二酸的制备。传统的生物发酵制备方法为分批发酵，发酵末期尽管整个体系的菌种的综合代谢和生存能力已经大幅衰退，但微生物细胞内仍然存留大量的营养和碳源，且相当一部分的菌体仍然具有相当活性。而分批发酵是将发酵液全部排掉，造成了发酵原料的浪费。
本发明所用菌株琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593，已在中国专利ZL 200610038113.6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。
为降低发酵成本，学术界逐渐兴起半连续工艺进行发酵的方法的研究，即每次到发酵后期，按照一定比例将发酵液放出一部分，然后将灭好菌的新培养基加入到发酵罐中，开始新的一批发酵。这种发酵方法的优势是减少了种子培养的过程，提高了营养物质的利用率，有利于降低发酵成本。然而，由于该种方法每次保留一部分发酵液在发酵罐中，因此相当于降低了发酵的产量和效率。
为了解决这个问题，学界中开始以棉纤维为载体固载菌株进行发酵的方法，该方法既能够实现半连续方法的优势，还能够将发酵液全部放光，而只使用留存在载体上的菌种进行下一次的发酵生产。
棉纤维可以作为载体的优势在于棉纤维表面有大量的毛细孔可存储含菌体的发酵液，然而由于棉纤维强度太差，在使用机械搅拌的发酵罐中容易产生破损；另外，由于棉纤维组成为纤维素，长期使用的过程中会被附着的微生物进行降解，破损。上述两种情况都会造成发酵液中纤维状物质增加，大大增加了后处理的难度。发明者在使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593进行发酵制备丁二酸的过程中，发现聚氨酯材料的强度完全适合使用机械搅拌的发酵罐中使用，甚至可以以多种纺织形式放在罐中，纤维球、纤维束、无纺布条等，搅拌桨的剪切不会破坏其结构。
但聚氨酯纤维为化工合成产品，表面非常光滑，需要人工在表面凿孔或蚀刻毛细孔。发明者主要研究了在聚氨酯纤维表面使用化学试剂蚀刻毛细孔或深度伤痕的办法。
本发明所用的聚氨酯纤维可以为废弃的氨纶纤维，也可以是以聚醚二元醇、异氰酸酯和二胺类物质共聚而成，结构致密，可以抵御大部分的化学试剂的侵蚀。在研究过程中发现，聚氨酯纤维在70~90℃的情况下，在含氯的高浓度溶液中，特别是二氧化氯溶液中，表面会产生大量的毛细穿孔的情况。宏观上来看，原本规整的聚氨酯纤维束或聚氨酯纤维球，经过高温和长时间浸泡后，堆积体积大幅增加，这正是纤维表面遭到氯离子蚀刻而产生凹凸面和毛细穿孔所致。
使用上述经过改性处理的聚氨酯材料做微生物载体固载琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593进行发酵制备丁二酸时，会起到与棉纤维相同的效果。而且在规模放大的发酵系统中使用时，改性的聚氨酯纤维束不会因强度问题而被解体，甚至影响使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，使用改性聚氨酯纤维束固载菌株代替用棉纤维为载体固载菌株进行发酵的方法，会起到与棉纤维相同的效果。而且在规模放大的发酵系统中使用时，改性的聚氨酯纤维束不会因强度问题而被解体，甚至影响使用。
本发明的技术方案：一种使用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，步骤为：
（1）改性聚氨酯纤维束的制备：市场上采购的聚氨酯纤维束（氨纶），放入质量浓度为5%~20%的二氧化氯水溶液中浸泡，其中浓度最优为6%~10%，容器密闭，温度加热到70℃以上，最优为80~90℃；浸泡时间不小于90h，最优时间为100~120h。
过高的温度和过长的浸泡时间容易引起纤维的脆裂。
为避免残留的二氧化氯分子对后期的发酵产生的影响，需要对浸泡后的纤维束进行彻底的清洗。首先，将浸泡后的聚氨酯纤维束用清水淋洗15min，然后使用质量浓度0.5%的氢氧化钠水溶液浸泡10min，清水淋洗15min后，再使用质量浓度1%的丁二酸水溶液进行中和清洗，最后再使用清水淋洗15min。
清洗非常关键，因为二氧化氯的微量残留也会对发酵产生致命的影响。
（2）投放改性聚氨酯纤维束：在发酵罐中放置好改性聚氨酯纤维束，并加水进行实消灭菌，其中温度控制为121℃，压力0.1MPa，时间20~30min；实消灭菌结束后，将水从底阀排净。
改性聚氨酯纤维束的投加量为发酵液质量的10%~20%。
（3）第一次发酵过程制备丁二酸：使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）CGMCC 1593代谢丁二酸厌氧发酵系统，本发明所用菌株琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593，已在中国专利ZL 200610038113.6中公开，公开号CN1814747A，公开日2006年8月9日。
培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1 ~5g/L，用去离子水配制。
按照培养基组成配制培养基，并在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7h后，将种子培养液接入厌氧发酵系统的发酵罐中的发酵培养基中，接种量10%。
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为5.5~6.5，最优控制在6.0~6.2，温度为37~39℃，二氧化碳的通入量为发酵液总体积的0.1%~0.5%/min。发酵时间为48h，丁二酸产量为75~80g/L。丁二酸含量检测方法使用液相色谱检测。
上述步骤为第一次发酵过程。
（4）第2～10次发酵过程制备丁二酸：将已经灭好菌的发酵培养基，接入放空的发酵罐中，按照步骤（3）第一次发酵过程制备丁二酸的发酵条件和参数进行发酵。发酵结果比较第一次略有增加，丁二酸含量持在达到80～85g/L。
按上述过程重复操作，发酵批次在10次之内，发酵结束时丁二酸含量先升后降，最高可以达到90~95g/L。进行发酵10次以上时，丁二酸的产酸能力逐渐下降。
下降的原因是由于纤维表面的微孔中逐渐被菌体自溶的碎片所填充，造成正常繁殖的新的菌体无法进入微孔中，致使参与下一次发酵的活性较强的菌体含量越来越低，所以产酸能力下降。
工业上应用时，发酵的批次可以固定在8~10次。
本发明的有益效果：本发明采用纤维为载体固载菌株进行发酵的方法，该方法既能够实现传统半连续发酵方法的优势，还能够将发酵液全部放光，而只使用留存在载体上的菌种进行下一次的发酵生产。独创了聚氨酯纤维束改性的方法，在5%~20%的二氧化氯水溶液中温度加热到70℃以上浸泡不小于90h的改性聚氨酯纤维束的制备工艺。以改性的聚氨酯纤维束为载体固载菌株进行发酵的方法。使用上述经过改性处理的聚氨酯纤维束做微生物载体固载琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593进行发酵制备丁二酸时，会起到与棉纤维相同的效果。而且在规模放大的发酵系统中使用时，改性的聚氨酯纤维束不会因强度问题而被解体，甚至影响使用。工业上应用时，发酵的批次可以固定在8~10次。
具体实施方式
实施例1改性聚氨酯纤维束的制备
市场上采购的聚氨酯纤维束（氨纶），放入浓度为5%~20%的二氧化氯水溶液中浸泡，其中浓度最优为6%~10%，容器密闭，温度加热到70℃以上，最优为80~90℃；浸泡时间不小于90h，最优时间为100~120h。
过高的温度和过长的浸泡时间容易引起纤维的脆裂。
为避免残留的二氧化氯分子对后期的发酵产生的影响，需要对浸泡后的纤维束进行彻底的清洗。首先，将改性好的聚氨酯纤维束用清水淋洗15min，然后使用质量浓度0.5%的氢氧化钠水溶液浸泡10min，清水淋洗15min后，再使用1%的丁二酸水溶液进行中和清洗，最后再使用清水淋洗15min。
清洗非常关键，因为二氧化氯的微量残留也会对发酵产生致命的影响。
实施例2
投放改性聚氨酯纤维束：在发酵罐中放置好改性聚氨酯纤维束，并加水进行实消灭菌，其中温度控制为121℃，压力0.1MPa，时间20~30min；实消灭菌结束后，将水从底阀排净。
改性聚氨酯纤维束的投加量为发酵液质量的10%~20%。
使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593代谢丁二酸厌氧发酵系统。
配制种子培养基100mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
配制发酵培养基1000mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1～5g/L，用去离子水配制。
种子培养基和发酵培养基均在灭菌锅中进行灭菌，温度121℃，灭菌20min。
发酵罐使用蒸汽进行空消灭菌，降温后通入二氧化碳5mL/min，维持发酵罐温度37~39℃。
种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7h后，将培养液接入发酵罐中的发酵培养基中，接种量10%。
发酵过程中使用氢氧化钠维持发酵系统的pH值为5.8~6.0，温度为37~39℃，发酵时间为48h，最终丁二酸产量为77g/L。
实施例3
投放改性聚氨酯纤维束：在发酵罐中放置好改性聚氨酯纤维束，并加水进行实消灭菌，其中温度控制为121℃，压力0.1MPa，时间20~30min；实消灭菌结束后，将水从底阀排净。
改性聚氨酯纤维束的投加量为发酵液体积的10%~20%。
使用琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）CGMCC 1593代谢丁二酸厌氧发酵系统。
配制种子培养基100mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制。
配制发酵培养基1000mL，组成为蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1g/L，用去离子水配制。
种子培养基和发酵培养基均在灭菌锅中进行灭菌，温度121℃，灭菌20 min。
发酵罐中加入改性聚氨酯纤维束100g，使用水实消灭菌，降温后将水排净，发酵罐中通入二氧化碳5mL/min，维持发酵罐温度37~39℃。
种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7小时后，将培养液接入发酵罐中的发酵培养基中，接种量10%。
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为6.0~6.1，温度为37~39℃，发酵时间为48h。
发酵液从发酵罐底阀排净，将灭好菌的1000mL新培养基液接入发酵罐中，根据上述的发酵条件和参数进行第二次发酵。
按照上述过程，重复发酵批次为8次。
8次发酵的结果如下：
发酵批次 丁二酸含量（g/L)
1 77
2 81
3 91
4 89
5 87
6 84
7 80
8 79

Claims (3)

1.一种使用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593（琥珀酸放线杆菌，Actinobacillus succinogenes）实现连续发酵制备丁二酸的方法，其特征在于步骤为：
（1）改性聚氨酯纤维束的制备：将聚氨酯纤维束放入质量浓度为5%~20%的二氧化氯水溶液中浸泡，容器密闭，温度加热到70℃以上；浸泡时间不小于90h；
对浸泡后的纤维束进行彻底的清洗，首先，将浸泡后的聚氨酯纤维束用清水淋洗15min，然后使用质量浓度0.5%的氢氧化钠水溶液浸泡10min，清水淋洗15min后，再使用质量浓度1%的丁二酸水溶液进行中和清洗，最后再使用清水淋洗15min；
（2）投放改性聚氨酯纤维束：在发酵罐中放置步骤（1）制得的改性聚氨酯纤维束，并加水进行灭菌，灭菌温度控制为121℃，压力0.1MPa，时间20~30min；灭菌结束后，将水从底阀排净；
改性聚氨酯纤维束的投加量为发酵液质量的10%~20%；
（3）第一次发酵过程制备丁二酸：使用CGMCC 1593代谢丁二酸厌氧发酵系统，培养基组成如下：
种子培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，酵母膏5g/L，用去离子水配制；
发酵培养基：蛋白胨5g/L，玉米浆10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氢钾 2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠1~5g/L，用去离子水配制；
按照培养基组成配制培养基，并在121℃下灭菌20min，种子一级为TSB培养液，培养14h后接种子培养基，接种量4%，培养时间达到7h后，将种子培养液接入厌氧发酵系统发酵罐中的发酵培养基中，接种量10%；
发酵过程中使用氢氧化钠溶液维持发酵系统的pH值为5.5~6.5，温度为37~39℃，二氧化碳的通入量为发酵液总体积的0.1%~0.5%/min，发酵时间为48h；丁二酸含量检测方法使用液相色谱检测；
上述步骤为第一次发酵过程；
（4）第2～10次发酵过程制备丁二酸：将已经灭好菌的发酵培养基，接入放空的发酵罐中，按照步骤（3）第一次发酵过程制备丁二酸的发酵条件和参数进行发酵；发酵结果比较第一次略有增加，丁二酸含量达到80～85g/L；
按上述过程重复操作，发酵批次在10次之内，发酵结束时丁二酸含量先升后降，最高达到90~95g/L，进行发酵10次以上时，丁二酸的产酸能力逐渐下降；
工业上应用时，发酵的批次可达8~10次。
2.根据权利要求1所述的使用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，其特征在于步骤（1）改性聚氨酯纤维束的制备：将聚氨酯纤维束放入质量浓度为6%~10%的二氧化氯水溶液中浸泡，容器密闭，温度加热到80~90℃；浸泡时间为100~120h。
3.根据权利要求1所述的使用改性聚氨酯纤维束固载菌株CGMCC 1593实现连续发酵制备丁二酸的方法，其特征在于步骤（3）发酵过程中使用氢氧化钠维持发酵系统的pH值为6.0~6.2。
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