CN104087624B

CN104087624B - 黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法

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Publication number: CN104087624B
Application number: CN201410329786.1A
Authority: CN
Inventors: 石贵阳; 陈坚; 王宝石; 张�杰; 胡志杰; 蒋小东; 孙福新; 李赢; 张梁; 李由然; 丁重阳; 顾正华
Original assignee: Joint Ltd Energy Co Of Jiangsu China Telecom; Jiangnan University
Current assignee: Joint limited energy company of Jiangsu China Telecom; Jiangnan University
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: CN104087624A

Abstract

一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤：（1）黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子；（2）孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液；（3）成熟的种子液转接至发酵培养基F1；（4）发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬酸；（5）分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液；（6）将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2；发酵培养后，回到步骤（4），如此重复实现连续发酵。本发明显著降低生产成本与运行成本，显著缩短生产周期，提高生产效率；同时提高设备利用率，降低劳动强度，过程简便易操作，可以广泛应用于柠檬酸的生产。

Description

黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是涉及一种采用黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的工艺。

背景技术

柠檬酸具有无毒、无臭、溶解性高、螯合力强的特性，广泛应用于食品、医药、化工等领域。随着世界经济的发展和人民生活水平的提高，柠檬酸市场需求也在快速增长，每年以3~5%的速度增长。

全球80%的柠檬酸产量是黑曲霉通过深层发酵法得到的，普遍采用分批发酵方式。但分批发酵方式存在非生产周期长，设备利用率低，生产效率低等缺点，已成为柠檬酸产业发展的技术瓶颈。连续发酵工艺无疑是解决此问题的良好途径。

然而，柠檬酸连续发酵生产过程比较困难，由于柠檬酸合成是部分生长偶联型，且黑曲霉特殊的菌丝结构，不利于连续过程的形成。国内外关于柠檬酸连续发酵或半连续发酵相关文献集中在酵母菌，但是发酵过程会产生大量的异柠檬酸（5%~10%），造成柠檬酸分离纯化困难，此缺陷严重限制了酵母菌的推广应用。

黑曲霉具有酶系丰富、底物广泛，产率高等优势，实现黑曲霉连续发酵工艺，是柠檬酸发酵发展的重要方向，也是提高柠檬酸生产率的重要途径。因此，如何实现黑曲霉连续发酵工艺，缩短生产周期，降低劳动强度，提高生产效率，是柠檬酸生产中亟待解决的一个重要问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法。本发明显著降低生产成本与运行成本，显著缩短生产周期，提高生产效率；同时提高设备利用率，降低劳动强度，过程简便易操作，可以广泛应用于柠檬酸的生产。

本发明的技术方案如下：

一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，包括以下步骤：

（1）黑曲霉经过逐级扩大培养，获得成熟的孢子；

（2）孢子液接种至种子培养基，培养成为成熟的种子液；

（3）成熟的种子液转接至发酵培养基F1；

（4）发酵培养后，分割发酵液为两部分；其中一部分发酵液继续发酵完毕，获得柠檬酸；

（5）分割出的另一部分发酵液经分散器分散处理，获得分散菌丝的发酵液；

（6）将分散菌丝发酵液接入发酵培养基F2；发酵培养后，回到步骤（4），如此重复实现连续发酵。

步骤（4）中发酵培养16~48h。步骤（5）分割出的发酵液量≥总量的1/5。

步骤（5）经过分散器分散处理的菌球或菌块平均直径≤200um。

种子培养基种后总糖控制在8~12%，总氮0.15~0.4%。发酵培养基F1种后总糖控制在14~16%，总氮为0.05~0.2%。发酵培养基F2种后总糖控制在14~16%，总氮为0.10~0.25%。

本黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的具体方法如下：

（1）步骤101、步骤102：将培养成熟的黑曲霉孢子移种入种子培养基；移种后孢子液浓度为30~60万个/ml料液，种子培养基种后总糖为8~12%，总氮0.15~0.4%；

（2）步骤103：种子培养20~36h，得到成熟的种子液；

（3）步骤104：配制发酵培养基F1，种后总糖控制在14~16%，总氮为0.05~0.2%；将成熟的种子液以10~20% (v/v)的接种量转接入发酵培养基F1；

（4）步骤106：成熟的种子液在发酵培养基F1中发酵培养16~48h；

（5）步骤107、步骤108：分割步骤106获得的发酵液，发酵液的分割量≥总量的1/5，分割出的发酵液经分散器处理，分散后的菌球直径≤200um；

（6）步骤105：第（5）步中分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0.5%时，发酵结束，得到柠檬酸；

（7）步骤109：配制发酵培养基F2，种后总糖控制在14~16%，总氮为0.10~0.25%；将第（5）步分散处理后的发酵液转接下一级发酵培养基F2，进行发酵培养；

（8）步骤110：发酵培养至16~48h的发酵液，回到第（5）步，如此重复上述操作，实现连续发酵。

所述种子培养基、发酵培养基F1、发酵培养基F2为淀粉质原料液化液配制的培养基，包括玉米粉，木薯，红薯。凡提及经过分割发酵液或菌丝分散处理技术实现微生物连续发酵方法，均适用本发明技术。

本发明有益的技术效果在于：

传统分批发酵方式存在非生产周期较长，生产效率低的缺点；并且由于频繁杀菌，检测装置损伤严重，每次培养均要接种，增加了生长成本。本发明针对这些缺点，基于菌丝球分散技术与营养调节技术，通过分割发酵方式，实现黑曲霉连续发酵生产柠檬酸。本发明的优点有：

（1）黑曲霉连续发酵工艺，直接减少种子培养过程，降低种子培养的原料成本与运行成本；

（2）采用连续发酵工艺，缩短生产周期，提高生产效率；自动化程度高，降低劳动强度；

（3）黑曲霉菌丝体处理后，获得更适宜发酵的菌丝体形态，利于传质与溶氧，提高产酸效率。

本发明提供的黑曲霉连续发酵工艺缩短了生产周期，提高了生产效率。本发明连续发酵10批次以上，糖酸转化率≥98%，发酵周期≤72h，柠檬酸发酵水平正常。

附图说明

图1为本发明黑曲霉连续发酵生产柠檬酸工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图1，对本发明进行具体描述。

在下面所有的实施方案中，总糖、还原糖采用菲林试剂滴定法，柠檬酸的测定采用0.1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板。菌丝分散采用高速分散机处理。其它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是宜兴协联生物化学有限公司生产菌种。

实施例1：葡萄糖与豆粕粉分别配制种子培养基（总氮8%，总氮0.15%）与发酵培养基(F1：总糖15.2%，总氮0.08%；F2~F10：总糖15.2%，总氮0.25%)；培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓度为30万个/ml；培养20h，得到成熟的种子液，然后以20%接种量转接发酵培养基；发酵培养48h，分割出1/3发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0.5%时，发酵结束，得到柠檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，处理后菌球平均直径为90um，转接下一级发酵培养基；

发酵培养48h，分割出1/3发酵液，经分散器分散处理，处理后菌球平均直径为98um，转接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，糖酸转化率≥99.6%，发酵周期≤72h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例2：玉米粉与去离子水按1:3比例在60℃左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙将pH调至6.0，按25U/g玉米粉加入高温α-淀粉酶，经过二次喷射液化，碘试合格（浅棕色），得到玉米液化混液；70%的混液经过板框过滤得到玉米液化清液。玉米液化混液与清液按一定的比例混合配制种子培养基(总糖12%，添加一定量的硫酸铵调节总氮0.25%)与发酵培养基(F1：总糖16%，总氮0.05%；F2~F10：总糖16%，总氮0.15%)。培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓度为45万个/ml；培养28h，得到成熟的种子液，然后以10%接种量转接发酵培养基；发酵培养16h，分割出1/4发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0.5%时，发酵结束，得到柠檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为190um，转接下一级发酵培养基；

发酵培养16h，分割出1/4发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为150um，转接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，糖酸转化率≥98.3%，发酵周期≤72h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例3：同实施例2，玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化得到液化混液，液化液与水按照一定的比例混合，添加一定比例的硫酸铵配制种子培养基（总糖9.5%，0.26%）。木薯粉与水按照1:4比例在60℃左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙将pH调至5.8，按30U/g木薯粉加入高温α-淀粉酶，经过二次喷射液化，得到木薯液化液；木薯液化混液全部经过板框过滤得到木薯液化清液。木薯液化清液与水按照一定的比例混合，添加一定量的玉米粉液化液，配制发酵培养基(F1：总糖14%，总氮0.15%；F2~F10：总糖14%，总氮0.25%)。培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓度为60万个/ml；培养36h，得到成熟的种子液，然后以15%接种量转接发酵培养基；发酵培养24h，分割出1/5发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0.5%时，发酵结束，得到柠檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为105um，转接下一级发酵培养基；

发酵培养24h，分割出1/5发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径为88um，转接下一级发酵培养基，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，糖酸转化率≥99.5%，发酵周期≤72h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例4：同实施例3，木薯粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化得到液化混液，70%的木薯液化混液经过板框过滤得到木薯液化清液。木薯液化混液与水按照一定的比例混合，添加一定量的豆粕粉配制种子培养基（总糖8.5%，0.4%）。木薯液化清液与水按照一定的比例混合，添加一定量的豆粕粉，配制发酵培养基(F1：总糖15.1%，总氮0.1%；F2~F10：总糖14.9%，总氮0.10%)。培养成熟的黑曲霉孢子接种种子培养基，移种后孢子液浓度为50万个/ml；培养32h，得到成熟的种子液，然后以10%接种量转接发酵培养基；发酵培养32h，分割出1/2发酵液，分割后剩余的发酵液继续在F1中发酵，当发酵培养基中还原糖浓度低于0.5%时，发酵结束，得到柠檬酸。分割出的发酵液经分散器分散处理，处理后菌球平均直径为110um，转接下一级发酵培养基；

发酵培养32h，分割出1/2发酵液，经分散器分散处理，分散处理后菌球平均直径120um，如此连续发酵，如此连续分割发酵10次。当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，糖酸转化率≥98.4%，发酵周期≤72h，柠檬酸发酵水平正常。

以上所述仅为本发明的交加实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种黑曲霉连续发酵生产柠檬酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）步骤103：种子培养20~36h，得到成熟的种子液；

（5）步骤107、步骤108：分割步骤106获得的发酵液，发酵液的分割量≥总量的1/5，分割出的发酵液经分散器处理，分散后的菌球直径≤200μm；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基、发酵培养基F1、发酵培养基F2为淀粉质原料液化液配制的培养基，包括玉米粉，木薯，或红薯。