CN104099253B

CN104099253B - 基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

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Publication number: CN104099253B
Application number: CN201410329652.XA
Authority: CN
Inventors: 石贵阳; 陈坚; 王宝石; 张�杰; 胡志杰; 蒋小东; 孙福新; 李赢; 张梁; 李由然; 丁重阳; 顾正华
Original assignee: Joint Ltd Energy Co Of Jiangsu China Telecom; Jiangnan University
Current assignee: Joint limited energy company of Jiangsu China Telecom; Jiangnan University
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: CN104099253A

Abstract

一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，包括以下步骤：（1）将黑曲霉孢子液接种至种子培养基，培养制备成熟的种子液；（2）成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液；（3）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%接种量转接至发酵培养基发酵，当发酵培养基还原糖浓度低于0.5%时发酵结束；（4）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%接种量接种至种子培养基，培养制备得到下一级成熟的种子液，然后回到步骤（2），即实现黑曲霉种子连续培养。本发明提供的黑曲霉种子连续培养方法，能直接减少黑曲霉孢子繁琐的培养过程，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。

Description

基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是涉及一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法。

背景技术

柠檬酸（CitricAcid）又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷三羧酸，无色晶体，常含有一分子结晶水，无臭，具有很强的酸味，易溶于水，在冷水中比热水中更容易溶解，常用来鉴定和分离。在食品化妆医药、建筑、印染、洗涤等行业具有广泛的用途，因其具有令人愉悦的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生成量和消费量最大的食用有机酸。柠檬酸在新兴行业的应用需求呈现出逐渐增长的趋势。柠檬酸在环境可持续发展方面有广泛应用，可以有效清除焊接残留，在生物聚合物、药物运输、组织工程中培养细胞方面也具有巨大的潜力。

柠檬酸发酵普遍采用黑曲霉二级发酵方式，即首先培养成熟的种子，然后成熟的种子液转接发酵培养。传统种子培养过程是采用黑曲霉孢子接种方式，需要大量成熟的黑曲霉孢子，黑曲霉孢子制备过程比较复杂。一批成熟的黑曲霉孢子需要经过平板筛选，斜面培养，茄子瓶培养，最后麸曲桶培养等逐级扩大培养过程，制备过程繁琐，活性筛选复杂，工作量大，制备周期需要30d以上。同时，采用孢子接种方式培养种子工艺，仅孢子萌发需要至少12h，因而成熟种子培养时间较长。

传统黑曲霉孢子逐级扩大培养过程存在流程长且复杂、筛选工作量大、周期长等缺点，需要消耗大量的原料成本以及运行成本。因而，如何改进黑曲霉孢子制备过程，缩短成熟种子培养时间，降低生产成本，是柠檬酸发酵生产亟待解决的一个重要问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法。本发明提供的黑曲霉种子连续培养方法，能直接减少黑曲霉孢子繁琐的培养过程，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。

本发明的技术方案如下：

一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，包括以下步骤：

（1）将黑曲霉孢子液接种至种子培养基，培养20~32h，制备成熟的种子液；

（2）成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液；

（3）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%（v/v）接种量转接至发酵培养基发酵，当发酵培养基还原糖浓度低于0.5%时发酵结束；

（4）将步骤（2）得到的部分分散菌丝种子液以5~15%（v/v）接种量接种至种子培养基，培养16~24h，制备得到下一级成熟的种子液，然后回到步骤（2），即实现黑曲霉种子连续培养。

步骤（1）中接种后黑曲霉孢子液浓度为40~55万个/ml接种。步骤（1）和步骤（4）中的种子培养基的总糖8~12%，总氮0.15~0.4%。

步骤（2）中成熟的种子液经过分散器处理，菌体的菌球或菌块平均直径40~100um。步骤（3）中的发酵培养基的总糖14~16%，总氮0.05~0.15%。

所述种子培养基、发酵培养基为淀粉质原料液化液配制的培养基，原料包括玉米粉，木薯，红薯。其他菌丝经过分散处理的微生物发酵，均适用本技术。

本发明有益的技术效果在于：

传统的柠檬酸生产菌种的黑曲霉孢子逐级扩大培养存在流程复杂、周期长、孢子活力筛选工作量大、种子培养周期长等问题，本发明基于菌丝球分散技术，采用分散菌丝替代传统孢子接种实现黑曲霉种子连续培养，直接减少传统种子培养方式中孢子逐级扩大培养工艺，缩短种子培养周期，降低原料与能量消耗；同时分散菌丝颗粒缠绕的菌丝较稀薄，利于传质与溶氧，提高糖酸转化率。

本发明具有以下优点：

（1）黑曲霉种子连续培养，直接减少孢子逐级扩大培养过程，减少此过程的原料消耗成本与运行成本；

（2）采用分散的菌丝接种培养种子液，直接缩短孢子接种方式的孢子萌发时间，减少成熟种子培养时间，减少过程运行成本；

（3）与传统菌丝球接种发酵相比，采用相对分散的菌丝接种发酵方式，增大与介质接触的比表面积，利于传质与溶氧，提高糖酸转化率。

本发明中种子连续培养10批次以上，从种子发酵结果看，糖酸转化率≥98%，发酵周期60~70h，柠檬酸发酵水平正常。

具体实施方式

在下面所有的实施方案中，总糖、还原糖采用菲林试剂滴定法，柠檬酸的测定采用0.1429mol/L的NaOH滴定，孢子计数采用血球计数板。菌丝分割采用高速分散机处理。其它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是宜兴协联生物化学有限公司生产菌种。

实施例1：

葡萄糖与豆粕粉分别配制种子培养基(总糖为8%，总氮0.15%)与发酵培养基(总糖为16%，总氮0.15%)；移种后孢子液浓度为55万个/ml接种；培养20h，得到成熟的种子液，种子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为100um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基，接种量均为5%。其中接入下一级种子培养基的，种子培养24h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径80um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下时发酵结束，如此循环。

发酵第一批次结束时，发酵酸度15.65%（v/v），糖酸转化率97.8%，发酵周期64h；循环8次时，发酵酸度15.74%(v/v)，糖酸转化率98.4%，发酵周期65h。如此循环10次，糖酸转化率≥98%，发酵周期≤65h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例2：

玉米粉与去离子水按1:3比例在60℃左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙将pH调至6.0，按25U/g玉米粉加入高温α-淀粉酶，经过二次喷射液化，经碘试合格（浅棕色），得到玉米液化混液；80%的混液经过板框过滤得到玉米液化清液。玉米液化混液与清液按照一定的比例混合配制种子培养基(总糖10%，添加一定量的硫酸铵调节总氮0.4%)与发酵培养基(总糖14%，总氮0.05%)。移种后孢子液浓度为58万个/ml接种；培养26h，得到成熟的种子液，种子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为55um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基，接种量分别为15%(v/v)，10%(v/v)。其中接入下一级种子培养基的，种子培养16h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径100um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，如此循环。

发酵第一批次结束时，发酵酸度13.78%（v/v），糖酸转化率98.4%，发酵周期65h；循环7次时，发酵酸度13.8%(v/v)，糖酸转化率98.6%，发酵周期65h。如此循环10次，糖酸转化率≥98%，发酵周期≤65h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例3：

同实施例2，玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经过二次喷射液化得到玉米液化混液，玉米液化混液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基(总糖8%，总氮0.2%)。木薯粉与水按照1:4比例在60℃左右的配料罐中混合均匀，加入氢氧化钙将pH调至5.8，按25U/g木薯粉加入高温α-淀粉酶，经过二次喷射液化，经碘试合格，得到木薯液化液；木薯液化液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵，配制发酵培养基(总糖15.6%，总氮0.076%)。移种后孢子液浓度为48万个/ml接种；培养32h，得到成熟的种子液，种子液菌丝经分散器分散，处理后的菌球平均直径为68um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基，接种量分别为10%(v/v)，15%(v/v)。其中接入下一级种子培养基的，种子培养24h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径51um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，如此循环。

发酵第一批次结束时，发酵酸度15.41%（v/v），糖酸转化率98.8%，发酵周期64h；循环8次时，发酵酸度15.47%(v/v)，糖酸转化率99.2%，发酵周期63h。如此循环10次，糖酸转化率≥98%，发酵周期≤65h，柠檬酸发酵水平正常。

实施例4：

同实施例2，玉米粉与水按照一定的比例混合均匀，经二次喷射液化得到玉米液化混液，玉米液化混液与水按照一定的比例混合，添加一定量的硫酸铵配制种子培养基(总糖9%，总氮0.18%)。同实施例3，木薯粉与水按照1:4比例混合经二次喷射液化，得到木薯液化液；木薯液化液、玉米液化混液与水按照一定的比例混合，配制发酵培养基(总糖15.8%，总氮0.09%)。移种后孢子液浓度为40万个/ml接种；培养25h，得到成熟的种子液，种子液菌丝经分散器分散，分散后的菌球平均直径为72um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基，接种量分别为15%(v/v)，15%(v/v)。其中接入下一级种子培养基的，种子培养20h，种子液经分散器分散，处理后的菌球平均直径66um，分别接入下一级种子培养基与发酵培养基；其中接入下一级发酵培养基的，当发酵培养基中还原糖浓度降至0.5%以下发酵结束，如此循环。

发酵第一批次结束时，发酵酸度15.46%（v/v），糖酸转化率97.89%，发酵周期63h；循环10次时，发酵酸度15.66%(v/v)，糖酸转化率99.1%，发酵周期64h。如此循环10次，糖酸转化率≥98%，发酵周期≤65h，柠檬酸发酵水平正常。

以上所述仅为本发明的交加实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种基于菌丝球分散技术的柠檬酸黑曲霉种子连续培养方法，其特征在于包括以下步骤：

（2）成熟的种子液经过分散器处理，得到分散菌丝种子液；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中接种后黑曲霉孢子液浓度为40~55万个/ml接种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）和步骤（4）中的种子培养基的总糖8~12%，总氮0.15~0.4%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中成熟的种子液经过分散器处理，菌体的菌球或菌块平均直径40~100μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中的发酵培养基的总糖14~16%，总氮0.05~0.15%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基、发酵培养基为淀粉质原料液化液配制的培养基，原料包括玉米粉，木薯，红薯。