CN102690850A

CN102690850A - 一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法

Info

Publication number: CN102690850A
Application number: CN2012102093834A
Authority: CN
Inventors: 张斌
Original assignee: SUZHOU BAIQU FOOD CO Ltd
Current assignee: SUZHOU BAIQU FOOD CO Ltd
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明提供了一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法，本发明以枯草芽孢杆菌为出发菌株，对影响发酵生产胞外多糖的发酵温度、接种量、转速、装液量、培养基pH及发酵时间进行了研究。

Description

一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法。

背景技术

核酸、蛋白质和多糖是最重要的三种生物大分子，核酸和蛋白质在生命现象中的重要性已为世人所知，而多糖的研究比核酸和蛋白质落后许多，真正对其研究仅是最近几十年的事。近20年来，国内外有关活性多糖的研究非常的活跃，目前主要从动物、植物组织以及藻类和微生物发酵液中提取多糖。本世纪生命科学的焦点是对细胞生物多糖高层次的生命现象解释，所以糖类作为生物体内细胞识别及调控信息分子，因此对其研究是非常重要的。

微生物胞外多糖是一种高粘度的大分子物质，近年来已发展成为一类新型的发酵产品。除具有大多数植物多糖和合成的高分子聚合物所特有的性质外，还具有低浓度下呈高黏度，假塑性，热稳定性，可与多种盐类配伍及形成有用的膜等特性，同时具有生产周期短，生产不受季节、地理条件、病害的限制等优点。另外，微生物多糖的无毒、不污染环境等特点又使其在将来有可能取代高分子聚合物，消除高聚物受石油资源制约、毒性、污染等弊病。微生物多糖除具有药用外还可作为增稠剂、悬浮剂和稳定剂而广泛地应用于化工、石油开采、医药加工、食品和化妆品等领域。根据D. E. Eveleigh 统计，已经发现49 属76 中微生物产胞外多糖，但真正有应用价值并已经进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增长量均在10% 以上，而一些新型多糖年增长量在30% 以上。目前为止，已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶、结冷胶、右旋糖苷、硬葡聚糖、异淀粉等。据估计，全世界微生物多糖年加工业产值可达50-100 亿美元。近几十年来，由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的优势特点而得到大力研究和开发，微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。

本专利以枯草芽孢杆菌为出发菌株，对影响发酵生产胞外多糖的发酵温度、接种量、转速、装液量、培养基pH及发酵时间进行了研究。

发明内容

本发明提供了一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法，本专利以枯草芽孢杆菌为出发菌株，对影响发酵生产胞外多糖的发酵温度、接种量、转速、装液量、培养基pH及发酵时间进行了研究。

1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产胞外多糖的方法，其特征在于发酵时，在100 mL三角瓶中装入一定体积的发酵培养基，接入一定量的枯草芽孢杆菌种子液到发酵培养基中，分别在不同的初始pH值条件下发酵培养以一定的转速和温度下发酵一定的时间。

2.步骤1所述的发酵培养基 (g/L)：蔗糖25，蛋白胨15，牛肉膏3.0，柠檬酸三钠1.0。pH值根据发酵条件选定。

3.步骤1所述的种子培养液的制备方法为：将在固体培养基上培养的菌落接种到发酵培养基培养12 d，制成种子培养液。

4.步骤3所述的固体培养基(g/L):葡萄糖5，蛋白胨5，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂15-20。

5.步骤1所述的最佳发酵温度为40℃。

6.步骤1所述的最佳接种量为3%。

7.步骤1所述的最佳转速为160 rpm。

8.步骤1所述的最佳装液量为30 mL。

9.步骤1所述的最佳培养基pH值为6.0。

10.步骤1所述的最佳发酵时间为35 h。

附图说明

图1培养温度对菌株胞外多糖产量的影响。

图2不同接种量对菌株胞外多糖产量的影响。

图3 不同转速对菌株胞外多糖产量的影响。

图4不同装液量对菌株胞外多糖产量的影响。

图5 不同培养基初始pH 对菌株胞外多糖产量的影响。

图6 发酵时间对菌株胞外多糖产量的影响。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

本专利所用的菌株为枯草芽孢杆菌，购买于ATCC，编号为：ATCC02733。

实施例1

本实施例说明不同培养温度对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以1% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6，于200 r/min振荡培养，培养基装液量为50 mL/500 mL三角瓶，发酵培养30 h，培养温度分别为：25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，结果如图1所示。

由图1可以看出，不同的发酵温度，菌株胞外多糖的产生情况明显不同。从图中可以看出在30℃以上菌株的胞外多糖产量较高，当温度达到40℃时，胞外多糖产量最高，而超过这个温度胞外多糖产量却逐渐下降。因此实验选择40℃为最佳生产胞外多糖的温度。

实施例2

本实施例说明不同接种量对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6，于37℃，200 r/min振荡培养，培养基装液量为50 mL/500 mL三角瓶，发酵培养30 h，结果如图2所示。

由图2可以看出，当菌株接种量为3%时，胞外多糖产量最高，随着接种量的增加，胞外多糖的产量并没有增加，反而有所下降。这可能是由于菌株是好氧菌，当接入量过高时，生长空间一定，密度增加，氧气量供应不足，影响其生长继而影响产物的产出; 还可能的原因是底物量一定，当接入过多菌种后，底物量只能满足其生长需求，其次级代谢产物还没有来的及产生已消耗尽，所以造成产糖量的减少。

实施例3

本实施例说明不同转速对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以3% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6，于37℃，转速分别为120 r/min，140 r/min，160 r/min，180 r/min，200 r/min振荡培养，培养基装液量为50 mL/500 mL三角瓶，发酵培养30 h，结果如图3所示。

由图3可以看出，随着摇床转速的提高，发酵液中胞外多糖的产量增大，但高于160 r/min后，转速提高胞外多糖的产量却下降。可见转速过低，通气效果不好，不利于菌体生长，提高摇床转速，虽然有利于菌种生长，但营养成分消耗也较大，造成营养成分不足，或者转速过高对菌体产生机械损伤，引起菌体自溶，生物量减少。所以转速过高，发酵液中胞外多糖的产量会降低。从图中可以看出选择转速为160 r/min时，菌株胞外多糖产量最高。

实施例4

本实施例说明不同装液量对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以3% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6，于37℃， 160 r/min振荡培养，不同培养基装液量，发酵培养30 h，结果如图4所示。

由图4可以看出，枯草芽孢杆菌是好氧性细菌，摇瓶中的氧气量将直接影响细菌的生长和活性物质的产生。试验结果显示，500 mL 三角瓶中装入30 mL的培养液最适于菌株胞外多糖的产生，随着装液量增大，瓶中空气量减少，菌体生长受到影响，因此其次级代谢产物胞外多糖产量减少。

实施例5

本实施例说明不同初始pH 培养基对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以3% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值分别为5-10，于37℃， 160 r/min振荡培养，培养基装液量为30 mL/500 mL三角瓶，发酵培养30 h，结果如图5所示。

pH主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性以及营养物质离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的pH难以控制，只能控制发酵液的初始pH。由图5 可以看出，pH对菌株胞外多糖的合成有较大的影响。较低或较高pH的情况下均不利于胞外多糖的产生。当pH低于6. 0 以下，因为酸的抑制作用，菌体不宜生长或生长缓慢，更是影响胞外多糖的产生。从图中可以看出，当pH为6. 0 时，最利于菌株胞外多糖的产生。所以选择培养基初始pH为6. 0 进行发酵培养。

实施例6

本实施例说明发酵时间对菌株胞外多糖产量的影响，将种子培养液以3% (V/V)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为6，于37℃， 160 r/min振荡培养，培养基装液量为30 mL/500 mL三角瓶，发酵培养不同的时间，结果如图6所示。

由图6 可以看出菌株胞外多糖的产量随着发酵时间的延长在不断增加，当发酵时间为35 h 时，菌株胞外多糖的产量达到最高。当继续延长发酵时间菌株胞外多糖的产量反而下降，原因可能是因为底物的营养价值已被消耗尽无法继续提供菌株细胞生长及胞外多糖的分泌，从而造成多糖产量的下降; 也可能是由于大量多糖覆盖在菌株细胞表面抑制了菌株的继续生长及分泌多糖。目前许多研究也在倾向于胞外多糖产量随发酵时间的延长而降低，可能与酶降解或培养基成分的减少有关。

Claims

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基: 蔗糖25 g/L，蛋白胨15 g/L，牛肉膏3.0 g/L，柠檬酸三钠1.0 g/L；pH值根据发酵条件选定。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养液的制备方法为：将在固体培养基上培养的菌落接种到发酵培养基培养12 d，制成种子培养液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于固体培养基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15-20 g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵温度为40℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于接种量为3%。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于转速为160 rpm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于装液量为30 mL。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养基pH值为6.0。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于发酵时间为35 h。