CN102242160B - 一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产l-苹果酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产L-苹果酸的方法，以柠檬酸发酵液为碳源，发酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的发酵液，通过酶转化的方法，使富马酸钠生成L-苹果酸。经过20～26小时转化，苹果酸含量可达到78-85g/L，转化率达到了81.2％～85.5％。本发明工艺简单，能耗少，原料便宜，大大节约了生产成本。

Description

一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产L-苹果酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产L-苹果酸的方法。
背景技术
L-苹果酸是生物体糖代谢过程中产生的一种重要有机酸，广泛存在于水果及蔬菜中，是一种优良的酸味剂和保鲜剂，主要运用于食品、化工、医药、日化及保健等，用其合成的尿素L-苹果酸还可用于非线性光学有机材料。
近年来，L-苹果酸市场逐渐启动，需要快速增加，已呈现严重供不应求的局面。由于用天然产物提取或者化学合成的来生产苹果酸的方法成本过高，因此用微生物的方法合成L-苹果酸是今后大规模生产的趋势。目前用微生物合成L-苹果酸的菌种繁多，但大致可以分为四类：
1.由丝状菌和酵母菌发酵，由多糖降解成L-苹果酸。
2.培养细菌，由菌体内的延胡索酸酶将加入的延胡索酸转化成L-苹果酸
3.将含延胡索酸的菌体细胞固定化，或从细胞中提取出延胡索酸酶制成固定化酶之后，再将延胡索酸转化成L-苹果酸。
4.先培养根酶将葡萄糖降解成延胡索酸，再接入普通变形杆菌混合培养，将延胡索酸转化成L-苹果酸。
其中，第2种方法是目前用于L-苹果酸生产的主要方法。但由于延胡索酸酶的制备培养基通常以柠檬酸为碳源，而成品柠檬酸的价格较高，从而导致生产成本较高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产L-苹果酸的方法。
本发明提供的发酵生产L-苹果酸的方法，其为以柠檬酸发酵液为碳源，发酵产延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的发酵液转化富马酸钠生成苹果酸。
其中，所述的发酵产延胡索酸酶菌株的培养基为：柠檬酸发酵液20～25wt％、MgSO40.02～0.05wt％、玉米浆3.5～4.5wt％、KH2PO40.2～0.4wt％、NH3·H2O 3～5wt％。
其中，所述的柠檬酸发酵液中柠檬酸的质量分数为10～15％。
其中，可通过本领域公知的方法发酵黑曲霉，获得柠檬酸发酵液。优选可参看CN101638675的方法发酵产程柠檬酸发酵液。
根据本发明，优选当延胡索酸酶的酶活力为21000～24000μmol/g·h时，停止发酵产延胡索酸酶菌株。其中，优选的发酵温度为34～36℃，发酵时间为20～40h。
根据本发明，在产延胡索酸酶菌株发酵过程中，优选的发酵液体积和无菌空气的通气量之比为1∶0.5-0.9。
根据本发明，可选用任何本领域公知的可发酵产生延胡索酸酶的菌株，可选自温特曲霉、产氨短杆菌、普通变形杆菌、黄色短杆菌或其组合，优选的菌株为产氨短杆菌菌株M13(保藏号为CICC 10169)。
根据本发明，将含有延胡索酸酶的发酵液转化富马酸钠，生成L-苹果酸，其中含有延胡索酸酶的发酵液和富马酸钠的混合液中延胡索酸酶酶活为10500～13333μmol/g·h，富马酸钠的浓度为0.44～0.83mol/L。
根据本发明，优选的转化L-苹果酸的温度为37-40℃，转化时间为20-26小时。
本发明针对延胡索酸酶发酵培养基中添加的成品柠檬酸价格较高的问题，采用按一定比例的柠檬酸发酵液来代替成品柠檬酸的添加，使得生产成本最低化，并建立了相应的柠檬酸发酵液预处理办法与酶发酵生产代谢控制技术；本发明利用柠檬酸发酵液为碳源，对其他培养基成分也进行了优化，并且对酶发酵过程和酶转化工艺也做出了相应的改进，最后得到的较高的L-苹果酸产量和转化率，对与L-苹果酸的大规模生产具有重要的现实意义。
具体实施方法
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
按照CN101638675公开的方法，发酵黑曲霉获得柠檬酸发酵液，发酵液中柠檬酸的含量为12％，将其经板框过滤器进行压滤，除去发酵液中的菌丝等固态杂质后，收集发酵液。
实施例2
先将延胡索酸酶生产菌株产氨短杆菌M13(保藏号为CICC10169)(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)在通风条件下培养40小时，以1％的接种量接种到10m2发酵罐中进行发酵，发酵温度控制在36℃，初始pH为7.3。其中，所述的发酵培养基为：实施例1制备的柠檬酸发酵液20wt％、MgSO40.02wt％、玉米浆3.5wt％、KH2PO40.2wt％、NH3·H2O 3wt％。
经发酵30小时后，当产氨短杆菌OD660nm达到0.48，生产得到的延胡索酸酶酶活为22311μmol/g·h时结束发酵，之后将酶发酵液和1.4mol/L的富马酸纳溶液按照1∶0.8的体积比混合加入生物反应结晶器中，在常压，pH为6.8，温度为37℃下进行酶反应，经过24小时转化，使L-苹果酸含量达到81g/L，转化率达到了82.2％。
实施例3
先将延胡索酸酶生产菌株产氨短杆菌M13在通风条件下培养40小时，以1％的接种量接种到50m2发酵罐中进行发酵，发酵温度控制在36℃，初始pH为7.5。其中，所述的发酵培养基为：实施例1制备的柠檬酸发酵液25wt％、MgSO40.05wt％、玉米浆4.5wt％、KH2PO40.4wt％、NH3·H2O 5wt％。
经发酵28小时后，当产氨短杆菌OD660nm达到0.51，生产得到的延胡索酸酶酶活为23712μmol/g·h时结束发酵，之后将酶发酵液和1.5mol/L的富马酸纳溶液按照1∶1的体积比混合加入生物反应结晶器中，在常压，pH为6.8，温度为37℃下进行酶反应，经过24小时转化，使L-苹果酸含量达到83g/L，转化率达到了83.9％。
实施例4
先将延胡索酸酶生产菌株产氨短杆菌M13在通风条件下培养40小时，以1％的接种量接种到80m2发酵罐中进行发酵，发酵温度控制在36℃，初始pH为7.5。其中，所述的发酵培养基为：实施例1制备的柠檬酸发酵液22wt％、MgSO40.04wt％、玉米浆4.0wt％、KH2PO40.3wt％、NH3·H2O 4wt％。
经发酵33小时后，当产氨短杆菌OD660nm达到0.47，生产得到的延胡索酸酶酶活为21890μmol/g·h时结束发酵，之后将酶发酵液和1mol/L的富马酸纳溶液按照1∶0.8的体积比混合加入生物反应结晶器中，在常压，pH为6.8，温度为37℃下进行酶反应，经过25小时转化，使L-苹果酸含量达到79.5g/L，转化率达到了81.3％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种利用柠檬酸发酵液为原料发酵生产L-苹果酸的方法，其特征在于，以柠檬酸发酵液为碳源，发酵生成延胡索酸酶，再用延胡索酸酶的发酵液，通过酶转化的方法，使富马酸钠生成L-苹果酸； 
所述的发酵产延胡索酸酶菌株的培养基为：柠檬酸发酵液20~25wt%、MgSO40.02~0.05wt%、玉米浆3.5~4.5wt%、KH2PO40.2~0.4wt%、NH3·H2O 3~5wt%，pH为7.2~7.5； 
所述的柠檬酸发酵液中柠檬酸的质量分数为10~15%； 
所述产延胡索酸酶菌株的发酵温度为34~36℃，发酵时间为20~40h； 
所述产延胡索酸酶菌株发酵的发酵液体积和无菌空气的通气量之比为1:0.5~0.9； 
所述的产延胡索酸酶菌株为产氨短杆菌M13； 
所述的延胡索酸酶的发酵液与富马酸钠的混合溶液中富马酸钠的浓度为0.44~0.83mol/L； 
所述的转化L-苹果酸的温度为37~40℃，转化时间为20~26小时。 
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵产延胡索酸酶菌株生成延胡索酸酶的酶活力为21000~24000μmol/g·h。 
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的延胡索酸酶的发酵液与富马酸钠的混合溶液中延胡索酸酶酶活为10500~13333μmol/g·h。 
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