CN101624589B - 一种新型米根霉固定化发酵载体单元及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种新型米根霉固定化载体单元，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝权星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝权星状载体单元。发酵时直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上；在三角瓶、柱式反应器、发酵罐中，均可以根据反应器形状和尺寸，通过串联或增加载体数量达到筛选和放大的实验目的。

Description

一种新型米根霉固定化发酵载体单元及使用方法

技术领域

本发明涉及一种发酵用载体，尤其涉及一种米根霉发酵生产L-乳酸的发酵载体。

背景技术

目前，利用米根霉发酵生产L-乳酸是目前工业生产光学纯L-乳酸的主要方法，发酵方式主要分为游离发酵和固定化发酵([1]Lorenzo M.L.D.，Crystallization behavior of poly(L-lactic acid).European Polymer J.2005，41：569-575；[2]Maas，R.H.，Bakker R.R.，Eggink G.，Lactic acid production from xylose by the fungus Rhizopus oryzae，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2006，72：861-868)。其中固定化发酵有菌体密度高、反应速率快、稳定性好、使用寿命长、可重复利用、便于实现催化剂与发酵液分离等优点，越来越引起研究者们的关注。

目前的固定载体类型主要有纤维吸附([3]宁尚勇，李十中，真菌固定床反应器发酵L(+)-乳酸的初步研究，食品与发酵工业，2006，32(3)：22-25；[4]张定丰，林建平，金志华，岑沛霖，用于固定化米根霉发酵生产L-乳酸的转盘反应器及其放大，化学工程，2004，32(1)：34-37)，海藻酸盐凝胶包埋([5]出处Hang Y.，Hamamci H.，Woodams E.E.，Production of L(+)-lactic acid by Rhizopus oryzae immobilized in calcium alginate gels，Biotechnol Lett.，1989，11：119-120)，聚氨酯吸附([6]陈育如，夏黎明，岑沛霖，聚氨酯吸附固定米根霉发酵L-乳酸的优化，南京师范大学学报(工程技术版)，2002，2(1)：52-55)等。纤维式载体又由于其来源广泛、价格低廉、固定效果优良等被广泛研究。

以纤维为载体的反应器有床式反应器([7]A.Tay and S.T.Yang，Production ofL(+)- lacticacid from glucose and starch by immobilized cells of Rhizopus oryzae in a rotating fibrous

但它们共同的缺陷在于：(1)需要大量的动力消耗；(2)当扩大试验时，所有参数和指标难以重现，甚至无法达到。主要原因在于反应器中的菌体载体与反应器尺寸成比例，但是发酵动力学及流体力学的影响却没有对应的比例关系，使得优化数据难以重现，从而难以扩大工业化。

发明内容

为了克服现有的纤维式固定发酵反应器扩大时，载体与反应器扩大相应比例难以控制的困难，本发明专利提供一种固定化发酵载体以及使用方法，该载体不仅能在三角瓶中进行小型平行筛选实验，而且能进行组合和改造，在现有的柱式及罐式反应器中扩大试验。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种新型米根霉固定化载体单元，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝杈星状载体单元。

发酵时，只需直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上；所述发酵装置采用三角瓶、柱式反应器或发酵罐，使用同样大小的载体单元，并根据发酵的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。多个载体单元之间上下串联，长度与反应器中的装液深度一致。根据反应器直径可以增加载体单元串的数量，将其纵向连接、平行排列，达到对发酵空间的最大化利用。

本发明的有益效果是，采用以棉布纤维为载体、不锈钢支架作支撑的固定化发酵载体结构，达到米根霉菌丝层既均匀生长又能维持六枝星状空间结构。载体单元采用了六枝杈星状载体单元，可以在三角瓶、柱式反应器、发酵罐中使用同样大小的发酵单元，唯一改变的只是所用载体单元的数量，在米根霉的形态控制和产率提高方面有显著效果。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的载体单元。A是未包裹棉布前的不锈钢网片图，B为棉布包裹后的水平截面图，C为载体单元的三维图。

图2载体单元上下连接成串的示意图。

图3载体单元平行排列成布置的示意图。

图中1、不锈钢网片，2、棉布，3、载体单元，4、载体单元串，5、发酵罐。

具体实施方式

(一)载体单元的制作和使用，参见图1、图2和图3：

新型米根霉固定化载体单元是以不锈钢网片1为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布2为表面材料，包裹在不锈钢网片1表面，形成六枝杈星状载体单元3。

具体制作中，可以先制得长2至3cm，宽0.5cm不锈钢网片1，再将棉布2包裹于表面，最后将三片网片的中心点合并，得到六枝之间的固定夹角为60°的载体单元3。

使用时，载体单元的大小相同，根据发酵容器的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。参见图2，从长度方向上，多个载体单元之间可以上下串联，形成载体单元串4，使长度与反应器中的装液深度一致。参见图3，从宽度方向上，根据发酵罐5的直径可以增加载体单元串4的数量，将其平行排列，达到对发酵空间的最大化利用。

(二)三角瓶中实验

实例1：将米根霉菌种As 3.3462的孢子悬液接种至250ml三角瓶(含有50ml种子培养基，已经单独灭菌的三个载体单元)，孢子浓度为10⁶/ml，在30℃，180rpm摇床条件下培养。6小时以后，培养基中无孢子存在，表明已经完全吸附在载体表面。24小时以后，将载体单元用无菌水冲洗，再转移至发酵培养基(80g/L葡萄糖)。48小时以后，葡萄糖消耗至零，L-乳酸浓度达到最大(49.5g/L)。同等条件下游离发酵的终产物浓度为30g/L，发酵时间为72小时。载体实验与同等条件下的游离发酵相比，产物浓度提高了66.7％，得率提高了154％。

(三)生物反应柱中实验

实例1：将八个载体单元上下串联至15厘米，长度等于与200ml的生物反应柱中的装液深度。实验开始之前，载体单元串与反应器一起空罐灭菌。隔夜放置以后，装入种子培养基，在121℃条件下，灭菌30分钟。在30℃下，将米根霉As 3.3462孢子悬液注入培养基，浓度为10⁶/ml。静置5-6小时，开始通入氧气，通气比为0.5vvm。24小时后，菌丝层明显，发酵液中无可见的菌球或菌丝，检测出乳酸浓度2.4g/L。将种子培养基放出，并用无菌水冲洗载体串，再将培养基换为发酵培养基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH调节pH。36小时以后，葡萄糖浓度降至零，乳酸浓度达到最大(40g/L)。载体实验与游离发酵相比，产物浓度提高了33％，得率提高了166.6％。

将反应柱继续进行分批填料的半连续发酵，在前5批(10天)中，该体系的发酵最终产物浓度都超过35g/L。而游离发酵因为生长形态为菌丝菌团，难以与菌液分离，只能进行单批实验。

(四)发酵罐中实验

实例1：将三串载体串(每串含有八个载体单元)平行置于1L生物发酵罐中。实验开始之前，载体串与发酵罐一起空罐灭菌。隔夜放置以后，装入种子培养基(50g/L葡萄糖)，在121℃条件下，灭菌30分钟。在30℃下，将米根霉As 3.3462孢子悬液注入培养基，浓度为10⁶/ml。静置5-6小时，开始通入氧气，通气比为0.5vvm。24小时后，菌丝层明显，发酵液中无可见的菌球或菌丝，检测出乳酸浓度3.1g/L。将种子培养基放出，并用无菌水冲洗载体串，再将培养基换为发酵培养基(80g/L葡萄糖)，并用NaOH调节pH。96小时以后，葡萄糖浓度降至零，乳酸浓度达到最大(68.8g/L)。载体实验与游离发酵相比，产物浓度提高了129.3％，得率提高了72.2％。

将发酵罐继续进行分批填料的半连续发酵，在前6批(24天)中，该体系的发酵最终产物浓度都超过56g/L，得率超过70％。

Claims (6)

1.一种新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，它以不锈钢网片为支撑骨架，形成六枝杈星状骨架结构，以棉布为表面材料，包裹在不锈钢网片表面，形成六枝杈星状载体单元。

2.根据权利要求1所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，相邻的枝杈夹角均为60°。

3.根据权利要求1或2所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，所述不锈钢网片为矩形。

4.根据权利要求1或2所述的新型米根霉固定化载体单元，其特征在于，所述形成六枝杈星状骨架结构一个枝杈的不锈钢网片长2至3厘米，宽0.5至1厘米。

5.权利要求1所述米根霉固定化载体单元的使用方法，其特征在于，发酵时，只需直接将所述载体单元灭菌后置于发酵装置内的发酵液中，细胞就会吸附固定在棉布上；所述发酵装置采用三角瓶、柱式反应器或发酵罐，使用同样大小的载体单元，并根据发酵装置的直径及装液深度，选取相应数量的载体单元。

6.根据权利要求5所述米根霉固定化载体单元的使用方法，其特征在于，根据反应器的装液深度，多个载体单元之间从长度方向上上下串联，长度与反应器中的装液深度一致；根据反应器的直径，多个载体单元之间在宽度方向上平行排列，达到空间的最大利用。

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